一、潘氏细胞防御素研究进展（论文文献综述）
唐刻意[1]（2019）在《扬子鳄β防御素基因家族的解析及其肠道微生物冬眠适应性宏基因组学研究》文中指出扬子鳄（Chinese alligator,Alligator sinensis）,中国特有的濒危爬行动物,国家一级保护动物,是世界现存的23种鳄类中的一员。作为一种半水生的食肉动物,扬子鳄无时无刻不经受来着环境和肠道病源微生物的潜在威胁。鳄类血清中存在具有广谱抗菌活性的抗菌肽类物质,其中β防御素（β-defensin）即是抗菌肽的一种,其构成动物先天性免疫系统的第一道屏障。不同于在哺乳动物和鸟类中对β防御素的广泛研究,关于爬行动物β防御素的信息则相对有限,在鳄目中甚至还未曾有β防御素的报道。扬子鳄还是一种具有冬眠习性的变温爬行动物。由于寒季环境温度的下降和食物的减少,扬子鳄在冬眠期间保持深度休眠、低代谢率和禁食的生理状态。基于之前16S rRNA扩增子测序的研究表明,冬眠动物的肠道微生物群落组成和结构会随着宿主生理状态和食物摄入量的变化而呈现季节性波动。但从宏基因组水平对冬眠动物肠道微生物组在功能上的季节性变化的研究却鲜有耳闻;此外,冬眠宿主肠道黏膜及其免疫屏障与肠道菌群之间的季节性互作机理也尚不明确。因此,扬子鳄是我们研究冬眠引起的肠道菌群结构、功能改变和肠道免疫应答的天然理想模型。本研究中,我们通过生物信息学手段和RACE-PCR的方法在扬子鳄基因组scaffold6871上鉴定到一个长390 kb的β防御素基因簇,由20个新的鳄类β防御素基因（AsBDs,Alligator sinensisβ-defensin genes）组成。通过对扬子鳄β防御素的基因结构、氨基酸序列、系统进化以及组织表达的解析,揭示了扬子鳄旁系AsBDs与哺乳动物α防御素在基因演化和功能上具有高度的相似性,为后续进行的β防御素与肠道微生物的关联研究奠定了基础。针对扬子鳄肠道微生物的研究,我们通过对冬眠期和活跃期的扬子鳄消化道各段（胃、小肠和结肠）内容物和粪便样品进行16S rRNA V3-V4高变区扩增子测序,并对粪便样品进行宏基因组de novo测序,以揭示其肠道微生物在优势菌群组成、菌群结构、群落多样性和预测功能上的季节性变化规律;并探讨了扬子鳄AsBDs在肠道组织中的季节性表达模式与肠道菌群的关系。主要的研究结果如下:（1）扬子鳄β防御素基因簇包含6个鸟类同源的直系AsBDs和9个爬行动物特有的旁系同源AsBDs。旁系AsBDs拥有一段较长的（3660个氨基酸）连接肽段（Pro-piece）,与哺乳动物α防御素的长连接肽段序列特征极为相似。由于二者拥有长度相当的氨基酸序列,致使旁系AsBDs和哺乳动物α防御素在电荷数和疏水性等理化性质上也保持高度的相似性。（2）旁系和直系AsBDs的“信号肽-连接肽”区段所受选择压力无明显差异（旁系:ω=0.759;直系:ω=0.604,p=0.471）,二者ω值均小于1,经受纯化选择。旁系AsBDs成熟肽的ω值则显着高于直系AsBDs成熟肽（旁系:ω=1.208;直系:ω=0.499;p=0.034）,表明旁系AsBDs成熟肽经历了更强烈的正选择压力;与哺乳动物α防御素成熟肽的进化方向一致。进化树结果显示旁系AsBDs与哺乳动物α防御素聚为一枝,暗示α防御素在进化上可能起源于爬行动物旁系AsBDs。（3）扬子鳄β防御素基因在各器官组织中的表达具有普遍性和差异性的特征。总体上,各AsBDs在消化道、脾、肝和肾等部位的表达量较高,在肌肉、胆囊和心脏中表达水平相对较低。旁系AsBDs在肠道各段的表达水平显着高于直系AsBDs在肠道相同部位的表达量,与同样在肠道中具有高表达特点的α防御素相似,暗示二者在表达和功能上也具有一定的相似性。（4）通过16S rRNA扩增子测序我们在扬子鳄肠道中鉴定到41个细菌门类和3215个OTUs。其中,变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和硬壁菌门（Firmicutes）为扬子鳄肠道微生物门水平的四大优势菌门,共同占比超过80%。基于宏基因组de novo测序,我们在扬子鳄粪便样本中共鉴定到51个细菌门和3907个细菌种,优势菌群在门和属水平上的分布情况与16S rRNA扩增子测序结果一致。（5）通过对不同季节的所有24个肠道微生物样本进行主成分分析（PCoA）、聚类分析（UPGMA）、相似性检验（ANOSIM）和典型相关性分析（CCA）,结果均显示冬眠期和活跃期的扬子鳄肠道菌群在组成和结构上存在明显季节差异。环境温度和冬眠禁食是塑造扬子鳄肠道微生物群落的两个主要环境驱动因子。此外,考虑到活跃期扬子鳄的粪便与结肠处微生物群落在组成和结构上具有的较高相似度,我们提出在对濒危动物的肠道微生物进行研究时,建议使用粪便样本替代结肠样品的非损伤性取样策略。（6）拟杆门菌（Bacteroidetes）及其分类下的拟杆菌属（Bacteroides）是冬眠期扬子鳄肠道中显着大量富集的冬眠特异微生物群落,占比分别达到57.95%和55.82%。该门类的微生物具有强大的降解利用宿主来源底物——粘蛋白糖苷（Mucin glycan）的能力。基于CAZy数据库注释结果,我们总共在扬子鳄肠道宏基因组中鉴定到193个碳水化合物酶家族（CAZymes families）和458个碳水化合物酶（CAZymes）。其中有14个涉及降解和结合粘蛋白糖苷的碳水化合物酶家族和28种粘蛋白寡糖降解酶（Mucin oligosaccharide-degrading enzymes）在冬眠期显着富集,且其相对丰度显着高于活跃期。我们在细菌和宏基因组水平揭示了冬眠期肠道特异性微生物通过降解利用宿主来源的粘蛋白糖苷维持生命,以适应宿主冬眠禁食期间肠道内食物匮乏的分子机制。（7）活跃期扬子鳄消化道后段聚集着高丰度的梭杆菌门（Fusobacteria）微生物（20.37%41.22%）,具有典型的食肉动物肠道微生物群落特征。梭杆菌门（Fusobacteria）分类下贡献了95%占比的是一种具有蛋白水解功能的细菌——Cetobacterium somerae,该菌在活跃期消化道后段大量富集,其相对丰度显着高于冬眠期（活跃期vs.冬眠期:小肠:17.81%vs.0.09%,p=0.05;结肠:31.40%vs.0.35%,p=0.002;粪便:33.91%vs.0.81%,p=0.038）。除了高丰度的C.somerae,我们还检测到其它20种同样具有水解蛋白质、多肽和发酵氨基酸能力的细菌在活跃期扬子鳄肠道内显着富集,表明活跃期正常进食的扬子鳄肠道内大量聚集的蛋白质降解微生物以适应宿主高蛋白的饮食结构,对动物源性食物的细菌性降解和发酵有利于宿主对营养物质更高效地消化利用。（8）扬子鳄肠道内病源微生物分布和免疫相关基因季节性表达的相关性研究结果显示,扬子鳄肠道中检测到机会病原菌在不同季节均有分布,但活跃期肠道中存在更多的常见致病菌和病毒序列（活跃期vs.冬眠期:4.03%vs.0.04%）。三个旁系β防御素（AsBD105α,105θ和105α）和MHC I1327基因在冬眠期肠道组织中的显着性高表达可能是应对冬眠期细菌性粘蛋白降解导致黏膜屏障减弱的免疫补偿机制;直系β防御素（AsBD5,AsBD10和AsBD13）、MHC beta和TLR-2基因的表达量则在活跃期显着地高于冬眠期,以抵御活跃期肠道内更多的病源微生物的入侵。得益于肠道免疫基因与肠道菌群的季节性互作反馈机制,扬子鳄得以维持肠道微生态系统的稳态并保障机体的健康。综上所述,扬子鳄β防御素基因簇的解析为后续研究其它动物类群尤其是爬行动物β防御素的进化研究提供了基础信息;为理解我国特有珍稀动物扬子鳄的免疫适应机制提供了重要参考;对未来开发新的抗生素类药物提供了重要的理论和应用依据。同时,在濒危动物的系统性保护工程中,我们呼吁相关从业人员应更多地关注动物肠道微生物多样性保护。扬子鳄肠道微生物组的研究结果在濒危动物保护生物学研究以及“宿主-微生物”共生体在能量代谢和免疫应答方面的互作机理具有重要实用意义和理论价值。
