雷公藤免疫调节的体外研究

雷公藤免疫调节的体外研究

一、雷公藤免疫调节的体外研究(论文文献综述)

白彦萍,刘文静,杨皓瑜,张维明[1](2021)在《雷公藤多甙作用机理及皮肤科应用》文中进行了进一步梳理雷公藤多甙是从卫矛科植物雷公藤根提取的一种脂溶性混合物,具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗菌等活性,是目前临床上使用较多的一种免疫抑制剂,被广泛用于治疗类风湿关节炎(RA)、肾小球肾炎、红斑狼疮及各种自身免疫性疾病和皮肤病等,并取得了良好的疗效。本文对雷公藤多甙主要的作用机理及其皮肤科临床应用进行综述,旨在为其临床应用提供参考。

王文平[2](2021)在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中指出研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:(1)从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞(HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞),3种肾细胞(HK-2、HKC和293T细胞)和3种心脏细胞(H9c2、HUVEC和HCMEC细胞);利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度(MNLC);体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。(2)选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放、DAPI染色、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。(3)利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:(1)重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。(2)重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。(3)蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:(1)细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;(2)重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。(3)蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。

王云雨[3](2020)在《基于表观遗传学的野菊花抗乙肝病毒活性部位作用机制研究》文中提出慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)持续复制引起的一种传染性疾病,不但严重威胁着人类生命健康,而且造成极大的社会危害。课题组前期通过对野菊花深入系统的研究,发现野菊花抗乙肝病毒活性部位CIC具有抗乙肝病毒、肝保护和免疫调节等多途径作用。本论文在前期研究的基础上,利用Hep G 2.2.15细胞模型,进行了活性部位CIC、CIT和CIF体外抗HBV作用研究,并首次探索了CIC对细胞DNA甲基化水平的影响,以阐明CIC抗HBV的作用机制。研究工作分为两个部分:第一部分:CIC、CIT和CIF体外抗HBV作用研究。利用CCK-8法检测CIC、CIT和CIF对细胞的毒性作用,确定半数毒性浓度和有效无毒浓度,然后在此基础上,应用ELISA法和荧光定量PCR法检测CIC、CIT和CIF对细胞分泌的HBs Ag、HBe Ag和HBV-DNA的影响。结果显示,CIC、CIT和CIF对Hep G 2.2.15细胞有毒性作用,且毒性作用随着给药浓度的增加而增加,三个活性部位对细胞的毒性作用为CIT>CIC>CIF,其TC50分别为16.86?g/m L、26.27?g/m L和35.50?g/m L,有效无毒浓度分别为12.5?g/m L、17.5?g/m L和25?g/m L。CIC、CIT和CIF在有效无毒浓度时对Hep G 2.2.15细胞分泌的HBs Ag、HBe Ag和HBV-DNA均有较好的抑制作用,其中,CIC和CIT对HBs Ag的抑制作用强于HBe Ag,CIF对HBe Ag的抑制作用强于HBs Ag。研究结果表明,三个活性部位均有良好的体外抗HBV的作用。第二部分:CIC抗乙肝病毒作用机制研究。(1)利用Illumina 850K芯片筛选CIC组和空白对照组差异甲基化位点,对比两组的整体甲基化差异。然后对甲基化差异显着的基因进行GO功能分析和KEGG功能分析,筛选候选差异甲基化基因。结果显示,CIC组整体甲基化水平略高于空白对照组,当P<0.05,|beta.difference|>0.1时,全基因组显着差异甲基化位点有94个,分布于81个基因上,甲基化程度升高的基因有46个,降低的有35个。GO和KEGG功能分析结果显示差异甲基化基因的功能主要集中在甘油磷脂、甘油酯等脂质代谢过程和生物合成过程以及MAP激酶活性的调节;主要通路有炎症介质调节的TRP通道、Fc epsilon RI和Erb B信号通路等炎症通路以及B细胞受体信号通路和NK细胞介导的细胞毒性等免疫调节通路。与之相关的异常高甲基化的基因主要有NGF、PIK3R3、PLCG2和AGPAT2,异常低甲基化的基因有HTR2B。(2)利用Real-time PCR技术对这些基因进行m RNA水平的测定。结果显示,NGF、PIK3R3和AGPAT2基因在CIC组中表达水平降低且有显着差异(P<0.05);PLCG2基因表达水平升高且有显着差异(P<0.05),HTR2B基因表达水平无显着差异。(3)利用焦磷酸测序技术对差异基因的差异甲基化位点进行验证。结果显示,NGF基因在CIC组中甲基化水平升高且存在显着差异(P<0.01);PIK3R3和AGPAT2基因在两组中的甲基化水平无显着差异。研究结果表明,CIC可能通过降低病毒载量、抗炎、调节免疫和脂质代谢等多途径、多靶点抑制乙肝病毒,并通过调节DNA甲基化水平达到抗HBV的作用。综上所述,本论文对野菊花抗乙肝病毒活性部位CIC、CIT和CIF直接抑制乙肝病毒作用进行了研究,并首次从微观层面、分子水平探索了CIC多途径、多靶点抗乙肝病毒的作用机制,为中药在抗乙肝病毒方面的作用研究提供了一定的科学参考价值。

杜星海[4](2020)在《雷公藤配伍益母草治疗类风湿性关节炎实验研究》文中研究表明目的 研究益母草与雷公藤配伍后,对雷公藤免疫活性和肝肾、生殖毒性的影响。方法 MTT法观察不同浓度雷公藤提取液对COS-7绿猴肾细胞和L-02肝细胞体外增殖的影响;MTT法观察不同浓度雷公藤和雷公藤配伍益母草提取液对淋巴细胞体外增殖的影响;建立以弗氏完全佐剂(FCA)诱导的类风湿关节炎雌性大鼠模型,将大鼠随机分为正常组、模型组、雷公藤组、雷公藤益母草组。雷公藤组、雷公藤益母草组按照实验设计剂量给予灌胃给药,正常组和模型组参照同体积的纯化水灌胃,持续21天,每4天观察记录大鼠的一般情况、测定记录大鼠足跖容积,21天后,测定大鼠各脏器指数、外周血中血清性激素水平(E2、FSH和LH),HE染色观察大鼠的卵巢、踝关节、子宫病理切片,TUNEL染色法测定大鼠卵巢组织中凋亡细胞数值并运用Western-blot法测定大鼠子宫组织中p450arom蛋白的表达。结果肝肾细胞体外增殖实验中,在3mg/mL浓度下,肝细胞体外增殖抑制率为7.158±3.003,肾细胞体外增值率为-11.942±8.997;15mg/mL肝细胞体外增殖抑制率为6.914±6.037,肾细胞体外增值率为40.698±6.375;雷公藤浓度越高,对肝肾细胞的增值抑制作用越明显,呈现浓度-毒性关系;淋巴细胞体外增殖实验中,在6mg/mL浓度下雷公藤组增殖抑制率为1.192±0.012、雷公藤益母草组增殖抑制率为1.112±0.069,两者差异有统计学意义(p<0.05);12mg/mL浓度下雷公藤组增殖抑制率为1.054±0.043、雷公藤益母草组增殖抑制率为1.059±0.030,两者差异无统计学意义(p>0.05);雷公藤配伍益母草在6mg/mL和12mg/mL浓度下,与雷公藤相同浓度下对小鼠脾淋巴细胞的抑制作用相当;雷公藤配伍实验结果表明,与模型组相比,雷公藤组和雷公藤益母草组体重增长率明显升高(p<0.05);与模型组相比,雷公藤益母草组足跖肿胀率有明显变化(p<0.05),与雷公藤组相比,雷公藤益母草组足跖肿胀率无明显变化(p>0.05);与雷公藤组相比,雷公藤益母草组肝脏脏器指数无明显变化(p>0.05)、胸腺、脾脏、肾脏、子宫脏器指数上均有显着差异(p<0.05),雷公藤益母草组E2、LH值明显升高(p<0.05)、FSH无明显变化(p>0.05);结果显示卵巢组织雷公藤组见少量淋巴细胞浸润,雷公藤益母草组未见明显淋巴细胞浸润、踝关节雷公藤组和雷公藤益母草组滑膜增生不明显、偶见炎症细胞浸润,子宫切片雷公藤组局部上皮细胞排列紊乱、内膜下层淋巴细胞浸润,雷公藤益母草组局部上皮细胞增生、内膜下层未见淋巴细胞浸润:与雷公藤组相比,雷公藤益母草组卵巢组织凋亡细胞明显减少(p<0.05)、p450arom蛋白的表达明显增强。结论 1.在肝肾细胞毒性关系的实验中,雷公藤对肝肾细胞有毒性作用,临床上不宜大剂量应用。2.在淋巴细胞体外增殖实验中,雷公藤配伍益母草后雷公藤的免疫抑制作用没有受到影响。3.雷公藤配伍益母草后对类风湿关节炎有治疗作用,在胸腺、脾脏、肾脏等脏器指数均表现出减毒作用、未增加雷公藤引起的肝肾毒性,配伍安全有效。根据性激素水平的升高、子宫脏器指数的提高、卵巢组织和子宫病理切片病理状态的改善、卵巢组织细胞凋亡的减少以及p450arom蛋白表达的增强,提示配伍后对生殖毒性有减毒作用。4.通过雷公藤的动物实验研究,探讨雷公藤配伍益母草的减毒机制可能一是与益母草具有类雌激素样作用有关,通过影响内源性激素合成,提高E2水平,促进大鼠子宫的修复及卵巢功能的恢复;二是通过减少卵巢组织细胞凋亡、增强子宫p450arom蛋白表达来减轻卵巢组织损害,起到降低由雷公藤引起的生殖毒性作用。

