一、TnGV增强蛋白在AcMNPV中的表达和活性分析（论文文献综述）
古小梅[1]（2021）在《杆状病毒AcMNPV PK-1互作蛋白的筛选及功能研究》文中研究表明杆状病毒应用十分广泛,可用于病虫害防治、表达载体、生物纳米技术、基因治疗等方面,并且对人、畜无害。目前杆状病毒的感染机制研究有了较大进展。现已知杆状病毒的核心基因有三十多个,分别作用于病毒复制、组装、感染等各个阶段。杆状病毒感染的极晚期阶段虽不影响病毒的复制,但此阶段会大量合成与病毒包涵体组装相关的蛋白。因此,揭示杆状病毒极晚期基因超量表达的机制对于进一步改造杆状病毒表达系统非常重要。PK-1是杆状病毒复制所必需的,同时也参与病毒极晚期基因的超量表达。本文就PK-1及与其相互作用的病毒编码蛋白开展一系列研究。首先通过酵母双杂交系统筛选与PK-1互作的蛋白。对已构建的AcMNPV感染的Sf9细胞cDNA文库进行质量鉴定,并构建诱饵载体pGBKT7-Y-PK-1从cDNA文库中进行筛选,成功筛选出于PK-1互作的5种蛋白,从这些蛋白中选取了 4种病毒编码蛋白,分别为蛋白激酶相互作用因子（AC24）、锌指蛋白（AC88）、衣壳蛋白（AC87）和主要衣壳蛋白（AC89）,进一步用免疫共沉淀验证PK-1与所选蛋白的互作,结果证实AC24、AC87、AC88与PK-1都存在互作,AC89与PK-1有相互作用的可能性。随后对PK-1及其互作蛋白AC24在细胞中进行了亚细胞定位分析。发现二者在细胞中定位基本一致,最初存在于整个细胞,随着感染时间的推移逐渐聚集于细胞核和细胞质中,这与PK-1及AC24的功能相关。推测二者在细胞核中参与蛋白的磷酸化以及极晚期基因的超量表达,在细胞质中可能与核衣壳的运动及出芽有关。最后,利用基因敲除初步探究了ac24在杆状病毒感染过程中的功能,通过构建ac24缺失型、拯救型病毒,将病毒基因组转染和感染昆虫细胞,分析重组病毒的感染性,结果表明缺失ac24基因仅对杆状病毒粒子的增殖速度造成较小影响,并不影响病毒粒子的产生与感染性。此外,通过构建PK-1融合eGFP表达框的缺失型病毒,以未缺失病毒作为对照,转染、感染细胞,发现缺失ac24会降低PK-1的表达量。总之,ac24属于杆状病毒非必需基因,其功能为增强PK-1在虫体内的表达,但具体机理还需进一步研究。
彭跃有[2]（2019）在《AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac132的功能研究》文中指出杆状病毒是一类双链、环状、超螺旋的DNA病毒,拥有80 kb到180 kb的基因组,编码大约100-180种蛋白。杆状病毒被人类广泛研究,以苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）最为突出,具有安全杀虫剂的称号,但因其杀虫时间慢等局限性而不被大范围使用。因此,加强杆状病毒活性以及全面了解其基因组中重要基因的功能尤为关键,特别是结构基因,ac132是其中之一。AcMNPV中的ac132位于基因组中的第132个开放阅读框,ac132基因全长660bp,编码关键的结构蛋白。有研究表明ac132的敲除对病毒DNA的复制和晚期基因没有明显的影响,但对病毒的形态发生有影响,ac132敲除以后,病毒发生基质（VS区）中出现包含单个核衣壳的卷毛状结构,基本不出现正常的棒状核衣壳,病毒发生基质出现的时间延迟。但是Ac132蛋白对子代病毒增殖的影响尚不明确,因此我们针对Ac132蛋白在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能展开研究。本研究主要分为三部分内容:第一部分:重组杆状病毒AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP的构建与Ac132-EGFP的表达分析首先,用λ-Red同源重组和Bac-to-Bac系统构建敲除ac132基因的病毒AcMNPVac132ko-EGFP,侵染Sf9细胞后观察到极少量的绿色荧光,表明敲除ac132基因大幅降低了AcMNPV子代病毒的增殖。为了确定这种现象确实是由ac132基因的敲除所引起的,我们又在P10启动子下构建了回补ac132基因的重组病毒AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP,观察到一、二、三代病毒侵染Sf9（Spodoptera frugiperda）细胞产生了大量的绿色荧光蛋白,表明了ac132基因是产生子代病毒不可缺失的。为进一步分析,我们构建了过表达Ac132的重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP。测定AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP的滴度,用5 MOI的AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP分别侵染Sf9细胞,Western blot结果表明,在AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组中,Ac132-EGFP从24 h p.i.开始表达,并在36 h p.i.达到了表达的峰值;过表达AcMNPV-Ac132-EGFP处理组中,Ac132-EGFP从12 h p.i.开始表达,较AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组提前了表达,在36 h p.i.同样达到表达高峰,并在随后的侵染时间段呈现较高的表达丰度。荧光显微镜观察结果与Western blot分析结果一致。第二部分:Ac132在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能首先,通过噬斑实验检测AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP子代病毒的增殖。结果表明,回补型AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP与野生型AcMNPV-EGFP子代病毒增殖的能力相当,而AcMNPV-Ac132-EGFP明显增加了子代病毒的产量,在36 h p.i.时,分别是AcMNPV-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP的5.55倍、2.28倍。那么过表达Ac132通过什么途径促进AcMNPV促进子代病毒增殖呢?之前的研究表明Ac132是结构蛋白并且随着侵染时间的推移定位于细胞核中,随后我们用Western blot定量检测了Ac132在细胞核的积累,用5 MOI的AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP侵染Sf9细胞,提取核蛋白,结果表明两个重组病毒处理组中Ac132在细胞核中都高度积累,说明Ac132在细胞核中发挥功能。那么它是如何进入细胞核呢?利用在线预测网站cNLS Mapper预测到在Ac132蛋白序列的第25-28位氨基酸残基处存在典型的核定位信号序列PPKK（脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸）。为明确PPKK序列对Ac132进入细胞核是否发挥作用,将PPKK全部突变为丙氨酸,构建了突变型病毒AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP,同时构建了过表达突变核定位信号的重组病毒AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP。接下来通过噬斑实验测定这两种突变型病毒子代病毒的增殖,相比AcMNPV-EGFP,突变型AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP抑制了子代病毒的产生;相较于AcMNPV-EGFP,过表达突变型AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP在48h p.i.子代病毒的产量约是野生型病毒的4倍,但仍比AcMNPV-Ac132-EGFP低,各种重组病毒转染或侵染宿主Sf9细胞的荧光观察结果与它们各自产生子代病毒的能力相对应。以上结果说明Ac132可通过PPKK核定位信号进入细胞核发挥功能并促进病毒增殖。另一方面,有研究表明Ac132的103-134位氨基酸残基与结合Actin的NEBU结构域同源,肌动蛋白在AcMNPV侵染宿主产生子代病毒的整个过程中都发挥着重要的作用,那么Ac132的过表达、突变会如何影响宿主细胞纤维状肌动蛋白F-actin进出细胞核?我们用5 MOI的AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP侵染Sf9细胞,荧光显微镜观察用鬼笔环肽定位的纤维状肌动蛋白在细胞核和质的分布,结果表明12 h p.i.时,在AcMNPV-Ac132-EGFP处理组中,F-actin就明显出现在细胞核中,一直持续到72 h,比其它处理组明显提前了F-actin在细胞核中的聚集,同时F-actin在细胞膜内侧大量聚集。而在突变型病毒AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中,F-actin在12-48 h p.i.均集中在细胞膜内侧面,72 h p.i.时在细胞核中大量聚集。AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组和野生型AcMNPV-EGFP处理组中F-actin在细胞核、质中的分布相同,均在12-48 h p.i.