一、一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP（论文文献综述）
钱昱,丁晓雨,刘志强,袁增强[1]（2021）在《基因修饰人多能干细胞的高效单克隆建系方法》文中指出目标:提供一种能够显着提高慢病毒稳定转染人多能干细胞的方法,并建立一种简便无损的转染细胞筛选方法。方法:在慢病毒转染人多能干细胞过程,分别比较添加与不添加Y-27632情况下细胞形态的动态变化规律,以及细胞不同形态下对慢病毒颗粒的摄入能力差异,优化建立高效的慢病毒转染方法。随后,设计并研制可视化的简便显微操作装置,探索在荧光显微镜辅助下挑取转染的阳性单克隆细胞建系的技术,建立较为简便的转染细胞纯化新方法。结果:正常培养的人多能干细胞（hESC、hiPSC）,添加Y-27632后6 h集落形态发生明显变化,细胞呈现出明显长梭形,集落松弛,细胞表面积显着增加;去除后6 h集落恢复正常;常规培养的多能干细胞克隆,慢病毒主要倾向于进入集落外围或局部细胞;经Y-27632提前处理6 h,细胞集落松驰、表面积显着增加的多能干细胞,慢病毒能够较为均匀地感染集落外围与内部细胞,显着提高慢病毒转染效率。利用毛细玻璃管,自主设计制作了一款显微镜下可视化的细胞单集落挑选器件,在显微镜辅助下能够简便地进行阳性克隆细胞的挑选建系,从而在常规实验室即可完成,取代具有一定细胞损伤效应的嘌呤霉素筛选及需要专业设备的流式分选方法。结论:在慢病毒转染过程中,常规培养的hESC/i PSC集落较为致密,对慢病毒感染具有一定抵抗性;小分子化合物Y-27632使得hESC/i PSC克隆集落结构相对松散,表面积增加,显着提高了对慢病毒的易感性,提高了感染效率;成功设计了一种简便且对细胞无毒性的显微操作器件,在常规实验室条件下,可有效取代流式分选及药物筛选,实现细胞单克隆的挑选建系。
徐天鹏[2]（2021）在《单碱基编辑技术在鸡体细胞上编辑效率优化的初步研究》文中研究说明随着动物生物育种技术的发展,通过在动物基因组中插入外源基因或敲除内源目的基因等方式,可直接改变动物的生产性状,获得全新的种质资源。近年来出现的单碱基编辑技术,可以在不产生双链DNA断裂的情况下,实现单碱基的靶向突变,在畜禽生物育种具有重要价值。在本研究中,我们在鸡DF-1细胞上对碱基编辑效率进行优化及初步应用进行探索,为该技术在鸡上的应用奠定基础。主要研究内容及结果如下:一、单碱基编辑器在鸡体细胞中编辑活性的验证和密码子优化为验证单碱基编辑器在鸡体细胞中的基因编辑作用,本研究设计了3个sg RNA,与胞嘧啶碱基编辑器BE4max共同转染鸡DF-1细胞,收集转染阳性细胞进行基因测序。结果显示,BE4max成功使3个靶位点中的4个碱基C产生了C-T的突变,说明BE4max在鸡体细胞上具有编辑活性。为了提高BE4max在鸡体细胞上的编辑效率,本研究将BE4max中的关键元件胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）做了鸡的密码子优化,得到了碱基编辑器ch BE4max。将sg RNA与ch BE4max共同转染鸡DF-1细胞,检验基因编辑效率。结果显示,与BE4max相比,ch BE4max的编辑效率提高了6.01%～16.88%,说明ch BE4max更适合在鸡体细胞的单碱基编辑。二、抑制鸡体细胞中MBD4基因对单碱基编辑效率的影响本研究通过靶向敲低鸡尿嘧啶糖基化酶MBD4基因,探究MBD4基因对单碱基编辑效率的影响。在si RNA的干扰作用下,鸡DF-1细胞中MBD4的表达量降低了60%。然后将sg RNA与ch BE4max共同转染鸡DF-1细胞,检验MBD4被干扰后编辑效率。结果显示,与对照组相比,MBD4 si RNA处理实验组中编辑效率提高了3.26%～6.51%,说明抑制鸡体细胞中MBD4基因可以提高单碱基编辑效率。三、利用单碱基编辑引入终止子的策略敲除鸡体细胞中目的基因首先,针对外源插入细胞中的GFP基因设计2个sg RNA,分别与ch BE4max共同转染稳定表达外源GFP基因的GFP-DF-1细胞系,而后通过流式细胞仪分析GFP阴性细胞比例检验敲除效率。结果显示,GFP KO-1sg RNA处理组中,GFP敲除的效率是1.79%;GFP KO-2 sg RNA处理组中,GFP敲除的效率是5.64%,说明利用单碱基编辑引入终止子的策略可在鸡体细胞中实现对外源基因的敲除。而后,对鸡MDA5基因设计了3个敲除的sg RNA,与ch BE4max共同转染鸡DF-1细胞,分选收集阳性细胞,用鸡传染性法氏囊病毒感染细胞,检测MDA5调控的下游基因IFN-β的表达情况。结果显示,与对照组相比,MDA5敲除组DF-1细胞中IFN-β的表达下降了65%,说明利用单碱基编辑引入终止子的策略可在鸡体细胞中实现对内源基因的敲除。综上所述,本研究通过密码子优化和抑制细胞尿嘧啶DNA糖基化酶相关基因MBD4的表达,可提高胞嘧啶碱基编辑器BE4max在鸡DF-1细胞上的编辑效率;通过单碱基突变引入终止密码子的方式,实现了对鸡DF-1细胞中目的基因的敲除,研究结果为鸡基因功能研究和基因编辑鸡制备提供了重要参考。
尹良伟[3]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中进行了进一步梳理自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
李昊[4]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究表明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
张曦文[5]（2019）在《Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的机制及其在ARDS中的意义》文中指出背景弥漫性肺泡上皮损伤是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的基本病理改变,有效修复损伤肺泡上皮对治疗ARDS具有关键作用。前期实验已证实经典Wnt通路能促进外源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）在ARDS小鼠肺内分化为肺上皮细胞,其具体机制不清。细胞周期在MSC分化中发挥关键作用,p130/E2F4是调控细胞周期的重要途径,而经典Wnt通路能调节p130/E2F4。推测经典Wnt通路通过调节p130/E2F4影响MSC的细胞周期进而调控其向肺泡上皮细胞定向分化。本研究旨在探讨Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向II型肺泡上皮细胞分化的机制及高表达p130或E2F4的MSC对ARDS小鼠肺损伤修复的意义。第一部分高表达p130/E2F4调控MSC细胞周期对其多向分化潜能影响的研究目的评价高表达p130/E2F4对小鼠骨髓来源间充质干细胞（mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells,mMSCs）多项潜能的影响及相关机制探讨。方法（1）通过慢病毒方法构建高表达p130或E2F4的质粒,设立只表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的空白对照质粒,然后分别通过Lipofectamine2000与包装质粒共同转染293T细胞,之后转染mMSCs;高表达细胞株用Blasticidin进行药物筛选,挑取克隆纯化传代培养20代后,荧光显微镜下观察报告基因GFP阳性细胞,并通过流式细胞仪分析GFP阳性细胞比率,qRT-PCR和Western blot检测mMSCs的p130或E2F4基因和蛋白表达水平评估转染效率。（2）通过碘化丙锭染色及流式细胞法检测慢病毒转染后及诱导分化后mMSCs细胞周期变化。（3）体外诱导转染后细胞株成骨、成脂及成软骨分化,并通过qRT-PCR测定成骨基因OSX及Runx2、成脂基因PPAR-γ及C/EBPα、成软骨基因Sox9及Co12α1 mRNA表达水平,同时Western bolt检测相应蛋白表达,评估基因转染对mMSCs成骨、成脂及成软骨分化的作用。（4）CCK-8法评估基因转染对mMSCs增殖的作用。（5）划痕实验及Transwell小室迁移实验评估基因转染对mMSCs的迁移能力的作用。结果（1）慢病毒介导的高表达p130或E2F4基因转染mMSCs,传代培养20代后,转染效率仍高达80.3～84.4%;与正常对照组（MSC-NC组）细胞相比,高表达p130的mMSCs（MSC-p130组）或高表达E2F4的mMSCs（MSC-E2F4组）p130或E2F4mRNA和蛋白水平均显着增加（P<0.0001）。（2）诱导分化前,MSC组、MSC-NC组、MSC-p130组和MSC-E2F4组细胞周期无明显差异（P>0.05）;成骨及成脂诱导分化后,MSC-p130组及MSC-E2F4组细胞G1期较MSC-NC组细胞明显延长（P<0.05）,但成软骨诱导分化后,MSC-p130及MSC-E2F4组细胞G1期较MSC-NC组细胞明显缩短（P<0.05）。（3）与MSC-NC组相比,MSC-p130组及MSC-E2F4组成骨分化明显增加,而成脂分化及成软骨分化明显受到抑制。（4）通过比较各组细胞的增殖曲线发现,第1d至第7d,与MSC-NC组相比,MSC-p130组及MSC-E2F4组细胞的增殖能力无明显变化（P>0.05）。（5）划痕后12h,MSC-p130组和MSC-EF24组划痕宽度较MSC-NC组明显缩小（P<0.05）,而Transwell迁移实验也观察到,与MSC-NC组相比,MSC-p130和MSC-E2F4组细胞迁移明显增多（P<0.05）。结论慢病毒载体介导的p130或E2F4基因高表达转染mMSCs长期、稳定且高效,并可进一步增加mMSCs在体外成骨分化,抑制成脂、成软骨分化。这种高表达p130或E2F4对mMSCs多项潜能的影响与调控细胞周期G1期相关。第二部分Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控MSC体外分化为II型肺泡上皮细胞的机制研究目的明确Wnt/β-Catenin-p130/E2F4对mMSCs向II型肺泡上皮细胞（type Ⅱalveolar epithelial cells,AT Ⅱ）分化的作用及其相关机制。