马杰[5](2020)在《基于网络药理学探讨清热凉血方活性成分经PI3K/AKT/GLUT1通路干预银屑病的作用》文中认为研究背景银屑病是一种常见的慢性炎性复发性皮肤病,主要表现有红斑、鳞屑等,中医称其为“白疕”,多因营血亏损,血热内蕴,生风生燥,肌肤失养而成。银屑病目前多从“血分”论治,血热证是其最常见的证型。清热凉血方是导师根据三十余年的临床经验从“犀角地黄汤”化裁而来。前期临床研究和基础实验证实清热凉血方通过多种生物学机制治疗银屑病安全、有效。而中药复方治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路的作用特点,清热凉血方干预银屑病的有效成分和机制尚未阐明。网络药理学是基于药物分子、基因、蛋白等多个公共数据库,运用现代生物信息学技术揭示中药对机体网络调控作用的一门学科。运用网络药理学可较好地阐释中药复方治疗疾病的“成分-靶点”网络。银屑病发病机制尚未明确,包括多基因遗传背景、T细胞免疫及环境的共同影响。银屑病尚无治愈的方法,现有的治疗手段难以使患者获得满意的效果。调节代谢可能是银屑病治疗的新思路。葡萄糖转运蛋白1(Glucose Transporter 1,GLUT1)是一种广泛表达的葡萄糖转运蛋白,可能通过促进表皮增殖、激活炎症以及血管生成等多种机制参与银屑病发病,并受到PI3K/AKT信号通路的调节。目前尚无清热凉血方及其活性成分是否通过PI3K/AKT/GLUT1信号通路治疗银屑病的研究。目的1、运用网络药理学挖掘清热凉血方治疗银屑病的可能活性成分及靶点。2、比较血热型银屑病患者皮损和健康对照组的皮肤中GLUT1蛋白的表达情况。3、基于体内、外实验,观察清热凉血方主要活性成分-槲皮素是否通过调控PI3K/AKT/GLUT1信号通路发挥对银屑病的治疗作用。方法研究一:通过数据库挖掘、文献检索构建了清热凉血方药物成分分子数据库;并利用计算机方法通过评估药物分子的ADME性质,获取清热凉血方的有效化学成分,进一步构建了成分-靶标网络,并通过蛋白互作、GOBP分析、Reactome通路分析揭示清热凉血方治疗银屑病的可能机制。研究二:入组血热型寻常型银屑病患者20名和健康对照组15名,运用免疫组织化学技术检测血热型银屑病患者皮损中GLUT1蛋白表达情况并比较两组有无差异。研究三:选用6~8周龄的BALB/c雄性小鼠47只,随机分为6组,空白对照组7只,其余各组每组8只。除空白对照组外,其余各组用含5%咪喹莫特乳膏涂抹在去毛的背部部位,1次/天,每次62.5 mg,持续7天。雷公藤组灌胃浓度为7.56 mg/kg雷公藤多苷液,槲皮素低、中、高组分别灌胃浓度为30mg/kg、60mg/kg及120mg/kg的槲皮素溶液,空白对照组和模型组均灌胃等渗盐水。干预7天后,第8天采集小鼠背部皮损和血清。通过肉眼观察皮损改变并进行PASI评分,HE染色比较皮肤组织病理改变并测量表皮厚度变化,免疫组织化学技术检测小鼠皮损中GLUT1蛋白表达,实时荧光定量PCR技术检测小鼠皮损中AKT mRNA和GLUT1 mRNA的相对表达量,Western Blot检测小鼠皮损中AKT、pAKT和GLUT1蛋白的表达水平以及流式细胞技术检测小鼠血清炎症因子的含量。研究四:运用HaCaT细胞模型,分为9组,分别是空白对照组(Control)、模拟银屑病疾病组(ModelA)、疾病+PI3K/AKT通路抑制组(ModelB)、疾病+高剂量槲皮素组(ModelA+QCH)、疾病+中剂量槲皮素组(ModelA+QCM)、疾病+低剂量槲皮素组(ModelA+QCL)以及疾病+抑制+高剂量槲皮素组(ModelB+QCH)、疾病+抑制+中剂量槲皮素组(Model B+QCM)和疾病+抑制+低剂量槲皮素组(Model B+QCL),运用CCK-8法检测槲皮素对HaCaT细胞增殖的影响,流式细胞学技术检测槲皮素对HaCaT细胞凋亡的影响,并运用Western Blot技术检测各组AKT、pAKT和GLUT1蛋白的表达情况。结果研究一基于数据库构建和计算机分析,我们得到了清热凉血方的131个活性分子及483个靶标。根据Degree排名,槲皮素可能是清热凉血方中主要的活性成分,其主要靶点涉及PI3K/AKT信号通路。清热凉血方干预银屑病的生物学过程包括调节代谢、免疫等。研究二GLUT1强表达于部分棘细胞和基底细胞的细胞膜,弱表达于部分棘细胞和基底细胞的细胞核。血热型寻常型银屑病患者皮肤棘细胞和基底细胞细胞膜的GLUT1的表达水平明显高于健康对照组(P<0.001)。研究三1、皮损变化方面,模型组小鼠出现比较典型的红斑、肥厚、鳞屑等“银屑病样”改变,槲皮素组的红斑、肥厚、鳞屑较同一时间点的模型组程度轻。PASI评分方面,槲皮素组在第8天的红斑、肥厚、鳞屑评分及总分均显着低于模型组(P值均<0.05)。2、病理改变方面,模型组小鼠表现出典型的“银屑病样”改变,槲皮素各剂量组的表皮角化过度和棘层肥厚较模型组的程度轻。表皮厚度方面,模型组显着高于空白对照组(130.93±69.66 μm vs 21.81±2.84μm,P<0.001),雷公藤组、槲皮素低、中、高剂量组表皮厚度依次为 77.93±12.54 μm、71.87±12.99 μm、77.73±10.08 μm、62.33±11.41μm,且均显着低于模型组(P值均<0.05)。3、免疫组化结果显示,模型组GLUT1蛋白表达水平显着高于空白对照组(P<0.001),雷公藤组、槲皮素低、中、高剂量组GLUT1蛋白表达水平均显着低于模型组(P 值均<0.001)。4、实时荧光定量PCR结果显示,模型组小鼠皮损中AKT mRNA和GLUT1mRNA的相对表达量均显着高于空白对照组(P值均<0.001),其余各组AKT mRNA和GLUT1 mRNA相对表达量均显着低于模型组(P值均<0.001),且槲皮素低、中、高剂量组AKT mRNA和GLUT1 mRNA的相对表达量逐渐递减。5、Western Blot结果显示,模型组小鼠皮损中pAKT蛋白相对表达量比AKT蛋白的相对表达量的比值(pAKT/AKT)显着高于空白对照组(P<0.05),雷公藤组和槲皮素高剂量组的pAKT/AKT均显着低于模型组(P<0.05),槲皮素低、中剂量组的pAKT/AKT均低于模型组但差异无统计学意义(P值均>0.05)。模型组GLUT1蛋白相对表达量显着高于空白对照组(P<0.001),雷公藤组及槲皮素中、高剂量组的GLUT1蛋白相对表达量均显着低于模型组(P值均<0.05),槲皮素低剂量组GLUT1蛋白相对表达量低于模型组但无显着统计学差异(P>0.05)。同时,槲皮素低、中、高剂量组GLUT1相对表达量依次递减。6、血清炎症因子方面,模型组小鼠TNF-α、IL-17A、IL-6、IL-10水平均显着高于空白对照组(P值均<0.05),而模型组IFN-γ、IL-21、IL-22水平也均高于空白对照组,但差异无统计学意义(P值均>0.05)。同时,槲皮素高剂量组TNF-α、IL-6和IL-17A水平均显着低于模型组(P值均<0.05)。研究四1、CCK-8法结果显示槲皮素能够抑制HaCaT细胞的增殖,槲皮素在不同给药时间下对 HaCaT 细胞抑制的 IC50 分别是:24h,IC50=160.3 mM;48h,IC50=73.28 mM;72h,IC50=42.20 mM。2、细胞凋亡结果显示,Model A组细胞凋亡率显着低于空白对照组(P<0.05),Model B组细胞凋亡率显着高于空白对照组(P<0.001)。ModelA+QCH、ModelA+QCM和Model A+QCL组细胞凋亡率逐渐降低且均显着高于Model A组(P值均<0.001)。Model B+QCH、Model B+QCM细胞凋亡率逐渐降低且均显着高于Model B组(P值均<0.001),Model B+QCL组细胞凋亡率也高于Model B组,但差异无统计学意义(P>0.05)。3、Western Blot 结果显示,Model A 组 pAKT/AKT 显着高于 Control 组(P<0.01),ModelB 组 pAKT/AKT 显着低于 Model A 组(P<0.01)。ModelA 组 GLUT1 蛋白相对表达量显着高于 Control 组(P<0.001)。Model A+QCH 组、Model A+QCM 组和 Model A+QCL组pAKT/AKT逐渐升高且均显着低于Model A组(P值均<0.001)。Model A+QCH组GLUT1蛋白相对表达量显着低于Model A组(P<0.05)。Model A+QCM组和Model A+QCL组GLUT1蛋白相对表达量也均低于Model A组,但差异无统计学意义(P>0.05)。Model B+QCH组、Model B+QCM组pAKT/AKT逐渐升高且均显着低于 Model B 组(P值均<0.01)。Model B+QCH 组、Model B+QCM 组 GLUT1 蛋白相对表达量逐渐升高且均显着低于Model B组(P<0.01,P<0.05)。Model B+QCL组GLUT1蛋白相对表达量也低于Model B组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、清热凉血方治疗银屑病具有“多成分-多靶点”的网络作用效应。槲皮素可能是清热凉血方的主要活性成分,其发挥作用的机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。2、槲皮素可能通过调控PI3K/AKT/GLUT1信号通路发挥对银屑病的治疗作用。