逐渐入核,在72 h p.i.时开始出核。AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中F-actin相比AcMNPV-EGFP处理组提前进核,延迟出核,但是比过表达重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP处理组提前和延迟的程度弱。随后Western blot定量分析了β-actin在细胞核中的聚集情况,结果与荧光定位的结果一致。以上结果说明了Ac132通过不完全依赖核定位信号进入细胞核,并且可以提前纤维状肌动蛋白在细胞核中的聚集,从而促进病毒的增殖。第三部分:重组病毒AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP对宿主细胞能量代谢的影响我们已经明确了Ac132蛋白对AcMNPV在Sf9细胞中增殖的重要性。AcMNPV的增殖可以激活PI3K-Akt-mTOR信号通路,从而进一步激活与细胞代谢有关的下游信号通路,提高糖酵解水平可以通过PI3K-Akt信号通路激活丙酮酸激酶来实现。那么过表达Ac132的重组病毒又会对Sf9细胞中的糖酵解过程产生怎样的影响?葡萄糖的消耗以及乳酸的积累可以反映糖酵解的水平,因此用5 MOI的AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP侵染Sf9细胞,检测细胞葡萄糖的消耗和乳酸的积累。结果表明相较于野生型处理组,重组病毒处理组子代病毒增殖能力越强,Sf9细胞消耗葡萄糖的越多,积累的乳酸越多。过表达重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP处理组和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中,宿主细胞在12 h p.i.显示出了较高的葡萄糖消耗,分别是野生型AcMNPV-EGFP处理组的1.82倍和1.18倍。同时,在6 h p.i.积累了大量的乳酸,分别是AcMNPV-EGFP处理组的2.66倍和1.42倍,但是之后葡萄糖消耗增加的幅度减缓。在AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组和野生型AcMNPV-EGFP处理组中,Sf9细胞对葡萄糖的消耗和乳酸的积累大体一致,并在24 h p.i.开始对葡萄糖的需求有较大幅度的增加,并且后续呈缓慢增加的趋势。AcMNPVac132ko-EGFP处理组和空白对照组的情况一致,Sf9细胞葡萄糖的消耗持续缓慢增加,几乎不积累乳酸。在AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中,由于前期子代病毒在缓慢积累,Sf9细胞在24h p.i.开始增加葡萄糖的消耗,乳酸的积累也在缓慢增加,直到72 h p.i.乳酸浓度突然增加,推测是在72 h p.i.子代病毒的积累达到了一定高浓度所致。总之,由于Ac132序列完整性导致的重组病毒对子代病毒增殖的影响可进而影响到Sf9细胞的糖酵解过程,这为进一步明确AcMNPV的关键结构基因对侵染宿主细胞能量代谢的影响提供了线索。本研究在细胞和分子水平上通过构建Ac132的敲除、过表达和突变型的重组病毒株,揭示了AcMNPV中关键结构蛋白Ac132的功能,它依赖自身核定位信号在细胞核中高度积累,通过促进F-actin在细胞核中聚集,提高子代病毒增殖效率,同时也激活了与细胞能量代谢相关的通路,加快糖酵解过程,为病毒的复制、装配和释放提供能量。以上结果为科学利用杆状病毒开展植物虫害生物防治提供了参考。
张雅昆[3]（2018）在《美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究》文中研究说明美国白蛾Hyphantria cunea（Drury）属鳞翅目（Lepidoptera）灯蛾科（Arctiidae）昆虫,是一种重要的世界性检疫害虫,也是我国重大入侵害虫之一。由于其寄主范围广、繁殖能力强和传播速度快等特点,对我国森林资源、农林业生产和生态建设造成了严重损失。据国家林业局2018年第3、4号公告显示,我国美国白蛾疫区已涉及全国11个省（区、市）的572个县级行政区。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前研究最成熟、应用最广泛的杀虫微生物,具有特异性强、环境友好和使用便捷等诸多优点,已经成功用于多种重要农林业害虫的防治,但用于美国白蛾防治的报道却相对较少。本研究对本实验室保存的15株Bt野生菌株进行生物活性测定,筛选出5株对美国白蛾具有高效杀虫活性的Bt菌株,分别为G31、GS24、GS31、GS36和GS70。该5株Bt菌株对美国白蛾一龄3 d幼虫的LC50（50%Lethal concentration）值为0.0840.268 mg/mL胞晶混合物,其中GS36菌株杀虫活性最高,LC50值为0.084 mg/mL胞晶混合物;表达晶体蛋白形态主要为大菱形、小菱形和圆球形等。5株菌株均含有多种cry基因且都含有cry1A和cry2A类基因,主要表达约130 kDa和60 kDa蛋白。从Bt菌株GS36中克隆了cry1Ab35基因（GenBank登录号KT692985）,开放阅读框（Openreadingframe,ORF）为3495bp,推测编码1181个氨基酸,编码蛋白分子量为133.6 kDa,等电点为4.74。构建了Bt工程菌HD1Ab35表达Cry1Ab35蛋白,分子量为140 kDa,晶体形态为小菱形。Cry1Ab35蛋白经胰蛋白酶消化,获得60 kDa的活化片段。Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫具有高效杀虫活性,LC50值为4.34μg/mL;对棉铃虫及甜菜夜蛾初孵幼虫杀虫活性较高,LC50值分别为24.31μg/mL和41.87μg/mL。克隆表达了Bt菌株GS36中enhancin-like基因（GenBank登录号MG012232）,开放阅读框为2202 bp,推测编码733个氨基酸,编码蛋白分子量为84 kDa,等电点为6.35,在重组大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达84 kDa蛋白。提取并纯化了粉纹夜蛾颗粒体病毒（Trichoplusia nigranulovirus,TnGV）中约90 kDa的Enhancin蛋白。生物活性测定显示,分别加入20μg/mLEnhancin蛋白和100μg/mL Enhancin-like蛋白可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫的杀虫活性分别提高4.93倍及4.21倍;加入1.0×105 PIBs/mL美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cuneanuclearpolyhedrosisvirus,HcNPV）可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾三龄2 d幼虫的杀虫活性提高11.16倍,单独Enhancin蛋白、Enhancin-like蛋白和1.0×105 PIBs/mL HcNPV对美国白蛾一龄3 d幼虫和三龄2 d幼虫均无杀虫活性。因此,TnGV中Enhancin蛋白、GS36菌株编码Enhancin-like蛋白、HcNPV三种增效因子可显着增加Cry1Ab35蛋白对美国白蛾的杀虫活性。通过配体杂交（Ligandblot）及质谱（Mass spectrometry,LC-MS/MS）分析技术,分离鉴定了美国白蛾幼虫中肠BBMV（Brush border membrane vesicle）上Cry1Ab35蛋白主要结合蛋白氨肽酶N（Aminopeptidase N,APNs）。结合美国白蛾中肠转录组数据,克隆鉴定了5个hcapn基因,分别为hcapn2（KY949254）、hcapn3（KY949256）、hcapn5（KY949257）、hcapn6（KY949258）和hcapn8（KY949259）。5个hcapn基因的开放阅读框分别为2811、3072、2817、2877和2796 bp,分别编码936、999、938、958和930个氨基酸,预测蛋白分子量分别为105、114、106、110和106 kDa。HcAPNs蛋白与已公布的HcAPN1（KP053647）和HcAPN4（KJ013598）蛋白具有相似的结构特征,即N端信号肽序列,谷氨酸锌化氨肽酶GAMEN基序及锌指结合基序HEXXH（X）18E,除HcAPN1和HcAPN6蛋白外,HcAPNs蛋白均具有C端糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol,GPI）锚定位点,均含有多个O-糖基化位点及N-糖基化位点。7个hcapns基因均在美国白蛾幼虫中肠和后肠组织表达量高,美国白蛾幼虫饲喂Cry1Ab35蛋白后,hcapns基因均表现为1224 h表达水平显着上升。利用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统表达了重组HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3、HcAPN4、HcAPN5、HcAPN6和HcAPN8蛋白,分子量分别为130、110、120、115、120、130和120kDa。配体杂交显示HcAPNs蛋白均能与Cry1Ab35蛋白活化片段结合。利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术探索了HcAPNs蛋白在Cry1Ab35蛋白在美国白蛾杀虫机制中的功能。分别用dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn4/-hcapn5/-hcapn6/-hcapn8注射美国白蛾三龄2d幼虫,3 d后靶标hcapns基因表达水平分别下降了91.9%、72.0%、87.2%、64.0%、68.3%、64.0%和67.1%。将注射ddH2O和dsRNA-egfp/-hcapns的幼虫用含有Cry1Ab35蛋白的饲料饲养5 d后,幼虫校正死亡率分别为70.8%、74.5%、51.4%、41.7%、49.6%、61.1%、50.3%、62.5%和63.9%。注射dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn5的幼虫校正死亡率显着低于注射ddH2O及dsRNA-egfp/-hcapn4/-hcapn6/-hcapn8的幼虫校正死亡率。因此,推测美国白蛾中肠HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3和HcAPN5蛋白为Cry1Ab35蛋白潜在的功能受体。