方法（1）在小鼠肺上皮细胞系-12（murinelungepithelial-12,MLE-12）共培养结合小气道上皮培养基体外诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT Ⅱ后7d、14d,免疫荧光检测AT Ⅱ特异性标志物肺表面活性蛋白C（surfactant protein C,SP-C）蛋白表达情况以及透射电镜下观察AT Ⅱ细胞特征性细胞器板层小体形成情况;并提取mMSCs蛋白,Westemblot法检测SP-C蛋白表达;（2）在MLE-12细胞共培养结合SAGM体外诱导mMSCs分化为AT Ⅱ的基础上,分别加入经典Wnt信号通路激活剂氯化锂（LiCl）或抑制剂Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf-related protein 1,DKK-1）调节mMSCs的经典Wnt信号,诱导分化后提取mMSCs的蛋白,Westernblot法检测SP-C、p130及E2F4蛋白表达;（3）在MLE-12细胞共培养结合SAGM体外诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT II的基础上,加入DKK-1抑制经典Wnt信号通路,诱导分化后7d、14d,Western blot法检测SP-C蛋白表达;（4）在共培养诱导分化体系诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT II后7d、14d,流式细胞法检测各组mMSCs细胞周期的变化;同时,在共培养诱导分化体系诱导mMSCs分化为AT II的基础上,分别加入LiCl或DKK-1,7d及14d后分别检测各组mMSCs细胞周期的变化。结果（1）在共培养诱导分化模型下,高表达p130或E2F4能促进mMSCs向AT Ⅱ分化:在诱导分化后7d、14d,与Control组相比,MSC-p130和MSC-E2F4组SP-C蛋白明显增高（P<0.05）;与此同时,荧光显微镜下发现MSC-p130组和MSC-E2F4组SP-C阳性细胞（红色）及DAPI和SP-C双阳性（蓝色与红色融合）数量明显高于Control组;用电镜进一步观察细胞超微结构,与Control组相比,MSC-p130组和MSC-E2F4组诱导分化后的mMSCs胞浆及包膜附近中可见较多的细胞空泡结构,并可见更多的板层小体。（2）在共培养诱导分化模型下,调控经典Wnt信号通路可影响mMSCs向II型肺泡上皮细胞分化:与Control组相比,LiCl活化经典Wnt途径能促进诱导分化后7d及14d SP-C表达上调（P<0.05）,而DKK-1抑制该通路后,SP-C的表达较Control组明显减少（P<0.05）。（3）体外诱导分化过程中,调控经典Wnt信号通路可影响mMSCs中p130/E2F4蛋白表达:诱导分化后7d、14d,与Control组相比,LiCl活化经典Wnt途径能促进p-p130、p130及E2F4 表达（P<0.05）,而DKK-1 抑制该通路后,p-p130、p130及E2F4的表达较Control组明显降低（P<0.05）。（4）在体外诱导分化过程中,抑制经典Wnt信号通路可影响高表达E2F4的mMSCs向AT II分化,而不能影响高表达p130的mMSCs向ATII分化:在诱导分化后7d、14d,与DKK-1+MSC-NC组相比,DKK-1+MSC-p130组细胞中SP-C表达明显增高（P<0.05）,而DKK-1+MSC-E2F4组细胞中SP-C表达无明显变化（P>0.05）。（5）在体外诱导分化过程中,高表达p130或E2F4促进mMSCs向AT II分化可能与G1期延长相关:在诱导分化后7d、14d,MSC-p130组细胞G1期比例明显高于Control组细胞G1期比例（P<0.0001）,而MSC-p130组细胞S期比例较Control组明显下降、G2/M期比例明显增加（P<0.0001）;并且,与Control组相比,MSC-E2F4组细胞G1期、G2/M期比例亦明显增加（P<0.0001）,S期细胞比例明显减少（P<0.0001）。（6）体外诱导分化过程中,调控经典Wnt信号通路影响mMSCs向AT II分化可能与G1+S期的变化相关:在诱导分化后7d,LiCl组细胞G2/M期比例明显低于Control组细胞（P<0.0001）,而DKK-1组细胞G2/M期比例较Control组明显升高（P<0.0001）;诱导分化后14d,与Control组相比,LiCl组细胞G2/M期比例明显减少（P<0.0001）,DKK-1组细胞G2/M期比例明显增加（P<0.0001）。结论经典Wnt信号通路可调控p130或E2F4表达影响mMSCs向II型肺泡上皮细胞分化,其机制与延长mMSCs的G1期相关。第三部分高表达p130/E2F4的MSC移植对ARDS小鼠II型肺泡上皮细胞损伤修复作用的研究目的明确高表达P130/E2F4的mMSCs在ARDS小鼠的肺组织迁移存留及向AT II分化的作用,以及其对修复ARDS小鼠肺损伤的影响。方法C57BL/6小鼠随机分为Control组（正常对照组）,ARDS组（LPS造模组）,LPS+MSC组（mMSCs细胞治疗组）,LPS+MSC-NC组（MSC-NC细胞治疗组）,LPS+MSC-p130组（MSC-p130细胞治疗组）和LPS+MSC-E2F4组（MSC-E2F4细胞治疗组）,气道内滴入LPS诱导ARDS小鼠动物模型,按分组经不同治疗后7d及14d分别行以下处理:（1）处死小鼠留取肺组织,HE染色行组织病理学检查和肺损伤评分评价肺损伤程度;（2）记录各组小鼠生存只数评价14d病死率（3）近红外成像追踪离体肺中NIR815标记的mMSCs以及免疫荧光染色评价mMSCs在肺组织中的存留;（4）免疫荧光染色共定位肺SP-C及Western blot检测肺组织中表面活性蛋白A（surfactant protein A,SP-A）、SP-C表达水平评价mMSCs在肺组织中向ATII细胞分化;（5）计算肺湿重/体重比（LWW/BW）评价肺水肿程度;（6）留取肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,ELISA法检测总蛋白（totalprotein,TP）和白蛋白（albumin,ALB）水平评价肺上皮通透性;（7）Western blot检测肺组织中occludin表达水平评价mMSCs对肺上皮细胞紧密连接的修复作用;（8）利用5%BSA的PBS行BAL,测定BALF中蛋白的吸光度,计算肺泡液体清除率（alveolar fluid clearance,AFC）;（9）Masson染（?）结果（1）高表达p130或E2F4能促进mMSCs减轻ARDS小鼠肺组织病理损伤。大体病理结果显示,LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC组与LPS+MSC-NC组小鼠肺损伤无明显差异,但较ARDS组小鼠肺损伤（充血、水肿及出血点）显着减轻,LPS+MSC-p130和LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组小鼠肺损伤程度减轻更明显;组织病理结果显示,LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC组和LPS+MSC-NC组小鼠肺组织病理损伤程度（水肿、出血、炎性细胞浸润）较ARDS组显着减轻,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组小鼠肺组织病理损伤程度减轻更明显;肺组织病理损伤评分结果显示,LPS+MSC和LPS+MSC-NC组7d、14d小鼠肺组织病理损伤评分较ARDS组明显减轻（P<0.05）,而与LPS+MSC-NC组相比,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织病理损伤评分显着降低（P<0.05）。（2）LPS诱导复制ARDS小鼠模型后14d,ARDS组病死率为55.6%,LPS+MSC和LPS+MSC-NC组病死率分别为41.2%、35.3%,较ARDS组无明显差异（P>0.05）,但有下降趋势,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组病死率较LPS+MSC-NC组无显着差异（P>0.05）,但有更进一步下降趋势。（3）高表达p130或E2F4增加mMSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺组织的存留。LPS诱导后7d和14d进行小鼠离体肺的近红外成像,经过颜色编码的荧光图像分析发现,7d时LPS+MSC-p130组及LPS+MSC-E2F4组小鼠离体肺荧光数量明显高于LPS+MSC-NC组（P<0.05）;14d时LPS+MSC-p130组及LPS+MSC-E2F4组小鼠离体肺荧光数量较LPS+MSC-NC组有增加趋势,但四个实验组之间荧光数量无统计学差异（P>0.05）。LPS诱导后7d和14d对小鼠肺组织进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察发现,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织内GFP阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-NC组。（4）高表达p130或E2F4促进mMSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺内向AT II分化。LPS诱导后7d和14d,取小鼠肺组织进行免疫荧光染色,荧光显微镜下发现LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织内GFP和SP-C双染阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-NC组;Western blot法检测发现LPS+MSC和LPS+MSC-NC组肺组织SP-A、SP-C蛋白明显高于ARDS组（P<0.05）,而LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组SP-A、SP-C蛋白表达明显高于LPS+MSC-NC组（P<0.05）。（5）高表达p130或E2F4的mMSCs改善LPS诱导的ARDS小鼠肺通透性。LPS诱导复制ARDS小鼠模型后 14d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4 组LWW/BW较LPS+MSC-NC组显着降低（P<0.05）,BALF中TP和ALB浓度也较LPS+MSC-NC组明显降低（P<0.05）;LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织中occludin蛋白的表达较LPS+MSC-NC组显着增加（P<0.05）;LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠AFC较LPS+MSC-NC组有增加趋势,但无明显差异（P>0.05）;至14d时,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠AFC较LPS+MSC-NC组显着增高（P<0.05）。（6）高表达p130或E2F4的mMSCs可减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺纤维化。LPS诱导后14d小鼠肺纤维化评分LPS+MSC-p130组与LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组明显降低（P<0.05）。结论高表达p130或E2F4能增加mMSCs在ARDS小鼠肺组织存留,并通过促进mMSCs向AT Ⅱ分化,从而改善肺上皮通透性、减轻肺水肿程度并增强mMSCs改善肺纤维化的作用,更进一步促进mMSCs修复ARDS肺损伤。