胡辉[6](2020)在《基于肿瘤相关巨噬细胞的极化探讨雷公藤内酯醇对耐顺铂上皮性卵巢癌抑制机制的研究》文中研究说明研究背景和目的:耐顺铂人上皮性卵巢癌和晚期卵巢癌的治疗已成为目前临床医师治疗上棘手问题,寻找安全有效的抗耐顺铂化疗药物的卵巢癌中药意义重大。我们前期工作发现雷公藤内酯醇(TP)对耐顺铂药物的人上皮性卵巢癌有抑制作用,并研究了其相关抑制机制。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)可诱导恶性肿瘤的生长,TAMs的极化在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用,而PI3K/Akt/NF-κB信号通路在TAMs极化扮演着重要的角色。我们前期工作也发现,TP可阻断PI3K/AKT信号通路进而抑制耐顺铂人上皮性卵巢癌生长。据此提出假设:TP可通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进TAMs向M1型巨噬细胞极化,抑制其向M2型巨噬细胞极化,从而促进卵巢癌细胞凋亡。因此,本实验从分子水平、细胞水平、组织以及动物水平等多层次探讨了TP作用于耐药上皮性卵巢癌后TAMs极化情况及PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白的变化,从而验证了TP通过对PI3K/AKT/NF-κB信号通路调节及调控肿瘤微环境进而发挥抗肿瘤作用。这个新视点为TP为耐顺铂化疗药物的上皮性卵巢癌和晚期卵巢癌患者的治疗提供实验依据和理论基础。方法:1、体外实验1.1 TAMs体外模型的建立1.1.1佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化:取细胞生长状态良好的THP-1细胞株,调整细胞密度为6*105个/ml,细胞接种于6孔板中,加入不同浓度的PMA,PMA浓度依次为0、100、200ng/ml,最后补充含1%谷氨酰胺、10%胎牛血清、1%双抗(青霉素和链霉素)配制的1640培养基至2ml,以0ng/ml PMA孔作为阴性对照孔,分别培养24h和48h后观察各孔细胞贴壁情况及细胞形态变化,以确定PMA诱导THP-1细胞分化的优化浓度和作用时间。1.1.2建立稳定的M1型及M2型巨噬细胞:THP-1细胞经过100ng/ml PMA诱导24h后,待细胞贴壁生长状态良好后,分别采用100μg/ml IL-4和10ng/ml LPS刺激被PMA诱导后的THP-1细胞株(可分别得到M2型TAMs和M1型TAMs),细胞分别放入细胞培养箱内培养48h,观察细胞生长状态。48小时后离心分别收集各组细胞上清液,采用ELISA法检测细胞上清液IL-10和IL-12的OD值,对体外模型巨噬细胞的诱导进行鉴定。1.2 CCK-8法检测雷公藤内酯醇对A2780/DDP细胞增殖的影响取对数生长期的A2780/DDP细胞株作为研究对象,给予不同浓度TP进行干预。实验分组分别为(0ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)TP,分别作用A2780/DDP细胞株24h之后用CCK-8方法检测每孔光吸收值(即OD值),计算TP对A2780/DDP细胞作用24h后的IC50值。1.3观察雷公藤内酯醇对A2780/DDP细胞增殖、侵袭转移能力的影响1.3.1 EDU检测TP对A2780/DDP细胞增殖影响:根据EDU试剂盒操作方法,将细胞分组为:(1)空白组:只加培养基(2)6.25ng/ml TP组(3)12.5ng/ml TP组(4)25ng/ml TP组(5)50ng/ml TP组(6)共培养组:细胞加已诱导的M2巨噬细胞上清液。1.3.2分别采用细胞划痕试验、细胞外基质粘附试验及Transwell试验检测不同浓度TP对A2780/DDP细胞干预后细胞的侵袭转移能力:分组同上。不同浓度的TP作用于肿瘤细胞后,用以上三种不同实验方法,观察TP作用细胞前、后,细胞的侵袭转移能力的变化。2、体内实验2.1、建立皮下移植瘤模型取对数生长期A2780/DDP细胞,将细胞密度调整为2*107个/ml。接种于裸鼠皮下,观察肿瘤变化,待肿瘤大小约100mm3左右时进行实验。裸鼠随机分为五组:阴性对照组、空白对照组、DDP组、TP组、联合(DDP+TP)组,每组6只裸鼠进行实验。2.1.1各组给药方法:(1)阴性对照组:生理盐水按50 ml/kg/d,腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天。(2)空白对照组:生理盐水按50 ml/kg/d,腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天。(3)DDP组:DDP按4 mg/kg/d,腹腔注射给药,第1天和第8天给药,总共用药2天。(4)TP组:0.15 mg/kg/d雷公藤内酯醇生理盐水稀释成终体积0.2 ml,予以腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天。(5)联合(DDP+TP)组:TP按0.15mg/kg/d,腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天,DDP按4 mg/kg/d腹腔注射给药,第1天和第8天给药,总共用药2天。给药24h后收集外周血及移植瘤体标本备用。2.2 ELISA法检测裸鼠外周血血清中IL-12和IL-10的OD值水平:将各组裸鼠外周血离心后,留取血清上清液,按ELISA试剂盒说明操作,检测各组外周血血清IL-12和IL-10的OD值水平。2.3测量各组裸鼠移植瘤重量及体积:处死裸鼠后,完整剥离移植瘤体,称取肿瘤湿重。测量肿瘤最长径(a)和最短径(b),V=ab2/2。2.4采用TUNEL法检测TP实验组裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡,以及采用免疫组化检测各实验组移植瘤组织中CD16/32和CD206蛋白表达。2.5采用Western-blot分析各组P13K/AKT/NF-κB信号通路中相关蛋白因子AKT、P-AKT、P65、P-P65的表达变化以及MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白的变化,通过Image J图像分析软件计算各种蛋白在不同组图片中的平均光密度值。结果:1、体外实验1.1、TAMs体外模型的建立1.1.1采用100ng/ml PMA诱导THP-1细胞株24h后,光学显微镜下可见THP-1细胞由单个圆形悬浮细胞逐渐变为贴壁细胞,细胞形态不规则,并伸出伪足明显,细胞浆透明,细胞光镜下折光度良好,贴壁细胞数量明显增加,此时细胞生长状态最佳。故选择100ng/ml PMA诱导THP-1细胞24h作为巨噬细胞的诱导剂量及作用时间。1.1.2 ELISA法检测细胞经不同因子刺激后,细胞刺激前、后M2型巨噬细胞表型IL-10 OD值分别为(0.203±0.059)和(0.610±0.048)(两者之间P<0.05),细胞刺激前、后M1型巨噬细胞表型IL-12 OD值分别为(0.203±0.068)和(0.613±0.057)(两者之间P<0.05)。说明对体外模型巨噬细胞的诱导是可行的。1.2、不同浓度TP对A2780/DDP细胞增殖的影响:TP对A2780/DDP细胞24小时有抑制作用,6.25ng/ml TP对细胞的抑制率为:(6.63±1.21)%,12.5ng/ml TP对细胞的抑制率为:(39.43±2.46)%,25ng/ml TP对细胞的抑制率为:(70.91±2.59)%。50和100ng/ml TP对细胞的抑制率均为100%,而共培养组中细胞存活率为124.24%。故TP作用A2780/DDP细胞24h后的IC50为12.5ng/ml。1.3、TP对A2780/DDP细胞增殖、侵袭转移能力的影响:1.3.1 EDU结果提示:共培养组见大量染成红色细胞,与阴性对照组相比,染成红色细胞数量明显增多。而TP组染成红色细胞数量少于共培养组,随着TP浓度的增加,新增殖细胞数量随之减少,说明细胞经TP干预后,渗入细胞DNA复制期间的EDU少,新增殖的细胞少,反映细胞增殖差,进入S期的细胞百分数少。1.3.2 M2巨噬细胞与A2780/DDP细胞共培养24h后,发现细胞之间距离缩短,细胞形态改变,细胞形态被拉长变为长梭形。M2巨噬细胞与A2780/DDP细胞共培养可促进肿瘤细胞生长活跃。细胞划痕实验显示,与M2巨噬细胞共培养后的肿瘤细胞爬片能力明显增强,TP组细胞爬片能力弱于共培养组,表现在划痕区域细胞少于共培养组,并随TP浓度的增加,划痕区域的细胞更少。同样,细胞粘附实验和Transwell实验证实A2780/DDP细胞与M2巨噬细胞共培养后,具有更多肿瘤细胞出现粘附和穿过小室。TP作用细胞后,细胞发生粘附和穿过小室的肿瘤数目减少,并且随TP浓度的增加,细胞发生粘附和穿过小室的肿瘤数目更少。表明A2780/DDP细胞与M2巨噬细胞共培养后肿瘤细胞的迁移及侵袭能力增强,TP作用于肿瘤细胞后,肿瘤细胞发生侵袭转移能力下降。2、体内实验2.1裸鼠成瘤后,各组肿瘤体积及重量不同,各组瘤体积:对照组(466.463±52.493)mm3,DDP组(309.843±52.595)mm3,TP组(223.870±22.585)mm3,联合组(149.460±33.670)mm3。DDP组、TP组及联合组瘤体积均明显小于对照组(P<0.05)。TP组和DDP组瘤体积均大于联合组(P<0.05)。各组瘤重:对照组(0.851±0.126)g,DDP组(0.541±0.055)g,TP组(0.394±0.034)g,联合组(0.244±0.047)g。TP组、DDP组及联合(DDP+TP)组瘤重均明显小于对照组(P<0.05),TP组和DDP组瘤重,均大于联合(DDP+TP)组(P<0.05)。2.2检测裸鼠外周血血清中IL-12和IL-10的OD值水平:(1)血清IL-10的检测情况:空白对照组(104.50±5.91)pg/ml,阴性对照组(39.84±4.12)pg/ml,DDP组(66.89±12.33)pg/ml,TP组(63.15±11.82)pg/ml,联合(DDP+TP)组:(34.05±7.60)pg/ml。阴性对照组、DDP组、TP组及联合(DDP+TP)组血清IL-10均小于空白对照组(P<0.05)。DDP组和TP组血清IL-10均高于联合(DDP+TP)组(P<0.05)。(2)血清IL-12的检测情况:空白对照组(37.16±4.23)pg/ml,阴性对照组(167.59±8.04)pg/ml,DDP组(80.81±6.82)pg/ml,TP组(79.17±6.05)pg/ml,联合(DDP+TP)组:(139.48±6.13)pg/ml。阴性对照组、DDP组、TP组及联合(DDP+TP)组血清IL-12均大于空白对照组(P<0.05)。DDP组和TP组血清IL-12均低于联合(DDP+TP)组(P<0.05)。2.3肿瘤组织HE染色可见肿瘤细胞存在异型性,细胞核被染成蓝紫色,细胞质被染成红色,核浆比增高,巨核或多核等改变。TUNEL显示:空白对照组(8.83±0.75)个/镜下,TP组(18.83±1.17)个/镜下,两者相比较,TP组的细胞凋亡明显升高(P<0.01)。2.4免疫组化检测各实验组作用成瘤裸鼠后肿瘤组织中CD16/32和CD206蛋白表达:与空白对照组相比,DDP组、TP组及联合组中CD16/32蛋白高于空白对照组,可见细胞浆染至棕黄色,尤其是联合组中,CD16/32蛋白呈强阳性表达。而空白对照组部分细胞浆染呈淡黄色,CD16/32蛋白呈弱阳性表达。与空白对照组相比,DDP组、TP组及联合组中CD206蛋白表达低于空白对照组,可见部分细胞浆染至淡黄色,尤其是联合组中,CD206蛋白呈弱阳性表达。而空白对照组细胞浆染呈深黄色,CD206蛋白呈强阳性表达。2.5、Western-blot分析各组蛋白的表达:Western-blot结果提示,通过图片灰度值比较,与空白对照组相比,DDP组、TP组及联合组中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白低于空白对照组(P<0.05),而联合组蛋白表达最低。各组非p-p65和非p-AKT蛋白无差异(P>0.05)。而各组p-p65和p-AKT蛋白表达均低于空白对照组(P<0.05),联合组p-p65和p-AKT蛋白表达水平最低。结论:1、体外诱导TAMs可行。2、TP可抑制A2780/DDP细胞生长,促进细胞凋亡,呈时间-剂量依赖关系。3、TP可协同DDP诱导人耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡,增加A2780/DDP对顺铂的敏感性。4、TP诱导肿瘤细胞凋亡机制可能与抑制了PI3K/AKT/NF-κB生存信号通路,下调磷酸化AKT和磷酸化NF-κB表达,抑制MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白表达,从而抑制TAMs向M2型巨噬细胞极化,促进TAMs向M1型巨噬细胞极化,促进肿瘤细胞凋亡。