苏国旗[2]（2019）在《猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究》文中研究说明防御素是哺乳动物先天免疫的重要组成部分,近些年的研究发现防御素具有抗菌活性、促炎抗炎、适应性免疫等多种生物学功能,既具有开发成抗生素替代品的潜力,又可以作为提高抗病力的药物靶点。2012年通过对猪的基因组比对分析发现了猪βdefensin 114（PBD114）,目前为止PBD114的表达调控机制,生物学功能及其机制尚未有报道。因此本研究开展五个试验,首先克隆并分析了PBD114基因序列,比较了不同品种猪PBD114基因表达的差异,探索了PBD114的表达调控机制;在此基础上,成功表达出PBD114蛋白,并以小鼠和IPEC-J2细胞为模型,研究了PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用和机制。主要研究结果如下:试验一PBD114基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达藏猪是西藏和川西地区特有的猪种之一,与外种猪相比,具有耐粗饲和抗病力强的优点。本试验分别以藏猪和DLY猪的cDNA为模板,克隆了藏猪和DLY猪PBD114基因CDS序列,用DNAMAN比对分析,且分析了猪、人、大猩猩和瘤牛的βdefensin114的氨基酸序列。结果表明:藏猪和DLY猪的PBD114基因CDS区序列完全一致,猪、人、大猩猩和瘤牛的beta defenisn 114同源性比较近;为研究PBD114在不同品种猪间的表达规律,选取6头60日龄藏猪（6.63±0.85 kg）和6头60日龄DLY三元仔猪（21.72±0.36 kg）,检测PBD114在猪的组织中表达丰度。结果表明:PBD114在DLY猪的十二指肠中表达丰度最高,在藏猪的空肠中表达丰度最高。藏猪的空肠、结肠和肺中的PBD114表达丰度显着高于DLY猪（P<0.05）,然而藏猪的肾脏中PBD114表达丰度显着低于DLY猪（P<0.05）。上述结果表明:Beta defensin 114在不同品种和物种间高度保守,藏猪各组织PBD114表达水平普遍高于DLY猪,提示PBD114可能在猪的健康与免疫调节方面发挥了重要作用,是潜在的抗病基因之一。试验二PBD114基因的表达调控机制研究为探索PBD114在免疫调节中的作用,分别以7日龄DLY仔猪和IPEC-J2为体内外模型,用E.coli K88作为病原菌进行攻毒,研究PBD114基因在免疫激活下的表达规律,结果表明:E.coli K88显着提高了猪十二指肠、空肠和回肠PBD114基因的表达量（P<0.05）以及IPEC-J2的PBD114基因的表达量（P<0.05）,说明PBD114在免疫激活下上调。由于TLRs是介导免疫激活的重要病原菌受体,为探索PBD114的表达受何种信号途径的调控,进一步采用不同的TLRs激活剂Pam3CSK4、Poly（I:C）、LPS、R837（分别为TLR2、3、4和7激活剂）处理IPEC-J2细胞。结果发现:Pam3CSK4显着降低PBD114基因的表达量（P<0.05）;Poly（I:C）、LPS和Imiquimod-R837均显着提高PBD114基因的表达量（P<0.05）。该结果表明,TLR2/3/4/7参与PBD114的表达;TLRs途径的下游是NF-κB和MAPK信号途径,而基因的表达是由转录因子调控。在此基础上,利用JASPAR在线预测发现转录因子NF-κBp65（RELA）和AP-1（FOS和JUN）能够结合PBD114上游启动子区,通过双荧光素酶报告试验证实,转录因子RELA、FOS和JUN均参与了PBD114转录激活,其调控强度为:RELA-JUN>RELA>RELA-FOS>FOS>JUN>FOS-JUN。另外IPEC-J2细胞在E.coli K88攻击下,PBD114基因表达显着提高（P<0.05）,但RELA抑制剂PDTC可显着抑制PBD114基因表达（P<0.05）,结果进一步表明PBD114基因表达受RELA的调控。上述结果表明:免疫激活（如E.coli K88攻击）可上调猪PBD114基因表达,TLR2/3/4/7信号途径均参与了PBD114基因表达的调控,其中,转录因子RELA、FOS和JUN对PBD114的基因表达起关键调节作用。试验三PBD114在大肠杆菌中的异源表达及其生物学特性研究为进一步研究PBD114的生物学特性及功能,将PBD114的成熟肽的DNA构建到表达载体pET32（a+）中,并转化到表达宿主菌Origami B（DE3）构建重组表达菌Origami B-pET32-PBD114,以获得重组PBD114蛋白。通过最优表达条件(最佳表达初始OD600值为0.6、0.8和1.0,最佳IPTG诱导浓度是0.5和1.0 mM,最佳诱导时间是4、6、8和10 h)、亲和层析纯化和蛋白质谱鉴定,成功获得纯度达到95%以上的重组PBD114（rPBD114）,且蛋白质谱结果表明rPBD114的氨基酸序列和NCBI数据库中NP001123445重合度达到100%。在线分析PBD114的蛋白结构和物理化学特性,PBD114同人的beta-defensin 2相似,具有α螺旋和β折叠组成的蛋白结构,带有+1电荷的具有双亲性的多肽。体外抑菌试验表明,rPBD114对E.coli DH5α和E.coli K88+均有较明显的抑制作用,MIC值分别为64和128μg/mL;红细胞溶血与细胞毒性试验则证实,rPBD114几乎没有溶血性和细胞毒性,表明rPBD114安全性较好,可用于后续体内外研究。试验四PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制肠上皮细胞炎性损伤是导致肠道屏障功能受损的重要原因之一,前面的研究结果已经证实PBD114在免疫激活下表达量显着提高,但其有怎样的免疫调节功能及其调控机制如何。本试验采用双因素设计,先用rPBD114和抑制剂PDTC（抑制NF-κB）、GDC-0994（抑制ERK1/2）和T-5224（抑制FOS）预处理IPEC-J2细胞1 h,再分别用PBS和LPS处理细胞3 h,以此探究PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制,结果表明:rPBD114和抑制剂显着提高LPS引起的IPEC-J2细胞活性的降低（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着提高ZO-1、claudin-1和occludin的基因表达量（P<0.05）,显着提高ZO-1和claudin-1蛋白表达（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低TNFα、IL-1β和IL-6的基因表达量（P<0.05）,显着降低细胞培养液TNFα和IL-1β蛋白浓度（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低LPS引起的IPEC-J2早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡的提高（P<0.05）,显着增加IPEC-J2的Bcl-2的基因表达量（P<0.05）,显着提高IPEC-J2的Bcl-2/Bax（P<0.05）。显着降低IPEC-J2的Bax的基因表达量（P<0.05）,显着降低caspase 8和caspase 9的蛋白水平（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低LPS诱导的IPEC-J2细胞pIκB-α/IκB-α、pNF-κB/NF-κB和pERK1/2/ERK1/2的升高（P<0.05）。上述结果表明:rPBD114可通过降低NF-κB和ERK信号通路关键分子IκB-α、NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,减少肠上皮细胞炎性因子表达,进而下调凋亡相关基因和蛋白表达水平,减少肠上皮细胞凋亡。试验五PBD114对LPS诱导小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用为进一步验证PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用效果,试验将72只3周龄ICR小鼠按照体重相近原则,随机分配到6个试验组:CON（生理盐水）、LOW（4 mg/kg的rPBD114）、HIGH（8 mg/kg的rPBD114）、LPS（生理盐水+10 mg/kg LPS攻毒）、LOW+LPS（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）和HIGH（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）。预饲一周后,按照试验设计所有试验鼠注射给与等体积的rPBD114或生理盐水,每天注射一次,连续注射6天。试验第7天早上小鼠注射完生理盐水和rPBD114后1 h,攻毒组立即注射10 mg/kg LPS,未攻毒组注射等体积的生理盐水,5 h后所有小鼠二氧化碳麻醉处死。结果表明:LOW组显着降低采食量和平均日采食量（P<0.05）,增加脾脏的脏器指数（P<0.05）;LPS攻毒显着增加血清D乳酸和二胺氧化酶的水平（P<0.05）,表明LPS攻毒模型成功导致小鼠肠道炎性损伤;LPS攻毒增加炎性因子的基因和蛋白水平,造成小鼠肝脏、肾脏和肠道屏障的损伤;而给与小鼠rPBD114,可降低血清和空肠的炎性因子（TNFα、IL-1β和IL-6）水平（P<0.05）,减少LPS对小鼠肝脏（降低血清ALT）的损伤（P<0.05）,并且通过调节空肠凋亡相关基因（增加Bcl-2和Bcl-2/Bax的基因表达,降低Bax和caspase3的基因表达）的表达（P<0.05）,提高肠道紧密连接蛋白（增加ZO-1、occludin和claudin-1的基因表达,增加ZO-1蛋白表达）表达（P<0.05）,增强机体免疫力（提高血清IgG、IgM、C3和C4）（P<0.05）,从而改善肠道形态（降低十二指肠隐窝深度和提高空肠的绒隐比）（P<0.05）。上述研究结果表明:LPS攻毒造成小鼠全身性炎症和肠道损伤。rPBD114在不影响小鼠生长性能的前提下,通过降低血清和空肠中炎症因子的产生,调节凋亡相关基因和蛋白的表达,减少肠黏膜凋亡,提高小鼠免疫力,改善肠道健康。综上所述,PBD114在不同品种猪之间高度保守,且PBD114在藏猪的组织中表达水平高于DLY猪,PBD114在免疫激活下表达上调,是一个重要的免疫应答基因,其表达受TLR2/3/4/7和转录因子RELA/FOS/JUN调控;PBD114不仅具有抑菌活性,且对免疫激活具有明显的反馈调节作用,即在免疫激活时,PBD114通过降低IκBα,NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,抑制炎性因子表达,缓解其导致的肠上皮细胞炎性损伤。上述研究结果不仅从理论上揭示了PBD114的表达调控机制及其生物学功能,还有望为新型抗生素替代品的研发以及寻求改善动物健康的营养调控措施等提供新的思路。