周诺[6]（2012）在《PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究》文中进行了进一步梳理目的牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）技术是利用骨痂的愈合机理产生新骨,是一种内源性的骨组织工程学技术。自其开始应用于颅颌面领域以来,大量基础和临床研究逐渐开展,随着基础研究的深入以及该技术的改进和成熟,牵张成骨在颌面部整形、肿瘤的术后重建以及牙槽种植修复等方面展现出了广阔的应用前景,成为口腔颌面外科领域的研究热点。虽然DO有许多传统手术不可比拟的优势,已被广泛地应用于各种颅颌面的畸形以及四肢短小畸形的矫治,但其较长的牵张和固定时间,限制了其在临床上的广泛应用。因此如何提高DO的新骨形成的速度,缩短其固定时间,减少其并发症的发生和保证新骨形成质量,正成为目前该领域的研究热点。本课题利用hBMP-2作为促进因子,将基因工程和组织工程的技术结合起来,先把hBMP-2转染入兔BMSCs,构建稳定表达hBMP-2的BMSCs,再与组织工程支架材料Pluronic F-127复合,注射入牵张区内,使hBMP-2能在牵张区内稳定持续地起作用,拟让其能促进兔下颌骨的牵张成骨新骨生成。从组织学水平、蛋白水平、基因水平观察和检测牵张间隙内新骨的形成以及改建的情况,为牵张成骨技术在治疗各种颌面部畸形或骨缺损等疾患上的广泛应用奠定基础。方法1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化:取成年健康新西兰大白兔,穿刺双侧胫骨抽取骨髓,通过密度梯度离心法收集细胞后培养,原代培养8-10d后传代培养,按照1:3传代,每3-4天可传代1次,传到第3代时用地塞米松,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸配制而成的成骨诱导分化液进行成骨诱导14至21天,并分别用茜素红染色,ELISA以及免疫组化的方法检测其矿化结节的形成和ALP、BGP的表达。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs:取第3代BMSCs,用脂质体介导携带hBMP-2基因的pcDNA3.1质粒转染入BMSCs中,观察GFP表达的情况,MTT法检测转染后细胞的增殖和生长的能力,通过RT-PCR检测瞬时转染后hBMP-2 mRNA的表达。转染后再用G418筛选2周,筛选出稳定转染的阳性细胞,收集备用。将经过筛选后的BMSCs培养4周后,对其进行BMP-2的免疫组织化学以及Western Blot检测。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养:利用Pluronic F-127低温下为水溶液,室温可凝固的特点,冰浴中制备凝胶并消毒后与转染hBMP-2的BMSCs复合,调整细胞浓度,使细胞浓度达到2.5×107个/ml,MTT法检测Pluronic F-127的细胞毒性。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型的建立:取成年健康新西兰大白兔6只,依据其下颌骨的解剖结构设计牵张器。利用传统单线骨皮质切开的术式,在右侧下颌骨第二和三磨牙间行骨切开术,固定牵张器。术后潜伏期为5天,第6天开始牵张,每天牵张2次,每次0.5mm,共牵张7mm,随后固定。于牵张固定2周、6周后分别摄X线片以观察新生骨愈合以及改建情况。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究:取健康新西兰白兔48只随机分为4组,每组12只,于固定期第2天进行干预。实验分组:A组:牵张间隙内注射200 u 1 hBMP-2基因修饰的BMSCs/Pluronic F-127凝胶复合物;B组:注射200μ1 hBMP-2基因修饰的BMSCs液;C组:注射200μ1 BMSCs液;D组:注射200μ1生理盐水。分别于牵张结束固定2w、6w各组处死动物6只,通过大体病理、摄X线片、扫面电镜、HE染色组织切片、免疫组化等手段检测新骨形成和改建情况。结果1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化结果:BMSCs培养8-10d后即可长满瓶底,并可传代,传代后细胞生长状态良好,可一直维持BMSCs的典型形态以及生长状态,细胞呈现长梭形形状,旋涡式的排列并可成功向成骨方向诱导。其中钙结节茜素红染色见阳性结节染色。ALP含量逐渐升高,并在2周后达到最高,与未诱导组有显着差异（p<0.05）。BGP免疫组化也呈阳性染色。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的结果:利用脂质体介导携带hBMP-2的pcDNA3.1质粒成功转染BMSCs,转染效率约30%;转染24h能观察到弱荧光表达,48h后荧光强度增强;MTT法显示转染后的BMSCs生长增殖能力无明显变化;RT-PCR也检测到了hBMP-2 mRNA的表达。用G418成功筛选出稳定转染的细胞,该细胞培养4周可用免疫组织化学以及Western Blot方法检测到BMP-2蛋白地稳定表达。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的结果:Pluronic F-127在4℃时为水溶液,37℃下为凝胶状,其与转染hBMP-2基因的BMSCs复合后,MTT检测结果见复合物中的BMSCs生长增殖能力无明显变化（p>0.05）。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的结果:所有的实验动物都成功地完成了手术,术区与口内无穿通,无感染,并能顺利牵张。实验动物全部存活至预定时间,体重皆有不同程度地增加。从手术至取材,应用于体内的牵张器均固位良好,无断裂以及脱钉现象。X线片见新骨形成在时间段有明显变化,符合临床上牵张成骨的成骨规律。动物模型构建成功。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究结果:通过大体病理、X线、扫描电镜和HE染色组织切片观察,新骨形成质量由高到低排列为:A组>B组>C组=D组;通过免疫组化观察并经过灰度值统计软件分析,在固定期第2周和6周A组牵张区骨质量明显高于B组（p<0.05）,B组牵张区骨质量明显高于C组与D组（p<0.05）,在各期C、D两组间无明显差异（p>0.05）。结论1.密度梯度离心法简便、易行,可大量扩增、纯化兔骨髓间充质干细胞,所获细胞经过诱导后可向成骨细胞分化。2.通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因导入BMSCs,并使其获得基因及蛋白的表达。3.组织工程支架材料Pluronic F-127具有低温下为水溶液,室温可凝固的特点,细胞相容性良好。4.兔子不仅性情温顺,饲养方便,对手术耐受性好,易于操作,而且术后愈合效果好,是一个稳定可靠的实验模型动物,可适合较大样本的实验研究。5.hBMP-2基因修饰BMSCs复合可注射骨组织工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成,为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供了一定的理论依据以及技术参考。
杜珊[7]（2011）在《山羊乳腺上皮细胞转人β防御素3基因的研究》文中指出近年来体细胞核移植技术已被广泛应用于转基因动物的研究。其中,乳腺上皮细胞是乳腺生物反应器的靶细胞,外源重组基因经翻译修饰可在乳腺上皮细胞中合成具有生物活性的外源蛋白,因而乳腺上皮细胞是检测乳腺特异性表达载体表达能力的一条有效途径。本研究针对人β防御素3基因（humanβ-defension-3, hβD3）乳腺特异性表达载体转染山羊乳腺上皮细胞的关键环节进行了系统研究。原代分离、培养了山羊乳腺上皮细胞,运用pEGFP-C1载体通过不同的转染方法转染山羊乳腺上皮细胞,筛选出乳腺上皮细胞的适宜转染条件,采用适宜转染条件进行人β-防御素-3基因的转染,经G418筛选后得到稳定转染hβD3基因的乳腺上皮细胞,并利用PCR, Southern blot和Western blot技术鉴定目的基因在细胞中的整合及表达。结果如下:1.采集泌乳期健康奶山羊乳腺组织四组,通过组织块贴壁倒置培养法分离山羊乳腺上皮细胞,原代培养的山羊乳腺上皮细胞中混杂有大量的成纤维细胞,试验通过细胞刮除,以及依据上皮细胞与成纤维细胞对消化酶敏感性不同的特性,用含0.25%胰蛋白酶/0.04%EDTA的细胞消化液在38℃条件下,利用选择性酶消化分离法进行乳腺上皮细胞的分离纯化,最终得到两组较纯的乳腺上皮细胞。2.分离纯化所得细胞呈现鹅卵石样,是典型的上皮细胞特征。试验通过对细胞生长曲线测定,以及运用免疫组织化学方法对细胞进行角蛋白18表达鉴定,结果显示细胞生长曲线类似于“S”形,符合细胞生长的生物学规律,且分离培养的乳腺上皮细胞角蛋白18表达呈阳性。可以进行进一步基因转染条件筛选。3.分别比较了在不同DNA含量（2, 4, 8, 10, 12 ug）、不同孵育时间（2, 4, 6, 10 h）以及不同遗传背景细胞（GMEC3, GMEC4）的不同代数（第1代、第3代、第5代、第9代）条件下,脂质体介导的外源基因转染效率。同时对比了不同电压（120 , 140 , 160, 180, 200 V）、不同电击时长（5, 10, 15, 20 ms）以及两株细胞（GMEC3, GMEC4）的不同代数（第1代、第3代、第5代、第9代）的条件下的外源基因电转染效率,两组实验结果均显示不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显着高于传代细胞,其中乳腺上皮细胞在电压180 V、电击时长15 ms、电击一次条件下的电转染效率最高。4.利用试验所筛选的优化条件,对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选后,获得稳定表达EGFP基因的单克隆细胞,对获得的单克隆阳性细胞进行扩增培养。并使用PCR, southern blot方法鉴定乳腺上皮细胞阳性细胞株中外源基因的整合,用western blot方法鉴定乳腺上皮细胞阳性细胞株体外诱导表达产物中人β-防御素3蛋白的表达。结果表明,运用优化条件进行外源基因电转染、筛选和扩增后获得稳定整合人β-防御素3基因且表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。