吕洋[7](2020)在《中药雷公藤治疗狼疮性肾炎有效性和安全性的Meta分析》文中认为背景雷公藤最早记载于《神农本草经》,正式用于自身免疫性疾病的治疗已有40余年用药史,然而随着雷公藤在临床应用范围上的扩大,其毒副作用也显现出来,甚至限制了雷公藤的使用。目前尚未有雷公藤治疗狼疮性肾炎有效性和安全性的Meta分析。目的评价中药雷公藤治疗狼疮性肾炎的有效性和安全性,旨在为雷公藤在狼疮性肾炎的临床应用上提供客观依据,以及为今后相关临床用药及实验研究提供一些依据和参考。方法检索中国知网(CNKI)、维普全文数据库(VIP)、万方数据库、国家科技图书文献中心(NSTL)、PubMed、The Cochrane Library等文献资料库中自建库起至2020年2月有关雷公藤治疗狼疮性肾炎的随机对照研究文献。试验组为雷公藤单用或联合西药治疗,对照组采用纯西药治疗。以“狼疮性肾炎”、“雷公藤”为中文主题词,主题词逻辑关系为“或”;以“lupus nephritis”、“Tripterygium”为英文主题词,以主题词+自由词检索策略检索相关文献,主题词间逻辑关系为“and”,主题词与自由词逻辑关系为“or”,以引文检索和参考文献检索作为补充。由2名研究者分别进行文献资料筛选,经阅读标题和摘要初筛、阅读全文复筛纳入研究文献,然后集中核对,有分歧者互相讨论或经与第3位研究者讨论后决定取舍;文献质量评价步骤同文献筛选,运用Cochrane推荐的质量评价标准评价纳入文献的方法学质量;运用RevMan5.3软件完成Meta分析,异质性检验(χ2检验)中,异质性较小者(P≥0.1,I2≤50%)采用固定效应模型,异质性较大者(P<0.1,I2>50%)采用随机效应模型,对异质性较大者通过逐篇剔除文献进行敏感性分析并分析其异质性来源,二分类变量的统计分析使用相对危险度(relative risk,RR)及其95%置信区间(confidence interval,CI),连续型变量则使用均数差(mean difference,MD)及其95%置信区间,P<0.05为差异有统计学意义。以总体有效率、不良反应发生率、24h尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血清白蛋白(ALB)、补体C3、SLEDAI(systemic lupus erythematosus disease activity index)评分为结局指标。结果共9篇文献包含608例患者纳入本项研究,发表年份从1993年至2019年,其中试验组242例,对照组234例,男性112例,女性496例。9篇文献均为低至中等质量文献。纳入文献中除何胜虎等研究为雷公藤草药直接煎服,12-15g/d,文火煎2小时顿服,其余研究均为雷公藤多苷片,11.5mg/(kg·d),分3次口服。各结局指标的合并RR值[95%CI]分别为总体有效率2.36[1.55,3.60]、不良反应发生率0.47[0.32,0.70],差异有统计学意义;合并MD值[95%CI]分别为24h尿蛋白定量-0.13[-0.23,-0.03]、血清肌酐-9.93[-17.94,-1.93]、血尿素氮-1.14[-2.13,-0.14]、血清白蛋白3.99[0.82,7.17]、补体C3 0.13[-0.12,0.38]、SLEDAI评分-0.35[-0.97,0.28],除补体C3、SLEDAI评分差异无统计学意义外,其余指标两组间差异均有统计学意义。即试验组在提高总体有效率、降低不良反应发生率、降低24h尿蛋白定量、血清肌酐、血尿素氮及升高血清白蛋白水平上均优于对照组,在升高补体C3、降低SLEDAI评分上与对照组效果相当。结果显示雷公藤单用或联合西药治疗狼疮性肾炎在提高疗效、减少不良反应发生方面均优于纯西药组。结论雷公藤单用或联合西药在狼疮性肾炎的治疗上有明显的效果,且安全性较好。

邱月[8](2020)在《羊踯躅根及其单体—闹羊花毒素Ⅱ对阿霉素肾病小鼠的治疗作用及其机制》文中指出杜鹃花科植物羊踯躅(Rhododendron molle G.Don)是一种天然中草药,在传统上被用于治疗类风湿性关节炎以及跌打损伤。在过去三十年间,羊踯躅根在临床上曾被用于治疗慢性肾炎,并取得一定疗效。局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是一种原因不明,持续进展的临床病理综合征,其特征性临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症、对激素治疗不敏感以及逐渐向终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)进展。FSGS病理上以肾小球局灶性、节段性硬化,肾小管间质炎症细胞浸润和晚期纤维化为主要特征。近年来,随着植物化学分离技术发展,诸多具有生物活性的化合物从羊踯躅中分离鉴定出来。本研究在模拟人类FSGS的小鼠阿霉素肾病(adriamycin nephropathy,ADRN)模型中,分别测试羊踯躅根的乙醇提取物以及从其中分离出的重要单体成分闹羊花毒素II,旨在羊踯躅根中找出具有肾脏保护作用的化合物,并探索其机制。第一部分羊踯躅根提取物对阿霉素肾病小鼠的治疗作用目的:验证羊踯躅根提取物对ADRN小鼠的治疗作用。方法:(1)8周大的雄性Balb/c小鼠通过单次尾静脉注射阿霉素(adriamycin,ADR)15 mg/kg建立ADRN模型;(2)ADRN小鼠分别予以以下治疗,低剂量羊踯躅根提取物(5 mg/kg),高剂量羊踯躅根提取物(60 mg/kg),以及阳性药物卡托普利(30mg/kg),连续灌胃治疗5周;(3)通过PAS染色观察各组肾小球损伤;(4)通过天狼星红染色和Masson染色观察各组肾脏纤维化;(5)通过免疫组织化学染色检测各组足细胞标志分子(nephrin和podocin)的表达;(6)通过免疫组织化学染色检测各组纤维连接蛋白(fibronectin)的表达。结果:(1)低剂量羊踯躅根提取物可显着降低ADRN小鼠尿蛋白和减轻低蛋白血症,而高剂量羊踯躅根提取物无明显治疗作用;(2)低剂量羊踯躅根提取物可明显减轻ADRN小鼠肾小球硬化,以及上调nephrin和podocin的表达;(3)低剂量羊踯躅根提取物可明显减少ADRN小鼠天狼星红染色和Masson染色的阳性面积,以及fibronectin的表达。结论:低剂量羊踯躅根提取物对ADRN小鼠具有减轻尿蛋白和肾小球损伤,以及延缓肾脏纤维化的作用。第二部分闹羊花毒素II对阿霉素肾病小鼠的治疗作用及其机制研究目的:验证闹羊花毒素II对ADRN小鼠的治疗作用以及探索其机制。方法:(1)通过单次尾静脉注射ADR 15 mg/kg建立小鼠ADRN模型;(2)将8周大的雄性Balb/c小鼠随机分成4组:Sham对照组(Sham),Sham对照+闹羊花毒素II 0.04mg/kg组(Sham+R-II 0.04),阿霉素肾病模型组(ADR),以及阿霉素肾病+闹羊花毒素II 0.04 mg/kg组(ADR+R-II 0.04)。其中闹羊花毒素II连续灌胃治疗5周;(3)通过PAS染色观察各组肾小球损伤;(4)通过天狼星红染色和Masson染色观察各组肾脏纤维化;(5)通过免疫组织化学染色和Western blot检测各组nephrin和podocin的表达;(6)通过免疫组织化学染色和Western blot检测各组fibronectin的表达;(7)通过免疫组织化学染色检测各组间质浸润的炎症细胞(CD4+T细胞,CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞);(8)通过Western blot检测各组NF-?B p-p65的表达;(9)通过Western blot检测各组TGF-β1,p-Smad3,Smad3和Smad7等TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达。结果:(1)闹羊花毒素II可显着降低ADRN小鼠尿蛋白和减轻低蛋白血症;(2)闹羊花毒素II可明显减轻ADRN小鼠肾小球硬化,以及上调nephrin和podocin;(3)闹羊花毒素II可明显减少ADRN小鼠天狼星红染色和Masson染色的阳性面积,以及fibronectin的表达;(4)闹羊花毒素II可显着减轻ADRN小鼠CD4+T细胞,CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞的间质浸润;(5)闹羊花毒素II可显着减轻ADRN小鼠NF-?Bp65的磷酸化;(6)闹羊花毒素II可显着下调ADRN小鼠TGF-β1和p-Smad3的表达。结论:(1)闹羊花毒素II对ADRN小鼠具有减轻尿蛋白和肾损伤的作用,是羊踯躅根在治疗ADRN小鼠中发挥肾脏保护作用的有效单体成分;(2)闹羊花毒素II对ADRN小鼠治疗作用的机制与抗炎作用以及调节TGF-β1/Smad信号通路相关。