邵新峰[4]（2014）在《两种杆状病毒ENHANCIN的真核表达和棉铃虫围食膜蛋白质组研究》文中研究说明相对于化学农药,生物杀虫剂虽然具有杀虫后持续效果好、不污染环境、不伤害天敌、对人类和其它高等动物无害等诸多优点,但也有自身的缺陷,例如杀虫速度相对缓慢、害虫抗性日益严重等。研究表明围食膜是昆虫最重要的抵御杀虫剂的组织。昆虫杆状病毒增效蛋白（ENHANCIN）具有金属蛋白酶活性,可能通过破坏宿主围食膜的完整结构或者介导病毒与昆虫中肠上皮细胞融合,进而加速病毒粒子的入侵,提高病毒和其他病原物的感染性。因此,ENHANCIN在提高杀虫效率方面具有广阔的应用前景。为揭示AsGV ENHANCIN蛋白的介导分子功能机制,本研究利用AcMNPV Bac-to-Bac系统,将实验室前期获得的AsGV enhancin和AsGV enhancing-2679基因通过供体质粒pFastBacHT转座到穿梭质粒AcMNPV Bacmid中,随后转染昆虫细胞Sf9进行真核表达。结果成功构建出真核表达载体Bacmid-AsGV-En/2679并转染成功;为获得足量的TnGV ENHANCIN蛋白以研究其蛋白酶功能机制,本研究将实验室已构建好的重组杆状病毒真核表达质粒Bacmid-TnEn和含有报道基因EGFP的重组杆状病毒真核表达质粒Bacmid-TnEn-GFP,分别转染昆虫细胞Sf9,然后进行大批量的细胞悬浮表达及纯化。结果镜检发现转染3天后细胞出现病变,通过荧光显微镜观察到绿色荧光,收集细胞,电泳检测确定外源基因已成功表达;在以往的病原与昆虫的互作研究方面,学者们往往更多关注于病原研究。然而,近年来人们日益认识到由于昆虫围食膜上的蛋白质关系到病原的作用方式、病原的定向改造方法以及昆虫抗药性机理等受体的研究,也是不可忽视的。因此本研究以棉铃虫（Helicoverpa armigera）为对象,通过液相色谱-质谱联用技术对其围食膜蛋白质进行分析,成功鉴定出97个蛋白质。分析发现这些蛋白质主要参与消化、免疫反应过程及解毒代谢等。这解释了围食膜不仅具有帮助中肠进行酶解食物等消化吸收作用,还参与昆虫的免疫防御过程,对中肠起到保护作用。为明确棉铃虫中肠围食膜蛋白的生理功能、寻找生物防治新靶标以及发展新的高效生物杀虫剂提供了理论依据。
胡原[5]（2014）在《小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析》文中指出小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulovirus, PlxyGV）属杆状病毒科β-杆状病毒属,是小菜蛾种群的重要天然控制因子。虽然PlxyGV已开发为商品化生物杀虫剂,但由于缺少支持PlxyGV离体复制的稳定受纳细胞系,PlxyGV分子生物学有关的研究工作相对滞后。本研究利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）构建了多个PlxyGV bacmids,试图建立PlxyGV基因操作和功能分析研究技术平台；在此基础上进一步开展了PlxyGV离体复制和基因表达分析。（1）通过直接克隆和λ-Red重组,在PlxyGV gran位点导入含F复制子、卡那霉素抗性基因（Kan）、lacZa基因和Tn7转座结合位点的细菌人工染色体载体片段构成PlxyGV bacmid vPxG。借助Bac-to-Bac系统,分别构建了由PlxyGV iel、vp39、gran或AcMNPV iel启动子控制egfp的PlxyGV荧光报告bacmid,依次为vPxGPiel-gfp、vPxGPvp39-gfp、vPxGPgran-gfp和vPxGPaciel-gfp。在vPxGPaciel-gfp转染的PxE2、Sf9和Hi5细胞培养皿以及vPxGPiel-gfp转染的Hi5培养皿中可见荧光细胞。vPxGPgran-gfp和vPxGPvp39-gfp分别转染的细胞培养皿中都未见荧光细胞。用四种PlxyGV荧光报告bacmids分别转染三种细胞系的上清液转接的新鲜细胞培养中均未见荧光细胞,表明在被转染细胞中未产生感染性病毒粒子。（2）通过基因克隆,构成含PlxyGV启动子控制egfp或luc的报告质粒。通过瞬时表达实验完成了对PlxyGV早期基因iel、exon0、dnapol、lefl、lef9和orf105启动子,晚期基因vp39启动子以及极晚期基因gran启动子在三种细胞中表达活性分析。荧光观察结果显示,在pPiel-gfp或pPdnapol-gfp转染Hi5细胞培养皿以及报告质粒和bMON14272共转染PxE2、Sf9和Hi5细胞培养皿中可见荧光细胞。定量结果显示,iel、exon0、dnapol、lefl、lef9和orf105等PlxyGV早期基因启动子在Hi5细胞中均有高水平的转录。结果表明,这些PlxyGV早期基因启动子在三种昆虫细胞系中能够不依赖其它病毒基因产物启动报告基因表达。（3）构成含PlxyGV hr的早期启动子报告质粒。通过瞬时表达实验完成了对PlxyGV hr序列的增强功能分析。结果显示,在PxE2细胞中,hrl、hr2、hr4和AcMNPV hr5对早期启动子（Piel、Pdnapol、Plefl和Plef9）具有增强作用。在Sf9细胞中,对早期启动子具有增强作用的是hrl、hr4和AcMNPV hr5。在Hi5细胞中,hrl、hr3、hr4和AcMNPV hr5对早期启动子具有增强作用,hr2对部分早期启动子（Piel、Pdnapol和Plefl）具有增强作用。结果表明,PlxyGV hr对早期基因表达具有增强作用。（4）通过瞬时表达实验,分析PlxyGV和AcMNPV iel蛋白对PlxyGV早期基因表达的调控作用。结果显示,PlxyGV iel抑制早期启动子控制报告基因表达；当PlxyGV hrl存在时这种抑制作用没有改变。AcMNPV iel对大多数PlxyGV早期启动子具有激活作用,而且当PlxyGVhr1存在时激活作用得到进一步加强。（5）利用AcMNPV bacmid系统分别完成了PlxyGV iap和f基因对AcMNPV p35和gp64基因的功能替代分析,发现PlxyGV iap不能功能性替代AcMNPV p35基因；证实PlxyGV f不能替代AcMNPV gp64。（6）构建了多个包含AcMNPV p35, iel和gp64基因单个或成对或全数的PlxyGV bacmids重组体。通过用所构建的PlxyGV bacmids重组体对三种昆虫细胞系的转染-感染实验发现AcMNPV p35无论是单独或其它两种基因一起插入PlxyGV基因组都能激活PlxyGV晚期基因vp39启动子控制的报告基因表达；AcMNPV iel增强p35的激活作用。AcMNPV p35、iel和gp64组合可以进一步增强报告基因表达；含AcMNPV p35、iel和gp64的PlxyGV bacmid转染Sf9和Hi5细胞可能产生了少量感染性病毒。
徐健,赵松,刘琴,杨青,李传明[6]（2013）在《转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性》文中进行了进一步梳理以东方粘虫为转宿主增殖的颗粒体病毒（PuGV Ps）DNA为模板通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段,纯化的PCR产物克隆到载体质粒pET 15b中,构建重组质粒pET 15b En,重组质粒外源基因测序证明PCR扩增产物是粘虫颗粒体病毒转宿主病毒PuGV Ps增效蛋白的全长基因。与原始美洲粘虫颗粒体病毒（PuGV）增效蛋白基因的序列比较,两者同源性达99.59%。11个突变碱基中有7个集中在5′端下游500 bp,而3′端上游500 bp仅1个碱基发生突变。PuGV Ps增效蛋白基因重组质粒pET 15b En转化到大肠杆菌中构建重组菌,在IPTG诱导下表达了108 kD的表达产物,Ni2+柱纯化证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Btδ内毒素对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性。
