一、介导RNAi的tRNA~(Val)启动子质粒载体的建立（论文文献综述）
董昌[1]（2021）在《酿酒酵母合成生物学新技术及中心代谢流重编程的研究》文中提出酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是目前研究最为透彻的模式真核生物,近几十年来极大地推动了分子生物学、代谢工程、基因组学和合成生物学等多个领域的发展。作为一种理想的微生物细胞工厂,酿酒酵母也被广泛应用于多种高附加值化合物的规模化生产。本论文主要以酿酒酵母为研究对象,探究发展了新型的代谢工程调控工具,并对酿酒酵母葡萄糖去阻遏效应调控靶点进行全基因组筛选。首先,通过优化CRISPR/Cas9系统,首次在酿酒酵母中利用单一的Cas9-VPR核酸酶实现了基因组多位点同时激活、抑制和编辑（CRISPR-ARE系统）。CRISPR-ARE系统介导的基因敲除效率接近100%,基因转录增强可达到3.8倍左右,基因抑制效率可达到60%以上。将CRISPR-ARE系统应用于代谢工程提升α-檀香烯产量时,同时完成了菌株中HMG1基因的激活、ERG9基因的抑制和UPC2基因的编辑。相比较于出发菌株,单步基因操作即实现了目标产物α-檀香烯产量2.66倍的提升。随后,通过敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧途径构建了丙酮酸脱羧酶敲除菌（Pdc菌株）,并在此基础上引入了细胞质定位的丙酮酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶菌株,PDH菌株）。本研究以这两个模型菌株出发进行了全基因组筛选来鉴定葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点。利用基于多功能CRISPR体系的可追踪全基因组进化技术MAGIC对酿酒酵母在全基因组水平进行了多模式代谢调控（基因激活、抑制和敲除）和筛选。第一轮全基因组规模筛选获得了 70个可以解除葡萄糖阻遏从而恢复Pdc菌株在葡萄糖培养基上生长的基因靶点;而后通过多轮的全基因组建库和高通量筛选的迭代进化,获得了大量的葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点并分别选择了 33个和34个靶点进行逆向代谢工程验证。经过三轮迭代进化,创建的工程菌株（Pdc-R3和PDH-R3）中的葡萄糖阻遏效应逐渐减弱,对葡萄糖的利用能力逐步提高,且具备较强的中间产物丙酮酸积累能力（超过3g/L）、目标产物R-BDO合成能力（超过5g/L）以及混合碳源的共利用能力,具有发展成为利用廉价混合碳源生产高附加值化合物的平台细胞工厂的潜力。最后,考虑到Pdc及其衍生菌株线粒体内增加的碳代谢流,将整个代谢途径共定位至线粒体的区室化工程具有潜在的代谢工程应用价值。多基因代谢途径共定位往往需要借助多个不同信号肽,因此本研究表征和构建了一系列的酿酒酵母线粒体定位信号肽,并探究其在实验室菌株和Pdc平台菌株中的代谢工程应用。通过生长补偿、荧光共聚焦等方式系统地表征了 18个并从中筛选出7个具备良好线粒体定位能力的线粒体定位信号肽。在代谢工程验证中,通过筛选获得的信号肽将完整的甲羟戊酸途径定位至线粒体后,α-檀香烯产量提升至对照菌株的4倍。将线粒体α-檀香烯途径应用于工程菌株PDH-R3中时,其α-檀香烯产量相较于野生型提升了约50%。本论文开发了一种酿酒酵母的代谢调控工具,可以便捷实现基因组多位点多模式协同调控;同时借助新型的CRISPR/Cas工具,对酿酒酵母全基因组进行多模式代谢调控（基因激活、抑制和敲除）,筛选葡萄糖去阻遏效应相关靶点并构建能够积累丙酮酸和乙酰辅酶A的平台菌株。本研究为全面解析葡萄糖阻遏效应的分子机制和构建高效酿酒酵母细胞工厂奠定了基础。
汤小美[2]（2021）在《柑橘抗溃疡病基因的挖掘与基因编辑体系优化》文中研究指明柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌（Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc）造成的细菌性病害,严重制约着柑橘产业的发展。大多数柑橘栽培品种易感染溃疡病,生产中溃疡病的防治主要是通过农药来控制,极大的增加了生产成本。柑橘种质资源丰富,可分为原始、野生和栽培品种,而关于原始或野生柑橘对溃疡病的抗病性及分子调控机制研究还比较有限。因此,本研究首先从野生柑橘资源入手,鉴定抗柑橘溃疡病的种质,发现原始柑橘酒饼簕（Atalantia buxifolia）对溃疡病具有较强的抗性,系统地研究了酒饼簕抗溃疡病的分子机制。同时,通过比较转录组学挖掘到了酒饼簕中潜在的抗性基因,并对其功能进行了初步分析。另外,柑橘传统育种常常受到胚珠败育、珠心胚干扰、以及童期长等问题的限制,育种效率较低。随着CRISPR/Cas9技术的出现,作物分子育种的进程得到了极大提高,目前该技术已经应用在柑橘抗病材料的创制。然而,基因编辑系统在柑橘上还存在编辑和突变率低的问题,关于如何优化柑橘基因编辑体系的研究还比较有限。本研究以甜橙为研究材料,探索了PTG/Cas9（polycistronic tRNA-sgRNA/Cas9）多靶点系统在柑橘基因编辑中的应用。主要研究结果如下:1、野生柑橘资源的抗病性评价。为发掘抗溃疡病的种质资源,本研究对柑橘属柑橘亚科的10个野生和栽培柑橘资源的抗性进行评价。结果表明,野橘、野柚和枸橼对柑橘溃疡病表现出不同程度的感病性,野生柑橘资源紫皮柚对溃疡病较为敏感,然而,柑橘的远缘野生资源酒饼簕对溃疡病表现出了极强的抗性。2、酒饼簕响应溃疡病菌的差异表达基因分析。通过分析酒饼簕与甜橙接种溃疡病菌的转录组数据,发现酒饼簕差异表达的基因主要是在接种48 h,对这个时期上调表达的差异基因进行GO富集分析,发现酒饼簕上调表达的基因主要富集在防卫响应和响应生物逆境通路,而感病甜橙上调表达基因主要富集在多糖代谢和催化通路。3、酒饼簕抗溃疡病分子调控机制的解析。甜橙基础转录因子CsTFIIAγ可以稳定溃疡病菌效应因子（PthA4）与感病基因LOB1启动子的效应子结合原件（EBE）的结合,而酒饼簕TFIIAγ（AbTFIIAγ）与甜橙TFIIAγ（CsTFIIAγ）存在3个氨基酸的差异。荧光素酶互补和GST pull down实验结果表明,突变的AbTFIIAγ虽然可以与病原菌TALE TFBs结合,但AbTFIIAγ的功能互补实验结果表明,AbTFIIAγ不能够支持由TALE诱导的LOB1基因表达。另外,通过分析AbLOB1和Cs LOB1的启动子序列,发现这2个启动子EBE上存在2个核苷酸的差异,进一步启动子活性实验结果表明,由Pth A4诱导的AbLOB1的启动子活性显着低于Cs LOB1的启动子活性。以上研究结果说明,AbTFIIAγ基因和AbLOB1启动子EBE的自然变异对于酒饼簕的抗病性是非常重要的。我们推测酒饼簕主要是通过降低感病基因LOB1的表达和激活植物自身的抗性响应基因表达来增强其对溃疡病的抵抗力。AbTFIIAγ基因和AbLOB1启动子EBE的自然突变位点为柑橘溃疡病抗性育种提供了一个有利的靶点。4、酒饼簕防御相关基因的发掘与功能验证。进一步对接种Xcc的酒饼簕和甜橙叶片转录组差异基因进行分析,发现COMT基因在酒饼簕中显着诱导上调表达,而在感病甜橙中诱导表达无显着变化。超量表达AbCOMT增加了柑橘叶片褪黑素含量,并且在一定程度上增强了其对溃疡病的抗性。5、甜橙高效基因编辑体系优化。通过将YAO启动子驱动的不同PTG/Cas9载体稳定转化甜橙上胚轴,一共获得了73个基因编辑苗,并且实现了对多靶点的基因编辑。通过优化甜橙的遗传转化体系,极大的提高了暗柳橙的转化效率。对获得的CsPDS基因编辑嵌合苗进行热激处理,显着提高了CsPDS基因突变效率。本研究为下一步对柑橘防御相关基因的高效多基因编辑提供了有效的分子工具。
张天豹[3]（2020）在《胡麻种子发育和脂肪酸代谢相关microRNAs的鉴定和功能分析》文中认为胡麻是我国特色油料作物之一,可在冷凉贫瘠的土地上生长,耐逆性较强。胡麻油含有多种不饱和脂肪酸,如油酸、亚油酸、α-亚麻酸等。与常见的食用油相比,胡麻油中α-亚麻酸含量高达40%-60%,被称为植物中的“深海鱼油”。胡麻油可以修复更新脑神经细胞膜的不饱和脂肪酸链,具有健脑、促智、降血脂、抗血小板聚集和预防血栓形成等作用。胡麻油还含有人体所需的18种氨基酸、3种维生素（A、E、B1）和8种微量元素以及膳食纤维等,是一种高营养价值的食用植物油。深入了解胡麻种子形成及其发育过程中的遗传调控机理,对培育高含油率和产油量的胡麻品种具有重要意义。本论文运用高通量测序技术和分子生物学方法,鉴定胡麻种子发育中与脂肪酸代谢相关的miRNA,研究它们之间的调控机制。以Macbeth和黑亚14号两个品种为实验材料,选取4个发育阶段的种子测定种子含油率,构建miRNA文库。随着种子不断发育,含油率逐渐升高。通过高通量测序技术,从品种Macbeth的4个种子miRNA文库中共得到235个miRNAs,包含114个已知miRNAs和121个新预测miRNAs,其中21 nt长度的miRNAs数量最多。从品种黑亚14号4个种子miRNA文库鉴定到238个miRNAs,结果显示与Macbeth共同表达的miRNAs达230个,其中一些miRNAs的表达趋势与种子含油率的变化趋势在两个品种中基本一致。miR156a、miR397b在种子发育早期表达量低,含油率也低,到种子发育后期,miR156a、miR397b表达量升高,含油率也升高。通过靶基因裂解位点分析,验证了 miR156a的5个靶基因的裂解位点和miR397b的1个靶基因的裂解位点。通过对T3代的拟南芥进行表型分析,发现过表达胡麻miR156a不仅可以调控莲座叶数目和开花时间,还可以降低种子总含油量、改变脂肪酸的组成,尤其是α-亚麻酸、亚油酸和硬脂酸的含量显着性降低。通过分析脂肪酸通路中相关基因的表达量,发现脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD3以及脂肪酸延长酶基因FAE1表达量下调。而过表达胡麻miR397b既可以增加莲座叶数目、降低株高,还可以提高种子总含油量和α-亚麻酸含量。通过分析野生型和转基因株系的转录组测序结果,发现与脂肪酸代谢通路相关的LEA3、FAD8、DOF5.7、LPAT5基因的表达量升高,这些结果表明miR397b参与调控脂肪酸合成。另外,为了进一步研究这些miRNAs在胡麻中的功能,通过农杆菌介导法,将这两种miRNAs转化胡麻,获得了T1代转基因种子,为今后在胡麻中进行功能研究奠定了基础。
李晨曦[4]（2020）在《基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制》文中研究指明日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）属于黄病毒科黄病毒属,能够引起人的中枢神经系统损伤和猪的繁殖障碍等疾病,在自然界中主要是通过蚊虫叮咬进行传播,蚊子是病毒的传播宿主,水禽和猪是病毒主要的扩增宿主。根据病毒E基因序列可将JEV分为五个基因型,即基因I、II、III、IV、V型（GI、II、III、IV、V）。从上世纪30年代到20世纪末,GⅢ型毒株一直占据着亚洲地区JEV流行的主要地位,但最近二十年GⅠ型JEV逐渐替代GⅢ型成为我国乃至整个亚洲地区的主要流行毒株,而对于基因型转换的分子机制目前尚不清楚。最近研究发现,GⅠ型JEV相对于GⅢ型在水禽宿主中具有适应性的优势,能够引起雏鸭产生滴度更高、持续时间更长的病毒血症,而宿主适应性的差异被认为可能是引起JEV基因型转换的一个重要的原因。为解析GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子基础,本研究首先建立了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统。GⅠ型与GⅢ型JEV基因组全序列的同源性约为88.9%,存在12.3%的差异性,而基因组序列间的差异,限制了酶切位点的选择,为后期GⅠ型与GⅢ型JEV间嵌合病毒的构建带来了困难。为解决这一困难,我们根据GⅠ型与GⅢ型JEV基因组间的保守序列,设计了四对通用型引物,以GⅠ型毒株SH7与GⅢ型毒株SH15的cDNA为模板,分四段扩增出涵盖病毒基因组全长的DNA片段,并在第一段的5’端引入一T7启动子序列,随后将四个片段克隆在低拷贝质粒POK-12上。以构建的低拷贝质粒为模板,扩增出各自的四个片段,随后利用特异的通用型引物,通过两轮Fusion PCR方法分别获得了含有T7启动子序列的GⅠ型与GⅢ型病毒基因组的全长DNA序列,经体外转录并转染BHK细胞,拯救出了病毒粒子rGI与rGIII。经鉴定拯救出的病毒粒子与亲本毒具有相似的复制特性,且在BHK上能够形成大小、形态相似的病毒蚀斑。GI/Ⅲ型JEV PCR-Based反向遗传学系统具有很好的稳定性且易于操作,这为下一步嵌合病毒与定点突变病毒的构建提供了关键性的技术平台。在研究初期发现GⅠ型毒株SH7与SD12相对于GⅢ型毒株SH15与SH19在水禽宿主细胞DEF中能够诱导更低水平IFN-α与IFN-β的表达,使得SH7与SD12毒株在DEF中能够达到更高的病毒复制滴度,并且在雏鸭动物实验中也发现攻毒GI-SH7的雏鸭组相对于攻毒GIII-SH15组,其血清中IFN-α与IFN-β的含量更低,且其病毒血症的滴度更高、持续的时间也更长。但是,这种诱导Ⅰ型干扰素表达差异的现象具有宿主特异性,仅在禽类宿主中发现,而在其他两类宿主细胞ST与bEnd.3中并没有发现诱导IFN-α与IFN-β表达的差异,且不存在病毒复制上的差异,因此GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中特异性的诱导Ⅰ型干扰素表达的能力,决定其宿主适应性的差异。为解析在水禽宿主中诱导Ⅰ型干扰素表达差异的分子机制,我们比较了50株GⅠ型与GⅢ型JEV的全基因组序列,找到了53个具有高度替换率的差异性氨基酸位点,利用建立的PCR-Based反向遗传学系统构建了GⅠ型与GⅢ型JEV间结构蛋白和各个非结构蛋白相互替换的嵌合病毒,结果发现结构蛋白的相互替换并没有改变GⅠ型与GⅢ型病毒的特性,但当非结构蛋白NS5相互替换后,具有GI-NS5蛋白的嵌合病毒rGIII/SH7NS5与亲本毒rGI相似,能够诱导更低水平的IFN-α与IFN-β表达,并且具有复制动力学的优势,同时发现GI-NS5蛋白相对于GIII-NS5蛋白具有更强的拮抗Ⅰ型干扰素表达的能力。而GⅠ型与GⅢ型NS5蛋白间共存在11个氨基酸位点的差异且分布在三个结构域上,进一步构建了NS5蛋白各个结构域相互替换的嵌合病毒,发现NS5蛋白a-a RdRp区域决定着病毒诱导IFN-α与IFN-β的表达能力,具有该区域的嵌合病毒rGI/SH7b-aRdRp、rGIII/SH7a-aRdRp与亲本毒rGI相似,在DEF细胞中能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并且病毒的复制水平更高。NS5蛋白a-aRd Rp区域共存在V372A与H386Y两个氨基酸位点的差异,V372与H386氨基酸位点在GI毒株中高度保守,但A372与Y386氨基酸位点在GⅢ型毒株中保守性较差。为探究关键性的氨基酸位点,构建了V372A或H386Y氨基酸位点的突变病毒,最终发现只有当GⅠ型或GⅢ型JEV NS5蛋白同时存在氨基酸V372与H386时,才能在水禽宿主中具有诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力,并表现出宿主适应性的优势。NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点位于NLS区域,该区域属于一种核定位信号并与NS5蛋白拮抗Ⅰ型干扰素能力相关。