赵遐[9](2019)在《雷公藤甲素对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用及机制研究》文中研究表明背景:雷公藤在祖国医学中已有数百年应用历史,其作为我国天然植物药瑰宝,逐渐被世界认可,但目前仍缺乏在动物整体水平深入研究雷公藤缓解狼疮鼠病情的具体免疫学和分子生物学机制的研究。雷公藤甲素(雷公藤内酯醇,triptolide)被认为是雷公藤的主要活性成分,是雷公藤中免疫抑制作用最强的单体之一。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种常见的累及多脏器的慢性自身免疫性疾病,其病因复杂,发病机制尚不明确,已成为当今国际研究的焦点。但由于其病因和发病机理未明,缺乏特异的治疗手段,深入研究SLE发病机制、开发新的治疗策略具有重要的临床意义。目的:本研究旨在探索中药单体雷公藤甲素治疗SLE的机制。选择MRL/lpr狼疮小鼠,系统观察了雷公藤甲素对其的治疗作用,在体内外初步探讨了雷公藤甲素在此模型中的作用机理,为SLE的治疗策略研究提供新的思路。方法:1.选择雌性MRL/lpr狼疮小鼠,分别随机给药低剂量雷公藤甲素组(0.2mg/kg/d)、高剂量雷公藤甲素组(0.3mg/kg/d)、空白载体溶液作为安慰剂及环磷酰胺作为阳性对照。各组小鼠从7周龄开始给药至21周龄,观察各组对MRL/lpr小鼠的治疗效果。采用BCA法定期定量检测小鼠尿蛋白浓度,ELISA法检测血清抗ds DNA抗体的水平。小鼠肾脏标本进行H&E染色,由肾脏病理专家采用盲法读片,半定量评估肾小球累及及肾小血管累及情况。2.分离各组小鼠脾脏淋巴细胞,流式检测其中调节性T(Treg)细胞亚群。Western Blot检测脾脏Foxp3蛋白。小鼠脾细胞用anti-CD3及anti-CD28刺激进行体外培养,分别加入0n M、1n M及10n M雷公藤甲素,流式检测脾脏细胞Treg细胞比例。3.体内实验中,实时定量荧光PCR检测脾脏淋巴细胞miR-125a-5p的表达水平,同时分析miR-125a-5p表达量和Treg细胞比例的关系。小鼠脾脏淋巴细胞用anti-CD3及anti-CD28刺激进行体外培养,分别加入0n M、1n M及10n M雷公藤甲素,RT-PCR检测miR-125a-5p表达。4.小鼠脾细胞用anti-CD3及anti-CD28刺激进行体外培养,加入雷公藤甲素10n M,脂质体转染miR-125a-5p抑制体和抑制体对照,实时定量荧光PCR检测脾脏淋巴细胞的Foxp3和miR-125a-5p的表达水平,流式检测脾脏细胞中Treg细胞比例。结果:1.雷公藤甲素可明显缓解MRL/lpr小鼠类狼疮样的疾病病情。小鼠经雷公藤甲素治疗后蛋白尿发生时间和水平均显着低于安慰剂组,肾脏病理显示免疫性肾炎病变轻于安慰剂组,肾小球损伤及血管周围炎症积分差异具有统计学差异。雷公藤甲素组小鼠抗ds DNA抗体水平显着低于安慰剂组。2.我们进一步发现雷公藤甲素在体内增加MRL/lpr小鼠脾脏淋巴细胞Treg细胞的百分比。体外实验中小鼠脾脏细胞分别加入1n M和10n M雷公藤甲素,与载体对照组相比,Treg细胞比例增加,且随雷公藤甲素浓度增加而增加,其中10n M雷公藤甲素组与0n M相比,Treg细胞比例有统计学意义(P<0.01)。3.雷公藤甲素在小鼠体内增加MRL/lpr小鼠脾脏淋巴细胞miR-125a-5p的表达,且在低剂量雷公藤甲素组(0.2mg/kg/d),Treg细胞的百分比与miR-125a-5p的表达成正比。体外实验中小鼠脾脏细胞分别加入1n M和10n M雷公藤甲素,与载体对照组相比,miR-125a-5p表达均增加,且随雷公藤甲素浓度增加而增加,其中10n M雷公藤甲素组与0n M相比,miR-125a-5p表达增加有统计学意义(P<0.05)。4.将miR-125a-5p抑制剂和抑制剂对照转染到脾细胞中,并加入10n M雷公藤甲素。与转染对照组相比,转染miR-125a-5p抑制体,Treg细胞比例下降,且有统计学意义(P<0.01)。结论:本研究探讨了雷公藤甲素对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用,并且阐明了雷公藤甲素可在体内和体外诱导Treg细胞和miR-125a-5p的表达,体外抑制miR-125a-5p的作用可以抵消雷公藤甲素诱导Treg细胞的作用。