丰秀静[8]（2010）在《人α-乳白蛋白转基因载体的构建及其奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立》文中指出α-乳白蛋白（alpha lactalbumin,α-LA）是乳清蛋白中结合钙离子的主要蛋白,能提高免疫力,具有抗癌、抗微生物的功效。其所含丰富的必需氨基酸和支链氨基酸有助于促进婴儿的神经发育,已在婴儿配方食品中得到广泛应用,同时还是产乳的一个重要调节因子。人乳中α-乳白蛋白含量较高,约为4.8g/L。奶山羊是小型反刍家畜,妊娠周期短,山羊奶乳蛋白、乳脂含量高,但α-乳白蛋白含量很少。通过转基因技术在山羊乳腺中表达人α-乳白蛋白,实现羊奶人乳化,可以提高羊奶的品质,并可能提高羊奶产量。而转基因载体的构建是外源基因在乳腺中高效表达的关键技术之一。已有研究表明,以β-乳球蛋白为启动子实现了外源目的基因高效表达,复合启动子也可提高表达效率。同时,基因打靶因为可以克服随机整合的“位置效应”引起的转基因沉默,实现高效表达而成为研究的热点。因此,本研究克隆了人α-乳白蛋白第1至4外元（含内元）及部分3’调控基因组序列,将其作为目的基因,构建了不同启动子的双标记转基因载体,经过乳腺上皮细胞的表达验证其有效性后,转染奶山羊胎儿成纤维细胞（Goat fetal fibroblast cells,gFFCs）,筛选得到了随机整合的转基因细胞株。在此基础上,又构建了含TK基因负筛选标记的打靶载体,转染gFFCs,筛选得到了定点整合的转基因细胞株,为制备定点修饰的转基因克隆羊提供了供核细胞。主要实验内容包括如下四部分:第一部分:人α-乳白蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及在乳腺上皮细胞中的表达以5.5kb的山羊βLG调控序列为启动子,hα-LA第1至4外元（含内元）及部分3’调控基因组序列为目的基因,Neo-IRES-EGFP共表达序列作为筛选标记基因,且在筛选标记两端含有两个同向的Loxp位点,1.7kb 3’βLG作为3’调控序列,依次进行表达元件、表达盒的拼接,构建成全长15.9kb的表达载体5A。在载体5A的基础上,βLG启动子后插入CMV增强子,构建成16.6kb的βLG/CMV复合启动子表达载体B9。通过酶切、PCR、测序验证了表达载体的正确性。脂质体转染法将线性化的5A、B9转染山羊乳腺上皮细胞,经G418抗性筛选9d左右,结合EGFP绿色荧光蛋白挑选出绿色荧光抗性克隆,经催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养,通过RT-PCR、Western-blot检测表明,本研究构建的表达载体可在乳腺细胞中表达人α-乳白蛋白,且发现βLG/CMV复合启动子的转录活性较βLG启动子高。这为下一步制备核移植的转基因供核细胞奠定了基础。第二部分:gFFCs的分离培养与脂质体转染条件优化研究 为获得转基因克隆羊的供核细胞,采用原代组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化gFFCs。绘制的细胞生长曲线表明该分离培养体系可以支持gFFCs良好生长,细胞生长特性符合单层贴壁细胞的增殖特征;采用SRY PCR法鉴定获得了雌性gFFCs。为获得外源基因高效转染gFFCs的方法,以GFP为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对转染条件进行了优化;在24孔培养板中,细胞接种6×1 04个/孔,24h后进行转染,质粒DNA0.6μg/孔,脂质体与质粒DNA比例为4.5:1,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6h时,转染效率（转染后24h荧光显微镜下统计）最高,达到81.2%。第三部分:稳定整合人α-乳白蛋白基因gFFCs的建立 利用第二部分建立的脂质体介导基因转染gFFCs方法,将线性化的5A和B9载体转染gFFCs。借助于Neo和EGFP基因,经过800μg/mLG418药物筛选13-15d,分别获得G418抗性绿色荧光细胞克隆121、102个,通过96孔板-6孔板分离扩大培养,经过巢式PCR扩增鉴定,建立的细胞株皆已经稳定整合目的基因。通过EGFP报告基因的表达检测,建立的转基因细胞系荧光强度5A较B9强,生长情况与对照组比较,转基因过程没有导致细胞生长异常;冻存五个月后解冻细胞,荧光强度依然很强,且生长旺盛。这些结果表明这些阳性转基因细胞可以作为奶山羊克隆研究的供核细胞。第四部分:TK负筛选标记基因打靶载体的构建及定点整合gFFCs的筛选 以第三章构建的载体5A和B9作为骨架,5’βLG为5’同源臂,3’βLG为3’同源臂,同源臂两侧各有一个同向的HSV-TK作为负筛选标记基因,构建成以βLG为基因座的含负筛选标记的置换型打靶载体TK-5A,TK-B9,通过质粒大小、酶切、测序验证了载体构建的完整性。并对GANC的最佳筛选浓度进行确定,发现6μM GANC筛选6d效果最佳。XhoI酶切,去除原核序列,载体线性化。通过脂质体介导转染gFFCs,经1000μg/mLG418和6μM GANC筛选,得到绿色荧光抗性克隆17个TK-B9,28个TK-5A,有待进一步验证。
张艳丽[9]（2010）在《转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究》文中进行了进一步梳理人溶酶体β-葡萄糖苷酶（human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase）是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵；在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转基因与核移植相结合制备动物乳腺生物反应器是当今转基因整合表达的一种有效途径。因此,本研究选取人溶酶体β-葡萄糖苷酶作为研究对象,首先克隆人GlcCerase cDNA序列并对其在COS7细胞中的表达进行初步研究,然后构建含有人GlcCerase cDNA的乳腺表达载体,经体外培养的乳腺上皮细胞验证载体的有效性后,进一步将该载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞,筛选稳定转基因细胞克隆株,通过体细胞核移植法生产转基因奶山羊克隆胚胎,以期获得乳腺特异性表达GlcCerase的转基因奶山羊乳腺生物反应器。本研究共分为六个部分,第一、二部分进行了人GlcCerase基因的克隆、表达载体的构建及体外细胞表达研究；第三、四部分主要是分离培养了奶山羊胎儿成纤维细胞,并优化了脂质体法转染该细胞的体系,获得了稳定整合人GlcCerase基因的供体细胞；第五部分利用转人GlcCerase基因的奶山羊胎儿成纤维细胞进行了核移植,研究转基因供体细胞对克隆胚胎体外发育的支持作用,并对克隆胚胎进行了胚胎移植；第六部分探讨了外源基因导入对奶山羊体细胞周期分布、细胞凋亡和基因表达水平的影响。主要的研究结果如下：第一部分人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核细胞表达试验中,首先从人胎盘组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人GlcCerase基因的编码序列,经测序分析,所得GlcCerase cDNA与GeneBank中同源性为99%,发现1个碱基差异,导致天冬氨酸到甘氨酸的改变。为了尽快检测所获得的目标基因是否能正常编码获得重组蛋白质,本试验以pEGFP-Cl为基础质粒,构建了含有人GlcCerase基因的真核表达载体pEGFP-GlcCerase。用脂质体介导法将该载体转染入COS7细胞中进行暂态表达研究,可见报告基因GFP顺利表达,经RT-PCR和荧光酶学法进行验证,在细胞中检测到了GlcCerase的mRNA表达,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase的生物活性。这些结果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能够正确编码蛋白,发挥生物学功能,可以用于下一步的乳腺表达载体构建。第二部分人GlcCerase基因乳腺特异性表达载体的构建及乳腺细胞表达试验中,将在体外经真核细胞表达验证正确的GlcCerase基因以及细胞筛选标记基因（Neor）插入含有山羊p-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,经PCR和酶切鉴定,得到正确的重组质粒pBCl-GlcCerase-Neo。为了检测乳腺表达载体的有效性,将该载体转染入小鼠乳腺上皮细胞系——HC-11细胞中,经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,将克隆细胞扩大培养后,经PCR检测结果表明,人GlcCerase基因己成功转入到HC-11细胞中。进一步用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经RT-PCR和Western-blot检测表明,山羊p-酪蛋白基因启动子驱动的人GlcCerase基因能够在乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。这些结果表明,所构建的人GlcCerase基因乳腺表达载体具有生物学功能,为下一步利用该载体进行转基因供体细胞的建立奠定了基础。第三部分奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究,采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,结果表明：该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。