宋小凤[7]（2012）在《TnGV ENHANCIN原核表达产物功能验证及真核表达》文中认为增效蛋白（Enhancin）是一类主要由昆虫杆状病毒基因编码金属蛋白酶,分子量大小约89-110KDa,它通过破坏昆虫中肠围食膜的完整结构,加速病毒粒子的侵入,从而提高生物杀虫剂对害虫的感染效率。为了寻找和确定增效蛋白在昆虫中肠围食膜上的靶标蛋白和进一步揭示Enhancin蛋白的增效机制,本研究设计如下：以粉纹夜蛾颗粒体病毒（TnGV）的增效蛋白Tn-En为研究对象,体外扩增获得目的基因,并进行原核表达。通过SDS-PAGE、Western blot和Ni+亲和层析验证目的蛋白。利用初步纯化的增效蛋白进行生物测定,并提取棉铃虫5龄幼虫的围食膜进行增体外酶解实验。构建重组杆状病毒真核表达载体Bacmid-pFastBac-En和含有报道基因EGFP的真核表达载体Bacmid-pFastBac-En-EGFP,转染昆虫细胞Sf9,实现目的基因的真核表达,通过SDS-PAGE和Western blot技术进行验证。Tn-En基因的原核表达成功,生物测定结果显示3VE可以提高死亡率23.34%,4VE提高死亡率22.22%,5VE提高死亡率1.67%。体外降解实验发现围食膜上某种大分子量的蛋白可以被增效蛋白降解。转染重组质粒Bacmid-pFastBac-En-EGFP的细胞在倒置荧光显微镜下观察有绿色荧光存在,电泳及杂交证明融合蛋白真核表达成功,为非分泌型蛋白。重组基因Bacmid-pFastBac-En经SDS-PAGE电泳检测结果显示在真核系统中表达成功。
陈晓慧[8]（2011）在《黄地老虎颗粒体病毒ORF55基因的功能研究》文中研究指明增效蛋白（ENHANCIN）是一种主要由昆虫杆状病毒编码的金属蛋白酶,现已证明它可以促进核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus ,NPV）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）等多种经消化道作用的微生物杀虫剂对害虫的感染,在生物杀虫剂的推广应用和抗虫转基因植物等方面具有很强的应用潜力。本研究利用PCR技术从AsGV基因组中获得enhancin-like全基因及其N-端1020bp截短序列及N-端2679bp截短序列,并对全基因进行序列分析;以PET-32a和PET-28a为表达载体,重组表达质粒转化大肠杆菌（BL21（DE3））,构建全基因及两个截短体的原核表达菌株;纯化分离N-端1020bp的原核表达产物,免疫兔子制备AsGV ENHANCIN的特异性抗体;SDS-PAGE、Western Blot检测目的基因的原核表达,利用亲和层析纯化目的蛋白;初步纯化得到的目的蛋白和不同浓度的HaNPV混合感染3龄初棉铃虫（6日龄）,采用室内生物测定法,鉴定三个基因的原核表达产物对棉铃虫核型多角体病毒（HaNPV）感染性的增效作用。序列分析表明该基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,另外其拥有特异的C-端脯氨酸富集区,这些特征可能与其作用机制有关;实验获得AsGV ENHANCIN的特异性抗体,并实现AsGV的enhancin-like全基因及两个截短序列（N-端1020bp及N-端2679bp序列）的原核表达;生物测定实验表明,HaNPV浓度为1.17×102 PIBS/mL、1.17×103 PIBS/mL、1.17×104 PIBS/mL时,全蛋白能使幼虫死亡率分别提高16.25%、21.25%和12.5%,增效作用显着,而N-1020截短体则无增效作用,N-2679蛋白有微弱的增效作用。由于N-2679蛋白是舍弃全蛋白C-端脯氨酸富集区得到的蛋白,推测蛋白的C-端脯氨酸富集区在蛋白功能中发挥重要的作用,根据哺乳动物中脯氨酸富集区的功能,推测其发挥的是介导作用,全蛋白作为中介分子增效病毒的感染性。本文的研究为AsGV编码ENHANCIN的推测提供了实验依据,也为生物农药增效剂ENHANCIN的规模化生产和推广应用奠定了研究基础,也有助于丰富对ENHANCIN的增效机制的认识。
赵丹[9]（2011）在《苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析》文中研究表明病毒增效蛋白是金属蛋白酶,能够特异性降解昆虫肠粘蛋白（IIM）,从而增强病毒或是Bt杀虫晶体蛋白对昆虫的感染。蜡状芽孢杆菌组发现了芽孢杆菌属的基因组中含有enhancin -like基因,它编码的肽段与病毒的增效蛋白相似性为20%30%,研究发现苏云金杆菌BMB171中的Enhancin-like蛋白能够降解棉铃虫幼虫的肠粘蛋白从而增强cry1Ac蛋白对棉铃虫的毒性,与病毒增效蛋白的作用相似。细菌中Enhancin-like蛋白的增效作用是否具有广谱性尚不明确。本研究从实验室保存的Bt菌株中筛选并成功克隆得到enhancin-like基因,提交GenBank登记,登录号为JF806504。该基因读码框为2202个碱基,编码733个氨基酸,预测的蛋白质的分子量为84kDa。Blastn结果发现其与病毒增效蛋白的相似性为22%25%,与细菌增效蛋白的相似性为96100%,并且具有保守锌结合结构域（HEIAH）,属于金属蛋白酶超家族成员。将重组表达质粒pET30a-enhancin-like转化E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测,enhancin-like基因在E.coli BL21（DE3）成功表达84 kDa的蛋白,再将enhancin-like基因连接到穿梭载体pSXY422b,电激转化HD73-（cry-）,构建工程菌,Western blot分析表明,enhancin-like基因能在HD73-（cry-）中稳定表达。利用亲和层析的方法得到纯化的Enhancin-like蛋白。纯化的Enhancin-like蛋白体外处理粉纹夜蛾和甜菜夜蛾围食膜,围食膜肠粘蛋白未降解。生物活性测定纯化的Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾幼虫,与单独用Cry9Ea蛋白饲喂粉纹夜蛾时,死亡率均为60%,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾时死亡率显着提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时无杀虫活性。用Cry9Ea蛋白单独饲喂甜菜夜蛾时,死亡率为5%,Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂后死亡率没有变化,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂甜菜夜蛾时死亡率显着提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时则无杀虫活性。生测结果表明Enhancin-like蛋白没有增加Cry9Ea蛋白的毒性。
张小霞,陈晓慧,梁振普,曹素梅,许锋,乔冠华,尹新明[10]（2010）在《昆虫杆状病毒的增效蛋白》文中认为
二、TnGV增强蛋白在AcMNPV中的表达和活性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TnGV增强蛋白在AcMNPV中的表达和活性分析（论文提纲范文）
（1）杆状病毒AcMNPV PK-1互作蛋白的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒的发现及分类 |
| 1.1.2 杆状病毒感染周期 |
| 1.1.3 杆状病毒基因表达 |
| 1.1.4 杆状病毒开发应用 |
| 1.2 蛋白质定位及互作研究方法 |
| 1.2.1 酵母双杂交技术 |
| 1.2.2 免疫共沉淀技术 |
| 1.2.3 亚细胞定位 |
| 1.3 pk-1基因背景 |
| 1.4 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 酵母双杂交系统筛选与PK-1互作的蛋白 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒及载体 |
| 2.1.2 酶及试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 cDNA文库质量鉴定 |
| 2.2.2 PCR反应体系 |
| 2.2.3 回收目的片段及酶切产物 |
| 2.2.4 DNA酶连体系 |
| 2.2.5 质粒或连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.2.6 碱裂解法提取质粒 |
| 2.2.7 酶切体系及条件 |
| 2.2.8 制备酵母感受态细胞 |
| 2.2.9 诱饵载体自激活鉴定和毒性分析 |
| 2.2.10 酵母结合法筛选AcMNPV感染的Sf9细胞cDNA文库 |
| 2.2.11 PCR鉴定阳性克隆中文库质粒插入片段并测序分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 文库质量鉴定 |
| 2.3.2 诱饵载体的构建 |
| 2.3.3 自激活鉴定和毒性分析 |
| 2.3.4 利用酵母双杂交筛选与PK-1互作的阳性克隆 |
| 2.3.5 测序结果分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 免疫共沉淀验证互作 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒及载体 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 细胞及培养基 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的基因克隆及载体构建 |
| 3.2.2 CaCl2法制备DH10B感受态 |
| 3.2.3 Bacmid转座DH10B感受态 |
| 3.2.4 重组Bacmid提取 |