而V372A与H386Y两个氨基酸位点决定着NS5蛋白的入核能力,通过实验发现GI-NS5蛋白具有与核转运受体蛋白du KPNA4更强的结合能力,但同时duKPNA4也可与Ⅰ型干扰素转录因子duIRF7结合,这使得GI-NS5蛋白与du IRF7竞争结合duKPNA4的能力更强,从而抑制duIRF7入核起始Ⅰ型干扰素的表达,这也就导致了具有NS5-V372-H386的突变病毒与亲本毒rGI能够诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力。那么,为什么两个氨基酸位点决定着NS5蛋白与duKPNA4的结合能力?利用生物信息学软件分析了两个氨基酸位点在NS5蛋白空间结构上的特点,发现V372A与H386Y各个氨基酸位点形成的氢键排布不同,这可能导致NS5蛋白的NLS柔韧性有所不同。为验证假设,将GⅠ型与GⅢ型NS5-372与-386氨基酸位点进行同性氨基酸替代,结果发现与亲本毒rGI的NS5-372-386位点具有相同氢键特性的突变病毒rGI/V372G-H386K,rGI/V372P-H386R,rGIII/A372G-Y386K和rGIII/A372P-Y386R,其NS5蛋白具有更强的入核能力,能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并表现出对水禽宿主适应性的优势。综上所述,本研究成功的构建了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统,并以此为基础构建了一系列的嵌合病毒与定点突变病毒,最终找到NS5-V372A-H386Y两个氨基酸位点决定着GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽宿主适应性的差异。进一步的研究发现NS5-V372A-H386Y位点决定着NS5蛋白与duIRF7竞争结合duKPNA4的能力,从而影响Ⅰ型干扰素的表达。同时,通过对GI-NS5与GIII-NS5蛋白进行结构模拟分析,发现NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点的氢键排布决定着宿主适应性的差异,并通过对V372A与H386Y位点进行同性氨基酸的替换得到了验证。因此,本研究中从病毒与宿主两个方面解释了GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽具有宿主适应性差异的原因,这为进一步揭示JEV基因型转换的分子机制奠定了理论基础。
隋雨菲[5]（2020）在《黑曲霉产糖化酶菌株的多组学分析和NADPH辅因子代谢工程探索》文中指出丝状真菌黑曲霉因其杰出的蛋白质分泌能力和良好的安全性被广泛用于多种酶制剂的生产。系统理解黑曲霉发酵过程中的代谢调控机制对通过代谢工程手段提高这一细胞工厂的性能具有重要意义。本论文分别从基因组学、过程转录组学和辅因子代谢工程三个角度对黑曲霉高效产酶机制提出了合理的解释并对产酶性能进行了优化。基于产孢异常与高蛋白分泌之间的潜在关联,本研究对一株高产糖化酶的无孢黑曲霉LDM3菌株进行了全基因组重测序,并与产糖化酶模式菌株CBS 513.88相比较,从基因组水平探索该工业菌株高产酶的分子机制。基因组装配结果揭示LDM3菌株中存在大范围的染色体重排,表明基因组结构发生了重大变化。比较基因组学分析显示,457个LDM3菌株的特异性基因主要参与氧化还原途径,蛋白质转运和蛋白质修饰过程。非同义突变主要分布于与蛋白质翻译、修饰、代谢、分泌、能量产生和转化密切相关的656个基因上,表明这些变异可能是影响LDM3中糖化酶得率的主要因素。对于与蛋白质合成和分泌能力增强密切相关的无孢表型,生物信息学和共表达网络分析预测全局转录抑制因子tupA的非同义突变是造成无孢表型的主要原因。基因功能实验表明,敲除tupA导致菌体生长速率降低,与参考菌株相比产孢减少了近35%,但胞外蛋白分泌量显着增加了 65%。证实抑制孢子形成可成为提高黑曲霉蛋白分泌的有力手段。氧限制条件是工业化糖化酶生产的重要策略。本研究以糖化酶高产菌DS03043为研究对象,从转录组水平揭示糖化酶发酵生产过程中细胞对氧限制条件的全局响应变化。通过比较黑曲霉补料发酵过程不同阶段的时序转录组数据,共识别到515个差异表达基因。基因表达模式聚类分析揭示,在细胞生长受限后,菌体蛋白合成减弱,而脂类分解代谢上调,部分NADPH途径增强,糖化酶及其原料氨基酸的合成上调,细胞在能量和前体物质分配上向糖化酶合成发生了倾斜,从而使糖化酶在能量供应受限的情况下仍能高效合成,并表现为得率上升。此外,甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）的转录因子SrbB持续显着上调,表明SrbB在黑曲霉适应氧限制条件的转录调控中起到重要作用。根据糖化酶氧限制发酵的过程转录组分学分析发现辅因子NADPH再生可能是影响黑曲霉产酶的限制性因素。基于实验室前期升级的黑曲霉基因组代谢网络模型（GSMM）和文献数据预测,以糖化酶低产菌即黑曲霉模式菌AB4.1为宿主,在Tet-on开关的调控下分别构建9种NADPH再生系统,考察优化NADPH供应对黑曲霉产酶的影响。在摇瓶水平上分析NADPH浓度与目标蛋白合成的关系,发现NADPH再生系统虽然小幅提高了胞内NADPH水平但是对蛋白合成的影响并不显着。因此,推测低产糖化酶菌株中还原力的供应并不是蛋白合成的瓶颈。本实验还从另一个角度探究抑制胞内还原力积累是否阻碍蛋白的合成。通过对NADPH氧化酶调控子riaA的研究,发现过表达riaA没有明显阻碍NADPH的积累,但却严重抑制了糖化酶合成基因glaA的表达。共表达网络分析证明riaA不仅通过调节辅因子代谢还通过抑制蛋白合成、运输等对产酶起到复杂的负调控作用。据报道,体外纯化的Cas9蛋白和体外合成的sgRNA可实现高效的基因编辑并降低脱靶效率。论文对黑曲霉体外CRISPR/Cas9基因编辑体系进行了优化,大大提高了黑曲霉基因靶向编辑的成功率,成功地获得了糖化酶高产菌株B36的尿嘧啶缺陷型突变株YS20.2。为后续在糖化酶高产菌株中开展辅因子工程研究提供了平台。代谢工程研究经典的“设计-构建-测试-学习”（DBTL）循环被越来越多地用于菌株理性设计。为优化黑曲霉细胞工厂的产酶性能,论文进而以上述获得的尿嘧啶缺陷型糖化酶高产株YS20.2为出发菌株,开展同低产菌中相似的辅因子代谢工程策略,利用DBTL方法探究黑曲霉中高效的辅因子调控策略。论文发现,相比于低产菌株,在高产菌株中优化NADPH供应可有效提高蛋白的生产能力,说明模型预测具有菌株依赖性,新产生的NADPH可能更多地流向糖化酶合成而非用于细胞生长。为阐明NADPH扰动引起的胞内代谢适应机制,我们从中选择了三株在摇瓶水平上蛋白合成能力最强的过表达株,即葡萄糖磷酸脱氢酶（G6PDH）、磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）和NADP+依赖型苹果酸酶（NADP-ME）过表达株,进一步开展了麦芽糖限制的反应器水平的恒化培养。不同的遗传扰动对NADPH水平的调控作用以及对细胞资源分配的影响差异很大。过表达G6PDH使NADPH仅微弱积累,但过表达6PGDH和NADP-ME分别使胞内NADPH水平显着提高了 45%和66%,说明6PGDH和NADP-ME是黑曲霉主要的还原力供应途径。值得注意的是,过表达G6PDH使蛋白得率明显降低,但6PGDH和NADP-ME再生系统分别将蛋白合成能力显着提高了 60%和30%。此外,三株过表达株与对照株相比分别呈现不同的代谢图谱,过表达NADP-ME相比调控PP途径引起了更广泛的代谢扰动。本论文首次在黑曲霉中证实NADPH再生是糖化酶高产菌株中蛋白合成的瓶颈,优化胞内NADPH水平可显着提高细胞工厂酶蛋白产率。综上所述,本文通过对具有无孢表型的黑曲霉工业菌株的基因组序列分析,识别了与高产酶相关的基因组差异,并通过基因功能实验揭示了影响菌体产孢和蛋白分泌能力的一个关键基因tupA,基因组数据分析与基因工程实验相结合为基因功能的推断提出更强有力的证据;首次通过转录组学分析描绘了菌体在适应氧限制发酵过程中转录组水平的全局响应机制;,针对前期多组学分析预测的产酶细胞工厂主要限制因素之一——NADPH,基于DBTL循环开展了系统代谢工程研究,首次在黑曲霉中证实强化部分NADPH合成途径,尤其是6PGDH和NADP-ME,可显着提高NADPH供应水平,并提高细胞工厂酶蛋白产率,NADPH辅因子代谢工程研究取得初步成效。以上工作从菌形、全局代谢尤其是NADPH调控的角度为进一步优化黑曲霉产酶细胞工厂的效率打下了坚实基础。
白易[6]（2020）在《肝癌诊断和预后生物标志物的筛选策略及治疗靶点机制研究》文中认为研究背景:本研究旨在探索Ras同源基因家族成员A（Rashomologgene family,member A,RhoA）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）患者中的mRNA和蛋白表达水平,并探讨RhoA对肝癌的诊断价值和预后意义。实验方法:基于人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas,HPA）数据库比较肝脏正常组织和癌组织中RhoA的mRNA和蛋白质水平差异。用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中的数据建立RhoA相关的预后模型,并在两个基因表达汇编（Gene Expression Omnibus,GEO）队列中进行外部验证。分别采用实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）方法对北京协和医院（Peking Union Medical College Hospital,PUMCH）标本进行基因和蛋白定量分析。建立了基于RhoA蛋白水平的诊断模型。通过Xena浏览器网络工具对肝癌中RhoA的组织学类型、体细胞突变、拷贝数变异、基因表达和DNA甲基化进行可视化。通过相关分析确定临床特征与RhoA基因表达的关系。以TCGAHCC mRNA表达数据为基础,采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）方法对高RhoA水平组和低RhoA水平组的主要京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路进行富集分析。高RhoA水平组主要富集在溶酶体、致病性大肠杆菌感染、嘌呤代谢和嘧啶代谢等信号通路,而RhoA低水平组则主要富集Hedgehog信号传导、亚油酸代谢、嗅觉转导和味觉转导等信号通路。实验结果:肝癌组织中RhoA mRNA和蛋白的表达明显高于正常组织。mRNA和蛋白水平的高表达与较差的预后相关。基于蛋白水平的诊断模型具有较高的敏感性（92.5%）和特异性（90.0%）。RhoA的表达主要受拷贝数变异的调控,而与甲基化修饰弱相关。实验结论:RhoA在HCC组织中普遍上调,其在mRNA和蛋白水平的表达与预后不良有关。值得注意的是,RhoA蛋白表达水平可以作为HCC的诊断生物标志物。研究背景:长非编码RNA（Longnoncoding RNA,lncRNA）的异常表达在肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）等生物学领域引起了越来越多的关注。实验方法:在本研究中,我们从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中获取了371例肝癌组织和50例正常组织中的lncRNA、小RNA（microRNA,miRNA）和信使RNA（messenger RNA,mRNA）的表达谱数据,并鉴定了肝癌进展相关的特异性差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG;log fold change≥2,FDR<0.01）。我们不仅分析了这些DEG之间的相互作用,而且还分析了lncRNA的核质定位（细胞质、细胞核或两者均有）。然后,在排除了仅位于细胞核内的lncRNA后,构建了一个HCC相关的失调ceRNA网络,并进一步对该网络进行生存分析、多因素Cox回归和LASSO分析,最后构建一个基于ceRNA网络中13条lncRNA表达水平的风险评分系统,评估其在预测HCC患者生存时间方面的效能。实验结果:我们从TCGA队列中筛选了特异性差异表达的753条lncRNA,97条miRNA和1535条mRNA,根据彼此之间的互作关系构建了一个主要存在于细胞质中的由37条lncRNA,10条miRNA和26条mRNA组成的HCC相关的失调ceRNA网络。生存分析表明其中15条lncRNA,3条miRNA和16条mRNA与肝癌患者的总生存期显着相关（P<0.01）。通过多因素Cox回归和LASSO分析,我们进一步构建了基于13条lncRNA的风险评分系统,该系统对HCC患者生存时间具有良好的判别和预测能力。实验结论:这种基于lncRNA分布的ceRNA网络构建方法,不仅缩小了目标lncRNA的研究范围,而且为评估HCC的预后提供了特异的候选分子生物标志物,这将有助于我们增加对参与HCC早期发展的ceRNA机制的理解。研究背景:热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）在调节多个关键癌基因方面具有重要作用,因此被认为是一个潜在的癌症治疗药理学靶点,可能使包括肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）在内的多个癌种患者获益。然而,安全性问题限制了常规HSP90抑制剂的临床应用。因此,亟待开发一种新的方法来靶向HSP90或者其下游精确的促进癌变的蛋白。实验方法:通过对肝癌组织和配对的癌旁正常组织进行全转录组测序,筛选出差异表达的长非编码RNA（Long noncoding RNA,LncRNA）。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）的HCC数据库中发现肺癌相关转录物1（Lung cancer associated transcript 1,LUCAT1）在HCC中的表达及其在判断预后中的临床作用,并在北京协和医院（Peking Union Medical College Hospital,PUMCH）的HCC患者队列中进一步验证。通过RNAscope和核质分离RNA qPCR,我们明确了LUCAT1的亚细胞定位。通过CCK8、细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭实验探索了LUCAT1在HCC进展中的作用。用CHIRP-MS实验发现了 HSP90与LUCAT1之间的相互作用,用蛋白质印迹实验（Western blot,WB）和RNA结合蛋白免疫共沉淀实验进一步验证了HSP90与LUCAT1之间的相互结合作用。我们通过核质分离蛋白WB和免疫荧光分析深入探究了 LUCAT1对HSP90的调控作用。为寻找二者之间具体的结合位点,我们使用了RNA pull down实验。免疫共沉淀实验验证了磷酸化-信号传导及转录激活蛋白 3（Signal transducer and activator of transcription3,STAT3）与HSP90之间的互作。通过体外实验对体内动物模型进行了验证。实验结果:LUCAT1是一种由肝癌中氧化应激诱导的细胞核内lncRNA,它可通过特异的位点（575-767）与HSP90结合,富集HSP90在核内的积聚继而维持STAT3的持续磷酸化。功能性获得及敲降实验表明,LUCAT1在体内和体外均能促进肝癌细胞生存、增殖和侵袭。实验结论:我们的实验结果表明上调的LUCAT1促进了肝癌的发生。此外,靶向LUCAT1的ASO可特异性消除HSP90在HCC中致癌作用而不影响其正常生理功能。