进一步利用脂质体法将pEGFP-Cl质粒转染入该细胞,研究了脂质体量、质粒量和转染时间对转染效率的影响,获得了脂质体转染该细胞的最佳条件：24孔细胞培养板中采用4.0μL脂质体转染试剂,1.2μg质粒DNA,细胞在复合物中孵育6 h。这为下一步目的基因转染奶山羊胎儿成纤维细胞的研究提供了参考依据。第四部分建立转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的试验,利用上述优化的转染体系,将线性化的乳腺特异性表达载体pBC 1-GlcCerase-Neo转染胎儿成纤维细胞,经G418筛选8-10天后,获得抗性细胞克隆,进一步通过96孔细胞培养板分离得到来源于单个转基因成纤维细胞的细胞克隆,经PCR扩增检测,得到稳定整人GlcCerase基因的转基因供体细胞8株,和对照组细胞比较,转基因过程中没有导致细胞的生长和核型异常。转基因细胞的核型（2n=58+XX）正常比例为66.8%,而第10-12代的非转染细胞核型正常率为70.9%,二者差异不显着（P>0.05）。这些结果表明可以利用这些阳性转基因细胞作供体细胞进行核移植研究。第五部分人GlcCerase转基因克隆胚胎的制备研究,采集屠宰山羊卵巢,获取卵母细胞并体外成熟培养,成熟率为63.3%。以100%汇合2天的转基因体细胞作核供体,以去核的MⅡ期卵母细胞作核受体进行核移植操作。完成核移植的卵母细胞采用122 kV/cm、20μs/次、间隔1s的直流电脉冲进行融合,融合率为83.3%,融合后的重构胚胎进一步用Ionomycin和6-DMAP进行激活处理,然后转移到SOFaa培养液中与单层卵丘细胞共培养,重构胚的卵裂率为89.1%,发育至桑葚胚/囊胚期的比例为36.4%。以正常体细胞来源的核移植胚胎作为对照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分别为77.8%、90.9%和38.9%,两种供体细胞来源的融合率和胚胎发育率差异不显着。手术法将发生卵裂且形态正常的转基因克隆胚（2-细胞期或以上）移植到同期发情的山羊输卵管中,16只受体山羊中有6只一直没有返情,在第40天经B超检测到2只妊娠的结果,但是最终妊娠没有发育到期,胎儿发生流产。第六部分探讨了外源基因转染对供体细胞生物学特性的影响。将构建的乳腺表达载体pBC1-GlcCerase-Neo分别转染体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞以及成年皮肤成纤维细胞,获得整合有外源基因GlcCerase的转基因体细胞。以非转染的正常细胞为对照,利用流式细胞仪分析了转基因奶山羊体细胞的细胞周期分布和细胞凋亡的情况,研究结果显示：三种转基因细胞100%汇合2d后,G0/G1细胞的百分比都显着低于对照组细胞（P<0.05）,其中转基因胎儿成纤维细胞的G0/G1期比例高于其它两种转基因细胞；转基因胎儿成纤维细胞凋亡率达22.56%,较对照组细胞有显着提高（P<0.05）；然后进一步利用荧光定量PCR法探讨了外源基因转染对胎儿成纤维细胞基因表达模式的影响,检测的基因分别为基因印记基因（IGF2, IGF2R）、凋亡相关基因（Bax）、应激相关基因（热休克蛋白,Hsp70.1）、细胞连接相关基因（Cx43）和DNA甲基化转移酶1基因（DNMT1）。其中IGF2, IGF2R和Cx43mRNA的转录水平显着高于对照组非转染的对照组细胞（P<0.05）。本研究首次从细胞周期分布、细胞凋亡以及基因表达变化模式等方面探讨外源基因转染对奶山羊体细胞的影响,探索转基因克隆效率低的内在机制,为更好地促进供体细胞的重编程,进一步提高转基因克隆的效率奠定了基础。
叶建新[10]（2009）在《减毒沙门氏菌为载体的4-1BBL基因疫苗对实验性大肠癌生长的影响》文中研究指明第一部分:重组大鼠4-1BBL基因真核表达载体的构建及功能鉴定目的探讨大鼠4-1BBL对树突状细胞（DCs）表面分子及免疫功能的影响。方法构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL并利用脂质体介导转染HepG2细胞,G418筛选出阳性克隆,RT-PCR和荧光显微镜分别检测4-1BBL基因转录和绿荧光蛋白（GFP）的表达;流式细胞术（FCM）检测不同HepG2细胞与DCs共培养2d后表面CD80及MHC-Ⅱ的表达,ELISA测定共培养上清中IL-6和IL-12的含量。结果成功构建pIRES2-EGFP-4-1BBL重组表达载体并在HepG2细胞中获得稳定表达,重组大鼠4-1BBL能促进骨髓来源DCs表面MHC-Ⅱ、CD80分子表达和IL-6、IL-12分泌（P＜0.05）。结论重组大鼠4-1BBL具有促进DCs成熟的功能。第二部分:含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌的构建及功能鉴定目的构建含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的减毒沙门氏菌（SL3261）疫苗菌。方法将质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入鼠伤寒沙门氏菌（LB5000）进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,抗生素筛选后挑取单个菌落扩增进行抽提质粒和PCR鉴定,SL3261疫苗菌与HepG2细胞体外共培养,荧光显微镜和RT-PCR分别检测绿荧光蛋白（GFP）的表达和4-1BBL基因的转录。结果导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261经抽提质粒电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带,质粒PCR获得了约930bp的条带,200个HepG2细胞感染SL3261为201±46 CFU、SL3261-pIRES2-EGFP为163±37 CFU,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32 CFU,含质粒SL3261在体外感染HepG2细胞的能力同原细菌基本相同。感染含质粒SL3261的HepG2细胞观察到GFP表达,感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞经RT-PCR检测到约930bp的目的条带。结论成功构建了能携带大鼠4-1BBL基因真核表达质粒的SL3261疫苗菌。第三部分:含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠免疫功能的影响目的利用减毒沙门氏菌为载体将4-1BBL体内转染抗原提呈细胞（APCs）,观察体内4-1BBL基因转染对大鼠免疫功能的影响。方法疫苗菌（SL3261+recombinedplasmid）2周内连续灌服大鼠3次,设立含质粒细菌（SL3261+plasmid）、细菌SL3261和PBS对照,末次灌服后14d心脏取血处死,RT-PCR检测报告基因GFP在脾脏细胞中的转录,荧光显微镜直接观察和流式细胞仪检测报告蛋白GFP在脾脏细胞中的表达,免疫双荧光染色检测脾脏组织中4-1BBL蛋白的表达,流式细胞仪对外周血和脾脏中细胞表型检测,ELISA法检测PHA刺激脾细胞72小时后培养上清中IFN-γ的含量。结果疫苗菌同原细菌具有相同的侵袭能力并能成功的将外源基因携带至外周血和脾脏组织中转录表达,灌服疫苗菌的大鼠外周血和脾脏细胞4-1BBL和4-1BB表达明显升高,外周血中CD3+、CD3+CD8+和CD3+CD25+,脾脏细胞中CD3+CD8+、CD3+CD25+也有明显增高（P＜0.05）。脾细胞经PHA刺激后分泌IFN-γ的能力也明显增强（P＜0.05）。结论含4-1BBL基因的减毒沙门氏疫苗菌能实验体内抗原提呈细胞的基因转染,4-1BBL的表达增强能明显增强机体的细胞免疫功能。第四部分:实验性大鼠大肠癌时机体免疫功能的改变目的模拟人类大肠癌的形成,建立一种大肠癌的模型并探讨实验性大肠癌时机体免疫功能变化。方法利用1,2-二甲肼诱导S-D大鼠建立大肠癌模型,流式细胞术（FCM）检测成瘤16周、21周时外周血和21周时脾脏中CD3、CD4、CD8、CD25、4-1BB和4-1BBL表达率,ELISA法检测成瘤21周时脾细胞经PHA刺激后分泌IFN-γ的能力。结果21周时处死大鼠并对大鼠的肠道进行解剖,结果表明利用该方法的诱癌率达100%（5/5）,16周时成瘤组外周血CD3+和CD3+CD4+较对照组表达率略有降低,但两者无统计学差异（P＞0.05）;21周时成瘤组外周血和脾脏中CD3+CD4+较对照组表达率明显降低（P＜0.05）,外周血和脾脏中成瘤组4-1BB和4-1BBL的表达较对照组均表达降低,但无统计学差异;成瘤组脾细胞PHA刺激试验后分泌IFN-γ的能力较对照组有显着的下降（P＜0.01）。结论利用1,2-二甲肼成功建立了S-D大鼠的大肠癌模型,证明了实验性大鼠大肠癌时同人类大肠癌具有类似的免疫功能降低,主要是细胞免疫功能的下降。第五部分含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠大肠癌生长的影响目的探讨减毒沙门氏菌为载体的4-1BBL基因疫苗菌对荷瘤大鼠免疫系统的影响以及治疗大肠癌可行性。方法利用1,2-二甲肼连续20周皮下注射建立大鼠大肠癌模型,在14周按分组（每组5只）分别灌服2ml PBS和2ml浓度为109/ml的SL3261、SL3261+plasmid和SL3261+recombined plasmid,荷瘤大鼠按上述方法分别在第16周和第18周再根据分组灌服二次加强免疫,于16周右心房抽血检测外周血细胞表型,21周处死全部大鼠,解剖并观察成瘤数量、大小、是否转移并进行Dukes分期评判;流式细胞仪检测外周血和和脾脏中细胞表型并利用PHA刺激脾细胞分泌IFN-γ水平,对大肠、肝、肺、腹腔等原发和转移部位以及功能可能影响的部位HE染色镜检,对结肠、脾脏和肝脏冰冻切片免疫双荧光法检测4-1BBL和报告基因GFP表达。结果SL3261+recombined plasmid组平均成瘤数为9.4±4.3个,明显低于PBS组的18.2±4.7个、SL3261组的12.8±4.5和SL3261+plasmid组的12.2±4.4（P＜0.05）,SL3261组和SL3261+plasmid组的成瘤数略低于PBS组,但相比无明显统计学意义（P＞0.05）;灌服疫苗菌的荷瘤大鼠在结肠、脾脏和肝脏中有报告蛋白GFP和较多的4-1BBL蛋白表达。外周血和脾脏细胞表型检测显示活化T细胞CD3+CD25+较其它荷瘤组明显增高（P＜0.05）,脾细胞PHA刺激试验后分泌IFN-γ的能力也明显增强（P＜0.05）。结论含重组质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL的减毒沙门氏菌可以实现荷瘤大鼠体内4-1BBL基因转染,体内高表达4-1BBL可提高荷瘤大鼠的细胞免疫功能从而抑制实验性大鼠大肠癌的生长。