赵哲[10](2019)在《组蛋白H3K27me3调控强直性脊柱炎Th17分化偏移及中药干预机制》文中研究说明背景:强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)为临床常见的慢性炎性脊柱关节病,有较高致残率,多侵犯中轴及骶髂关节,临床多见脊柱及骶髂关节炎以及肌腱韧带附着点炎。炎症是造成AS患者骨破坏和病理性骨化的关键因素,反复的炎症可造成骨侵蚀与异位骨化,导致骨关节融合、僵直,使患者活动受限,严重影响日常生活及工作。因此,控制炎症是延缓AS病程、防止致残的关键。辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)是AS炎症发生的主要效应细胞,通过特征性分泌细胞因子白细胞介素17(interleukin 17,IL-17),诱导促炎介质和趋化因子,介导AS炎症发生。因此,抑制Th17分化,减少IL-17的分泌,是控制AS炎症的重要靶标。Th17细胞由初始CD4+T细胞(Naive CD4+T cell)分化而来,属于CD4+T细胞亚群之一,当外界炎性因子刺激活化Naive CD4+T细胞后,启动Th17细胞分化特征性转录因子维甲酸相关孤儿受体yt(Retinoid-acid receptor-related orphan receptor yt,RORyt)表达,开启向Th17细胞分化偏移过程,且向其他亚群的分化受抑。抑制RORyt转录活化,是抑制Th17分化偏移的关键一步。转录因子RORyt受上游Janus激酶/信号转导子和转录激活因子(JAK/STAT)通路的调控。JAK2/STAT3是参与Th17细胞分化的一条重要通路,受外界IL-23刺激后,JAK/STAT信号通路激活并诱导STAT3发生磷酸化,并以二聚体的形式进入细胞核,与转录因子RORc结合,开启Th17细胞分化;另一方面此二聚体还能与IL-17基因启动子序列的特定位点直接结合,促进IL-17的分泌。因此,抑制JAK/STAT信号通路活化,从而抑制RORyt的转录激活,对控制AS炎症发生具有重要意义。近年来大量研究发现,转录因子RORyt、上游信号分子STAT3与下游效应因子IL-17的编码基因启动子区域存在广泛的组蛋白H3赖氨酸27-三甲基化(Methylation of histone H3 at lysine 27,H3K27me3)标记,H3K27me3 对 Th17的分化偏移起重要调控作用。组蛋白H3是染色体的主要结构蛋白之一,组蛋白H3 的 N-末端赖氨酸残基 K27(methylation of histone H3 at lysine 27,H3K27)是维持基因沉默的关键位点,该位点的甲基化修饰是调控RORc由沉默转向活化的“开关”。当组蛋白H3K27以三甲基化修饰状态存在时,可特异性的招募抑制性复合物,使染色体结构变得紧密,基因维持沉默状态。研究发现H3K27me3可抑制RORyt、STAT3以及IL-17转录激活,当将H3K27me3标记从RORyt、STAT3以及IL-17基因启动子区被移除后,基因转录抑制作用减弱,沉默解除并转向活化,开启Th17细胞分化。因此,组蛋白H3K27me3水平可能是影响AS患者Th17细胞分化偏移的重要调控因素。组蛋白H3K27me3水平受组蛋白去甲基化酶JMJD3与组蛋白甲基转移酶EZH2 共同调控。JmjC 结构域的蛋白家族 3(Jumonji domain-containing protein 3,JMJD3)与 Zeste 同源物增强子 2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是一对作用于组蛋白H3K27位点的一对具有拮抗作用的组蛋白甲基化修饰酶,JMJD3作为组蛋白去甲基化酶能特异性降解H3K27me3,而EZH2通过特异性催化H3K27位点发生三甲基化修饰,抑制基因表达。敲除JMJD3或应用JMJD3小分子抑制剂后的Naive CD4+T细胞几乎不向Th17细胞分化偏移;与之相反,敲除EZH2后的Naive CD4+T细胞则开启向Th17的分化偏移,说明组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2可能通过调控H3K27me3水平,对Th17分化发挥上游调控作用。清热利湿活血法是中医临床治疗AS的常用治法之一,在前期国家十一五科技支撑计划重大疑难病AS研究中,采用清热活血立法组方的清热强脊汤治疗活动期AS,国际ASAS20、50、70判定临床疗效有效率分别可达86.75%、60.68%和41.45%,且清热强脊汤对AS疾病活动度、炎症指标及临床症状均有明显的改善作用。在前期北京市自然科学基金项目中,我们发现清热活血法可抑制Th17分化,发挥抗炎作用。此外,在前期研究中我们发现,AS患者PBMC中存在着高表达的JMJD3以及低表达的EZH2,并且清热活血法可显着降低AS患者PBMC中JMJD3表达水平。基于上述研究结果,我们推测中药对Th17分化的抑制作用,可能是通过影响组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2,从而干预转录因子RORc、JAK/STAT通路信号分子及效应因子IL-17基因启动子区域H3K27三甲基化水平而实现的。雷公藤是具有抗炎、免疫抑制、止痛等功能的祛风湿类药物,雷公藤甲素是中药雷公藤的有效成分之一,在前期研究中,我们发现中药单体雷公藤甲素可抑制AS患者外周血单个核细胞中组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达,或上调组蛋白甲基转移酶EZH2的表达水平,影响Th17细胞的分化及功能。本研究基于此,进一步探究中药单体雷公藤甲素干预组蛋白H3K27me3水平,调控AS患者Th17细胞分化的表观遗传机制。研究一:AS患者Th17分化状况及组蛋白H3K27me3表达水平的研究目的:初步探究AS患者H3K27me3表达水平及其在AS炎症过程中调控Th1 7细胞分化的表观遗传机制;方法:1.纳入来自中国中医科学院广安门医院门诊或住院符合诊断标准的活动期AS患者(AS-Active)30例,稳定期AS患者(AS-Stable)15例。纳入10例健康志愿者为正常对照组(N)。取肘窝静脉血后收集血清,采用Ficoll-hypaque密度梯度离心法分离PBMC,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血清IL-17表达水平,研究IL-17水平与炎症指标ESR、CRP及疾病活动指数BASDAI的相关性。2.蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组患者PBMC中H3K27me3表达水平,检测JAK/STAT信号通路各级信号因子的表达及磷酸化状况,检测特征性转录因子RORc表达状况,并与健康志愿者进行对照。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测 mRNA 表达情况,检测采用 Spearman相关系数进行相关性分析,研究H3K27me3与AS患者炎症活动情况及Th17分化情况的相关性。结果:1.活动期与非活动期AS患者血清IL-17水平均较正常对照组显着增高(p<0.05);活动期AS患者较非活动期患者血清IL-17水平显着增高(p<0.01);且AS患者血清IL-17水平与炎症指标CRP、ESR均呈显着正相关(IL-17-CRP:p<0.05;IL-17-ESR:p<0.05);2.与正常对照组相比,活动期AS患者JAK2蛋白表达水平升高,STAT3蛋白表达量无显着差异(JAK2:p<0.05;STAT3:pp>0.05);与非活动期相比较,活动期AS患者JAK2、STAT3蛋白表达水平虽无显着差异(JAK2:p>0.05;STAT3:p>0.05),但 pJAK2、pSTAT3 表达水平显着增高(pJAK2:p<0.05;pSTAT3:pp<0.01)。非活动期AS患者与正常对照组相比,JAK2、STAT3蛋白表达量无显着差异(JAK2:p>0.05;STAT3:p>0.05),pJAK2 水平无显着差异,pSTAT3水平明显升高(pJAK2:p>0.05;pSTAT3:p<0.05)。活动期与非活动期AS患者RORc mRNA及蛋白表达水平均较正常对照组显着升高(p<0.05),活动期AS患者较非活动期RORc mRNA及蛋白表达水平显着升高(p<0.01)。3.与正常对照组比较,活动期AS患者H3K27me3水平显着降低(p<0.05);与非活动期比较,活动期AS患者H3K27me3水平显着降低(p<0.01);非活动期AS患者较正常组无显着差异。H3K27me3水平与炎症指标CRP、ESR均呈负相关(H3K27me3-CRP:P<0.05;H3K27me3-ESR:pp<0.05),与 RORc 蛋白表达水平呈负相关(p<0.05)。研究二:组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2调控H3K27me3水平影响Th17分化的研究目的:初步探究AS患者组蛋白甲基化修饰酶JMJD3与EZH2的表达情况及其对Th17分化的干预作用;方法:蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组患者PBMC中JMJD3、EZH2蛋白表达水平,并与健康志愿者进行对照。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测mRNA表达情况,检测采用Spearman相关系数进行相关性分析,研究JMJD3、EZH2与AS患者炎症活动情况及Th17分化情况的相关性。结果:与正常对照组相比,活动期AS患者JMJD3 mRNA及蛋白表达均明显升高(pp<0.05);与非活动期相比,活动期AS患者JMJD3mRNA及蛋白表达均明显升高(蛋白:p<0.01;mRNA:p<0.05)。非活动期AS患者较正常组无显着差异。与正常对照组相比,活动期及非活动期AS患者EZH2 mRNA及蛋白表达均明显下降(p<0.05);活动期AS患者较非活动期EZH2 mRNA及蛋白表达均明显降低(p<0.05)。经相关性分析后,发现JMJD3表达水平与H3K27me3水平呈负相关(p<0.05);EZH2表达水平与H3K27me3水平呈正相关(p<0.05)。JMJD3表达水平与IL-17、RORc水平均呈正相关(p<0.05);EZH2表达水平与IL-17、RORc水平均呈负相关(p<0.05)。研究三:清热利湿活血法对H3K27me3水平及Th17分化的影响目的:初步探究清热利湿活血法对AS患者PBMC H3K27me3表达水平的影响及对Th17分化的调节作用。方法:观察清热利湿活血法治疗前后AS患者炎症指标及疾病活动度的变化,ELISA法检测中药治疗前后血清IL-17表达水平;Western Blot检测清热利湿活血法治疗前后患者PBMC中H3K27me3表达水平及Th17分化特征性转录因子RORc表达状况。结果:1.经清热活血法治疗3个月后,AS患者炎症指标ESR、CRP较中药治疗前明显下降(ESR:p<0.01;CRP:p<0.05);AS患者疾病活动指数BASDAI较治疗前明显下降(p<0.01);血清IL-17水平较中药治疗前明显下降(p<0.01)。2.经清热活血法治疗3个月后,AS患者H3K27me3表达水平较中药治疗前明显升高(pp<0.01),RORc表达水平较中药治疗前明显下降(pp<0.01)。研究四:清热利湿活血法对组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达的影响目的:初步探究清热利湿活血法对AS患者PBMC中组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达水平的影响。方法:Western Blot检测清热利湿活血法治疗前后患者PBMC中JMJD3/EZH2表达水平结果:经清热活血法治疗3个月后,AS患者JMJD3表达水平较中药治疗前明显下降(p<0.01),EZH2表达水平较中药治疗前明显升高(p<0.01)。研究五:中药单体雷公藤甲素对H3K27me3水平及Th17分化的影响目的:观察体外干预中药单体雷公藤甲素对活动期AS患者PBMC H3K27me3表达水平的影响及对Th17分化的调节作用。方法:体外分离培养活动期AS患者PBMC,中药单体雷公藤甲素进行体外干预,以JMJD3的小分子抑制剂GSK-J4为阳性对照组。Cell Counting Kit-8(CCK-8)法及ELISA法确定中药单体雷公藤甲素和GSK-J4的最佳体外干预浓度。观察在最佳药物浓度的作用下,雷公藤甲素对H3K27me3表达的影响及对JAK/STAT信号通路各级信号因子的表达和磷酸化状况和转录因子RORc表达的影响,具体方法详见“研究一”。结果:1.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)H3K27me3水平较空白对照组均明显升高(p<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。2.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)均能明显抑制JAK2/STAT3通路信号因子磷酸化水平(p<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)JAK2、STAT3 mRNA表达水平较空白对照组差异均无统计学意义。3.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)均能明显抑制RORcmRNA及蛋白水平(p<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。研究六:中药单体雷公藤甲素对组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达的影响目的:观察体外干预中药单体雷公藤甲素,对活动期AS患者PBMC JMJD3、EZH2表达水平的影响。方法:观察在最佳药物浓度的作用下,雷公藤甲素对JMJD3、EZH2表达的影响及对JAK/STAT信号通路各级信号因子的表达和磷酸化状况和转录因子RORc表达的影响,具体方法详见“实验一”。结果:1.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)JMJD3mRNA、蛋白水平较空白对照组均明显降低(pp<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。2.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)EZH2 mRNA、蛋白水平较空白对照组均明显升高(p<0.05);阳性对照组较AS-TP组EZH2水平上升更为明显(p<0.05)。研究结论:1.AS患者PBMC中H3K27三甲基化水平较正常人显着下降,可能是激活Th17特征性转录因子RORc及上游JAK/STAT信号通路,介导AS炎症发生的重要机制之一。2.AS患者组蛋白去甲基化酶JMJD3高表达,甲基转移酶EZH2低表达,使H3K27位点去甲基化,可能是AS炎症发生的主要调控因素之一。3.清热利湿活血法抑制去甲基化酶JMJD3活性,上调甲基转移酶EZH2表达,促进H3K27位点发生三甲基化,从而抑制Th17分化,可能是其缓解AS炎症的机制之一。4.中药单体雷公藤甲素体外干预AS患者PBMC能明显抑制Th1 7特征性转录因子RORc表达及上游JAK2/STAT3信号通路的活化,其作用机制可能是通过抑制去甲基化酶JMJD3活性,上调甲基转移酶EZH2表达,从而促进组蛋白H3K27位点发生三甲基化而实现的。

二、雷公藤免疫调节的体外研究(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、雷公藤免疫调节的体外研究(论文提纲范文)

(1)雷公藤多甙作用机理及皮肤科应用(论文提纲范文)

1 作用机理
    1.1 抗炎作用
    1.2 免疫调节作用
    1.3 调节信号通路
    1.4 抗氧化应激
2 雷公藤多苷在皮肤科的临床应用
    2.1 银屑病
        2.1.1 纠正患者的免疫失衡状态
        2.1.2 抑制角质形成细胞增殖
        2.1.3 其他
    2.2 皮炎湿疹类皮肤病
    2.3 红斑狼疮
    2.4 皮肌炎
    2.5 系统性硬皮病
    2.6 治疗白塞病
        2.6.1 改善血管内皮细胞功能
        2.6.2 激发抗炎因子分泌及生成和抑制淋巴细胞增殖
    2.7 血管炎
    2.8 天疱疮
    2.9 大疱性类天疱疮
    2.10 治疗麻风反应
    2.11 治疗慢性荨麻疹
3 小结