魏薇[3]（2019）在《马、驴、马骡β-防御素1基因克隆、体内表达及原核表达研究》文中认为防御素作为机体天然免疫系统的重要组成部分,广泛分布于哺乳动物各种组织器官的上皮细胞中,是一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽。防御素不仅可以直接抵抗病原微生物,而且还具有免疫调节作用。虽然人们对于大多数哺乳动物β-防御素1的结构、功能及表达等都有所研究,但对于马、驴、马骡的研究鲜有报道。本文根据NCBI公布的马、驴的β-防御素1cDNA保守序列设计引物,通过RT-PCR和cDNA末端快速克隆技术（RACE）获得了马、驴、马骡基因序列。通过RT-qPCR（RealTime QuantitativePCR）检测三种动物各个组织器官（舌、气管、食管、肺、胃底、十二指肠、幽门、空肠、回肠、直肠、结肠、膀胱、肾、脾、脊髓）β-防御素1的表达水平。建立了β-防御素1的原核表达系统,原核表达产物抑菌,为今后防御素生物产业化奠定了理论基础。1.驴、马、马骡β-防御素1基因全长分别为501bp、449bp、474bp。对比UniProtKB数据库中已有的mRNA,发现马、驴、马骡处于同一个进化阶段,确定了马、驴、马骡之间的同源保守性。通过与其他哺乳动物（大鼠、黑猩猩、褐家鼠、猪、山羊、绵羊、狗）氨基酸的对比与进化树的构建,确定了马的β-防御素1在哺乳动物中的进化地位,并找出了由207bp组成的开放读码框（ORF）,该ORF编码69个氨基酸残基,其中包括信号肽（1-22）、前片段（22-33）、以及成熟肽（33-69）,在成熟肽的特定位置含有6个半胱氨酸残基。2.Real-time qPCR方法检测了防御素在马、驴、马骡三种动物不同组织器官中的表达。结果显示防御素在三种动物的各个器官的粘膜层中均有不同程度的表达。驴的幽门部、驴皮以及肾的表达量明显高于其他器官;在马的心、肾、胃底的表达量明显高于其他器官。而与其他器官相比,马骡的胃底、食管、肾的表达量最高。防御素在三种动物消化道及肾表达明显偏高,说明防御素的表达可能与其食性有关。3.利用与类弹性蛋白ELP（Elastin-Like Protein,ELP）共同融合表达方法成功构建了 eBD-1（马β-防御素1）原核表达系统。通过相关软件对合成的eBD-1-ELP的基因进行优化,合成该基因后,将其成功克隆到原核表达载体pET-22b。构建获得了融合重组质粒pET-22b-eBD-1-ELP,通过不同温度及不同浓度IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE结果显示在37℃、25℃、18℃融合蛋白均能表达,在37℃,IPTG浓度为0.5 mM/L诱导6h,且蛋白纯化缓冲液pH值为8.2时,融合蛋白表达量最高。经过对蛋白进一步纯化、浓缩等成功获得对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用的马β-防御素eBD-1。
刘丽燕[4]（2018）在《潘氏细胞抗菌肽对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道损伤的影响及机制初探》文中研究说明背景与目的急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis,ANP）常伴随着肠道屏障损伤与肠道菌群紊乱。潘氏细胞通过分泌抗菌肽维持肠道屏障功能正常且参与维持肠道菌群稳态。本研究观察潘氏细胞抗菌肽对ANP大鼠肠道损伤的影响并对其机制进行初步的探讨。方法逆行胆胰管注射3.5%牛黄胆酸钠溶液建立大鼠急性坏死性胰腺炎模型,尾静脉注射100 mg/kg双硫腙溶液建立大鼠潘氏细胞耗竭模型,在尾静脉注射双硫腙溶液6h后诱发大鼠急性坏死性胰腺炎以建立ANP+双硫腙大鼠联合组模型,所有大鼠在各自造模后6h、12h、24h、36h及48h处死并留取标本。依各组大鼠自然死亡率绘制Kaplan-Meier生存曲线;Schmidt评分标准评估各组大鼠胰腺病理损伤;肠道损伤用以下指标评估:Chiu’s评分标准评估各组大鼠末端回肠病理损伤;测定血清二胺氧化酶（DAO）及D-乳酸的水平评估肠道通透性,ELISA检测血清与肠道组织TNFα、IL-1β和IL-17A水平,评估全身及肠道炎症;荧光原位杂交技术（FISH）检测肠道菌群移位情况。荧光定量PCR及免疫荧光观测末端回肠潘氏细胞溶菌酶的表达及潘氏细胞计数。气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测各组大鼠粪便短链脂肪酸的含量;荧光定量PCR检测各组大鼠粪便 RuminococcaceaeUCG-005 及 RuminococcaceaeUCG-014 的表达。蛋白印迹（western blot）检测末端回肠粘膜内质网应激蛋白BIP及ATF6的表达。结果Kaplan-Meier生存曲线显示假手术组、双硫腙组、ANP组及ANP+双硫腙联合组造模后48h的生存率分别为100%、98.8%,78.7%及50.5%。ANP组各个时间点胰腺病理损伤及评分高于假手术组,联合组各个时间点胰腺病理损伤及评分高于相应时间点的ANP组,尤其在24h及36h（p<0.05）。与假手术组比较,ANP组各个时间点末端回肠病理损伤及评分逐渐加重,肠道通透性指标升高;末端回肠及血清炎症因子TNFα、IL-1β和IL-17A表达水平增加并伴随有肠道菌群移位。联合组与ANP组比较,在各个时间点联合组末端回肠病理损伤及评分明显高于ANP组织（P<0.01）,尤其是6h;ANP组及联合组血清DAO及D-乳酸含量随时间逐渐升高,在6h、12h、24h联合组较ANP组肠通透性损伤更明显（p<0.05）;联合组末端回肠炎症因子普遍高于ANP组,其中IL-17A及IL-1β水平在 6h,12h,24h 较 ANP 组明显上调（分别为 6h、12hp<0.01,24hp<0.05）,而TNF-α水平在各个时间点皆较ANP组升高（分别为6hp<0.01,12h、24h、36h、48hp<0.05）。ANP组及联合组血清炎症因子表达随时间逐渐上升,联合组血清TNFα,IL-1β及IL-17A水平在6h、12h、24h较ANP组明显升高（分别为TNFα,IL-1β 6h p<0.01,12h、24h<0.05;IL-17A6h、12h、24h P<0.05）;FISH 显示联合组肠道菌群移位最明显。qPCR显示ANP组溶菌酶基因表达量较假手术组下降且溶菌酶基因表达下降与肠通透性指标及炎症因子表达上调呈负相关,免疫荧光显示联合组溶菌酶的表达最低且潘氏细胞计数最少。大鼠粪便短链脂肪酸ANP组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量随时间的延长进行性下降,联合组短链脂肪酸含量普遍低于ANP组,其中乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸的含量随时间的延长轻度升高,丁酸、异戊酸的含量随时间的延长变化不明显,联合组乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的含量在6h,12h较ANP组明显下降（p<0.05）,异丁酸、异戊酸的含量在6h较ANP组比较明显减少（p<0.05）;大鼠粪便RuminococcaceaeUCG-005 及 RuminococcaceaeUCG-014 的基因表达在 ANP 组随时间的进展逐渐下降,在联合组表达下降的最明显,其中6h、24h联合组明显低于ANP组（p<0.01）。ANP组及联合组末端回肠粘膜BIP及ATF6蛋白随时间延长表达上调,且在检测的6h、24h、48h联合组的表达强于ANP组（p<0.05）。结论潘氏细胞耗竭后急性坏死性胰腺炎大鼠生存率降低,胰腺及末端回肠组织的病理损伤加重,肠通透性增加,末端回肠及血清炎症因子TNFα、IL-1β和IL-17A的表达上调,肠道菌群移位明显并伴随着抗菌肽的减少。潘氏细胞作为保护因子可能通过其分泌的抗菌肽减少,致与其相关的厚壁菌门RuminococcaceaeUCG-005 及 RuminococcaceaeUCG-014 数量减少,并导致相应的细菌代谢产物乙酸生成减少,乙酸减少可能增强了肠道上皮内质网应激进而导致急性坏死性胰腺炎大鼠肠道的损伤。