二、一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP（论文提纲范文）
（1）基因修饰人多能干细胞的高效单克隆建系方法（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人多能干细胞培养及传代 |
| 1.2.2 慢病毒制备 |
| 1.2.3 多能干细胞的慢病毒感染及效率 |
| 1.2.4 制备单克隆挑取显微操作器件 |
| 1.2.5 使用显微操作器件挑取扩增细胞单集落 |
| 1.2.6 神经诱导完全培养基的配制 |
| 1.2.7 i PSC向神经样细胞分化 |
| 1.2.8 细胞免疫荧光染色 |
| 1.2.9 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 小分子化合物Y-27632对多能干细胞的形态影响 |
| 2.2 Y-27632慢病毒转染h ESC效率的影响 |
| 2.3 小分子化合物Y-27632对慢病毒转染hi PSC效率细胞的影响 |
| 2.4 单克隆挑取简易器件设计及h ESC阳性单克隆挑取 |
| 2.5 多能干细胞分化的神经样细胞中稳定表达RFP基因 |
| 2.6 多能干细胞分化的神经样细胞鉴定 |
| 3 讨论 |
（2）单碱基编辑技术在鸡体细胞上编辑效率优化的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1.1 依赖双链DNA断裂的基因编辑技术的研究进展 |
| 1.1.1 锌指核酸酶 |
| 1.1.2 转录激活子效应因子核酸酶 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9 系统 |
| 1.2 不产生双链DNA断裂的碱基编辑工具的发展 |
| 1.2.1 胞嘧啶碱基编辑工具(Cytidine base editors,CBEs)的建立和发展 |
| 1.2.2 腺嘌呤碱基编辑工具(Adenine base editors,ABEs)的建立和发展 |
| 1.2.3 引导编辑工具(Prime Editor,PE)的建立和发展 |
| 1.3 碱基切除修复通路调控碱基编辑效率的研究进展 |
| 1.3.1 碱基切除修复通路的作用原理 |
| 1.3.2 碱基切除修复通路对哺乳动物细胞中碱基编辑效率的影响 |
| 1.3.3 碱基切除修复通路对鸡细胞中碱基编辑效率的影响 |
| 1.4 单碱基编辑工具的应用 |
| 1.4.1 动物疾病模型的制备和基因治疗 |
| 1.4.2 动植物基因功能研究与育种 |
| 第二章 单碱基编辑器在鸡体细胞中编辑活性的验证和密码子优化 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.1.6 胞嘧啶碱基编辑器活性验证sg RNA的设计与质粒构建 |
| 2.1.7 鸡密码子优化胞嘧啶碱基编辑器ch BE4max的构建 |
| 2.1.8 细胞的培养 |
| 2.1.9 细胞和质粒的准备 |
| 2.1.10 DF-1 细胞转染 |
| 2.1.11 细胞的流式分析与分选 |
| 2.1.12 阳性细胞基因组DNA的提取、PCR和测序 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 碱基编辑器在鸡体细胞中编辑效率的验证 |
| 2.2.2 碱基编辑器在鸡体细胞中的密码子优化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 抑制鸡体细胞中MBD4 基因对单碱基编辑效率的影响 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂与耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.1.5 si RNA的设计和转染 |
| 3.1.6 MBD4 与单碱基编辑器活性探究相关sg RNA的设计与质粒构建 |
| 3.1.7 细胞的培养与转染 |
| 3.1.8 细胞的分选与分析 |
| 3.1.9 阳性细胞基因组DNA的提取、PCR和测序 |
| 3.1.10 RNA的提取与q-PCR分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 MBD4 si RNA干扰效率的检测 |
| 3.2.2 MBD4 与单碱基编辑器活性验证相关质粒的构建 |
| 3.2.3 抑制MBD4 的表达可以提高单碱基编辑器在DF-1 细胞中的编辑活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 利用单碱基编辑引入终止子的策略敲除鸡体细胞中目的基因 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 实验试剂与耗材 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.1.5 ch BE4max-all in one质粒的构建 |
| 4.1.6 外源基因GFP敲除质粒的构建 |
| 4.1.7 鸡内源基因MDA5 敲除sg RNA的设计和质粒构建 |
| 4.1.8 细胞的培养与转染 |
| 4.1.9 细胞的分选与分析 |
| 4.1.10 阳性细胞基因组DNA的提取、PCR和测序 |
| 4.1.11 病毒感染 |
| 4.1.12 RNA的提取与q-PCR分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 鸡体细胞外源GFP基因单碱基基因敲除的验证 |
| 4.2.2 鸡体细胞内源MDA5 基因单碱基基因敲除的验证 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 5.3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（4）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的机制及其在ARDS中的意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 论文前言 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 主要实验仪器与试剂 |
| 第一部分 高表达p130/E2F4调控MSC细胞周期对其多向分化潜能影响的研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控MSC体外分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞的机制研究 |
| 参考文献 |
| 第三部分 高表达p130/E2F4的MSC移植对ARDS小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤修复作用的研究 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 发表论文 |
| 基金资助 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文前言 |
| 第一章: 兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第二章: 脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第三章: 支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图表 |
| 6. 讨论 |
| 第四章: 兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第五章: Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 1. 颌骨牵张成骨研究进展 |
| 参考文献 |
| 2. 可注射支架材料在骨和软骨组织工程中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间所发表论文 |
| 攻读博士学位期间所主持的科研项目及课题 |
（7）山羊乳腺上皮细胞转人β防御素3基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 乳腺上皮细胞及转基因动物的研究进展 |
| 1.1 乳腺上皮细胞体外培养研究进展 |
| 1.1.1 乳腺上皮细胞系的建立 |
| 1.1.2 乳腺上皮细胞分离培养 |
| 1.1.3 乳腺上皮细胞纯化 |
| 1.2 人-Β防御素3 研究进展 |
| 1.2.1 防御素概述 |
| 1.2.2 人β-防御素3 的分子生物学特征 |
| 1.2.3 人β-防御素3 的应用前景 |
| 1.3 转基因动物研究进展 |
| 1.3.1 转基因动物研究 |
| 1.3.2 转基因动物生产方法 |
| 1.3.3 转基因动物的应用 |
| 1.3.4 转基因动物面临的问题 |
| 试验研究 |
| 第二章 奶山羊乳腺上皮细胞的培养及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 组织来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 乳腺上皮细胞原代培养 |
| 2.2.2 乳腺上皮细胞纯化 |
| 2.2.3 乳腺上皮细胞传代培养 |
| 2.2.4 乳腺上皮细胞冻存与复苏培养 |
| 2.2.5 乳腺上皮细胞鉴定 |
| 2.2.6 乳腺上皮细胞生长曲线测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 乳腺上皮细胞形态学观察 |
| 2.3.2 山羊乳腺上皮细胞角蛋白染色 |
| 2.3.3 山羊乳腺上皮细胞生长曲线测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 乳腺上皮细胞分离和纯化 |
| 2.4.2 乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 山羊乳腺上皮细胞基因转染条件的优化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 材料来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒pEGFP-C1 及重组质粒pEBB 的纯化 |