| 3.2.5 Sf9细胞复苏、传代及冻存 |
| 3.2.6 Bacmid转染Sf9细胞 |
| 3.2.7 病毒粒子感染Sf9细胞 |
| 3.2.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.2.9 SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.10 Western blot |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 扩增带标记基因的目的片段 |
| 3.3.2 构建重组载体 |
| 3.3.3 构建重组Bacmid |
| 3.3.4 重组Bacmid转染、感染Sf9细胞 |
| 3.3.5 免疫共沉淀实验 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 PK-1与AC24的亚细胞共定位 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒及载体 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 细胞及培养基 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.1.5 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 目的基因克隆及载体构建 |
| 4.2.2 重组Bacmid构建及重组病毒产生 |
| 4.2.3 亚细胞共定位 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PCR扩增目的基因片段 |
| 4.3.2 构建重组载体 |
| 4.3.3 重组Bacmid的构建 |
| 4.3.4 重组Bacmid转染、感染Sf9细胞 |
| 4.3.5 亚细胞共定位 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 ac24基因缺失、拯救型重组病毒的构建及缺失后对病毒的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株、质粒及载体 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 细胞及培养基 |
| 5.1.4 引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 目的基因克隆及载体构建 |
| 5.2.2 重组Bacmid构建 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 重组病毒的构建 |
| 5.3.2 重组病毒Bacmid转染细胞 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 使用的引物 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac132的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.2 杆状病毒的分类 |
| 1.1.3 杆状病毒的侵染周期 |
| 1.1.4 杆状病毒的结构蛋白 |
| 1.1.5 λ-Red同源重组及其在杆状病毒中的应用 |
| 1.1.6 杆状病毒载体表达系统 |
| 1.1.7 病毒侵染宿主的研究进展 |
| 1.2 杆状病毒Ac MNPV的基因:ac132 |
| 1.2.1 ac132概述 |
| 1.2.2 Ac132的相关研究 |
| 1.3 杆状病毒与宿主肌动蛋白 |
| 1.3.1 杆状病毒侵染与宿主肌动蛋白 |
| 1.3.2 杆状病毒运输与宿主肌动蛋白 |
| 1.4 杆状病毒侵染与宿主细胞能量代谢 |
| 1.5 杆状病毒的发展前景 |
| 1.6 论文的设计思路 |
| 1.6.1 研究内容与意义 |
| 1.6.2 研究方法及流程 |
| 1.6.3 实验流程 |
| 1.6.4 研究创新点 |
| 第二章 重组杆状病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP、AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的构建及Ac132-EGFP的表达分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及其配置 |
| 2.2.3 细胞、病毒、菌株及载体 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP和AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.3.2 重组病毒Ac MNPV-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.3.3 Sf9细胞的培养、复苏、传代及冻存 |
| 2.3.4 重组杆粒转染Sf9细胞 |
| 2.3.5 噬斑法测定重组病毒的滴度 |
| 2.3.6 Western blot及荧光显微镜观察分析Ac132-EGFP的表达量 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP的构建 |
| 2.4.2 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.4.3 重组病毒Ac MNPV-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.4.4 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP、AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的获得 |
| 2.4.5 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP、AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的滴度 |
| 2.4.6 荧光显微镜和Western blot检测Ac132-EGFP在Sf9细胞中的表达水平 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Ac132在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要试剂及其配制 |
| 3.2.3 载体、菌株、细胞、病毒 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Sf9细胞的培养 |
| 3.3.2 Western blot检测Ac132-EGFP在细胞核中的积累 |
| 3.3.3 Ac132蛋白的核定位信号序列预测分析 |
| 3.3.4 重组突变型病毒的构建 |
| 3.3.5 重组突变型杆粒转染Sf9细胞 |
| 3.3.6 噬斑法测定重组突变型病毒的滴度 |
| 3.3.7 噬斑法检测重组病毒子代病毒的增殖 |
| 3.3.8 荧光显微镜观察重组病毒对F-actin进和出细胞核的影响 |
| 3.3.9 Western blot检测重组病毒对 β-actin在细胞核内的聚集 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP侵染Sf9细胞中Ac132-EGFP在细胞核的积累 |
| 3.4.2 突变病毒AcMNPV~(ac132ko)-Ac132~(PPKK25-28AAAA)-EGFP的构建 |
| 3.4.3 突变病毒Ac MNPV-Ac132~(PPKK25-28AAAA)-EGFP的构建 |
| 3.4.4 重组突变病毒的获得 |
| 3.4.5 重组突变病毒的滴度 |
| 3.4.6 各种重组病毒子代病毒增殖的分析 |
| 3.4.7 荧光显微镜观察各种重组病毒对F-actin进和出细胞核的影响 |
| 3.4.8 Western blot分析各种重组病毒对 β-actin在细胞核中的聚集 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 重组杆状病毒对宿主细胞能量代谢的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要试剂及其配置 |
| 4.2.3 细胞、病毒 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Sf9细胞的培养 |
| 4.3.2 细胞种板 |
| 4.3.3 病毒侵染 |
| 4.3.4 葡萄糖浓度的测定 |
| 4.3.5 乳酸浓度的测定 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 各种重组病毒侵染Sf9细胞对宿主消耗葡萄糖的影响 |
| 4.4.2 各种重组病毒侵染Sf9细胞对宿主积累乳酸的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 美国白蛾简介 |
| 1.1.1 美国白蛾发生与为害状况 |
| 1.1.2 美国白蛾防治现状 |
| 1.2 苏云金杆菌及杀虫蛋白概述 |
| 1.2.1 苏云金杆菌Bt概况 |
| 1.2.2 Bt杀虫蛋白种类 |
| 1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白的进化 |