付晓莹[5]（2016）在《ToxoDB#17型弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病特点及潘氏细胞损伤的研究》文中指出为探究ToxoDB#17弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病特点及对潘氏细胞的影响,本实验以4周龄健康昆明小鼠为研究对象,设置8个浓度梯度（<1个卵囊/ml,100106个卵囊/ml）。此外,选取104个/只,105个/只,106个/只三个剂量及生理盐水组设置三个实验组及一个对照组,在灌胃后6h、1d、3d、8d,各组分别处死三只小鼠,取小肠各段及全身脏器固定,常规病理学切片,H&E和免疫组化染色,显微镜观察各组织病理损伤与虫体分布,并对小肠各段潘氏细胞及其颗粒的数量进行统计。主要研究结果如下:1、ToxoDB#17型弓形虫卵囊的分离及鉴定。通过小鼠生物学鉴定和细胞培养技术从河南一只阳性血清猫体内分离出1株弓形虫活虫,应用PCR-RFLP鉴定其基因型为ToxoDB#17,将含有ToxoDB#17型包囊的小鼠大脑饲喂给弓形虫血清学阴性的猫,采集新鲜猫粪,经蔗糖漂洗,分离弓形虫卵囊。2、ToxoDB#17弓形虫对昆明小鼠的致病性。将收集的卵囊原液从106个/ml倍比稀释到<1个/ml,分别灌胃小鼠,观察小鼠临床症状及致死情况。结果显示:小鼠在攻虫后一周内出现一过性的精神沉郁,弓背,被毛逆立等现象。其中102个/ml与104个/ml剂量组中各出现一只死亡的小鼠,死亡的时间分别为37DAI和44DAI。剩余小鼠存活时间均超过60DAI。3、ToxoDB#17弓形虫在全身各脏器的分布与损伤。选择104个卵囊/ml,105个卵囊/ml,106个卵囊/ml三个剂量组分别灌胃小鼠,根据免疫组化切片结果,三组小鼠在4个时间点均有阳性抗原分布,其中抗原分布最多的组织是肠系膜淋巴结,卵囊浓度越高,IHC小鼠阳性检出率越高,损伤越重。剖检可见淋巴结和脾脏肿大。镜检发现淋巴结、脾脏严重坏死,大脑、肝脏血管周围有炎症反应。4、ToxoDB#17弓形虫卵囊灌胃小鼠后小肠损伤及弓形虫阳性面积的关系。小肠的HI评分结果显示:随着时间的增加,各组小肠损伤评分呈现先降低后升高的趋势。免疫组化结果显示,随着感染时间的增加,弓形虫在小肠各段中阳性面积逐渐增大。镜检可见:小肠上皮细胞坏死脱落,肠腺被破坏,潘氏细胞及颗粒大量减少。5、卵囊灌胃昆明小鼠后,小肠隐窝、潘氏细胞及其颗粒的变化。三组小鼠小肠各段隐窝数、PCs总数及其颗粒数都呈现先减少后增多再减少的趋势。6、ToxoDB#17弓形虫卵囊对昆明小鼠小肠溶菌酶的影响。免疫组化结果显示,小肠各段潘氏细胞中溶菌酶并没有表达。
沈雪梅[6]（2016）在《兔源干酪乳杆菌对仔兔小肠潘氏细胞分泌功能的影响》文中研究指明断奶仔兔容易发生肠道疾病,鉴于使用抗生素的弊端,利用益生菌等抗生素替代品将是必然趋势。乳酸菌是猪、鸡等单胃动物的主要益生菌,但并不是家兔肠道中的优势菌,其是否可以被开发为家兔的益生菌还有待研究。益生菌对动物的作用包括消化营养物质、促进肠道发育和调节肠道微生物区系等。其中,益生菌调节微生物区系的方式之一是通过宿主肠细胞内Toll样受体与宿主产生信号交流,促进宿主感知肠道菌群数量及结构,并通过激活先天与后天免疫进行调控。本试验旨在分离仔兔肠道乳酸杆菌和小肠潘氏细胞的基础上,检测乳酸杆菌对仔兔潘氏细胞分泌功能及肠道免疫的影响;并通过检测乳酸杆菌基因组DNA对潘氏细胞TLR 9受体表达水平及炎性反应的影响来探讨其益生效应,为开发家兔益生菌提供理论依据。本研究利用选择性培养基分离兔源乳酸杆菌;给7日龄新西兰白兔灌服所分离的干酪乳杆菌8d后,检测其对仔兔肠道发育水平以及十二指肠、空肠和回肠组织中TLR 9受体、溶菌酶及α-防御素基因表达水平的影响;以原代分离的小肠隐窝为试验材料,用未酶切及酶切处理的干酪乳杆菌基因组DNA分别免疫刺激家兔的隐窝细胞,检测基因组DNA对隐窝中潘氏细胞TLR 9受体、溶菌酶、α-防御素、TNF-α、INF-β和IL-6基因表达水平的影响。试验结果如下:1)用选择性培养基结合特异引物PCR及16S rDNA序列测序方法分离鉴定出兔源酸鱼乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌和屎肠球菌,其中干酪乳杆菌GC含量最高,被选作受试菌种;2)采用改进的EDTA螯合法分离隐窝细胞,不同螯合条件下分离效果差异显着（P<0.05）,本试验选择低温、10 mmol/L EDTA为最佳分离条件,得到的绒毛和隐窝形态完整,基因组DNA与总RNA未发生降解。分离的隐窝富集物中溶菌酶和α-防御素基因相对表达水平极显着高于绒毛（P<0.01）;3)人工哺乳仔兔灌服干酪乳杆菌菌液,可极显着提高小肠总菌中乳酸杆菌的比例（P<0.01）,降低大肠杆菌的比例（P<0.01）;显着提高仔兔十二指肠、空肠组织中TLR 9、溶菌酶及α-防御素基因的表达水平（P<0.05）,但对所检测的回肠各基因表达水平没有显着影响（P>0.05）;能极显着提高十二指肠和空肠中脱颗粒潘氏细胞所占的比例（P<0.01）,但对回肠没有影响;4)未经酶切处理的干酪乳杆菌基因组DNA对培养的肠隐窝细胞并没有显着的免疫刺激功能（P>0.05）;5)肠隐窝细胞可以接受CpG 2007的免疫刺激,CpG 2007极显着地提高隐窝TLR 9受体、溶菌酶、α-防御素、TNF-α、INF-β和IL-6基因的表达水平（P<0.01）;干酪乳杆菌基因组DNA经过Sau3AI酶切之后,可对隐窝产生免疫刺激作用,并显着地提高肠隐窝细胞TLR 9及α-防御素的基因表达水平（P<0.05）,但对溶菌酶、TNF-α、INF-β和IL-6基因的表达没有显着影响。综上所述,干酪乳杆菌可以提高哺乳仔兔肠道固有免疫水平,宿主细胞可以识别来源于细菌基因组的小片段核酸序列,激活固有免疫反应相关信号通路,提高肠道抗菌能力,为合理运用乳酸菌提供一定的理论依据。
杨玉荣,焦喜兰,梁宏德[7]（2010）在《潘氏细胞及其防御素的研究进展》文中研究表明潘氏细胞防御素（Paneth cell defensin,PCD）在维持动物消化道内稳态、参与消化道固有免疫方面发挥重要作用,潘氏细胞的变化与肠道功能异常有密切关系。研究发现潘氏细胞α-防御素表达紊乱是炎症性肠病的关键发病因素之一。本文综述潘氏细胞的分布和形态、生物学特点、潘氏细胞防御素的生物合成过程及其功能。
杨玉荣,刘占举,梁宏德[8]（2010）在《防御素在炎症性肠病中的作用机制》文中研究说明炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）患者或IBD动物模型肠道的防御素表达紊乱可能与IBD的发生和迁延不愈有关.防御素除了具有直接杀灭或抑制病原微生物的作用,在生物应激时还具有调节或扩大获得性免疫反应的作用.防御素表达紊乱后可能干扰了获得性免疫的启动,又扩大了肠道局部的炎症反应,加快IBD的进程.本文主要论述防御素在IBD的作用机制,并对防御素的应用前景作一展望.
孙哲[9]（2010）在《隐窝素-1与隐窝素-4在溃疡性结肠炎小鼠模型肠道组织中的动态表达规律研究》文中研究说明为了研究隐窝素-1与隐窝素-4在溃疡性结肠炎发病过程中的作用及作用机制,本研究以BALB/c小鼠为研究对象,自由饮用7%的葡聚糖硫酸钠溶液7 d制造UC急性模型,分别在用药1 d,3 d,5 d,7 d时,采取小鼠十二指肠,空肠,回肠和结肠,应用实时荧光定量PCR的方法检测小鼠肠道中cryptdin-1与cryptdin-4的动态表达规律及相关性。主要结果如下:1.小鼠急性UC模型不同时期肠道同一部位cryptdin-1 mRNA的动态表达变化:小肠中,cryptdin-1 mRNA在1 d时表达量最高,且极显着高于其他3个时期（P<0.01）;5 d的表达量次之且与3 d表达水平有差异显着性（P<0.05）;7 d时表达量最低,且极显着低于前3个时期（P<0.01）。结肠中,在1 d时表达水平最高,也极显着高于其他3个时期（P<0.01）;7 d的表达量次之;5 d的相对表达量最低。2.小鼠急性UC模型同一时期肠道不同部位cryptdin-1 mRNA表达量的动态变化:炎症1 d时,cryptdin-1 mRNA在十二指肠表达最高,显着高于其他三个肠段（P<0.05）;空肠次之;结肠中最低且与其他三肠段的呈极显着差异性（P<0.01）。炎症3 d和5 d时,十二指肠最高,回肠次之,也是在结肠中最低且极显着低于十二指肠、空肠、回肠的表达水平（P<0.01）。炎症7 d时的表达量是空肠中最高,回肠次之,结肠最低,三个部位之间的差异均极显着（P<0.01）。3.小鼠急性UC模型不同时期肠道同一部位cryptdin-4 mRNA的动态表达变化:十二指肠和空肠是在炎症1 d时达到最高表达量水平且极显着高于3 d,7 d的水平（P<0.01）;5d的表达水平次之;在7 d时表达量降至最低。回肠中,cryptdin-4 mRNA在5 d时最高且显着高于其他三个时期（P<0.05）;1 d时次之与3 d、7 d相比均达到极显着水平（P<0.01）;也是7d时最低水平。