| 3.2.2 pEGFP-C1 质粒与重组质粒pEBB 浓度测定 |
| 3.2.3 细胞抗性实验 |
| 3.2.4 脂质体介导的外源基因转染山羊乳腺上皮细胞 |
| 3.2.5 乳腺上皮细胞电转染 |
| 3.2.6 山羊乳腺上皮细胞转人β-防御素3 基因的转染及筛选 |
| 3.2.7 数据处理和统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 质粒pEGFP-C1 及重组质粒pEBB 的纯化 |
| 3.3.2 乳腺上皮细胞抗性筛选结果 |
| 3.3.3 脂质体介导山羊乳腺上皮细胞转染条件优化 |
| 3.3.4 山羊乳腺上皮细胞电穿孔转染条件优化 |
| 3.3.5 山羊乳腺上皮细胞转人β-防御素3 基因的转染及筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 转人Β-防御素3 基因乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 阳性细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转人β-防御素3 基因山羊乳腺上皮细胞的PCR 鉴定 |
| 4.2.2 奶山羊阳性细胞株的整合鉴定 |
| 4.2.3 奶山羊乳腺上皮细胞阳性细胞株的体外诱导表达及鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 阳性细胞株PCR 检测 |
| 4.3.2 阳性细胞株southern blot 杂交检测 |
| 4.3.3 阳性细胞株的体外诱导表达western blot 鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）人α-乳白蛋白转基因载体的构建及其奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一部分 综述 |
| 第一章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1 乳腺特异性表达载体 |
| 1.1 启动子调控元件 |
| 1.2 目的基因的选择 |
| 2 α-乳白蛋白的研究进展 |
| 2.1 α-乳白蛋白的结构与性质 |
| 2.2 α-乳白蛋白的功能 |
| 2.3 α-乳白蛋白转基因动物国内外研究概况 |
| 3 乳腺生物反应器的应用前景及所存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二章 基因打靶 |
| 1 基因打靶的策略 |
| 1.1 构建插入型载体(gene-insertion vector,O-type) |
| 1.2 构建置换型载体(gene-replacement vector,Ω-type) |
| 1.3 “打了就走”策略(“Hit and Run”) |
| 1.4 标记与交换法(tag and exchange) |
| 1.5 双置换法(double replacement) |
| 1.6 时空特异性基因打靶(spatiotemporal gene targeting,STGT)的策略 |
| 2 体细胞基因打靶 |
| 3 基因打靶效率的影响因素 |
| 3.1 同源臂长度与转基因效率 |
| 3.2 插入片段长度的影响 |
| 3.3 同源片段来源的影响 |
| 3.4 其他因素 |
| 4 基因打靶的筛选策略 |
| 4.1 PCR筛选方法 |
| 4.2 启动子缺失筛选 |
| 4.3 poly-A缺失筛选 |
| 4.4 正负筛选策略 |
| 5 基因打靶技术的应用 |
| 6 基因打靶的前景 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第三章 人α-乳白蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 载体5A的构建 |
| 1.4 载体B9的构建 |
| 1.5 山羊乳腺上皮细胞的培养 |
| 1.6 G418对GMEC最小致死量的确定 |
| 1.7 载体5A、B9的线性化 |
| 1.8 GMEC的转染与筛选 |
| 1.9 GMEC阳性细胞的PCR鉴定 |
| 1.10 转染细胞诱导表达 |
| 1.11 人α-乳白蛋白的mRNA检测 |
| 1.12 山羊乳腺上皮细胞的人α-乳白蛋白检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体5A的鉴定 |
| 2.2 乳腺特异性表达载体B9的鉴定 |
| 2.3 GMEC的一般形态学观察 |
| 2.4 G418对GMEC最小致死量的确定 |
| 2.5 GMEC的转染与筛选 |
| 2.6 GMEC绿色荧光细胞的PCR鉴定 |
| 2.7 RT-PCR检测 |
| 2.8 Western-blot检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养与脂质体转染条件优化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 2.2 胎儿细胞性别鉴定 |
| 2.3 gFFCs生长曲线 |
| 2.4 gFFCs转染条件的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的体外原代培养模式的建立及生长特性 |
| 3.2 脂质体转染体细胞条件的优化 |
| 参考文献 |
| 第五章 整合人α-乳白蛋白基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞抗性实验 |
| 2.2 5A、B9转染奶山羊胎儿成纤维细胞后报告基因EGFP的表达 |
| 2.3 gFFCs克隆的PCR鉴定 |
| 2.4 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.5 转基因细胞冻存与解冻 |
| 3 讨论 |
| 3.1 5A、B9转染奶山羊胎儿成纤维细胞后报告基因EGFP的表达 |
| 3.2 转基因阳性细胞的分离及扩大培养 |
| 3.3 阳性细胞的PCR鉴定 |
| 参考文献 |
| 第六章 TK负筛选标记基因打靶载体的构建及定点整合gFFCs的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 打靶载体的鉴定 |
| 2.2 GANC最佳筛选浓度的确定 |
| 2.3 打靶载体的转染、筛选与扩大培养 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（9）转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1 哺乳动物体细胞核移植技术的发展 |
| 2 哺乳动物体细胞核移植的基本技术环节 |
| 2.1 供体细胞的选择 |
| 2.2 核受体胞质的准备 |
| 2.3 供体细胞和受体细胞的重组 |
| 2.4 重构胚的激活 |
| 2.5 重构胚的培养 |
| 3 哺乳动物体细胞核移植有关机理研究进展 |
| 3.1 受体细胞和供体细胞的核质互作 |
| 3.2 体细胞供体核的表观重编程 |
| 4 体细胞核移植技术存在的问题与应用前景 |
| 4.1 体细胞细胞核移植技术存在的问题 |
| 4.2 应用前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器生产重组药用蛋白的研究进展 |
| 1 转基因动物制药的诞生 |
| 1.1 细菌基因工程药物阶段 |
| 1.2 细胞基因工程药物阶段 |
| 1.3 转基因动物制药阶段 |
| 2 动物乳腺生物反应器的研究简史 |
| 3 乳腺生物反应器的分类 |
| 3.1 啮齿动物乳腺生物反应器 |
| 3.2 反刍动物乳腺生物反应器 |
| 4 乳腺生物反应器表达载体构建的研究 |
| 4.1 与乳腺组织特异性表达有关的调控元件 |
| 4.2 基于普通质粒的表达载体 |
| 4.3 基于人工染色体的表达载体 |
| 4.4 基于基因打靶的表达载体 |
| 5 乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展 |
| 5.1 原核期胚胎的显微注射法 |
| 5.2 转座子介导法 |
| 5.3 逆转录病毒介导法 |
| 5.4 精子载体法 |
| 5.5 胚胎干细胞介导法 |
| 5.6 原始生殖细胞介导法 |
| 5.7 转基因克隆动物法 |
| 5.8 体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 5.9 诱导多能干细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 6 乳腺生物反应器的鉴定 |
| 6.1 DNA水平的检测 |
| 6.2 RNA水平的检测 |
| 6.3 目的蛋白的检测 |
| 7 转基因乳腺生物反应器存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 人溶酶体β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人胎盘组织总RNA的完整性 |
| 2.2 GlcCerase cDNA的扩增 |
| 2.3 GlcCerase序列分析结果 |
| 2.4 pEGFP-GlcCerase重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.5 荧光显微镜观察COS7细胞中GFP基因的表达 |
| 2.6 转染COS7细胞中GlcCerase基因的mRNA表达 |
| 2.7 转染COS7细胞中GlcCerase基因的蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 人GleCerase基因乳腺表达载体的构建及其在乳腺上皮细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体的鉴定 |
| 2.2 HC-11细胞的转染与鉴定 |
| 2.3 GlcCerase基因在转基因HC-11细胞中的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺特异表达载体的构建 |
| 3.2 乳腺特异表达载体的验证手段 |
| 3.3 乳腺上皮细胞合成乳蛋白的可能机制 |
| 参考文献 |