(2)重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
符号说明
文献综述
    综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状
        1 药效成分
        2 药理作用
        3 不良反应研究现状
        4 总结与讨论
        参考文献
    综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展
        1 CYP代谢
        2 线粒体稳态
        3 氧化损伤
        4 细胞凋亡
        5 胆汁淤积
        6 Ca~(2+)浓度平衡破坏
        7 免疫激活介导的炎症因子释放
        8 特异反应
        9 总结与讨论
        参考文献
前言
技术路线图
第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价
    第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第四节 小结与讨论
        1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验
        2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性
        3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究
    本章总结与讨论
第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究
    第一节 肝细胞毒性机制研究
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第二节 心血管细胞毒性机制研究
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
    第三节 小结与讨论
        1 肝细胞毒性机制研究
        2 心血管毒性机制研究
    本章总结
第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制
    第一节 TMT标记定量蛋白质组学
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
        5 生物信息分析
        6 机制分析
        7 PPI网络
        8 潜在生物标志物
    第二节 Q300靶向代谢组学
        1 概述
        2 实验材料
        3 实验方法
        4 实验结果
        5 通路富集
        6 通路分析
        7 潜在生物标志物
    第三节 小结与讨论
        1 TMT标记定量蛋白质组学
        2 Q300靶向代谢组学
        3 蛋白组学-代谢组学关联分析
    第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证
        1 动物组织Western blot验证
        2 斑马鱼qPCR实验验证
        3 小结与讨论
结语
    1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价
    2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究
    3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究
    4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析
    5 不足与展望
    创新点
参考文献
致谢
个人简历

(3)基于表观遗传学的野菊花抗乙肝病毒活性部位作用机制研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
符号和缩略词说明
第一章 表观遗传学在中药研究中的应用
    1.1 表观遗传学概述
    1.2 DNA甲基化与中药研究
    1.3 组蛋白修饰与中药研究
    1.4 miRNA调控与中药研究
    1.5 本课题的目的和意义
第二章 野菊花抗乙肝病毒活性部位CIC、CIT和 CIF抗乙肝病毒作用研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 仪器与设备
        2.1.2 试剂与药品
        2.1.3 实验细胞
        2.1.4 药品与试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 HepG2.2.15细胞培养
        2.2.2 CCK-8 法检测活性部位CIC、CIT和 CIF对 Hep G2.2.15 细胞的毒性作用。
        2.2.3 ELISA法检测活性部位CIC、CIT和 CIF对 Hep G2.2.15 细胞分泌的HBs Ag和HBeAg的影响
        2.2.4 荧光定量PCR法检测活性部位CIC、CIT和 CIF对 Hep G2.2.15 细胞分泌的HBV-DNA的影响
        2.2.5 数据分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 活性部位CIC、CIT和 CIF对 Hep G2.2.15 细胞毒性作用结果
        2.3.2 活性部位CIC、CIT和 CIF对 Hep G2.2.15 细胞分泌的HBs Ag和 HBe Ag的影响结果
        2.3.3 活性部位CIC、CIT和 CIF对 Hep G2.2.15 细胞分泌的HBV-DNA的影响结果
    2.4 讨论
第三章 野菊花抗乙肝病毒活性部位CIC作用机制研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 仪器与设备
        3.1.2 试剂与药品
        3.1.3 实验细胞
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞培养
        3.2.2 DNA样品的提取与检测
        3.2.3 Illumina850K芯片检测
        3.2.4 Real-time PCR验证候选基因的表达水平
        3.2.5 焦磷酸测序验证候选差异位点的甲基化水平
    3.3 实验结果
        3.3.1 DNA样品检测结果
        3.3.2 Illumina850K芯片结果分析
        3.3.4 Real-time PCR技术验证候选基因的表达水平实验结果
        3.3.5 焦磷酸测序验证候选差异位点的甲基化水平实验结果
    3.4 讨论
第四章 全文总结与展望
参考文献
附表
个人简历及在校期间学术成果
致谢

(4)雷公藤配伍益母草治疗类风湿性关节炎实验研究(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
前言
第一部分 雷公藤不同剂量与肝肾细胞毒性关系研究
    一、材料与方法
        (一) 实验材料
        1. 主要实验试剂
        2. 主要仪器设备
        3. 主要试剂配置
        (二) 实验方法
        1. 绿猴肾细胞(COS-7细胞)悬液的制备
        2. COS-7细胞活力检测
        3. MTT法检测雷公藤不同剂量对COS-7细胞增殖的影响
        4. L-02肝细胞的活化与传代
        5. MTT法检测雷公藤不同浓度下对L-02细胞增殖的影响
        6. 计算公式及数据分析
    二、结果
        (一) 雷公藤各浓度下对L-02肝细胞的增殖抑制影响
        (二) 雷公藤各浓度下对COS-7肾细胞的增殖抑制影响
    三、小结
第二部分 雷公藤配伍益母草对淋巴细胞增殖作用的影响
    一、材料与方法
        (一) 实验材料
        1. 实验动物
        2. 主要实验试剂
        3. 主要仪器设备
        4. 主要试剂配置
        (二) 实验方法
        1. 淋巴细胞悬液的制备
        2. 脾淋巴细胞活力检测
        3. 雷公藤及雷公藤配伍益母草对脾淋巴细胞体外增殖影响(MTT法)
        4. 计算公式及数据分析
    二、结果
    三、小结
第三部分 雷公藤配伍益母草对类风湿性关节炎大鼠的影响
    一、材料与方法
        (一) 实验材料
        1. 实验动物
        2. 主要实验试剂
        3. 主要仪器设备
        4. 主要试剂配置
        (二) 实验方法
        1. 动物分组
        2. 制作佐剂性关节炎大鼠模型
        3. 剂量设计
        4. 给药方法
        5. 观察指标及检测方法
        6. 统计分析
    二、结果
        (一) 雷公藤配伍益母草对大鼠体重增重率的影响
        (二) 雷公藤配伍益母草对大鼠足跖容积肿胀率的影响
        (三) 雷公藤配伍益母草对大鼠脏器指数的影响
        (四) 雷公藤配伍益母草对大鼠血清性激素的影响
        (五) 雷公藤配伍益母草引起大鼠卵巢组织、踝关节、子宫的病理变化
        (六) 雷公藤配伍益母草对大鼠卵巢组织细胞凋亡的影响
        (七) 雷公藤配伍益母草对大鼠子宫组织中p450arom蛋白表达的影响
    三、小结
第四部分 分析与讨论
    一、雷公藤治疗RA的疗效及不良反应的观察
    二、雷公藤配伍益母草的减毒增效观察及机制探讨
    三、中医学对配伍减毒的认识
结论
参考文献
附图
致谢
文献综述 雷公藤药理作用的研究进展
    参考文献

(5)基于网络药理学探讨清热凉血方活性成分经PI3K/AKT/GLUT1通路干预银屑病的作用(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
符号说明
第一部分 文献综述
    综述一 网络药理学在银屑病中的研究进展
        1. 现代医学对银屑病的认识
        2. 中医对银屑病的认识
        3. 网络药理学概念及应用
        4. 网络药理学在银屑病中的应用
        5. 展望
        参考文献
    综述二 T细胞代谢在常见疾病中的研究进展
        1. 基本的T细胞代谢
        2. T细胞的代谢调节因子
        3. 代谢基质
        4. T细胞代谢的其他调节途径
        5. T细胞代谢异常在常见疾病中的研究进展
        6. 展望
        参考文献
    综述三 葡萄糖转运蛋白1的研究进展
        1. GLUT1的定义及功能
        2. GLUT1参与多种疾病进展
        3. 多种小分子能调节GLUT1的表达
        4. GLUT1作为载药靶点具有良好的前景
        5. 展望
        参考文献
前言
第二部分 实验研究
    研究一 基于网络药理学的清热凉血方活性成分及干预银屑病的机制研究
        1. 材料与方法
        2. 结果
        3. 讨论
        4. 小结
        参考文献
    研究二 血热型寻常型银屑病患者GLUT1蛋白表达水平
        1. 材料
        2. 方法
        3. 结果
        4. 讨论
        5. 小结
        参考文献
    研究三 槲皮素对咪喹莫特银屑病模型小鼠的作用
        1. 材料
        2. 方法
        3. 结果
        4. 讨论
        5. 小结
        参考文献
    研究四 槲皮素对HaCaT细胞PI3K/AKT/GLUT1信号通路的机制研究
        1. 材料
        2. 方法
        3. 结果
        4. 讨论
        5. 小结
    参考文献
结语
致谢
附录
在学期间主要研究成果
个人简历

(6)基于肿瘤相关巨噬细胞的极化探讨雷公藤内酯醇对耐顺铂上皮性卵巢癌抑制机制的研究(论文提纲范文)

摘要
abstract
英文缩略词
第1章 引言
第2章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 裸鼠
        2.1.3 实验用药
        2.1.4 主要试剂
        2.1.5 主要仪器及耗材
        2.1.6 主要实验试剂配置方法
    2.2 研究方法及内容
        一、体外实验
        2.2.1 TAMs体外模型建立
        2.2.2 A2780/DDP细胞体外实验
        二、体内实验
        2.2.3 建立异种移植瘤的模型
    2.3 统计分析
第3章 结果
    一、体外实验
        3.1 TAMs体外模型建立
        3.1.1 THP-1 细胞培养
        3.1.2 佛波酯诱导THP-1 细胞结果
        3.1.3 ELISA法检测
        3.2 A2780/DDP细胞生长曲线
        3.3 EdU细胞增殖检测
        3.4细胞划痕实验
        3.5细胞粘附实验
        3.6 Transwell实验
        3.7 CCK-8 实验
    二、体内成瘤实验
        3.8 裸鼠移植瘤体积和重量
        3.9 TUNEL法染色检测肿瘤细胞凋亡
        3.10 HE染色
        3.11 免疫组化检测各组裸鼠中移植瘤组织中CD16/32和CD206 的表达
        3.11.1 各组移植瘤组织中CD16/32 蛋白表达情况
        3.11.2 各组移植瘤组织中CD206 蛋白表达情况
        3.12 Western-blot检测各组不同蛋白的表达差异
        3.13 TP对裸鼠外周血清IL-10和IL-12 的影响
第4章 讨论
    4.1 M1及M2 巨噬细胞的诱导
    4.2 TP对 A2780/DDP细胞的抑制作用
        4.2.1 实验中TP浓度的选择
        4.2.2 TP对 A2780/DDP的抑制增殖及侵袭转移能力的作用
    4.3 TP通过对M2 巨噬细胞极化的抑制而发挥对卵巢癌抗癌作用
    4.4 TP对肿瘤血管生成及基质金属蛋白的影响
    4.5 PI3K/AKT/NF-κB信号通路在TP抗癌中的作用
    4.6 TP在 DDP对卵巢癌的抗癌中具有增敏作用
第5章 结论和展望
    5.1 结论
    5.2 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果
综述
    参考文献