杜丹[7]（2020）在《水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析》文中提出水稻（Oryza sativa L.）不仅是研究单子叶生物重要的模式植物,也是世界上重要的粮食作物之一。而水稻在种植过程中会受到环境中许多生物胁迫,特别是一些病虫害可以导致水稻严重减产、影响品质。同时,大量农药的使用严重污染了环境,提高了病虫的耐药性,造成了粮食安全的隐患。因而,水稻抗病机制的基础研究对阐释植物的抗性机理具有重大的理论意义,在水稻抗病育种中也具有巨大的应用价值。稻瘟病（Pyricularia oryzae）和白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）均是水稻的主要病害,严重时可导致水稻颗粒无收。因此,稻瘟病和白叶枯病抗病机制研究有助于阐释水稻的抗性机理和抗性育种。本研究利用EMS（ethyl methane sulfonate）诱变籼稻恢复系缙恢10号（J10）获得稳定遗传的叶片类病变突变体并进行了系列研究。通过遗传分析和图位克隆技术得到了目的基因,RPM1 like gene 1（OsRLR1）,进一步分析了该抗病基因的表达模式,解析了野生型和突变体OsRLR1的蛋白结构以及在水稻抗病机制中的功能,主要研究结果如下:1.OsRLR1基因的定位与克隆在自然种植条件下,突变体rlr1从苗期开始在叶片中出现类似病变的细胞死亡现象并伴随着叶片衰老黄化的表型,而病变和黄化表型受到光的诱导。在突变体中,抗病相关基因OsNPR1、OsWRKY45、PAL1、OsPR1a、OsPR10被激活,对稻瘟病和白叶枯病的抗性显着增强。遗传分析表明,突变体rlr1的表型受一对隐性核基因的控制。利用分子标记将目的基因OsRLR1定位在第10染色体66 kb的区间内。通过gDNA和cDNA的测序发现,只有基因LOCOs10g07978编码框的第953位碱基由A颠换为T,导致编码氨基酸由GLU变为了VAL。因而,初步将LOCOs10g07978作为候选的目的基因。2.OsRLR1基因功能互补分析为了验证LOCOs10g07978是否是目的基因,克隆了其在野生型中的编码框序列,并在突变体rlr1中过量表达,突变体rlr1细胞死亡、早衰以及植株农艺性状得到了恢复。同时,与突变体rlr1相比,转基因互补植株的抗病性也得到了削弱,接近野生型的水平。因此,LOCOs10g07978是目的基因OsRLR1。3.OsRLR1基因的蛋白结构分析OsRLR1编码一个CC-NBS-LRR（CNL）抗病蛋白,多重序列比对与系统进化树分析表明OsRLR1编码蛋白与其他CNL蛋白很好的聚类在一起,与拟南芥抗病蛋白AtRPM1和玉米ZmRPM1同源,并与水稻的一个稻瘟病抗性蛋白OsPid3高度一致。对OsRLR1蛋白序列分析表明突变位点位于NB结构域,临近一个相对保守的RNBS-B/Se模体。参照蛋白ZAR1的三维建模表明:在OsRLR1（E318V）中,突变导致了其三维空间结构与结合ATP时的活化状态极为相似,暗示突变可能会导致结合的ATP不能水解或影响ADP结合而持续处于活化状态。同时,OsRLR1蛋白在酵母中能够通过CC结构域形成聚合体。OsRLR1和OsRLR1（E318V）蛋白均定位于细胞核。OsRLR1是一个典型的CNL抗病蛋白。4.OsRLR1基因的表达分析在水稻生长发育的苗期、分蘖期和抽穗期,对各个组织定量分析表明:基因OsRLR1主要在叶片中表达。OsRLR1的启动子表达GUS基因染色表明:GUS蛋白主要在叶片维管束中表达。在突变体中,OsRLR1基因的表达水平与叶片过敏反应程度正相关。稻瘟病和白叶枯病接种后,OsRLR1基因的表达上调。因此,OsRLR1在叶片维管束中组成性表达,但也受阳光和病菌的诱导。5.OsRLR1基因的过表达功能分析在野生型J10中,利用Ubiquitin强启动子过量表达OsRLR1基因。与野生型相比,转基因纯合植株对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗病性显着增强,抗病相关基因OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也上升,但其抗病性仍然没有达到突变体rlr1的水平。不过,过量表达OsRLR1植株中没有出现类似病变的表型,同时对株高、结实率等农艺性状也没有影响,因而该基因在育种上具有潜在的应用价值。6.OsRLR1的互作蛋白筛选与验证通过酵母双杂交（Y2H）系统,利用OsRLR1的CC端结构域,筛选到了OsRLR1的互作转录因子OsWRKY19。并利用OsRLR1和OsRLR1（E318V）的CC-NB、CC-NB-ARC和全长蛋白序列在酵母中对互作关系进行了验证,进一步利用双分子荧光互补实验（BiFC）对OsWRKY19与OsRLR1的相互作用在植物体内进行验证分析。在烟草叶片细胞中,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生相互作用而发出黄色荧光信号,并与核指示剂DAPI指示信号高度吻合。因此,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生蛋白质的相互作用。7.互作蛋白OsWRKY19的干涉分析在突变体rlr1中,利用干涉技术（RNAi）沉默基因OsWRKY19的表达,获得了纯合的T2代干涉植株,OsWRKY19的表达量在不同的转基因株系中均得到了不同程度的降低,与突变体rlr1相比,干涉植株黄化和过敏反应的类病变表型得到了很大程度的减轻,植株长势和相关农艺性状也得到了很大程度的恢复。干涉植株接种稻瘟病菌和白叶枯病菌后,OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也得到了很大程度的降低,对稻瘟病和白叶枯病的抗病性减弱。因此推测OsWRKY19正向调控了OsRLR1介导的抗性反应。8.转录因子OsWRKY19的转录分析在水稻原生质体中瞬时表达融合蛋白OsWRKY19-GAL,并测量LUC的活性发现OsWRKY19具有转录激活活性。进一步瞬时共表达OsWRKY19和OsPR10的1000bp的启动子发现OsWRKY19能够激活OsPR10的表达。而在烟草中,瞬时共表达实验表明OsRLR1和OsRLR1（E318V）均对OsWRKY19的转录具有增强作用,且OsRLR1（E318V）的增强效果远高于OsRLR1。
朱守鸿[8]（2019）在《棉花纤维发育相关基因GhCLASP2和GhAlaRP功能研究》文中研究说明目的:棉花是世界上最重要的天然纤维和纺织工业材料来源。棉纤维是由棉花胚珠表皮细胞分化、发育而成。在棉纤维发育的过程中,有许多基因参与调控。植物细胞骨架的主要组分之一-微管在棉纤维伸长发育和次生壁加厚中也发挥着重要的功能。CLASP蛋白（CLIP-Associated Protein）能够与微管结合,参与调节微管结构与功能。已有研究表明CLASP基因与根和下胚轴细胞的伸长、信号转导及叶表皮毛分支等相关。棉纤维是棉花种子的表皮毛,由于结构和遗传上的相似性,棉纤维细胞与拟南芥表皮毛发育可能具有相似的调控机制。GhAlaRP（Ala-Rich-Protein）在棉花纤维中特异表达,在棉花纤维发育的伸长期（6 DPA）表达水平最高,推测该基因可能与棉纤维伸长发育相关。鉴于GhCLASP和GhAlaRP基因在纤维发育中可能存在重要的调控作用。本研究拟从棉纤维中克隆CLASP和AlaRP基因,解析其在棉纤维发育过程中的调控功能与分子机制,为利用基因工程改良棉纤维品质奠定基础。方法:对克隆获得的GhCLASP2和GhAlaRP基因序列进行生物信息学分析;构建GhCLASP2和GhAlaRP基因的植物亚细胞定位载体、过表达载体和RNAi（RNA interference）载体,分别浸染烟草（N.benthamiana）、拟南芥（Col-0和clasp-1）和棉花（YZ-1）;对获得的转基因植物进行鉴定及表型观察,阐明GhCLASP2和GhAlaRP的功能。采用酵母双杂交和BIFC（Bimolecular fluorescence complementation）,鉴定与GhAlaRP互作的蛋白,解析其在棉花纤维发育中的蛋白调控网络。构建CRISPR/Cas9-GhAlaRP基因编辑载体,浸染棉花（YZ-1）,对获得转基因棉花进行鉴定,为研究GhAlaRP的功能提供突变体材料。结果与结论:（1）从陆地棉纤维中克隆获得了一个与AtCLASP序列同源的GhCLASP2基因。生物信息学分析表明,GhCLASP2含有2个HEAT重复结构域和2个CLASP-N结构域,属于CLASP家族I亚家族。qRT-PCR分析表明GhCLASP2在棉花纤维中优势表达,尤其在棉花纤维发育的次生壁加厚期（27 DPA和30 DPA）表达水平最高;表明GhCLASP2参与棉花纤维发育调控,可能和棉花纤维品质形成相关。亚细胞定位结果表明,GhCLASP2定位在细胞中的微管上。GhCLASP2基因异位表达拟南芥叶片表皮毛分支数目增加,并能恢复拟南芥clasp-1突变体表皮毛、下胚轴和根系的表型。与对照YZ-1株系相比,过表达GhCLASP2转基因棉花株系纤维强度显着增强,这可能与微管蛋白（TUA和TUB）、纤维素合成酶（CESA）和延伸蛋白（EXP）基因的表达水平变化相关;GhCLASP2-RNAi转基因株系表现出植株矮小、节间缩短、柱头异常、雄蕊无花粉的表型。这些现象与拟南芥突变体clasp-1的表型相似。以上结果表明,棉花GhCLASP2和拟南芥AtCLASP可能具有相似的功能,通过调控微管来调节棉花的生长发育。（2）GhAlaRP是一个含有2个跨膜结构域的蛋白,与可可树AlaRP同源关系最近。亚细胞定位表明,GhAlaRP定位在细胞质膜、细胞核和内质网上,表明GhAlaRP参与棉花纤维细胞中的物质运输。酵母双杂交和BIFC结果表明,GhAlaRP分别与膜联相关蛋白GhAnnexin（GhD11G2184）和延伸蛋白GhEXPA（GhA10G2323）相互作用。抑制GhAlaRP表达的转基因棉花纤维长度变短,同时GhAnnexin和GhEXPA表达水平亦显着降低。上述结果表明,GhAlaRP参与调控棉花纤维伸长发育,干扰该基因表达其纤维长度显着下降,GhAlaRP通过与GhAnnexin和GhEXPA蛋白相互作用,形成一个调控网络来调节棉花纤维的发育,在此过程中可能还有其他蛋白质的参与。此外,对CRISPR/Cas9基因编辑获得的棉花alarp突变体纤维进行观察,突变体纤维长度较对照YZ-1纤维显着变短。与GhAlaRP-RNAi植株纤维的表型一致,这些结果进一步表明GhAlaRP参与调控棉花纤维发育的伸长。
陶华[9]（2019）在《沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究》文中研究表明背景:在中国十大最常见的恶性肿瘤中,食管癌排名第六,仅次于胃肠道肿瘤的胃癌,呈现双高特征,即高发病率和高死亡率,而且往往呈区域聚集性。中两部卫生资源匮乏的农村尤其高发,食管癌高额的医疗费用仍是当地居民的上要疾病负担,严重的威胁个人的生命健康及生活质量,给家庭、社会带来巨大的影响。随着现代医疗水平突飞猛进的提高,临床上,食管癌的预防、诊治工作也取得了显着的进展,治疗方案的制定需要综合患者的临床分期、全身情况、当地吹院的条件设备及医疗水平等因素。外科手术仍是目前食管癌最重要的治疗手段,然而,局部晚期食管癌患者的预后并不理想。针对有手术机会的ⅡA-Ⅲ期食管鳞癌,单纯手术切除5年生存率低,有待进一步提高。由于食管癌对化疗和放疗敏感性较差,术后化疗或术后放疗均未能有效提高食管癌患者的预后。早期诊治成为改善食管癌患者预后的关键。然而食管癌的病因和发病机制尚不完全明了,基因突变、染色体重排、转录调控及修饰等基因遗传学的改变在食管癌中无疑发挥着极其重要的作用。因此,寻找食管癌特异性相关基因将可能为食管癌的诊断和治疗提供新的理论依据、成为针对该肿瘤的防治关键。表观遗传调控并不涉及DNA序列改变,是一个动态可逆、可遗传的过程,与诸多疾病的关系密切,组蛋白去乙酸化酶（Histone deacetylase,HDACs）、组蛋白乙酰化转移酶（histone acetylase,HATs）,不仅是维持核心组蛋白去乙酰化和乙酰化两者之间稳态的基础,而且有利于染色质状态的调节。进而影响基因的表达,因此,乙酰化调控是表观遗传学调控最重要的方式之一。蛋白家族HDACs有众多的成员。组蛋白脱乙酰化酶6（HDAC6）因其结构中含有两个且功能上独立的HDAC催化结构域,归属于一种比较特殊的HDACs成员。HDAC6的主要作用是催化乙酰化αα-微管蛋白、热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）等非组蛋白的脱酰化效应。而组蛋白酰基化作用并不受控于 HDAC6活性的特异性抑制。通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控,HDAC6在肿瘤的形成中起着重要作用。分裂周期中,发生在细胞中的不适当脱乙酰化、从细胞质到细胞核的再分配,都可能导致转录抑制,并且异常基因表达从而诱导肿瘤的发生、发展。当下研究的焦点、热点问题之一就是HDACs及其抑制剂。已有大量的研究表明,抑制HDACs的表达或活性成为治疗恶性肿瘤行之有效的分子靶点。越来越多的研究表明,许多恶性肿瘤包括乳腺癌、口腔鳞癌、白血病、肺癌等组织中HDAC6表达异常,表明其在参与肿瘤的形成中起着不愈言说的作用。HSP90是对许多蛋白质的稳定性和功能起至关重要的分子伴侣蛋白,以维持细胞蛋白质稳态和细胞存活。同样,在肿瘤发生过程中,HSP90对肿瘤发展中不可缺少的多种致癌蛋白的稳定性和功能至关重要。HSP90在食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系中的表达量较正常的食管上皮细胞的表达量明显增加。HSP90抑制剂能阻断食管癌细胞的增殖效应,该抑制剂如17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）。当 HDAC6沉默、失活或敲除时,作为HDAC6的底物HSP90,将发生高乙酰化作用,从而造成HSP90活性的丧失。联合抑制HDAC6和HSP90显示很好的协同作用,在人白血病细胞中,HDAC6和HSP90的联合抑制在抗癌活性中具有协同作用。HSP90-HDAC6的药物治疗可能是食管癌的一种有前景的策略。然而,迄今为止,国内外尚罕见有关HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖及转移的作用机制的研究报道。目的:1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;2、构建慢病毒载体并制备,该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默,奠定了后续体内、外实验工具的基石,该表达系统的应用,以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响,为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。