结肠中,cryptdin-4 mRNA在7 d时表达水平最高,且与其他三个时期差异都极显着（P<0.01）;1 d时次之;3 d时表达水平最低。4.小鼠急性UC模型同一时期肠道不同部位cryptdin-4 mRNA表达量的动态变化:炎症1 d和3 d时,cryptdin-4 mRNA在十二指肠最高且与结肠的差异极显着（P<0.01）;空肠次之且与结肠的表达水平差异显着（P<0.05）;结肠中最少。5 d时,十二指肠最高且与其他部位都差异极显着（P<0.01）;回肠次之且与结肠的差异显着（P<0.05）;也是在结肠中最低。炎症7 d时,结肠中最高且极显着高于十二指肠的水平（P<0.01）;空肠次之;十二指肠最低且与三个部位之间的差异均极显着（P<0.01）。5.小鼠急性UC模型中cryptdin-1与cryptdin-4相对表达量的相关性:cryptdin-1和cryptdin -4 mRNA表达在小鼠急性UC模型炎症过程中呈极显着正相关（r=0.801,P<0.01）。这些结果提示,在cryptdin-1与cryptdin-4在UC炎症的整个过程都有表达,其表达水平呈动态变化规律且有极显着相关性。在UC炎症的过程中,cryptdin-1与cryptdin-4在十二指肠和空肠中的表达水平都是在1 d时表达量最高,然后3 d时下降,5 d时又有回升,到7 d时降低到最低水平。cryptdin-1在回肠中的表达规律与十二指肠一样,而cryptdin-4是在5 d时处于最高水平。对于结肠段,cryptdin-1与cryptdin-4虽然都有表达,但整体的表达水平均较低,cryptdin-1是1 d时表达量最高而cryptdin-4是7 d时最高。说明cryptdin-1与cryptdin-4参与UC模型炎症的整个过程,且与UC的发生发展存在密切的关系,扮演着重要作用。
陶凯忠,唐庆娟,郑萍[10]（2009）在《潘氏细胞研究进展》文中指出潘氏细胞是位于小肠腺底部的浆液性腺上皮细胞,其主要特征是细胞顶部有大量粗大的嗜酸性分泌颗粒,内含防御素、溶菌酶、sIgA等多种抗菌物质。表达于潘氏细胞的NOD2、Toll样受体9、肝癌-肠-胰腺/胰腺炎相关蛋白、RegIIIγ、肿瘤坏死因子α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-17等也是免疫与炎症反应的重要成分。金属硫蛋白、富半胱氨酸肠蛋白、潘氏细胞锌结合蛋白等金属结合蛋白均分布于潘氏细胞,提示潘氏细胞参与金属代谢。潘氏细胞是构成肠黏膜屏障的重要细胞成分。NOD2单核苷酸多态性与克罗恩病有关。潘氏细胞化生常发生于胃、大肠的炎症与肿瘤病变,其病理意义有待于进一步研究。
二、潘氏细胞防御素研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、潘氏细胞防御素研究进展（论文提纲范文）
（1）扬子鳄β防御素基因家族的解析及其肠道微生物冬眠适应性宏基因组学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 扬子鳄β防御素基因家族的鉴定与进化、表达解析 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 扬子鳄的研究概述 |
| 1.1.1 扬子鳄的历史分布与种群盛衰 |
| 1.1.2 扬子鳄的保护现状 |
| 1.1.3 扬子鳄的生活习性 |
| 1.1.4 鳄类强大的免疫抗菌能力 |
| 1.1.5 扬子鳄免疫相关研究进展 |
| 1.2 抗菌肽 |
| 1.2.1 抗菌肽的研究现状 |
| 1.2.2 防御素的分类 |
| 1.2.3 β防御素的基因和蛋白结构 |
| 1.2.4 β防御素的表达与功能 |
| 1.2.5 β 防御素在爬行动物中的研究进展 |
| 1.3 防御素与肠道微生物的互作 |
| 1.4 立项依据与研究目的 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 扬子鳄β防御素基因的预测 |
| 2.3 扬子鳄β防御素基因全长序列的获取 |
| 2.3.1 组织Total RNA的提取 |
| 2.3.2 5 ’-和3’-RACE |
| 2.3.2.1 总RNA的去磷酸化 |
| 2.3.2.2 沉淀RNA |
| 2.3.2.3 去除mRNA帽子(5’-cap)结构 |
| 2.3.2.4 连接RNA Oligo到 Decapped mRNA |
| 2.3.2.5 反转录反应 |
| 2.3.2.6 特异性引物扩增5’-和3’-cDNA末端 |
| 2.3.3 基因克隆与5’-和3’-cDNA末端序列的测序 |
| 2.4 扬子鳄β防御素基因组织表达检测 |
| 2.4.1 反转录合成cDNA |
| 2.4.2 实时荧光定量PCR |
| 2.4.3 相对表达水平分析 |
| 2.5 系统进化与生物信息分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 组织总RNA提取结果与RACE-PCR扩增结果 |
| 3.1.1 总RNA提取结果 |
| 3.1.2 RACE-PCR扩增β防御素基因全长序列 |
| 3.2 扬子鳄β防御素基因簇的鉴定与基因共线性分析 |
| 3.3 扬子鳄β防御素的进化分析 |
| 3.4 扬子鳄β防御素基因的结构特征 |
| 3.5 扬子鳄β防御素的组织表达 |
| 3.6 扬子鳄旁系AsBDs与哺乳动物α防御素的比较分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 哺乳动物α防御素起源于旁系β防御素的假说 |
| 4.2 β防御素的抗菌活性 |
| 4.3 肠道高表达的β防御素与肠道微生物的关系 |
| 第五章 结论、创新点与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 第二部分 扬子鳄肠道微生物冬眠适应性宏基因组学研究 |
| 第六章 文献综述 |
| 6.1 肠道微生物研究 |
| 6.1.1 引言 |
| 6.1.2 宏基因组de novo测序 |
| 6.1.3 16 S rRNA扩增子测序 |
| 6.1.4 野生动物肠道微生物研究现状 |
| 6.2 动物的冬眠 |
| 6.2.1 冬眠的简介 |
| 6.2.2 冬眠影响免疫系统及肠道生理的研究 |
| 6.2.3 鳄鱼的冬眠及研究进展 |
| 6.3 冬眠对肠道微生物的影响研究进展 |
| 6.3.1 冬眠对肠道微生物群落多样性的影响 |
| 6.3.2 冬眠对肠道菌群组成的影响 |
| 6.4 肠道黏膜层粘蛋白(Mucin)与肠道微生物 |
| 6.5 肠道免疫屏障(防御素等)与肠道微生物的关系 |
| 6.6 立项依据与研究目的 |
| 第七章 材料与方法 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.2 主要仪器与设备 |
| 7.3 方法与实验步骤 |
| 7.3.1 微生物总DNA的提取 |
| 7.3.2 16S rRNA扩增子文库构建与测序 |
| 7.3.3 扩增子测序生物信息学分析 |
| 7.3.4 扩增子测序结果数据分析 |
| 7.3.5 鸟枪法宏基因组测序 |
| 7.3.6 宏基因组生物信息学分析 |
| 7.3.7 宏基因组测序结果的统计分析 |
| 7.3.8 免疫相关基因肠道组织表达分析 |
| 第八章 实验结果 |
| 8.1 微生物基因组DNA提取情况 |
| 8.2 扩增子测序与宏基因组测序结果 |
| 8.2.1 扩增子测序的总体结果 |
| 8.2.2 宏基因组测序的总体结果 |
| 8.3 扬子鳄肠道微生物群落组成及其季节性变化 |
| 8.3.1 门水平肠道菌群的组成及其季节性变化 |
| 8.3.2 属水平肠道菌群的组成及其季节性变化 |
| 8.4 扬子鳄肠道微生物群落结构分析 |
| 8.4.1 扬子鳄肠道菌群α多样性分析 |
| 8.4.2 扬子鳄肠道菌群β多样性分析 |
| 8.5 扬子鳄肠道微生物组的冬眠适应性研究 |
| 8.5.1 冬眠期特异肠道微生物群落的组成变化及其功能 |
| 8.5.2 基于CAZy数据库的冬眠肠道微生物组的功能分析 |
| 8.6 活跃期扬子鳄肠道微生物组研究 |
| 8.6.1 活跃期扬子鳄特征性食肉动物肠道微生物群落 |
| 8.6.2 基于KEGG数据库的活跃期肠道微生物组功能分析 |
| 8.7 扬子鳄肠道免疫基因(β防御素等)和肠道微生物研究 |
| 8.7.1 扬子鳄肠道病原微生物的季节性分布 |
| 8.7.2 β 防御素季节性表达模式防止肠道微生物入侵 |
| 第九章 讨论 |
| 9.1 扬子鳄肠道菌群结构和组成重塑的驱动因素 |
| 9.1.1 环境因子对肠道微生物群落构建及其功能的影响 |
| 9.1.2 扬子鳄肠道菌群多样性的季节性差异 |
| 9.2 “肠道微生物-宿主”共生体的环境适应性及互作机理 |
| 9.2.1 冬眠特异性肠道微生物利用宿主来源粘蛋白糖苷适应冬眠的分子机制 |
| 9.2.2 活跃期肠道微生物降解利用食物来源蛋白质和氨基酸以适应扬子鳄的食肉特性 |