| 第五章 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞的一般形态观察 |
| 2.2 胎儿细胞性别鉴定 |
| 2.3 胎儿细胞生长曲线分析 |
| 2.4 胎儿细胞核型分析 |
| 2.5 胎儿细胞转染效率的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的原代培养与生物学特性分析 |
| 3.2 脂质体转染体细胞效率的优化 |
| 参考文献 |
| 第六章 转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞抗性试验 |
| 2.2 外源基因转染山羊胎儿成纤维细胞 |
| 2.3 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.4 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.5 转基因细胞的核型分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转基因阳性细胞克隆的分离 |
| 3.2 转基因阳性细胞的筛选 |
| 3.3 转基因供体细胞的染色体倍性 |
| 参考文献 |
| 第七章 转人GlcCerase基因奶山羊克隆胚的构建及胚胎移植 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊卵母细胞的体外成熟培养 |
| 2.2 山羊转基因体细胞的核移植 |
| 2.3 转基因体细胞克隆胚的体外培养与发育 |
| 2.4 转基因体细胞克隆胚的PCR检测 |
| 2.5 山羊转基因克隆胚的胚胎移植 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转染和筛选对转基因克隆胚胎发育的影响 |
| 3.2 技术操作过程对核移植效率的影响 |
| 3.3 重构胚胎培养体系 |
| 参考文献 |
| 第八章 外源基因转染对奶山羊供体细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养细胞的形态与生长曲线 |
| 2.2 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.3 外源基因转染对细胞周期分布的影响 |
| 2.4 外源基因转染对细胞凋亡的影响 |
| 2.5 外源基因转染对细胞基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因转染对奶羊体细胞周期分布和细胞凋亡的影响 |
| 3.2 外源基因转染对奶羊体细胞基因相对表达水平的影响 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的内容 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）减毒沙门氏菌为载体的4-1BBL基因疫苗对实验性大肠癌生长的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 重组大鼠4-1BBL基因真核表达载体的构建及功能鉴定 |
| 一、材料 |
| 1.细胞、菌株和质粒 |
| 2.大鼠 |
| 3.试剂 |
| 4.引物 |
| 5.大鼠4-1BBL cDNA |
| 6.仪器 |
| 二、方法 |
| 1.4-1BBL基因的扩增 |
| 2.重组表达质粒的构建和鉴定 |
| 3.重组质粒转染HepG2细胞及阳性克隆的筛选 |
| 4.重组大鼠4-1BBL基因的HepG2细胞鉴定 |
| 5.大鼠DCs细胞的分离培养 |
| 6.各组HepG2细胞与大鼠DCs共培养 |
| 7.共培养DCs细胞FCM表型和上清检测 |
| 8.统计学处理 |
| 三、结果 |
| 1.重组pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的鉴定 |
| 2.重组4-1BBL基因的HepG2细胞鉴定 |
| 3.大鼠DCs的形态学观察 |
| 4.共培养DCs的形态学观察和表面分子检测 |
| 5.混合培养上清中细胞因子检测 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 第二部分 含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌构建及功能鉴定 |
| 一、材料 |
| 1.质粒、菌株和细胞 |
| 2.试剂 |
| 3.引物 |
| 4.仪器 |
| 二、方法 |
| 1.重组质粒转化减毒沙门氏菌LB5000 |
| 2.LB5000中抽提质粒电转化减毒沙门氏菌SL3261 |
| 3.含质粒减毒沙门氏菌的体外稳定和鉴定 |
| 4.含质粒减毒沙门氏菌的生长特性和形态学观察 |
| 5.含L质粒减毒沙门氏菌表面抗原和质粒稳定性检测 |
| 6.含质粒减毒沙门氏菌感染HepG2细胞 |
| 7.感染减毒沙门氏菌HepG2细胞的4-1BBL基因表达检测 |
| 8.统计学处理 |
| 三、结果 |
| 1.重组4-1BBL基因疫苗SL3261菌鉴定 |
| 2.含质粒减毒沙门氏菌表面抗原和培养过程中质粒稳定性检测 |
| 3.含质粒减毒沙门氏菌的生长特性和形态学观察结果 |
| 4.含质粒减毒沙门氏菌感染HepG2细胞 |
| 5.感染不同SL3261细菌HepG2细胞的绿荧光观察 |
| 6.感染不同SL3261细菌HepG2细胞的4-1BBL基因转录检测 |
| 7.感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞免疫双荧光观察 |
| 五、参考文献 |
| 第三部分 含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠免疫功能的影响 |
| 一、材料 |
| 1.菌株 |
| 2.大鼠 |
| 3.试剂 |
| 4.引物 |
| 5.仪器 |
| 二、方法 |
| 1.SL3261菌感染大鼠 |
| 2.腹腔脏器的取材、观察 |
| 3.脾细胞分离 |
| 4.脾脏中报告基因GFP的检测 |
| 5.外周血淋巴细胞和脾细胞表型检测 |
| 6.伤寒肥达氏反应检测 |
| 7.脾细胞分泌IFN-γ的检测 |
| 8.免疫双荧光法检测组织中4-1BBL的表达 |
| 9.统计学处理 |
| 三、结果 |
| 1.大鼠脾细胞中报告基因GFP的转录和表达 |
| 2.外周血淋巴细胞表型检测和肥达氏反应 |
| 3.脾细胞流式细胞仪检测细胞表型结果 |
| 4.外周血和脾细胞4-1BB和4-1BBL检测结果 |
| 5.各组大鼠脾细胞经PHA刺激后分泌IFN-γ的检测结果 |
| 6.各组大鼠脾脏中4-1BBL的表达 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 第四部分 实验性大鼠大肠癌时机体免疫功能的改变 |
| 一、材料 |
| 1.大鼠 |
| 2.试剂 |
| 二、方法 |
| 1.大鼠大肠癌模型的建立 |
| 2.16周时外周血细胞表型检测 |
| 3.荷瘤大鼠21周时心脏取血处死 |
| 4.腹腔脏器的观察以及取材 |
| 5.病理学检查 |
| 6.荷瘤大鼠免疫功能检测 |
| 7.统计学处理 |
| 三、结果 |
| 1.一般情况 |
| 2.大鼠的体重变化 |
| 3.荷瘤大鼠16周时外周血淋巴细胞表型检测 |
| 4.荷瘤大鼠21周时外周血、脾细胞表型和分泌IFN-γ水平检测 |
| 5.病理学检查结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 第五部分 含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠大肠癌生长的影响 |
| 一、材料 |
| 1.菌株 |
| 2.大鼠 |
| 3.试剂 |
| 4.引物 |
| 5.仪器 |
| 二、方法 |
| 1.大鼠大肠癌模型建立 |
| 2.荷瘤大鼠灌服疫苗菌 |
| 3.荷瘤大鼠16周时外周血淋巴细胞表型检测 |
| 4.荷瘤大鼠21周时处死 |
| 5.常规病理学检测 |
| 6.荷瘤大鼠免疫功能检测 |
| 7.免疫双荧光法检测组织中4-1BBL的表达 |
| 8.统计学处理 |
| 三、结果 |
| 1.大鼠一般情况的观察和体重变化 |
| 2.荷瘤大鼠16周时外周血淋巴细胞表型检测 |
| 3.荷瘤大鼠解剖观察、病理学观察和肿瘤分期 |
| 4.荷瘤大鼠21周时肥达氏反应和报告基因GFP的转录检测 |
| 5.荷瘤大鼠21周时外周血淋巴细胞和脾细胞表型检测 |
| 6.脾细胞分泌IFN-γ水平检测结果 |
| 7.荷瘤大鼠各种组织中4-1BBL的表达 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间获课题和公开发表的论文 |
| 致谢 |
四、一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP（论文参考文献）
- [1]基因修饰人多能干细胞的高效单克隆建系方法[J]. 钱昱,丁晓雨,刘志强,袁增强. 中国生物工程杂志, 2021(08)
- [2]单碱基编辑技术在鸡体细胞上编辑效率优化的初步研究[D]. 徐天鹏. 广西大学, 2021(12)
- [3]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [5]Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的机制及其在ARDS中的意义[D]. 张曦文. 东南大学, 2019(01)
- [6]PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究[D]. 周诺. 广西医科大学, 2012(08)
- [7]山羊乳腺上皮细胞转人β防御素3基因的研究[D]. 杜珊. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [8]人α-乳白蛋白转基因载体的构建及其奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立[D]. 丰秀静. 南京农业大学, 2010(05)
- [9]转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D]. 张艳丽. 南京农业大学, 2010(06)
- [10]减毒沙门氏菌为载体的4-1BBL基因疫苗对实验性大肠癌生长的影响[D]. 叶建新. 苏州大学, 2009(07)