方法:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义分别采集10例食管癌及癌旁组织,qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本,IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况,分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1根据HDAC6基因（NM0001130416.1）序列为标靶,通过BLAST 同源性分析,设计、选择两段寡核甘酸序列,长度为21 nt,作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列,以该序列为模板,即能合成两对DNA单链片段,并以次为引物,经退火、双酶切后,也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）质粒进行双酶切,连接、转化两种双酶切后的产物,获得2个质粒:以HDAC6基因为模板,合成了 2对长引物单链DNA片段,退火后双消化,同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系（HEEC-1）及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况,将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系（KYSE140、KYSE180）,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平,以HDAC6基因为靶点,筛选出沉默表达效应最显着的质粒;基于该质粒,通过基因克隆技术,可将携带有 HDAC6 基因靶向沉默的 shRNA 片段-pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒包装质粒构建。2.3采用 Invitrogen公司的共转染系统,进行制备慢病毒表达载体系统（Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP）及其相关的质量检测,qRT-PCR 和 Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验采用构建的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株 KYSE140和 KYSE180。3.1.1 CCK-8法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞增殖的影响;3.1.2 Transwell法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.3 CCK-8法检测不同浓度的HDAC6抑制剂 Tuabasin A对食管癌细胞增殖的影响;3.1.4 Transwell法检测不同浓度的Tuabasin A对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.5 Western blot及免疫荧光法检测HDAC6 siRNA、不同浓度的Tubastatin A对α微管蛋白乙酰化的影响;3.1.6 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,CO-IP）检测 HDAC6 siRNA、不同浓度Tubastatin A对HSP90蛋白乙酰化的影响;3.1.7 Western blot检测不同浓度的HSP90特异性抑制剂 PU-H71、Tubastatin A对下游蛋白质表达的影响;3.1.8 CCK-8法检测HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响;3.1.9 Transwell法检测 HSP90-HDAC6抑制剂对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.10 Western blot检测HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白质表达的影响。3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型,接种2周成瘤后,根据治疗方式的不同,按照随机数字法,将裸鼠分为PU-H71组、TubastatinA组、PU-H71+TubastatinA组,并设赋形剂为对照组,进行腹腔注射,观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。结果:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织,在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显着增加,差异明显,组间差异比较具有统计学意义（P<0.05）。1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中,62份HDAC6阳性表达,表达率为68.9%。1.4在ESCC患者中,食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关（P<0.05）;而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关（P<0.05）。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1干扰靶点的设计结果人HDAC6特异性shRNA-1序列（正向序列:CCGGGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCACCCAAC TGCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCA CCCAACTGC）;人HDAC6特异性shRNA-2序列（正向序列:CCGGGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAGTTAACT CCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAG TTAACTCC）。2.2 测序鉴定重组质粒 pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP经BLAST软件分析,重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序结果与原始序列比对,设计序列正确插入载体,并无碱基的缺大、突变、移位,证实合成的实验组与对照组干扰靶点均已成功构建成重组质粒,符合预期设计,载体构建成功。2.3采用共转染策略制备经PCR鉴定的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点。3、HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响3.1 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性体外实验3.1.1 CCK-8检测了阴性对照组、干扰靶点1和十扰靶点2 组 ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.2 Transwell检测了阴性对照组、干扰靶点1和干扰靶点2组ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的迁移运动能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞穿膜数均显着减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.3一致地,HDAC6抑制剂Tuabasin A,也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的增殖,并呈剂量依赖性。当Tuabasin A的浓度达到500 nM时,较之于阴性对照组,抑制剂组细胞增殖率明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.1.4一致地,Tuabasin A也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的迁移运动,并呈剂量依赖性。当浓度达到500 nM时,与阴性对照组比较,抑制组细胞穿膜数均显着减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,且在食管癌KYSE140细胞中更为明显（P<0.05）。3.1.5 α-微管蛋白是HDAC6的一个靶点,与细胞运动有关。Western blot法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达量增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在KYSE140和KYSE180细胞中,阴性对照组、TuabasinA（100 nM）组、TuabasinA（500 nM）组、Tuabasin A（1μM）乙酰化α微管蛋白的相对表达量逐渐增加,差异比较具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光检测中发现,冷诱导微管破坏后,微管被分解,KYSE140和KYSE180细胞中几乎不能观察到微管。与阴性对照组相比,Tuabasin A处理的细胞中检测到更多微管（P<0.05）。3.1.6免疫共沉淀法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,乙酰化HSP90蛋白在干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在HDAC6抑制剂的研究中,呈现一致地结果。在KYSE140和 KYSE180 细胞中,阴性对照组、Tuabasin A（100 nM）组、Tuabasin A（500 nM）组、TuabasinA（1 μM）中HSP90蛋白乙酰化量呈现递增的趋势,组间比较差异明显,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.7 HSP90抑制剂PU-H71、Tubastatin A调节蛋白质的表达。在KYSE140和KYSE180细胞中,与对照组相比,PU-H71处理的细胞中EGFR、Akt、磷酸激酶和磷酸化ERK水平降低。在KESE140和KYSE180细胞系中,Tubastatin A治疗还可降低蛋白EGFR、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化ERK（p-ERK）的表达水平,但抑制的程度较HSP90抑制剂低（P<0.05）。3.1.8 CCK-8检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组的平均细胞增殖率分别为 100.00%、91.45%、78.26%、62.03%,联合Tubastatin A+PU-H71与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞活力（P<0.05）。3.1.9 Transwell检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组细胞穿膜转移数呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组细胞穿膜转移数明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。联合Tubastatin A+PU-H71 治疗与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞迁移运动能力（P<0.05）。3.1.10 Western blot检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。两种细胞系的实验结果均致的表明,Tuabasin A和PU-H71联合治疗与单独的Tuabasin A或PU-H71治疗相比,EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白表达水平最低。3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响3.2.1裸鼠皮下移植瘤的造模选用人食管鳞状细胞癌KYSE140细胞株裸鼠皮下移植,观测移植瘤不同时间段成瘤的大小。裸鼠腹股沟接种区平均2周左右出现移植瘤,3 周后直径约0.2-0.6 cm,接种的所有动物均存活下来,并在体形成了肿瘤,接种点无发热、红肿、破溃等炎症反应。第3周开始,PU-H71+Tubastatin A注射组裸鼠移植瘤直径均明显低于上述其他三对照组移植瘤的直径,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）;第6周开始,PU-H71注射组裸鼠移植瘤直径均低于赋形剂注射组、Tubastatin A注射组移植瘤的直径,差异有统计学意义（P<0.05）。仅在 Tuabasin A（10 mg/kg）和 PU-H71（50 mg/kg）联合注射的裸鼠中观察到显着的肿瘤抑制作用。3.2.2观察裸鼠存活情况及皮下移植瘤大体标本对照组、Tuabasin A组、PU-H71组裸鼠活动少,精神状态、食欲差,嗜睡等,而PU-H71组+Tuabasin A组裸鼠活动多,精神状态好,食欲佳。联合PU-H71+Tuabasin A注射显着抑制肿瘤生长,有利于改善裸鼠的生存质量。Tuabasin A和PU-H71联合注射组移植瘤体积较小,瘤体周围能看到较明显完整的包膜形成,形状较规整,有清楚的界限,无明显浸润、粘连的现象,能较完整的剥离肿瘤组织。而瘤体内注射赋形剂、TuabasinA组的裸鼠中,移植瘤的体积则较大,瘤体组织与周围无明显的界限,边缘毛糙,瘤体周围无完整的包膜形成,更有甚至,表面皮肤将受累。3.2.3 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响荷瘤裸鼠移植瘤中,赋形剂注射对照组、单独Tubastatin A（100 nM）注射组、单独 PU-H71（100 nM）注射组、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）注射组瘤体中EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,比较具有统计学意义（P<0.05）。与其他三组相比,TuabasinA（10mg/kg）和PU-H71（50 mg/kg）联合注射组裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平最低。此外,IHC 分析也显示,Tuabasin A（10 mg/kg）+PU-H71（50 mg/kg）联合注射组可显着抑制荷瘤裸鼠移植瘤中EGFR蛋白的表达。结论:1、HDAC6高表达于食管癌组织中,促进食管癌的发生、发展,有望作为食管癌治疗的重要靶点。2、采用共转染策略制备,成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后,制备了 HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP重组慢病毒载体,经PCR鉴定和Western blot检测方法,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点,为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。3、HSP90作为HDAC6的底物,其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力,沉默HDAC6之后,HSP90的脱乙酰化效应随着沉默,表现出HSP90的乙酰化过度,从而导致HSP90配体活性散失,两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂（TubastatinA）和HSP90抑制剂（PU-H71）与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功,HSP90-HDAC6抑制剂显着的抑制肿瘤的生长,有利于改善裸鼠的生存质量,HSP90-HDAC6抑制剂显着降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化,开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说,临床应用前景呈现出一片大好的趋势。