| 1.2.4 Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.2.5 Bt杀虫晶体蛋白作用机制 |
| 1.2.6 Bt杀虫蛋白增效途径 |
| 1.3 Bt杀虫蛋白在昆虫中肠受体 |
| 1.3.1 氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN) |
| 1.3.2 钙粘蛋白(Cadherin,CAD) |
| 1.3.3 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP) |
| 1.3.4 ABC转运体(ATP-binding cassette transporter,ABC) |
| 1.3.5 其它受体蛋白 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 对美国白蛾高效活性Bt菌株的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要溶液及试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定 |
| 2.2.2 Bt菌株晶体形态观察 |
| 2.2.3 Bt菌株cry基因型鉴定 |
| 2.2.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定 |
| 2.3.2 Bt菌株晶体形态观察 |
| 2.3.3 Bt菌株cry基因型鉴定 |
| 2.3.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 对美国白蛾高效Cry1Ab35蛋白的表达及活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 菌株及质粒 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要溶液及试剂 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Bt菌株质粒的提取 |
| 3.2.2 cry1Ab35基因的克隆与原核表达 |
| 3.2.3 Bt工程菌HD1Ab35的构建 |
| 3.2.4 Bt工程菌HD1Ab35晶体蛋白提取 |
| 3.2.5 Cry1Ab35蛋白浓度的测定 |
| 3.2.6 Cry1Ab35蛋白抗体的制备 |
| 3.2.7 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 cry1Ab35基因的克隆与序列分析 |
| 3.3.2 cry1Ab35基因的原核表达 |
| 3.3.3 工程菌HD1Ab35的构建及鉴定 |
| 3.3.4 工程菌HD1Ab35晶体蛋白形态观察 |
| 3.3.5 工程菌HD1Ab35晶体蛋白的表达及定量 |
| 3.3.6 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性增效因子 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试昆虫 |
| 4.1.2 菌株及质粒 |
| 4.1.3 昆虫病毒 |
| 4.1.4 主要溶液及试剂 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 TnGV的增殖、提取与纯化 |
| 4.2.2 TnGV Enhancin蛋白的制备 |
| 4.2.3 Bt GS36菌株enhancin-like基因的克隆 |
| 4.2.4 Enhancin-like蛋白的原核表达 |
| 4.2.5 Enhancin-like蛋白的提取与纯化 |
| 4.2.6 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 TnGV Enhancin蛋白的检测 |
| 4.3.2 enhancin-like基因的克隆及序列分析 |
| 4.3.3 enhancin-like基因的原核表达 |
| 4.3.5 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白的鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 菌株及质粒 |
| 5.1.3 主要溶液及试剂 |
| 5.1.4 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Cry1Ab35蛋白的活化 |
| 5.2.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的提取 |
| 5.2.3 Ligandblot检测Cry1Ab35蛋白结合蛋白 |
| 5.2.4 Cry1Ab35蛋白结合蛋白LC-MS/MS分析 |
| 5.2.5 美国白蛾幼虫及组织样本制备 |
| 5.2.6 美国白蛾总RNA的提取及cDNA合成 |
| 5.2.7 hcapns基因的克隆与序列分析 |
| 5.2.8 hcapns基因时空表达分析 |
| 5.2.9 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Cry1Ab35蛋白的活化 |
| 5.3.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的检测 |
| 5.3.3 Cry1Ab35蛋白美国白蛾中肠BBMV结合蛋白的鉴定 |
| 5.3.4 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白质谱分析 |
| 5.3.5 hcapns基因的克隆 |
| 5.3.6 hcapns基因序列分析 |
| 5.3.7 hcapns基因时空表达分析 |
| 5.3.8 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达水平分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 美国白蛾HcAPNs蛋白的表达及功能分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 供试昆虫 |
| 6.1.2 菌株及质粒 |
| 6.1.3 培养基及试剂 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达 |
| 6.2.2 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析 |
| 6.2.3 hcapns基因RNAi及功能分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 重组Bacmid-hcapns的构建 |
| 6.3.2 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达 |
| 6.3.3 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析 |
| 6.3.4 dsRNA的合成及检测 |
| 6.3.5 注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcapns后hcapns基因表达水平检测 |
| 6.3.6 注射dsRNA-hcapns美国白蛾幼虫对Cry1Ab35蛋白敏感性测定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（4）两种杆状病毒ENHANCIN的真核表达和棉铃虫围食膜蛋白质组研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 昆虫病毒简介 |
| 1.2 昆虫病毒研究的现实意义 |
| 1.2.1 害虫防治 |
| 1.2.2 外源基因表达载体 |
| 1.3 昆虫病毒的分类 |
| 1.4 杆状病毒科 |
| 1.4.1 杆状病毒的分类 |
| 1.4.2 杆状病毒的结构 |
| 1.4.3 杆状病毒的基因组 |
| 1.4.4 杆状病毒表达载体系统的研究 |
| 1.4.5 杆状病毒作为杀虫剂的优缺点及解决方向 |
| 1.4.6 围食膜的结构及研究进展 |
| 1.4.7 蛋白质组学研究进展 |
| 1.4.8 增效蛋白简介 |
| 1.4.9 增效蛋白的特征及作用机制 |
| 1.4.10 增效蛋白的应用及研究展望 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒、病毒、细胞系和昆虫 |
| 3.1.2 酶和其他试剂 |
| 3.1.3 溶液及培养基 |
| 3.1.4 耗材与仪器 |
| 3.1.5 引物合成和测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 AsGV-En、AsGV-En-2679真核表达载体构建 |
| 3.2.2 细胞贴壁培养 |
| 3.2.3 细胞悬浮培养 |
| 3.2.4 AsGV-En/2679的真核表达 |
| 3.2.5 TnGV-En、TnGV-En-GFP真核表达及纯化 |
| 3.2.6 棉铃虫中肠围食膜的提取 |
| 3.2.7 棉铃虫中肠围食膜蛋白质的分离和鉴定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 AsGV-En/2679的真核表达 |
| 4.1.1 重组克隆载体pFastBacHT-En/2679的构建 |