| 9.3 肠道免疫基因(β防御素等)的季节性应答与肠道微生物的互作机理 |
| 9.3.1 冬眠期细菌性粘蛋白降解削弱黏膜屏障 |
| 9.3.2 肠道免疫基因与肠道微生物的互作 |
| 9.3.2.1 MHC、TLR基因与肠道微生物的相互影响 |
| 9.3.2.2 扬子鳄β防御素与肠道微生物的互作 |
| 9.4 病源微生物的来源及保护对策 |
| 第十章 结论、创新点与展望 |
| 10.1 主要结论 |
| 10.2 创新点 |
| 10.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 :(第一部分) |
| 附录 :(第二部分) |
| 攻读博士学位期间发表的主要论文 |
（2）猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文缩略语表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 防御素概述 |
| 1.1 防御素的种类 |
| 1.2 防御素的分布与表达 |
| 2 防御素的表达调控 |
| 2.1 营养素对猪防御素的表达调控 |
| 2.2 非营养素对猪防御素的表达调控 |
| 3 防御素的生物学功能 |
| 3.1 抗菌活性 |
| 3.2 促炎和抗炎 |
| 3.3 屏障保护作用 |
| 3.4 加强趋化作用 |
| 3.5 Defensins和 TLRs |
| 3.6 增强胞内外杀伤能力 |
| 3.7 促进细胞分化 |
| 4 Defensins的应用中遇到的问题 |
| 5 存在的问题 |
| 第二章 本研究的目的、意义、主要内容和技术路线 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 试验研究 |
| 试验一 PBD114 基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达 |
| 一、Beta defensin114 的序列分析 |
| 1 PBD114 克隆技术图 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 总RNA提取和反转录 |
| 3.2 PBD114 基因的扩增 |
| 3.3 核酸电泳 |
| 3.4 DNA纯化 |
| 3.5 DNA加 A |
| 3.6 DNA连接 |
| 3.7 大肠杆菌感受态制备 |
| 3.8 转化与初筛 |
| 3.9 测序与分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 PBD114 的克隆及其序列分析 |
| 4.2 不同物种beta defensin114 同源性 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 二、不同品种猪PBD114 基因的差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验设计 |
| 1.2 组织样品采集 |
| 1.3 测定指标与方法 |
| 1.3.1 总RNA提取及反转录 |
| 1.3.2 引物设计 |
| 1.3.3 qRT-PCR |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PBD114 在藏猪和DLY猪组织中的表达丰度 |
| 2.2 PBD114 在藏猪和DLY猪中的差异表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 PBD114 基因的表达调控机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.2.1 E.Coli K88 攻毒对PBD114 基因表达的影响 |
| 1.2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的影响 |
| 1.2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控 |
| 1.2.4 转录因子RELA和 FOS的抑制对IPEC-J2的PBD114 基因表达的影响 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 腹泻评分 |
| 1.3.2 E.coli K88 的培养 |
| 1.3.3 细胞培养 |
| 1.3.4 总RNA提取、反转录和qRT-PCR |
| 1.3.5 酶联免疫检测细胞因子 |
| 1.3.6 PBD114 启动子区转录因子结合预测 |
| 1.3.7 载体构建 |
| 1.3.8 转染与荧光检测 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 免疫激活对PBD114 基因表达的影响 |
| 2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的调控 |
| 2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控 |
| 2.4 反向验证转录因子RELA和 FOS对 PBD114 表达的调控 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 PBD114 的大肠杆菌异源表达及其生物学特性研究 |
| 1 表达策略 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 表达载体的构建 |
| 3.2 重组大肠杆菌构建 |
| 3.3 诱导表达 |
| 3.4 SDS-PAGE鉴定 |
| 3.5 蛋白质质谱 |
| 3.6 诱导表达条件优化 |
| 3.6.1 诱导初始OD值的优化 |
| 3.6.2 诱导剂IPTG的优化 |
| 3.6.3 诱导时间的优化 |
| 3.7 重组蛋白的纯化回收 |
| 3.8 PBD114 蛋白质的空间结构和物理化学特性的预测 |
| 3.9 MIC |
| 3.10 溶血性 |
| 3.11 细胞毒性 |
| 4 数据处理与统计分析 |
| 5 试验结果 |
| 5.1 表达载体的构建 |
| 5.2 重组菌Origami B-pET32-PBD114 的构建 |
| 5.3 重组蛋白rPBD114 的表达 |
| 5.4 表达条件的优化 |
| 5.5 重组蛋白rPBD114 的纯化和蛋白质质谱鉴定 |
| 5.6 重组蛋白rPBD114 的空间结构和物理化学特性 |
| 5.7 最小抑菌浓度 |
| 5.8 溶血性 |
| 5.9 细胞毒性 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 试验四 重组PBD114 对肠道屏障炎性损伤的缓解及其机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.2.1 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 浓度梯度 |
| 1.2.2 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 时间梯度 |
| 1.2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤 |
| 1.2.4 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 抑制剂安全剂量 |
| 1.3.3 细胞增殖 |
| 1.3.4 荧光定量PCR |
| 1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 1.3.6 ELISA检测细胞因子 |
| 1.3.7 免疫荧光检测ZO-1和claudin-1 |
| 1.3.8 免疫印迹 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度和时间梯度的优化 |
| 2.1.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度优化 |
| 2.1.2 重组蛋白rPBD114 时间梯度优化 |
| 2.2 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 炎性损伤 |
| 2.2.1 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞增殖的影响 |
| 2.2.2 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡的影响 |
| 2.2.3 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡基因的影响 |