姜固[10]（2019）在《铜胺氧化酶在氮限制诱导小球藻油脂积累中的作用》文中研究表明特定环境可改变微藻细胞内碳素分配,促使某一类碳基化合物在细胞中积累,具体机制尚不明确。我们前期研究发现,在氮限制诱导小球藻（Chlorella sp.HN11）油脂积累的过程中,一个铜胺氧化酶基因2（ChlC4O2）表达上/下调倍数最高。铜胺氧化酶（CuAOs）是一类具有多种生理的功能的胺氧化酶,参与植物细胞分化和对非生物胁迫的反应,以及哺乳动物脂肪细胞的形成和分化。然而小球藻CuAOs的生理作用尚未见报导。为进一步探明小球藻ChlCAO2在氮限制诱导的油脂积累过程中的功能与作用,本研究设置了“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢复”三个处理,测定小球藻HN11在0h,24h,48h,72h及96h的CuAOs活性和ChlCAO2基因相对表达量与油脂积累的相关性。进而通过ChlC4O2超表达和RNAi载体的遗传转化获得转化藻株,测定转化藻株油脂积累和ChlCAOs酶活等表型,以期探明ChlCAO2在氮限制诱导小球藻油脂积累中的作用。此外,为探明CuAO在油脂积累中的作用是否存在共性,本研究还测定了在“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢复”三个处理下,另外一株小球藻（C.vulgaris C3）的CuAOs活性,莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii CC425）CuAO活性和基因相对表达量,与油脂积累的相关性。实验结果表明,小球藻HN11在全氮培养96h内均无脂质积累。在氮限制处理24h即开始积累油脂,限氮培养24h、48h、72h和96h的油脂相对荧光强度分别是全氮培养的3.03、4.48、4.17和4.63倍;基因相对表达量分别是全氮培养的105、397、808和333倍;酶活性是3.73、7.15、6.37和13倍。限氮48h后经氮恢复（添加0.1 g/L硝酸钠）的藻细胞油脂的荧光强度显着降低,细胞密度也显着性增加（P<0.05）;其ChlCAO2的相对表达量在72h和96h下降至6.86%和0.79%;ChlCAOs活性分别下降至70.6%和51.3%。小球藻HN11中的铜胺氧化酶活性,基因表达与油脂积累量显着正相关。衣藻在全氮培养96h内均无脂质积累。在氮限制处理24h即开始积累油脂,限氮培养衣藻在24 h、48 h、72 h和96 h的油脂相对荧光强度分别是全氮的3.17、4.49、7.58 和 5.15 倍;CuAOs 的活性是 3.17、4.49、7.58 和 5.15 倍;限氮培养衣藻在24 h、48 h、72 h和96 h的CuAO1相对表达量分别是全氮对照组的236、721、348、1817倍,CuAO2的相对表达量分别是对照的11、4.7、13和12倍,CuAO3的相对表达量分别是对照的1.64、2.11、5.85和11.5倍。在限氮48h后补充氮素（添加0.4g/LNH4Cl）细,细胞密度显着性增加（P<0.05）,油脂积累减少。氮恢复24h和48h的CuAO表达量迅速下降,CuAO1的相对表达量下降至对照0.04%和0.22%,CuAO2的相对表达量下降至0.67%和17.7%,CuAO3的相对表达量下降至3.04%和24.83%,CuAOs的活性分别下降至23.4%和25.2%。衣藻中的铜胺氧化酶活性,基因表达与油脂积累量显着正相关。小球藻C3在全氮培养96h内均无脂质积累。在氮限制处理24h即开始积累油脂,限氮培养24h、48h、72h和96h的油脂相对荧光强度分别是全氮培养的3.4、10.33、9.54 和 12.04 倍,酶活性是 1.97、2.46、4.3 和 5.62 倍。限氮48h 后经氮恢复（添加0.1 g/L硝酸钠）的藻细胞油脂的荧光强度显着降低,细胞密度也显着性增加（P<0.05）,氮恢复24h和48h CuAOs活性下降至95.8%和35.7%。小球藻C3中的铜胺氧化酶活性与油脂积累量显着正相关。RACE获得小球藻HN11中ChlCAO2全长序列,与转录组拼接的序列完全匹配。该蛋白含有存在于许多其他常见物种中的两个结构域,一个Cuamineoxid N2结构域和一个Cuamineoxid结构域。系统进化树分析表明ChlCAO2的氨基酸序列与小球藻sorokiniana CuAO的同源性为56%,与微星藻CuAO的同源性为54%,聚集成一个分支。利用农杆菌介导法将质粒载体转入至小球藻HN11,成功构建ChlCAO2的超表达和RNAi载体。超表达藻株C15、C21、RNAi藻株R13的藻细胞数与野生型藻细胞无显着差异,即转化铜氨氧化酶基因的藻株正常生长。超表达转化藻株C21和C15细胞内中性脂质含量显着高于野生型小球藻（P<0.05）,分别是对照的1.6和1.93倍;ChlCAOs活性显着高于野生型藻株（P<0.05）,分别是野生型小球藻的2.91倍和3.07倍。RNAi转化藻株R13的油脂相对荧光值相较于野生型小球藻无显着差异,但是ChlCAOs活性显着低于野生型小球藻,是正常培养野生型藻株ChlCAOs活性的24%,ChlCAO2可能在小球藻限氮条件下油脂积累过程中起着关键作用。
二、介导RNAi的tRNA~(Val)启动子质粒载体的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、介导RNAi的tRNA~(Val)启动子质粒载体的建立（论文提纲范文）
（1）酿酒酵母合成生物学新技术及中心代谢流重编程的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统的发展和应用 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统的发展 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统分类 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas系统衍生技术 |
| 1.2.4 多功能CRISPR/Cas系统 |
| 1.2.5 CRISPR/Cas系统在酿酒酵母中的研究进展 |
| 1.3 酿酒酵母葡萄糖去阻遏效应及丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株的研究进展 |
| 1.3.1 酿酒酵母葡萄糖阻遏效应 |
| 1.3.2 丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株简介 |
| 1.3.3 胞质乙酰辅酶A合成 |
| 1.3.4 丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株的改造和应用 |
| 1.4 酿酒酵母全基因组进化技术 |
| 1.4.1 传统全基因组进化技术 |
| 1.4.2 基于CRISPR/Cas系统的全基因组进化技术 |
| 1.5 本研究的基本思路及拟研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 原始菌株和质粒 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 试剂和试剂盒 |
| 2.4 培养基和抗生素 |
| 2.5 分子克隆实验方法 |
| 2.5.1 DNA扩增和后续处理 |
| 2.5.2 大肠杆菌转化 |
| 2.5.3 重组质粒的验证和提取 |
| 2.5.4 酿酒酵母的转化 |
| 2.5.5 酿酒酵母质粒的提取 |
| 2.6 菌体培养及分析检测方法 |
| 2.6.1 菌株培养条件 |
| 2.6.2 细胞密度和生长速度测定 |
| 第三章 利用单Cas9-VPR核酸酶实现基因组多位点同时激活、抑制和编辑 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基和培养条件 |
| 3.2.3 质粒构建 |
| 3.2.4 菌株构建 |
| 3.2.5 荧光强度检测 |
| 3.2.6 RT-PCR方法 |
| 3.2.7 檀香烯发酵和检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CRISPR-ARE系统的设计 |
| 3.3.2 CRISPR-ARE系统在双荧光报告菌株中的验证 |
| 3.3.3 基于Ⅲ型启动子的CRISPR-ARE的系统优化 |
| 3.3.4 CRISPR-ARE系统应用于代谢工程提升檀香烯产量 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 酿酒酵母Pdc平台菌株和衍生PDH菌株构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基和培养条件 |
| 4.2.3 质粒构建 |
| 4.2.4 菌株构建 |
| 4.2.5 生长分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Pdc菌株的构建 |
| 4.3.2 PDH菌株的构建 |
| 4.3.3 平台菌株的初步表征 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全基因组规模筛选葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 培养基和培养条件 |
| 5.2.3 质粒构建 |
| 5.2.4 菌株构建 |
| 5.2.5 菌株生长表征 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 第一轮全基因组筛选 |
| 5.3.2 第二轮全基因组筛选 |
| 5.3.3 第三轮全基因组筛选 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 丙酮酸和乙酰辅酶A高产酿酒酵母平台菌株的表征 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株和质粒 |
| 6.2.2 培养基和培养条件 |
| 6.2.3 菌株构建 |
| 6.2.4 丙酮酸和2,3-丁二醇检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 平台菌株中丙酮酸的积累 |
| 6.3.2 平台菌株应用于2,3-丁二醇的合成 |
| 6.3.3 平台菌株碳源共利用 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 酿酒酵母线粒体定位信号肽表征及在平台细胞中的应用 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌株和质粒 |
| 7.2.2 培养基和培养条件 |
| 7.2.3 质粒构建 |
| 7.2.4 菌株构建 |
| 7.2.5 荧光共聚焦 |
| 7.2.6 檀香烯发酵和检测 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 信号肽的选择和克隆 |
| 7.3.2 基于生长回补的信号肽活性表征 |
| 7.3.3 基于荧光共聚焦的线粒体信号肽特异性表征 |
| 7.3.4 线粒体信号肽应用于线粒体内檀香烯的合成 |
| 7.3.5 Pdc-R3和PDH-R3菌株中线粒体信号肽檀香烯途径的应用 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 第三章中使用的引物 |
| 附录Ⅱ 第四章中使用的引物 |
| 附录Ⅲ 第五章中使用的引物 |
| 附录Ⅳ 第七章中使用的引物 |
| 附录Ⅴ 第二轮全基因组筛选选定靶点 |
| 附录Ⅵ 第三轮全基因组筛选选定靶点 |
| 作者简历 |
（2）柑橘抗溃疡病基因的挖掘与基因编辑体系优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 课题的提出 |
| 2 前人研究进展 |
| 2.1 柑橘溃疡病研究进展 |
| 2.1.1 柑橘溃疡病的发生及危害 |
| 2.1.2 柑橘溃疡病的发病症状 |
| 2.1.3 柑橘溃疡病的发生 |
| 2.1.4 柑橘溃疡病病菌的形态特征研究 |
| 2.1.5 柑橘溃疡病病菌的分类研究 |
| 2.1.6 柑橘溃疡病的诊断与防治 |
| 2.2 植物抗病免疫研究 |
| 2.2.1 PTI引发的免疫反应 |
| 2.2.2 ETI引发的免疫反应 |
| 2.3 Ⅲ型效应子蛋白在病菌侵染植物过程中的功能研究 |
| 2.4 溃疡病菌TALEs效应因子研究进展 |
| 2.4.1 TALEs效应因子的分类 |
| 2.4.2 TALEs效应因子的结构及致病性研究 |
| 2.5 基础转录因子TFIIA研究进展 |
| 2.5.1 TFIIA的结构及功能研究 |
| 2.5.2 TFIIAγ在植物中的功能研究 |
| 2.6 植物褪黑素的合成及作用研究进展 |
| 2.6.1 植物褪黑素的发现及合成 |
| 2.6.2 植物褪黑素合成基因COMT研究进展 |
| 2.6.3 褪黑素在植物生长发育中的调控研究 |
| 2.6.4 褪黑素在植物非生物胁迫中的调控研究 |
| 2.6.5 褪黑素在植物生物胁迫中的调控研究 |
| 2.7 基因编辑技术研究进展 |
| 2.7.1 ZFNs技术研究进展 |
| 2.7.2 TALENs技术研究进展 |
| 2.7.3 CRISPR/Cas系统研究进展 |
| 2.7.4 CRISPR/Cas9系统研究进展 |
| 2.7.5 CRISPR/Cas9技术在植物品种改良中的应用 |
| 2.7.6 CRISPR/Cas9技术在植物中的优化策略 |
| 2.7.7 CRISPR/Cas9介导的PDS基因编辑研究进展 |
| 3 本研究的目的与内容 |
| 第二章 酒饼簕抗柑橘溃疡病的分子机制解析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株、质粒和载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 柑橘亚家族系统发育树构建 |
| 2.2.2 溃疡病病菌接种 |
| 2.2.3 细菌生长与病斑面积测定 |
| 2.2.4 基因组DNA提取 |
| 2.2.5 基因组RNA提取 |
| 2.2.6 反转录及荧光定量PCR |
| 2.2.7 酒饼簕与甜橙病菌接种转录组学分析 |
| 2.2.8 TFIIAγ基因和LOB1 启动子序列克隆与分析 |
| 2.2.9 TFIIAγ蛋白同源建模 |