| 4.1.2 重组穿梭质粒Bacmid-2679/En的构建 |
| 4.1.3 AsGV-En/2679的真核表达 |
| 4.2 TnGV-En、TnGV-En-GFP的表达 |
| 4.2.1 TnGV-En、TnGV-En-GFP转染 |
| 4.2.2 TnGV-En、TnGV-En-GFP的大量表达 |
| 4.2.3 TnGV-En-GFP纯化 |
| 4.3 棉铃虫围食膜蛋白质鉴定结果 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（5）小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 本文缩写符号 |
| 目录 |
| 1. 绪论 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 两相复制周期 |
| 1.1.2 基因表达调控 |
| 1.1.3 同源重复区和IE1 |
| 1.1.4 抗细胞凋亡基因 |
| 1.1.5 杆状病毒的应用 |
| 1.2 颗粒体病毒 |
| 1.2.1 β-杆状病毒 |
| 1.2.2 β-杆状病毒的离体复制 |
| 1.3 杆状病毒基因操作 |
| 1.3.1 早期研究使用的方法 |
| 1.3.2 bacmid构建方法与Bac-to-Bac系统 |
| 1.3.3 λ-Red重组技术 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2. 小菜蛾颗粒体病毒荧光报告Bacmid的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 2.2.2 细胞系和病毒株 |
| 2.2.3 常用质粒 |
| 2.2.4 培养基和抗生素 |
| 2.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 2.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 2.2.7 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 2.3.2 Bacmid相关实验方法 |
| 2.3.3 质粒和bacmids构建 |
| 2.3.4 细菌菌株构建 |
| 2.3.5 细胞培养、转染和感染 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PlxyGV bacmid vPxG的构建 |
| 2.4.2 荧光报告PlxyGV bacmids的构建 |
| 2.4.3 PlxyGV bacmid对三种昆虫细胞系的转染-感染实验分析 |
| 2.5 讨论 |
| 3. 小菜蛾颗粒体病毒在三种昆虫细胞系中的基因表达分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 3.2.2 细胞系和病毒株 |
| 3.2.3 常用质粒 |
| 3.2.4 培养基和抗生素 |
| 3.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 3.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 3.2.7 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 3.3.2 瞬时表达质粒构建 |
| 3.3.3 瞬时表达实验 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PlxyGV早、晚期启动子和hr序列的转录因子结合位点 |
| 3.4.2 PlxyGV早、晚期启动子在三种昆虫细胞系中转录活性分析 |
| 3.4.3 PlxyGV hrs对早期启动子转录活性的影响 |
| 3.4.4 iel蛋白对早期启动子转录活性的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 4. AcMNPV p35、iel和gp64基因对PlxyGV重组体的功能拯救 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 大肠杆菌菌株 |
| 4.2.2 细胞系和病毒株 |
| 4.2.3 常用质粒 |
| 4.2.4 培养基和抗生素 |
| 4.2.5 酶,化学试剂和试剂盒 |
| 4.2.6 常用缓冲液及溶液 |
| 4.2.7 引物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 常规分子生物学实验方法 |
| 4.3.2 Bacmid相关实验方法 |
| 4.3.3 质粒和bacmids构建 |
| 4.3.4 细菌菌株构建 |
| 4.3.5 细胞培养、转染和感染 |
| 4.3.6 透射电子显微镜分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 PlxyGVf不能功能性替代AcMNPV gp64 |
| 4.4.2 PlxyGV iap1和iap2不能功能性替代AcMNPVp35 |
| 4.4.3 AcMNPV p35和ie1基因对PlxyGV离体复制的拯救 |
| 4.5 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 |
| 为本论文提供支持的国家自然科学基金项目 |
| 致谢 |
（6）转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 Pu GV-Ps基因组DNA及质粒DNA提取 |
| 1.2.2 Pu GV-Ps增效蛋白基因的PCR扩增 |
| 1.2.3 Pu GV-Ps增效蛋白基因重组质粒的构建和测序 |
| 1.2.4 大肠杆菌转化菌株的诱导表达和纯化 |
| 1.2.5 增效蛋白表达产物对Btδ-内毒素的增效活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Pu GV-Ps增效蛋白基因的PCR扩增 |
| 2.2 Pu GV-Ps增效蛋白基因的克隆和测序 |
| 2.3 重组增效蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.4 重组增效基因表达产物对Btδ-内毒素的增效活性 |
| 3 讨论 |
（7）TnGV ENHANCIN原核表达产物功能验证及真核表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 昆虫杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.2 杆状病毒杀虫剂的应用研究 |
| 1.1.3 杆状病毒表达载体的研究 |
| 1.2 昆虫中肠围食膜的研究简介 |
| 1.3 增效蛋白 |
| 1.3.1 增效蛋白简介 |
| 1.3.2 增效蛋白的命名 |
| 1.3.3 增效蛋白的来源 |
| 1.3.4 增效蛋白的分子生物学特征 |
| 1.3.5 增效蛋白的作用模式 |
| 1.3.6 增效蛋白的开发与应用 |
| 2. 引言 |
| 3. 材料与方法 |
| 3.1 材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 载体 |
| 3.1.3 常用药品 |
| 3.1.4 培养基及试剂 |
| 3.1.5 细胞培养所用的试剂 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HaNPV病毒纯化 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 目的基因的克隆 |
| 3.2.4 目的基因的原核表达和功能鉴定 |
| 3.2.5 目的基因的真核表达和功能鉴定 |
| 4. 结果与分析 |
| 4.1 目的基因的扩增 |
| 4.2 目的基因的原核表达 |
| 4.2.1 重组克隆载体pGEM-T-En的验证 |
| 4.2.2 重组表达载体pET-28a-En的验证 |
| 4.2.3 目的基因的原核表达 |
| 4.2.4 Western blot鉴定 |
| 4.2.5 目的蛋白的纯化 |
| 4.3 目的蛋白的功能鉴定 |
| 4.3.1 生物测定结果 |
| 4.3.2 体外孵育 |
| 4.4 目的基因的真核表达 |
| 4.4.1 重组克隆载体pGEM-T-En的验证 |
| 4.4.2 重组表达载体pEGFP-N1-En的鉴定 |
| 4.4.3 重组供体质粒pFastBacHT-A-En-EGFP的构建 |
| 4.4.4 重组穿梭质粒Bacmid-En-EGFP的构建 |
| 4.4.5 重组供体质粒pFastBacHT-A-En的构建 |
| 4.4.6 重组穿梭质粒Bacmid-En的构建 |
| 4.4.7 杆状病毒包装 |
| 4.4.8 目的基因En-EGFP的真核表达及Western blot鉴定 |
| 4.4.9 目的基因En的真核表达及Western blot鉴定 |
| 5. 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（8）黄地老虎颗粒体病毒ORF55基因的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒简介 |
| 1.2 增效蛋白简介 |
| 1.3 增效蛋白的发现及分布 |
| 1.3.1 增效蛋白的发现 |
| 1.3.2 增效蛋白的分布 |
| 1.4 增效蛋白的特征 |
| 1.4.1 分子特征 |