| 2.2.4 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞炎症因子的影响 |
| 2.2.5 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制 |
| 2.3.1 抑制剂浓度梯度筛选 |
| 2.3.2 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞增殖的影响 |
| 2.3.3 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 2.3.4 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞炎症因子的影响 |
| 2.3.5 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.6 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡基因和凋亡蛋白的影响 |
| 2.3.7 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞NF-κB/MAPK信号通路蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验五 重组蛋白rPBD114 对小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 饲养管理 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 测定指标与方法 |
| 1.5.1 生长性能 |
| 1.5.2 血液生化 |
| 1.5.3 空肠粘膜凋亡 |
| 1.5.4 肠道形态 |
| 1.5.5 空肠免疫荧光 |
| 1.5.6 荧光定量PCR |
| 1.6 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠生长性能的影响 |
| 2.2 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠脏器指数的影响 |
| 2.3 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清二胺氧化酶和D-乳酸的影响 |
| 2.4 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清生化的影响 |
| 2.5 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清免疫球蛋白和补体的影响 |
| 2.6 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠肠道形态的影响 |
| 2.7 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠紧密连接蛋白的影响 |
| 2.8 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠凋亡及相关基因的影响 |
| 2.9 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠炎症的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 总体讨论、结论与展望 |
| 1 总体讨论 |
| 2 主要结论 |
| 3 创新点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）马、驴、马骡β-防御素1基因克隆、体内表达及原核表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 防御素的概念及特征 |
| 1.1.1 防御素的概念 |
| 1.1.2 防御素的结构特征 |
| 1.1.3 防御素的分类 |
| 1.1.4 防御素的作用机理 |
| 1.2 家畜防御素体内组织表达 |
| 1.2.1 牛防御素 |
| 1.2.2 马防御素 |
| 1.2.3 羊防御素 |
| 1.2.4 猪防御素 |
| 1.2.5 鹿防御素 |
| 1.2.6 骆驼防御素 |
| 1.3 家畜防御素的体外表达研究 |
| 1.3.1 原核表达方法 |
| 1.3.2 真核表达方法 |
| 1.4 防御素应用前景 |
| 1.4.1 药用前景 |
| 1.4.2 饲料添加 |
| 1.5 ELP简介 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 实验一 家畜β-防御素1的克隆与序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物样本采集 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 驴、马、马骡β -防御素1基因中间序列的扩增 |
| 2.2.2 驴、马、马骡β -防御素1 cDNA全序列扩增及检测 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RNA完整性检测 |
| 2.3.2 RT-PCR产物特异性 |
| 2.3.3 三种动物β-防御素1RACE扩增结果 |
| 2.3.4 驴β -防御素1基因RACE产物测序结果 |
| 2.3.5 马β-防御素1基因RACE产物测序结果 |
| 2.3.6 马骡β-防御素1基因RACE产物测序结果 |
| 2.3.7 RACE产物分析 |
| 2.3.8 不同组织β-防御素1基因表达的差异性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 马β-防御素1原核表达载体的构建及其活性检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 载体和酶 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 eBD-1目的基因的克隆及序列分析 |
| 3.2.2 重组原核表达质粒pET-22b-eBD-1-ELP的构建 |
| 3.2.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 3.2.4 利用蛋白纯化仪(AKTA pure 25)最佳纯化条件优化 |
| 3.2.5 目的蛋白活性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 马肾组织RNA提取检测 |
| 3.3.2 eBD-1基因的克隆与鉴定 |
| 3.3.3 ELP基因的克隆与鉴定 |
| 3.3.4 阳性重组工程菌的筛选与鉴定 |
| 3.3.5 重组eBD-1-ELP基因测序结果及序列分析 |
| 3.3.6 重组融合eBD-1-ELP蛋白表达条件优化 |
| 3.3.7 融合蛋白eBD-1-ELP的纯化 |
| 3.3.8 Western blot检测结果 |
| 3.3.9 抗菌活性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）潘氏细胞抗菌肽对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道损伤的影响及机制初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 潘氏细胞抗菌肽在急性坏死性胰腺炎大鼠中的变化 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器与设备 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 实验分组与模型建立 |
| 3.2 样本留取与处理 |
| 3.3 胰腺组织病理HE染色及评分 |
| 3.4 ELISA检测血清炎症因子TNFα、IL-1β、IL-17A的表达 |
| 3.5 肠道损伤的检测 |
| 3.5.1 末端回肠组织病理HE染色及评分 |
| 3.5.2 肠道通透性指标检测 |
| 3.5.3 ELISA检测肠道炎症因子TNFα、IL-1β、IL-17A的表达 |
| 3.5.4 荧光探针原位杂交观测大鼠24h末端回肠菌群染色 |
| 3.6 Real-time PCR检测末端回肠潘氏细胞溶菌酶基因的表达 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第二部分 潘氏细胞耗竭对急性坏死性胰腺炎大鼠的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器与设备 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 实验分组与模型建立 |
| 3.2 样本留取与处理 |