| 2.2.10 酵母双杂交载体构建 |
| 2.2.11 烟草荧光素酶互补载体构建 |
| 2.2.12 原核表达载体构建 |
| 2.2.13 蛋白纯化和GST Pull down实验 |
| 2.2.14 植物超量表达载体构建 |
| 2.2.15 植物干涉和沉默载体构建 |
| 2.2.16 农杆菌介导甜橙的遗传转化 |
| 2.2.17 LOB1启动子序列和活性分析 |
| 2.2.18 TFIIAγ基因功能分析 |
| 2.2.19 GUS活性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 野生柑橘资源对溃疡病的抗性评价分析 |
| 3.2 酒饼簕和甜橙病菌接种转录组测序分析 |
| 3.3 酒饼簕和甜橙响应溃疡病菌的差异基因分析 |
| 3.4 AbLOB1和CsLOB1表达模式分析 |
| 3.5 不同柑橘资源TFIIAγ基因序列分析 |
| 3.6 TFIIAγ与TALETFBs互作分析 |
| 3.7 AbTFIIAγ基因功能分析 |
| 3.8 AbLOB1启动子EBE的突变导致其活性降低 |
| 4 讨论 |
| 4.1 野生柑橘资源酒饼簕对溃疡病具有较强的抗性 |
| 4.2 AbTFIIAγ基因有助于酒饼簕对柑橘溃疡病的抗性 |
| 4.3 AbLOB1启动子EBE的突变有助于酒饼簕的抗病性 |
| 4.4 自然突变在柑橘抗溃疡病品种培育中的利用 |
| 第三章 酒饼簕防御相关基因AbCOMT功能分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溃疡病病菌接种及病斑面积测定 |
| 2.2.2 褪黑素离体抑菌实验 |
| 2.2.3 DNA和RNA提取及cDNA合成 |
| 2.2.4 酒饼簕和甜橙COMT基因克隆与分析 |
| 2.2.5 植物超量表达载体构建 |
| 2.2.6 农杆菌介导甜橙的遗传转化 |
| 2.2.7 褪黑素含量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 COMT基因表达分析 |
| 3.2 COMT基因在野橘和栽培橘中受到驯化选择信号 |
| 3.3 AbCOMT和CsCOMT基因序列比对分析 |
| 3.4 转基因柑橘植株抗病性评价 |
| 3.5 褪黑素可以抑制溃疡病病菌生长 |
| 4 讨论 |
| 4.1 超量表达AbCOMT增加了柑橘叶片的褪黑素含量 |
| 4.2 超量表达AbCOMT增强了柑橘对溃疡病的抗性 |
| 第四章 甜橙高效基因编辑体系优化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 甜橙基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 甜橙总RNA的提取及第一链cDNA的合成 |
| 2.2.3 甜橙PDS基因序列扩增 |
| 2.2.4 AtU6-26-sgRNA-SK载体改造 |
| 2.2.5 PTG/Cas9系统表达载体的组装 |
| 2.2.6 柑橘转基因及转基因阳性苗鉴定 |
| 2.2.7 脱靶预测分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AtU6-26-sgRNA-SK载体改造 |
| 3.2 PTG/Cas9在甜橙中的高效基因编辑 |
| 3.3 甜橙CsPDS编辑苗位点特异性突变检测 |
| 3.4 脱靶位点分析 |
| 3.5 甜橙遗传转化体系优化与阳性苗嫁接技术 |
| 3.6 热激处理提高了CsPDS突变效率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 YAO::SpCas9系统诱导的突变效率受温度影响 |
| 4.2 暗柳橙高效遗传转化体系 |
| 4.3 茎尖离体嫁接极大的提高了阳性苗成活率 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 附表 |
| 附录B 本研究用到的相关基因编码区序列 |
| 附录C 附图 |
| 附录D 发表论文列表 |
| 致谢 |
（3）胡麻种子发育和脂肪酸代谢相关microRNAs的鉴定和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物脂肪酸 |
| 1.1.1 植物脂肪酸的种类 |
| 1.1.2 植物脂肪酸的功能 |
| 1.1.3 植物脂肪酸的生物合成 |
| 1.1.4 食用油中的脂肪酸组成 |
| 1.1.5 油料作物中油脂相关的基因 |
| 1.2 miRNA研究 |
| 1.2.1 miRNA的生物合成 |
| 1.2.2 植物miRNA的作用机制 |
| 1.2.3 植物miRNA的研究方法 |
| 1.2.4 植物miRNA在种子发育与脂肪酸合成中的作用 |
| 1.3 胡麻简介 |
| 1.3.1 胡麻籽的脂肪酸组成和功能 |
| 1.3.2 胡麻转录组的研究 |
| 1.3.3 胡麻miRNA研究进展 |
| 1.3.4 胡麻种子中油脂合成积累规律的研究 |
| 1.3.5 胡麻脂肪酸合成相关基因的研究 |
| 1.4 胡麻转基因技术 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 第二章 胡麻种子发育过程中miRNAs的鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 种子含油率测定 |
| 2.2.2 RNA提取 |
| 2.2.3 小RNA文库构建 |
| 2.2.4 小RNA文库测序结果分析 |
| 2.2.5 miRNAs的表达量分析 |
| 2.2.6 miRNAs差异表达分析 |
| 2.2.7 qPCR对差异表达miRNAs进行验证 |
| 2.2.8 miRNA靶基因预测 |
| 2.2.9 miRNA的靶基因GO分析 |
| 2.2.10 miRNA靶基因裂解位点验证 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同时期种子含油率的测定 |
| 2.3.2 小RNA文库数据初步分析 |
| 2.3.3 已知和新的miRNA鉴定 |
| 2.3.4 miRNA的表达与荧光定量验证 |
| 2.3.5 miRNAs靶基因预测及GO分析 |
| 2.3.6 miRNAs靶基因验证 |
| 2.3.7 黑亚14号miRNA文库分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 胡麻miR156a的功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 材料与种植 |
| 3.1.2 质粒载体与菌株 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 DNA提取方法 |
| 3.2.2 构建表达载体 |
| 3.2.3 拟南芥的转化 |
| 3.2.4 转基因拟南芥株高、叶片和开花期的统计 |
| 3.2.5 种子脂肪酸组分和含油量测定 |
| 3.2.6 过表达转基因株系基因表达量检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 过表达载体的构建 |
| 3.3.2 过表达miR156a株系的莲座叶变化 |
| 3.3.3 过表达miR156a株系的开花期统计 |
| 3.3.4 过表达miR156a株系的种子含油量变化 |
| 3.3.5 过表达miR156a株系的靶基因和油品相关基因的表达模式分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 胡麻miR397b的功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 材料与种植 |
| 4.1.2 质粒载体与菌株 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DNA提取方法 |
| 4.2.2 构建表达载体 |
| 4.2.3 拟南芥的转化 |
| 4.2.4 转基因拟南芥株高和叶片的统计 |
| 4.2.5 种子含油量测定 |
| 4.2.6 过表达转基因株系基因表达量分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 过表达载体的构建 |
| 4.3.2 过表达miR397b株系的株高变化 |
| 4.3.3 过表达miR397b株系的莲座叶变化 |
| 4.3.4 过表达miR397b株系的种子含油量变化 |
| 4.3.5 过表达miR397b株系的基因表达量变化 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 胡麻遗传转化体系的建立 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验所用的表达载体 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 种子消毒及无菌苗的培养 |
| 5.2.2 侵染转化与共培养 |
| 5.2.3 恢复培养 |
| 5.2.4 诱导培养 |
| 5.2.5 伸长培养 |
| 5.2.6 生根培养 |
| 5.2.7 再生苗移栽 |
| 5.2.8 阳性苗的鉴定 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 次氯酸钠消毒时间对种子的影响 |
| 5.3.2 共培养天数对外植体的影响 |
| 5.3.3 草铵膦筛选剂浓度的确定 |
| 5.3.4 诱导培养基激素组合的确定 |
| 5.3.5 伸长培养基激素组合的确定 |
| 5.3.6 生根培养基激素组合的确定 |
| 5.3.7 阳性苗的鉴定 |
| 5.3.8 农杆菌介导的胡麻遗传转化体系 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型脑炎概述 |
| 1.1.1 乙型脑炎流行病学特征 |
| 1.1.2 乙型脑炎的临床症状与病理变化 |
| 1.1.3 乙型脑炎的防控措施 |
| 1.2 乙型脑炎病毒 |
| 1.2.1 乙型脑炎病毒的形态、理化及生物特性 |
| 1.2.2 乙型脑炎病毒基因组结构及其功能 |
| 1.2.3 乙型脑炎病毒复制周期 |
| 1.2.4 乙型脑炎病毒基因型分布及基因型转换 |
| 1.3 黄病毒感染性克隆研究进展 |
| 1.4 乙型脑炎病毒反向遗传学系统的应用 |
| 1.5 黄病毒逃逸天然免疫的分子机制 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 GⅠ型与GⅢ型 JEV PCR-Based反向遗传学系统的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒、细胞、质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 病毒的扩增 |
| 2.1.5 病毒RNA的提取 |
| 2.1.6 GⅠ型与GⅢ型 JEV第一链c DNA合成 |
| 2.1.7 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组的分段克隆 |
| 2.1.8 GⅠ型与GⅢ型 JEV全长c DNA的克隆 |
| 2.1.9 病毒的拯救 |
| 2.1.10 拯救病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 2.1.11 拯救病毒的多步生长曲线 |
| 2.1.12 病毒蚀斑试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GI与 GⅢ型 JEV基因组序列的同源性分析及引物保守型分析 |
| 2.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组分段扩增与克隆 |
| 2.2.3 病毒全长cDNA扩增 |
| 2.2.4 rGI与rGIII JEV的拯救与鉴定 |
| 2.2.5 被拯救病毒与亲本毒生长特性的比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 GI与 GⅢ型 JEV在水禽宿主中诱导IFN-I表达的差异 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞、实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 3.1.5 RNA提取与反转录 |
| 3.1.6 荧光定量PCR检测Ⅰ型干扰素表达 |
| 3.1.7 ELISA方法检测Ⅰ型干扰素的表达量 |
| 3.1.8 细胞上清中病毒滴度测定 |
| 3.1.9 细胞中病毒蛋白水平测定 |
| 3.1.10 雏鸭动物实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 三种细胞感染JEV后间接免疫荧光验证 |
| 3.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导Ⅰ型干扰素表达的差异 |
| 3.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV在宿主细胞中病毒滴度的测定 |
| 3.2.5 GⅠ型与GⅢ型 JEV在雏鸭体内诱导干扰素表达的差异 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导水禽宿主IFN-I表达差异的分子基础 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV氨基酸序列的比对分析 |
| 4.1.5 嵌合病毒与定点突变病毒的构建 |
| 4.1.6 嵌合病毒与定点突变病毒在DEF中诱导IFN-I表达能力分析 |
| 4.1.7 嵌合病毒与定点突变病毒复制动力学分析 |
| 4.1.8 嵌合病毒与定点突变病毒的空斑形成试验 |
| 4.1.9 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白拮抗IFN-I表达能力分析 |
| 4.1.10 小鼠动物实验 |
| 4.1.11 雏鸭动物实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV差异性氨基酸位点分析 |
| 4.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV间结构蛋白相互替换嵌合病毒的构建及拯救 |
| 4.2.3 结构蛋白相互替换的嵌合病毒诱导Ⅰ型干扰素能力分析 |
| 4.2.4 结构蛋白相互替换的嵌合病毒复制动力学分析 |
| 4.2.5 非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B/NS3、NS4A/NS4B、NS5 相互替换的嵌合病毒构建 |
| 4.2.6 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异 |
| 4.2.7 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型 JEV在 DEF细胞中的复制优势 |
| 4.2.8 NS5-a-a Rd Rp区域决定GI与 GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异 |