(7)中药雷公藤治疗狼疮性肾炎有效性和安全性的Meta分析(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
英文缩略词
前言
第一部分
    1 资料与方法
        1.1 检索策略
        1.2 纳入标准
        1.3 排除标准
        1.4 结局指标
        1.5 研究文献筛选、数据提取及分析
        1.6 质量评估
    2 结果
        2.1 检索结果及纳入文献情况
        2.2 发表偏倚分析
        2.3 各结局指标分析
    3 讨论
第二部分
    1 LN的诊治进展
    2 雷公藤的药理毒理作用及合理应用
    3 中医药循证医学的发展
讨论
结语
参考文献
附录
    附录 1 文献综述
        参考文献
    附录 2 Cochrane 风险偏倚评估工具
    附录 3 在校期间发表论文情况
致谢

(8)羊踯躅根及其单体—闹羊花毒素Ⅱ对阿霉素肾病小鼠的治疗作用及其机制(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
引言
第一部分 羊踯躅根提取物对阿霉素肾病小鼠的治疗作用
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
第二部分 闹羊花毒素II对阿霉素肾病小鼠的治疗作用及其机制研究
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
全文小结
参考文献
综述 传统中药在慢性肾脏病中的研究进展
    参考文献
英文缩略词表
攻读学位期间发表文章
致谢

(9)雷公藤甲素对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用及机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
前言
第一部分 雷公藤甲素对MRL/Lpr狼疮小鼠疾病的疗效观察
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
第二部分 雷公藤甲素对MRL/lpr小鼠中Treg细胞的效应研究
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
第三部分 雷公藤甲素对Treg细胞调节因子mi R-125a-5p的调控研究
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
全文总结
参考文献
文献综述 调节性T细胞、滤泡辅助性T细胞、滤泡调节性T细胞与自身免疫性疾病
    参考文献
附录 :英文缩略词表
博士期间取得的学术成果
致谢

(10)组蛋白H3K27me3调控强直性脊柱炎Th17分化偏移及中药干预机制(论文提纲范文)

摘要
Abstract
英文缩略词
第一部分 文献综述 Th17分化调节机制及其在强直性脊柱炎中的研究进展
    1. Th17细胞的分化及功能
    2. Th17细胞分化的调节机制
    3. Th17细胞分化在强直性脊柱炎中的研究进展
    4. 小结与展望
    参考文献
第二部分 理论研究 浅谈清热利湿活血法治疗强直性脊柱炎
    1 湿热瘀阻证是强直性脊柱炎的常见证候
    2 清热利湿活血法是强直性脊柱炎的基本治法
    3 小结
    参考文献
第三部分 临床与实验研究
    前言
    研究一 AS患者Th17分化状况及组蛋白H3K27me3表达水平的研究
        1. 资料与方法
        1.1 研究对象
        1.2 诊断标准
        1.3 纳入标准
        1.4 排除标准
        2. 实验方法
        2.1 BASDAI评分及炎症指标CRP、ESR的检测
        2.2 ELISA法检测血清IL-17水平
        2.3 外周血单个核细胞(PBMC)分离
        2.4 Western Blotting检测RORc、JAK2/STAT3通路信号分子及H3K27me3蛋白表达
        2.5 实时荧光定量PCR检测RORc、JAK2/STAT3通路信号分子mRNA表达
        2.6 统计学分析方法
        3. 实验结果
        3.1 疾病活动指数BASDAI及炎症指标CRP、ESR情况
        3.2 血清IL-17表达情况
        3.3 Th17分化关键信号通路JAK2/STAT3各级信号分子表达及活化情况
        3.4 Th17特征性转录因子RORc表达状况
        3.5 组蛋白H3K27me3表达情况
        3.6 相关性分析
        4. 讨论
        4.1 IL-17是AS炎症发生的主要效应因子
        4.2 Th17分化异常是触发AS炎症的关键
        4.3 组蛋白H3K27me3参与调控Th17分化
        5. 结论
    研究二 组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2调控H3K27me3水平影响Th17分化的研究
        1. 实验材料
        2. 实验方法
        2.1 实验分组
        2.2 外周血单个核细胞(PBMC)分离
        2.3 Western Blotting检测JMJD3、EZH2蛋白表达
        2.4 实时荧光定量PCR检测JMJD3、EZH2 mRNA表达情况
        2.5 统计学分析方法
        3. 实验结果
        3.1 组蛋白去甲基化酶JMJD3表达情况
        3.2 组蛋白甲基转移酶EZH2表达情况
        3.3 相关性分析
        4. 讨论
        4.1 组蛋白去甲基化酶JMJD3促进AS患者Th17异常分化
        4.2 组蛋白甲基转移酶EZH2抑制AS患者Th17分化偏移
        5. 结论
    研究三 清热利湿活血法对H3K27me3水平及Th17分化的影响
        1. 实验材料
        2. 实验方法
        2.1 研究对象
        2.2 治疗方案
        2.3 ELISA法检测中药治疗前后IL-17表达
        2.4 清热利湿活血法对H3K27me3表达及Th17分化状况的影响
        2.5 统计学分析方法
        3. 实验结果
        3.1 清热利湿活血法治疗前后ESR、CRP及BASDAI变化情况
        3.2 清热利湿活血法治疗前后血清IL-17水平变化情况
        3.3 清热利湿活血法治疗前后H3K27me3表达水平的变化
        3.4 清热利湿活血法治疗前后RORc表达水平的变化
        4. 讨论
        4.1 清热利湿活血是AS的重要治法
        4.2 清热利湿活血法可有效抑制Th17分化
        4.3 清热利湿活血法可有效上调组蛋白H3K27me3水平
        5. 结论
    研究四 清热利湿活血法对组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达的影响
        1. 实验材料
        2. 实验方法
        2.1 研究对象
        2.2 治疗方案
        2.3 清热利湿活血法对JMJD3、EZH2表达的影响
        2.4 统计学分析方法
        3. 实验结果
        3.1 清热利湿活血法治疗前后JMJD3表达水平的变化
        3.2 清热利湿活血法治疗前后EZH2表达水平的变化
        4. 讨论
        5. 结论
    研究五 中药单体雷公藤甲素对H3K27me3水平及Th17分化的影响
        1. 实验材料
        2. 实验方法
        2.1 实验分组
        2.2 CCK-8法检测细胞增殖毒性
        2.3 ELISA法检测细胞因子IL-17表达
        2.4 雷公藤甲素对H3K27me3表达及Th17分化状况的干预作用
        2.5 统计学分析方法
        3. 实验结果
        3.1 雷公藤甲素、GSK-J4体外实验量效学研究
        3.2 雷公藤甲素对H3K27me3表达水平的影响
        3.3 雷公藤甲素对JAK2/STAT3通路各级信号分子表达的影响
        3.4 雷公藤甲素对RORc表达的影响
        4. 讨论
        4.1 雷公藤治疗AS的临床研究及其有效成分雷公藤甲素的现代药理学研究
        4.2 中药单体雷公藤甲素对AS患者H3K27me3表达及Th17分化的干预作用
        5. 结论
    研究六中药单体雷公藤甲素对组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达的影响
        1. 实验材料
        2. 实验方法
        2.1 实验分组
        2.2 Western Blotting检测蛋白表达情况
        2.3 实时定量PCR检测mRNA表达情况
        2.4 统计学分析方法
        3. 实验结果
        3.1 雷公藤甲素对JMJD3、EZH2蛋白表达水平的影响
        3.2 雷公藤甲素对JMJD3、EZH2 mRNA表达水平的影响
        4. 讨论
        5. 结论
论文总结
    1. 研究小结
    2. 课题意义及创新点
    3. 问题与展望
参考文献
致谢
个人简历

四、雷公藤免疫调节的体外研究(论文参考文献)

  • [1]雷公藤多甙作用机理及皮肤科应用[J]. 白彦萍,刘文静,杨皓瑜,张维明. 皮肤科学通报, 2021(04)
  • [2]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
  • [3]基于表观遗传学的野菊花抗乙肝病毒活性部位作用机制研究[D]. 王云雨. 郑州大学, 2020(02)
  • [4]雷公藤配伍益母草治疗类风湿性关节炎实验研究[D]. 杜星海. 浙江中医药大学, 2020(02)
  • [5]基于网络药理学探讨清热凉血方活性成分经PI3K/AKT/GLUT1通路干预银屑病的作用[D]. 马杰. 北京中医药大学, 2020(04)
  • [6]基于肿瘤相关巨噬细胞的极化探讨雷公藤内酯醇对耐顺铂上皮性卵巢癌抑制机制的研究[D]. 胡辉. 南昌大学, 2020(08)
  • [7]中药雷公藤治疗狼疮性肾炎有效性和安全性的Meta分析[D]. 吕洋. 湖北中医药大学, 2020(12)
  • [8]羊踯躅根及其单体—闹羊花毒素Ⅱ对阿霉素肾病小鼠的治疗作用及其机制[D]. 邱月. 华中科技大学, 2020(01)
  • [9]雷公藤甲素对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用及机制研究[D]. 赵遐. 南京医科大学, 2019(04)
  • [10]组蛋白H3K27me3调控强直性脊柱炎Th17分化偏移及中药干预机制[D]. 赵哲. 中国中医科学院, 2019(01)

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雷公藤免疫调节的体外研究
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