| 1.4.1.1 增效蛋白基因是晚期表达基因 |
| 1.4.1.2 增效蛋白的定位 |
| 1.4.1.3 增效蛋白拥有保守的锌结合位点 |
| 1.4.1.4 增效蛋白富含酸性氨基酸和可能的糖基化位点 |
| 1.4.1.5 增效蛋白氨基酸水平同源性差异较大 |
| 1.4.2 生化特征 |
| 1.4.2.1 金属蛋白酶性质 |
| 1.4.2.2 其他生化性质 |
| 1.5 增效蛋白的作用机制 |
| 1.5.1 介导学说 |
| 1.5.2 酶解学说 |
| 1.6 增效蛋白的应用研究 |
| 1.6.1 GV 与NPV 的复配 |
| 1.6.2 构建含增效蛋白基因的重组病毒 |
| 1.6.3 增效蛋白应用于植物转基因 |
| 1.6.4 增效蛋白工程菌株的构建 |
| 1.7 增效蛋白的研究展望 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 菌株与载体 |
| 3.1.2 酶和其它试剂 |
| 3.1.3 主要溶液 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.1.6 棉铃虫人工饲料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病毒纯化及AsGV 基因组制备 |
| 3.2.1.1 病毒纯化 |
| 3.2.1.2 病毒DNA 的制备 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 基因的克隆及序列分析 |
| 3.2.3.1 目的基因扩增 |
| 3.2.3.2 基因的克隆与测序 |
| 3.2.3.3 序列分析 |
| 3.2.4 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.5 目的蛋白的表达 |
| 3.2.5.1 蛋白诱导 |
| 3.2.5.2 蛋白提取 |
| 3.2.6 目的蛋白的纯化 |
| 3.2.7 抗体的制备 |
| 3.2.7.1 抗原准备 |
| 3.2.7.2 动物免疫及抗体效价检测 |
| 3.2.7.3 抗体特异性检测 |
| 3.2.8 目的蛋白的Western blot |
| 3.2.9 目的蛋白的功能鉴定 |
| 3.2.9.1 蛋白处理液的制备 |
| 3.2.9.2 生物测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 AsGV 基因组的制备 |
| 4.2 序列分析 |
| 4.3 目的基因的扩增 |
| 4.4 基因表达载体的构建 |
| 4.4.1 表达载体的构建策略 |
| 4.4.2 表达载体的验证 |
| 4.5 N-1020 蛋白的表达及优化 |
| 4.5.1 N-1020 蛋白的表达 |
| 4.5.2 表达条件的优化 |
| 4.6 抗体的制备和检测 |
| 4.6.1 抗原制备和抗体特异性鉴定 |
| 4.6.2 抗体的效价检测 |
| 4.7 全蛋白的表达及Western blot 鉴定 |
| 4.8 N-2679 蛋白的表达及纯化 |
| 4.9 生物测定结果分析 |
| 4.9.1 全蛋白生物测定结果 |
| 4.9.2 N-1020 蛋白生物测定结果 |
| 4.9.3 N-2679 蛋白生物测定结果 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 5.2.1 AsGV ORF55 的编码产物的增效作用 |
| 5.2.2 AsGV ORF55 编码产物的作用机制 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（9）苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 苏云金杆菌概述 |
| 1.1.1 苏云金杆菌的毒力因子 |
| 1.1.2 杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白的杀虫机理 |
| 1.1.4 杀虫晶体蛋白的应用 |
| 1.1.5 杀虫晶体蛋白与其它物质间的增效 |
| 1.1.6 苏云金杆菌存在的问题及解决方法 |
| 1.2 昆虫杆状病毒增效蛋白 |
| 1.2.1 昆虫杆状病毒增效蛋白的发现及其增效活性 |
| 1.2.2 增效蛋白的生化特性 |
| 1.2.3 增效蛋白的作用机理 |
| 1.2.4 昆虫病毒增效蛋白的应用 |
| 1.3 细菌中增效蛋白类似基因的发现及研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试昆虫与颗粒体病毒 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 常用仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 E. coli 质粒DNA 的提取 |
| 2.2.2 Bt 菌株质粒DNA 的提取 |
| 2.2.3 enhancin-like 基因的克隆 |
| 2.2.4 基因的序列的测定与分析 |
| 2.2.5 enhancin-like 基因在E. coli 中的诱导表达 |
| 2.2.6 目的蛋白的纯化 |
| 2.2.7 目的蛋白的定量及抗体制备 |
| 2.2.8 工程菌的构建 |
| 2.2.9 Western blot 检测外源蛋白的表达 |
| 2.2.10 Cry9Ea 蛋白的制备及蛋白浓度测定 |
| 2.2.11 粉纹夜蛾颗粒体病毒TnGV 的活体增殖与纯化 |
| 2.2.12 Enhancin-like 蛋白体外处理围食膜 |
| 2.2.13 Enhancin-like 蛋白对Cry9Ea6 蛋白的增效作用分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 enhancin-like 基因的PCR 鉴定 |
| 3.2 enhancin-like 基因的克隆 |
| 3.3 enhancin-like 基因的序列测定与分析 |
| 3.4 enhancin-like 基因在E. coli 中的诱导表达 |
| 3.5 enhancin-like 蛋白的纯化及定量 |
| 3.6 Bt 工程菌的构建和分子检测 |
| 3.7 工程菌HDenhancin-like 的western bolt 分析 |
| 3.8 Enhancin-like 蛋白对围食膜的作用 |
| 3.9 Enhancin-like 蛋白与Cry9Ea 蛋白的协同作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 缩略词 |
| 附录 2 GenBank 登记资料 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）昆虫杆状病毒的增效蛋白（论文提纲范文）
| 1 增效蛋白及其分布 |
| 1.1 增效蛋白的发现 |
| 1.2 增效蛋白的分布 |
| 2 增效蛋白的特征 |
| 2.1 分子特征 |
| 2.1.1 增效蛋白基因是晚期表达基因 |
| 2.1.2 增效蛋白基因的下游不存在典型的Ploy (A) |
| 2.1.3 增效蛋白的定位 |
| 2.1.4 增效蛋白拥有保守的锌结合位点 |
| 2.1.5 增效蛋白富含酸性氨基酸和可能的糖基化位点 |
| 2.1.6 增效蛋白氨基酸水平同源性差异较大 |
| 2.2 生化特征 |
| 2.2.1 金属蛋白酶性质 |
| 2.2.2 其他生化性质 |
| 3 增效蛋白的作用机制 |
| 3.1 介导学说 |
| 3.2 酶解学说 |
| 4 增效蛋白的应用研究 |
| 4.1 GV与NPV的复配 |
| 4.2 构建含增效蛋白基因的重组病毒 |
| 4.3 增效蛋白应用于植物转基因 |
| 4.4 增效蛋白工程菌株的构建 |
| 5 结语与展望 |
四、TnGV增强蛋白在AcMNPV中的表达和活性分析（论文参考文献）
- [1]杆状病毒AcMNPV PK-1互作蛋白的筛选及功能研究[D]. 古小梅. 扬州大学, 2021(08)
- [2]AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac132的功能研究[D]. 彭跃有. 山西大学, 2019(01)
- [3]美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究[D]. 张雅昆. 河北农业大学, 2018(02)
- [4]两种杆状病毒ENHANCIN的真核表达和棉铃虫围食膜蛋白质组研究[D]. 邵新峰. 河南农业大学, 2014(06)
- [5]小菜蛾颗粒体病毒荧光报告bacmid系统构建和基因表达分析[D]. 胡原. 华中师范大学, 2014(07)
- [6]转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性[J]. 徐健,赵松,刘琴,杨青,李传明. 中国生物防治学报, 2013(03)
- [7]TnGV ENHANCIN原核表达产物功能验证及真核表达[D]. 宋小凤. 河南农业大学, 2012(07)
- [8]黄地老虎颗粒体病毒ORF55基因的功能研究[D]. 陈晓慧. 河南农业大学, 2011(08)
- [9]苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析[D]. 赵丹. 河北农业大学, 2011(08)
- [10]昆虫杆状病毒的增效蛋白[J]. 张小霞,陈晓慧,梁振普,曹素梅,许锋,乔冠华,尹新明. 病毒学报, 2010(05)