| 4.2.9 NS5-a-a Rd Rp区域决定GⅠ型 JEV在 DEF中的复制优势 |
| 4.2.10 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中诱导IFN-表达的差异 |
| 4.2.11 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中复制差异. |
| 4.2.12 NS5-V372A-H386Y位点突变不改变病毒对小鼠的毒力 |
| 4.2.13 NS5-372V-386H位点决定GⅠ型 JEV在雏鸭宿主中适应性的优势 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 NS5-V372A-H386Y决定水禽宿主IFN-I表达差异的分子机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 细胞核与细胞质蛋白分离 |
| 5.1.5 鸭源核转运受体蛋白与鸭源IRF7分子的克隆表达 |
| 5.1.6 鸭源核转运受体蛋白与JEVNS5蛋白分子的互作 |
| 5.1.7 鸭源核转运受体蛋白与duIRF7分子的互作 |
| 5.1.8 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4与du IRF7 共定位实验 |
| 5.1.9 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4对Ⅰ型干扰素表达的作用 |
| 5.1.10 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5-372 与386 位点的同性氨基酸替代 |
| 5.1.11 NS5-372-386 位点突变病毒的诱导IFN-I表达能力分析 |
| 5.1.12 NS5-372-386位点突变病毒的复制动力学分析 |
| 5.1.13 NS5-372-386位点突变病毒的空斑形成试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白核定位能力分析 |
| 5.2.2 GⅠ型与GⅢ型 NS5 蛋白与du KPNA2、du KPNA3、du KPNA4 互作 |
| 5.2.3 鸭源IRF7 分子与核转运受体蛋白du KPNA4 互作 |
| 5.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白不与du IRF7 分子互作 |
| 5.2.5 du KPNA4 促进du IRF7 分子入核启始IFN-I表达 |
| 5.2.6 NS5-372-386 位点决定NS5 蛋白与du KPNA4 的结合能力 |
| 5.2.7 NS5-372-386 氢键排布决定GⅠ型与GⅢ型 JEV对水禽宿主适应性 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）黑曲霉产糖化酶菌株的多组学分析和NADPH辅因子代谢工程探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑曲霉 |
| 1.2 工业化糖化酶生产 |
| 1.3 黑曲霉基因组学研究进展 |
| 1.4 黑曲霉转录组学研究进展 |
| 1.4.1 比较转录组学分析指导黑曲霉的高效生产 |
| 1.4.2 转录组学分析揭示黑曲霉调控次级代谢产物合成的机制 |
| 1.4.3 转录组学揭示黑曲霉在不同碳源条件下的转录响应 |
| 1.5 黑曲霉代谢物组学 |
| 1.6 黑曲霉多组学整合研究 |
| 1.7 黑曲霉基因遗传改造平台 |
| 1.7.1 Tet-on可诱导表达系统的应用 |
| 1.7.2 丝状真菌中CRISPR基因编辑技术研究进展 |
| 1.8 代谢工程研究优化微生物细胞工厂的性能 |
| 1.8.1 DBTL循环驱动高效智能细胞工厂的构建 |
| 1.8.2 黑曲霉细胞工厂的研究进展 |
| 1.8.3 辅因子代谢工程 |
| 1.9 本课题的研究内容与意义 |
| 第2章 比较基因组学分析预测与糖化酶工业菌株高蛋白分泌能力有关的基因 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和培养基 |
| 2.2.2 基因组DNA提取 |
| 2.2.3 测量干重,总分泌蛋白,残糖和糖化酶酶活的方法 |
| 2.2.4 构建ΔtupA和ΔprpA敲除株 |
| 2.2.5 黑曲霉LDM3基因组拼接 |
| 2.2.6 生物信息学分析 |
| 2.2.7 SNP、InDel和SV分析 |
| 2.2.8 共线性区域分析 |
| 2.2.9 LDM3基因组中相比于参考基因组的菌株特异性基因 |
| 2.2.10 TupA和PrpA编码基因的共表达网络分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 菌株培养和基因组DNA的质量检测 |
| 2.3.2 LDM3基因组特征 |
| 2.3.3 结构变异分析 |
| 2.3.4 LDM3菌株特异性基因分析 |
| 2.3.5 SNP和InDel分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 黑曲霉产糖化酶发酵过程中的全局转录响应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 摇瓶发酵 |
| 3.2.3 反应器水平发酵 |
| 3.2.4 取样 |
| 3.2.5 酶活和干重 |
| 3.2.6 RNA提取 |
| 3.2.7 链特异性RNA测序 |
| 3.2.8 与参考基因组的比对和基因表达水平的归一化 |
| 3.2.9 差异表达基因分析 |
| 3.2.10 基因功能注释 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 黑曲霉产糖化酶发酵过程的生理学特性 |
| 3.3.2 RNA-Seq数据概况 |
| 3.3.3 差异表达基因的功能注释和表达模式分析 |
| 3.3.4 糖化酶发酵过程中代谢途径的转录响应 |
| 3.3.5 分泌途径上的转录响应 |
| 3.3.6 转录因子的转录水平响应 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 探究NADPH供应对黑曲霉低产糖化酶菌株产酶的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株和培养基 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 过表达质粒克隆和大肠杆菌转化方法 |
| 4.2.4 大肠杆菌菌落PCR |
| 4.2.5 An14g00430和An16g02510基因敲除盒的构建 |
| 4.2.6 黑曲霉孢子液洗脱方法 |
| 4.2.7 获得黑曲霉菌丝体的方法 |
| 4.2.8 黑曲霉原生质体转化法 |
| 4.2.9 真菌基因组提取方法 |
| 4.2.10 Diagnostic PCR验证阳性转化子 |
| 4.2.11 Southern杂交验证阳性转化子 |
| 4.2.12 发酵液分析 |
| 4.2.13 活性氧种类ROS的定量 |
| 4.2.14 荧光定量PCR |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 构建NADPH供应酶的相关过表达质粒 |
| 4.3.2 摇瓶水平上探究NADPH调控对糖化酶低产菌株产酶的影响 |
| 4.3.3 NADPH氧化酶调控子riaA对黑曲霉蛋白合成的调控 |
| 4.3.4 NADP+依赖型转氢酶对NADPH水平的调控作用 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9基因编辑技术构建黑曲霉高产糖化酶菌株B36的尿嘧啶营养缺陷型突变株 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 菌株和培养基 |
| 5.2.2 同源重组法构建尿嘧啶缺陷株的策略 |
| 5.2.3 获取黑曲霉B36菌丝体用于原生质体转化 |
| 5.2.4 黑曲霉原生质体转化方法 |
| 5.2.5 合成和体外纯化Cas9蛋白策略 |
| 5.2.6 体外合成sgRNA策略 |
| 5.2.7 体外CRISPR/Cas9体系编辑pyrG基因 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 同源重组方法构建B36尿嘧啶缺陷株 |
| 5.3.2 Cas9蛋白的体外纯化 |
| 5.3.3 体外CRISPR/Cas9体系编辑pyrG基因 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 NADPH辅因子代谢工程优化黑曲霉蛋白生产性能 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 菌株和培养基 |
| 6.2.2 黑曲霉菌落PCR |
| 6.2.3 黑曲霉批发酵实验设计 |
| 6.2.4 黑曲霉碳限制恒化培养实验设计 |
| 6.2.5 葡萄糖和胞外有机酸测定 |
| 6.2.6 Dot blotting定量糖化酶酶量 |
| 6.2.7 发酵过程尾气检测 |
| 6.2.8 胞内代谢物快速抽提方法 |
| 6.2.9 GC-MS检测胞内氨基酸和磷酸糖类代谢物 |
| 6.2.10 LC-MS检测辅因子、有机酸和磷酸糖类代谢物 |
| 6.2.11 胞内NADPH定量 |
| 6.2.12 荧光定量PCR |
| 6.2.13 胞内代谢物组学数据的多元统计学分析方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 B36尿嘧啶缺陷株转化效率验证 |
| 6.3.2 优化糖化酶高产菌株的原生质体转化效率 |
| 6.3.3 NADPH辅因子代谢工程对黑曲霉产酶的影响具有菌株依赖性 |
| 6.3.4 不同NADPH再生系统在批培养发酵过程中的影响 |
| 6.3.5 恒化培养揭示黑曲霉辅因子调控引起的胞内代谢响应机制 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 卷内备考表 |
（6）肝癌诊断和预后生物标志物的筛选策略及治疗靶点机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 RhoA在肝细胞癌诊断和预后中的作用 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 生物信息学数据挖掘与处理 |
| 2.2 基于北京协和医院样本的实验验证 |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HPA中RhoA的mRNA和蛋白质表达谱 |
| 3.2 RhoA基因表达在肝癌患者中的预后作用 |
| 3.3 RhoA表达与性别相关 |
| 3.4 RhoA的mRNA和蛋白质表达验证 |
| 3.5 基于RhoA蛋白质水平的肝癌诊断模型 |
| 3.6 RhoA表达受基因扩增调控以及相关的KEGG通路富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 补充 |
| 第二部分 基于ceRNA网络分析得到的与肝细胞癌进展及预后相关的长非编码RNA |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据来源与加工 |
| 2.2 识别差异表达基因 |
| 2.3 构建ceRNA网络 |
| 2.4 DEmRNA的功能和信号通路分析 |
| 2.5 生存分析 |
| 2.6 构建风险评分系统 |
| 2.7 单因素与多因素Cox回归分析 |
| 2.8 DElncRNA和DEmRNA的回归分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 差异表达的lncRNA,miRNA和mRNA |
| 3.2 预测miRNA靶向的lncRNA |
| 3.3 预测miRNA靶向的mRNA |
| 3.4 lncRNA的细胞内定位和ceRNA网络 |
| 3.5 GO和KEGG富集分析 |
| 3.6 ceRNA网络相关基因的生存分析 |
| 3.7 构建lncRNA相关的风险评分系统 |
| 3.8 lncRNA和mRNA之间的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 补充 |
| 附录 |
| 第三部分 LUCAT1通过募集HSP90入核维持STAT3的磷酸化以促进HCC进展 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 方法 |
| 2.1 生物信息学数据挖掘和处理 |
| 2.2 北京协和医院队列的外部实验验证 |
| 2.3 细胞系培养 |
| 2.4 RNA提取,逆转录和qPCR |
| 2.5 siRNA或ASO转染 |
| 2.6 FFPE和细胞载玻片的RNAscope |
| 2.7 细胞核和细胞质RNA的提取和定量 |
| 2.8 慢病毒质粒的构建及稳定过表达细胞系的筛选 |
| 2.9 细胞增殖与凋亡的动态观察 |
| 2.10 CCK8检测细胞增殖 |
| 2.11 细胞凋亡检测 |
| 2.12 细胞周期监测 |
| 2.13 细胞侵袭试验 |
| 2.14 LUCAT1顺式调控基因的鉴定及共表达分析 |
| 2.15 CHIRP-MS鉴定LUCAT1的潜在RNA结合蛋白 |
| 2.16 蛋白提取和蛋白印迹实验 |
| 2.17 内源性RNA结合蛋白免疫共沉淀分析 |
| 2.18 分别提取细胞核与细胞质中的蛋白质 |
| 2.19 免疫荧光实验 |
| 2.20 免疫共沉淀 |
| 2.21 体外转录实验和RNA pull down |
| 2.22 患者来源的肿瘤异种移植模型的建立及体内实验 |
| 2.23 免疫组织化学 |
| 2.24 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LUCAT1在HCC中上调并与氧化应激相关 |
| 3.2 作为一个独立预后因素,LUCAT1高表达的HCC患者预后较差 |
| 3.3 LUCAT1的细胞核定位提示反义寡核苷酸可作为其抑制剂 |
| 3.4 抗LUCAT1的ASO对HCC有很强的治疗潜力 |
| 3.5 肝癌中HSP90是LUCAT1的结合蛋白 |
| 3.6 LUCAT1改变HSP90在细胞内的分布,并维持STAT3的高磷酸化水平 |
| 3.7 PDX动物模型的体外验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 综述 LncRNA的分类和功能以及在肝癌中作为生物标志物,调控因子和药物靶点的研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 LncRNA的产生和分类 |
| 3 LncRNA的功能 |
| 4 LncRNA作为肝癌诊断和预后生物标志物 |
| 5 LncRNA在主要肝癌信号通路中的功能和分子机制 |
| 5.1 LncRNA对肝癌Wnt/β-catenin信号通路的调控 |
| 5.2 LncRNA对肝癌JAK/STAT信号通路的调控 |
| 5.3 LncRNA对肝癌EMT过程的调控 |
| 5.4 LncRNA调控肝癌的其它机制 |
| 6 基于lncRNA靶点的肝癌治疗 |
| 7 结语和展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物体的防御反应机制 |
| 1.1.1 基础免疫 |
| 1.1.2 特异性免疫反应 |
| 1.1.3 WRKY转录因子概述 |
| 1.1.4 植物激素介导的抗病反应 |
| 1.1.5 系统获得性免疫反应SAR |
| 1.1.6 小RNAs在抗病反应中的作用 |
| 1.2 水稻抗病机制研究 |
| 1.2.1 抗病基因介导稻瘟病抗病机制研究 |
| 1.2.2 R基因介导白叶枯病研究进展 |
| 第二章 OSRLR1的克隆与功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 主要培养基配方 |
| 2.2.4 主要生化试剂的配方 |
| 2.2.5 主要生化、分子生物学试剂与仪器 |
| 2.3 方法与步骤 |
| 2.3.1 农艺性状调查 |
| 2.3.2 光和色素的测定 |
| 2.3.3 衰老相关指标的测定 |
| 2.3.4 组织化学分析 |
| 2.3.5 图位克隆 |
| 2.3.6 质粒的提取 |
| 2.3.7 候选基因的克隆 |
| 2.3.8 载体的设计与构建 |
| 2.3.9 基因RT-PCR表达分析 |
| 2.3.10 生物信息学分析 |
| 2.3.11 水稻原生质体瞬时表达 |
| 2.3.12 烟草叶片瞬时表达体系 |
| 2.3.13 酵母双杂交实验 |
| 2.3.14 双分子荧光互补实验 |
| 2.3.15 稻瘟病的培养与接种 |
| 2.3.16 白叶枯病的培养与接种 |
| 2.3.17 纹枯病接种实验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 rlr1的表型与组织化学分析 |
| 2.4.2 突变体rlr1中病程相关基因表达情况 |
| 2.4.3 OsRLR1候选基因的遗传图谱分析 |
| 2.4.4 OsRLR1基因功能互补验证 |
| 2.4.5 OsRLR1的生物信息学分析 |
| 2.4.6 OsRLR1基因的表达分析 |
| 2.4.7 OsRLR1 的亚细胞定位 |
| 2.4.8 OsRLR1的过表达分析 |
| 2.4.9 OsRLR1与OsWRKY19 相互作用 |
| 2.4.10 OsWRKY19 正调控OsRLR1 介导的抗病反应 |
| 2.4.11 OsWRKY19 调控OsPR10 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 Rlr1是抗性反应自激活类病变突变体 |
| 2.5.2 OsRLR1 是一个典型的CLR抗病基因 |
| 2.5.3 OsRLR1 E318V自激活机制 |
| 2.5.4 OsRLR1正调控水稻抗性反应 |
| 2.5.5 OsRLR1与OsWRKY19 互作调控OsPR10 的表达 |
| 2.6 结论 |
| 1、OsRLR1 是一个典型的CC-NB-LRR抗病蛋白 |
| 2、E318V是一个新的自激活位点 |
| 3、OsWRKY19与OsRLR1 在细胞核中互作并正调控抗性反应 |
| 4、OsWRKY19 调控OsPR10 的表达 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 发表与待发表的论文 |
（8）棉花纤维发育相关基因GhCLASP2和GhAlaRP功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花纤维发育及相关基因研究进展 |
| 1.1.1 棉纤维细胞发育起始期 |
| 1.1.2 棉纤维细胞伸长期 |
| 1.1.3 棉纤维发育次生壁加厚期 |
| 1.1.4 脱水成熟期 |
| 1.2 微管结合蛋白研究进展 |
| 1.2.1 微管结合蛋白定义、分类及功能 |
| 1.2.2 微管结合蛋白CLASP研究进展 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术在棉花中的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 Gh CLASP2 基因的克隆与功能研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Gh CLASP2 基因的克隆及鉴定 |
| 2.2.2 基因的序列分析 |
| 2.2.3 Gh CLASP2 基因的表达模式分析 |
| 2.2.4 GhCLASP2 在烟草叶片瞬时表达系统及与微管共定位研究 |
| 2.2.5 异位表达GhCLASP2 在拟南芥中的功能研究 |
| 2.2.6 过表达GhCLASP2 转基因棉花的鉴定及表达分析 |
| 2.2.7 Gh CLASP2-RNAi转基因棉花的鉴定及表达分析 |
| 2.2.8 转GhCLASP2 基因棉花表型分析 |
| 2.2.9 棉花纤维发育相关基因在过表达GhCLASP2 转基因株系棉花纤维中的转录水平变化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 GhAlaRP基因的功能研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.2.1 Gh AlaRP基因的鉴定及序列分析 |
| 3.2.2 GhAlaRP多重序列比对和进化树分析 |
| 3.2.3 GhAlaRP亚细胞胞定位观察 |
| 3.2.4 过表达GhAlaRP转基因棉花的鉴定及表达分析 |
| 3.2.5 Gh AlaRP-RNAi转基因棉花的鉴定及表达分析 |
| 3.2.6 转GhAlaRP基因棉花表型分析 |
| 3.2.7 与GhAlaRP互作蛋白的筛选及鉴定 |
| 3.2.8 与GhAlaRP互作蛋白的功能初步分析 |
| 3.2.9 Gh AlaRP基因编辑载体棉花遗传转化及鉴定 |
| 3.2.10 棉花alarp突变体纤维表型观察 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 Gh AlaRP调控棉花纤维发育网络分析 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9 基因编辑系统 |
| 第四章 全文结论与创新点 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.1.1 Gh CLAPS2 功能研究主要结论 |
| 4.1.2 Gh AlaRP功能研究主要结论 |
| 4.2 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（9）沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织来源及患者资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HDAC6 mRNA在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平 |
| 2.2 食管癌组织及癌旁组织中的HDAC6蛋白的表达水平 |
| 2.3 免疫组织化学检测结果 |
| 2.4 食管癌组织中HDAC6的表达水平与食管癌临床病理特征关系 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 靶向沉默HDAC6基因shRNA慢病毒载体的构建和制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 载体及细胞 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.2 重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序鉴定 |
| 2.3 HDAC6 mRNA在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.4 HDAC6蛋白在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.5 慢病毒干扰后KYSE140和KYSE180细胞中HDAC6 mRNA和蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响 |
| 第一节 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.2 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞的迁移运动 |
| 2.3 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.4 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞迁移运动 |
| 2.5 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加α微管蛋白的乙酰化作用 |
| 2.6 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加HSP90的乙酰化作用 |
| 2.7 HSP90抑制剂和TubastatinA调节下游蛋白质的表达 |
| 2.8 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响 |
| 2.9 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞迁移的影响 |
| 2.10 HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白表达的影响 |
| 第二节 HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体内实验研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 2.2 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HSP90相关性抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间参编的书籍 |
| 攻读博士学位期间获得奖项 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）铜胺氧化酶在氮限制诱导小球藻油脂积累中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 微藻应用现状 |
| 1.2 微藻油脂积累的机制研究进展 |
| 1.3 铜胺氧化酶研究进展 |
| 1.4 小球藻基因工程的研究进展 |
| 1.4.1 小球藻转化方法 |
| 1.4.2 小球藻转基因研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验藻株、菌株以及质粒载体 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 小球藻铜胺氧化酶基因ChlCAO2克隆 |
| 2.2.1 藻株培养 |
| 2.2.2 RNA提取 |
| 2.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.4 设计引物 |
| 2.2.5 逆转录PCR扩增 |
| 2.2.6 回收纯化PCR产物 |
| 2.2.7 连接转化 |
| 2.2.8 RACE扩增 |
| 2.2.9 生物信息学分析 |
| 2.3 铜胺氧化酶与油脂积累的相关性分析 |
| 2.3.1 藻株培养 |
| 2.3.2 限氮处理 |
| 2.3.3 几株微藻的生长量和油脂含量测定 |
| 2.3.4 铜胺氧化酶活性的测定 |
| 2.3.5 铜胺氧化酶基因的表达 |
| 2.3.6 数据分析 |
| 2.4 载体构建 |
| 2.4.1 超表达载体构建 |
| 2.4.2 RNAi载体构建 |
| 2.5 小球藻转化体系的建立 |
| 2.5.1 抗生素敏感性测定 |
| 2.5.2 农杆菌转化小球藻 |
| 2.5.3 阳性转化藻株的鉴定 |
| 2.6 ChlCAO2超表达和RNAi载体的转化 |
| 2.6.1 农杆菌的转化 |
| 2.6.2 农杆菌介导小球藻转化 |
| 2.7 转基因藻株表型分析 |
| 2.7.1 限氮处理 |
| 2.7.2 生长量和油脂含量测定 |
| 2.7.3 铜胺氧化酶活性和表达量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ChlCAO2全长序列的获得和分析 |
| 3.1.1 ChlCAO2全长序列的获得 |
| 3.1.2 蛋白质序列的同源性分析和系统发育分析 |
| 3.1.3 预测蛋白的结构分析 |
| 3.2 三种绿藻铜胺氧化酶与油脂积累相关性 |
| 3.2.1 小球藻HN11铜胺氧化酶与油脂积累相关性 |
| 3.2.2 莱茵衣藻铜胺氧化酶与油脂积累相关性 |
| 3.2.3 限氮处理小球藻C3铜胺氧化酶油脂与相关性分析 |
| 3.3 载体构建 |
| 3.3.1 超表达载体构建 |
| 3.3.2 RNAi载体构建 |
| 3.4 小球藻遗传转化体系的建立 |
| 3.4.1 小球藻HN11抗生素敏感性测定 |
| 3.4.2 农杆菌介导小球藻遗传转化 |
| 3.5 ChlCAO2在小球藻油脂产生过程中的功能分析 |
| 3.5.1 小球藻超表达载体和RNAi载体的遗传转化 |
| 3.5.2 转化藻株表型分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 氮胁迫对微藻的影响 |
| 4.2 微藻油脂积累与铜胺氧化酶相关性 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
四、介导RNAi的tRNA~(Val)启动子质粒载体的建立（论文参考文献）
- [1]酿酒酵母合成生物学新技术及中心代谢流重编程的研究[D]. 董昌. 浙江大学, 2021(01)
- [2]柑橘抗溃疡病基因的挖掘与基因编辑体系优化[D]. 汤小美. 华中农业大学, 2021
- [3]胡麻种子发育和脂肪酸代谢相关microRNAs的鉴定和功能分析[D]. 张天豹. 中国农业科学院, 2020
- [4]基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制[D]. 李晨曦. 中国农业科学院, 2020(01)
- [5]黑曲霉产糖化酶菌株的多组学分析和NADPH辅因子代谢工程探索[D]. 隋雨菲. 华东理工大学, 2020(08)
- [6]肝癌诊断和预后生物标志物的筛选策略及治疗靶点机制研究[D]. 白易. 北京协和医学院, 2020(05)
- [7]水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析[D]. 杜丹. 西南大学, 2020
- [8]棉花纤维发育相关基因GhCLASP2和GhAlaRP功能研究[D]. 朱守鸿. 石河子大学, 2019(01)
- [9]沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究[D]. 陶华. 苏州大学, 2019(08)
- [10]铜胺氧化酶在氮限制诱导小球藻油脂积累中的作用[D]. 姜固. 海南大学, 2019(03)