| 3.3 生存曲线绘制 |
| 3.4 胰腺组织病理HE染色及评分 |
| 3.5 ELISA检测血清炎症因子TNFα、IL-1β、IL-17A的表达 |
| 3.6 肠道损伤的检测 |
| 3.6.1 末端回肠组织病理HE染色及评分 |
| 3.6.2 肠道通透性指标检测 |
| 3.6.3 ELISA检测肠道炎症因子TNFα、IL-1β、IL-17A的表达 |
| 3.6.4 荧光探针原位杂交观测大鼠24h末端回肠菌群染色 |
| 3.7 免疫荧光观测大鼠24h末端回肠潘氏细胞溶菌酶染色 |
| 3.8 潘氏细胞计数 |
| 3.9 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第三部分 潘氏细胞对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道损伤保护作用的机制初探 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器与设备 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 实验分组与模型建立 |
| 3.2 气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测大鼠粪便短链脂肪酸的含量 |
| 3.3 荧光定量PCR检测大鼠粪便瘤胃球菌UCG-005及瘤胃球菌UCG-014基因的表达 |
| 3.4 蛋白免疫印迹检测末端回肠Bip及ATF6蛋白表达 |
| 3.5 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）ToxoDB#17型弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病特点及潘氏细胞损伤的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 弓形虫研究进展 |
| 1.1.1 弓形虫的发现 |
| 1.1.2 弓形虫的传播方式 |
| 1.1.3 刚地弓形虫的发育阶段 |
| 1.1.4 刚地弓形虫生活史 |
| 1.1.5 弓形虫在小肠的免疫应答 |
| 1.2 潘氏细胞研究进展 |
| 1.2.1 来源与分布特点 |
| 1.2.2 潘氏细胞与宿主免疫防御 |
| 1.3 肠道中溶菌酶的分布及作用 |
| 1.4 中国弓形虫分离株基因型及致病性研究进展 |
| 1.5 弓形虫病的诊断、治疗与预防 |
| 1.5.1 弓形虫病的诊断 |
| 1.5.2 弓形虫病的治疗 |
| 1.5.3 弓形虫病的预防 |
| 1.5.4 弓形虫对畜牧业的影响 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 ToxoDB#17 弓形虫卵囊的分离及鉴定 |
| 3.1.1 自然感染的猫及样品 |
| 3.1.2 猫血清中弓形虫抗体的检测 |
| 3.1.3 猫组织中弓形虫活虫的分离 |
| 3.1.4 细胞培养和基因型鉴定 |
| 3.1.5 ToxoDB#17 弓形虫卵囊的收集 |
| 3.2 ToxoDB#17 弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病性 |
| 3.2.1 实验动物及分组 |
| 3.2.2 弓形虫虫株的准备 |
| 3.2.3 实验仪器及试剂 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 ToxoDB#17 弓形虫在昆明小鼠全身各脏器的分布及组织损伤 |
| 3.3.1 实验动物及分组 |
| 3.3.2 弓形虫虫株的准备 |
| 3.3.3 样品的采集与处理 |
| 3.3.4 实验仪器及试剂 |
| 3.3.5 实验试剂配制方法 |
| 3.3.6 显微镜观察 |
| 3.4 ToxoDB#17 弓形虫在昆明小鼠小肠的分布及损伤 |
| 3.4.1 实验动物及分组 |
| 3.4.2 弓形虫虫株的准备 |
| 3.4.3 样品的采集与处理 |
| 3.4.4 实验仪器及试剂 |
| 3.4.5 显微镜观察 |
| 3.4.6 组织学评分(Histological index,HI) |
| 3.4.7 数据处理 |
| 3.5 ToxoDB#17 弓形虫对昆明小鼠隐窝及潘氏细胞的影响 |
| 3.5.1 实验动物及分组 |
| 3.5.2 弓形虫虫株的准备 |
| 3.5.3 样品的采集与处理 |
| 3.5.4 实验仪器及试剂 |
| 3.5.5 实验试剂配制方法 |
| 3.5.6 显微镜观察 |
| 3.5.7 数据处理 |
| 3.6 ToxoDB#17 弓形虫对昆明小鼠小肠潘氏细胞溶菌酶的影响 |
| 3.6.1 实验动物及分组 |
| 3.6.2 弓形虫虫株的准备 |
| 3.6.3 样品的采集与处理 |
| 3.6.4 实验仪器及试剂 |
| 4 结果 |
| 4.1 ToxoDB#17 弓形虫卵囊的分离及鉴定 |
| 4.1.1 中国中部地区猫组织中弓形虫基因型鉴定结果 |
| 4.1.2 ToxoDB#17 弓形虫卵囊的收集 |
| 4.2 ToxoDB#17 弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病性 |
| 4.2.1 临床表现 |
| 4.2.2 致病与感染情况 |
| 4.2.3 大脑组织包囊计数 |
| 4.3 ToxoDB#17 弓形虫在昆明小鼠全身各脏器的分布及组织损伤 |
| 4.3.1 弓形虫在昆明小鼠各组织中的分布结果 |
| 4.3.2 三个剂量组整体弓形虫分布结果 |
| 4.3.3 小鼠各脏器的组织损伤 |
| 4.3.4 弓形虫慢性感染期小鼠致病情况 |
| 4.4 ToxoDB#17 弓形虫在昆明小鼠小肠的分布及损伤 |
| 4.4.1 各组小鼠小肠弓形虫阳性面积的变化 |
| 4.4.2 各组小鼠小肠损伤评分结果 |
| 4.4.3 各组小鼠小肠损伤与分布特点 |
| 4.5 ToxoDB#17 弓形虫卵囊对昆明小鼠隐窝及潘氏细胞的影响 |
| 4.5.1 十二指肠隐窝及潘氏细胞的变化 |
| 4.5.2 空肠隐窝及潘氏细胞的变化 |
| 4.5.3 回肠隐窝及潘氏细胞的变化 |
| 4.6 ToxoDB#17 弓形虫对昆明小鼠小肠潘氏细胞溶菌酶的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 ToxoDB#17 弓形虫卵囊的分离及鉴定 |
| 5.2 ToxoDB#17 弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病性 |
| 5.3 ToxoDB#17 弓形虫在昆明小鼠全身各脏器的分布及组织损伤特点 |
| 5.4 ToxoDB#17 弓形虫在昆明小鼠小肠的分布及损伤特点 |
| 5.5 ToxoDB#17 弓形虫卵囊对昆明小鼠隐窝及潘氏细胞的影响 |
| 5.6 ToxoDB#17 卵囊对昆明小鼠小肠潘氏细胞溶菌酶的影响 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 图版与说明 |
（6）兔源干酪乳杆菌对仔兔小肠潘氏细胞分泌功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 家兔肠道菌群结构与功能 |
| 1.2.1 家兔肠道菌群结构特点 |
| 1.2.2 家兔肠道菌群的功能 |
| 1.3 乳酸杆菌 |
| 1.3.1 乳酸杆菌的分类 |
| 1.3.2 乳酸杆菌的免疫功能 |
| 1.4 潘氏细胞 |
| 1.4.1 潘氏细胞能合成和分泌多种抗菌物质 |
| 1.4.2 潘氏细胞的分泌物对肠道微生物区系的影响 |
| 1.4.3 潘氏细胞的防御素对先天免疫的调节 |
| 1.5 TOLL样受体与非甲基化CPG DNA |
| 1.5.1 Toll样受体分类及基本结构 |
| 1.5.2 TLR 9 与非甲基化CpG DNA |
| 1.6 研究内容与技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 兔源干酪乳杆菌的分离鉴定及其对哺乳仔兔潘氏细胞分泌功能的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 乳酸杆菌的分离培养 |
| 2.2.2 菌落鉴定与保存 |
| 2.2.3 动物试验 |
| 2.2.4 动物试验指标测定方法 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 分离培养得到乳酸菌菌株 |
| 2.3.2 灌服干酪乳杆菌对哺乳仔兔胃、盲肠pH和肠道微生物的影响 |
| 2.3.3 灌服干酪乳杆菌对哺乳仔兔肠道形态结构的影响 |
| 2.3.4 灌服干酪乳杆菌对哺乳仔兔肠道潘氏细胞数量的影响 |
| 2.3.5 灌服干酪乳杆菌对肠组织TLR 9、DEFEN、LYZ基因表达的影响 |
| 2.3.6 灌服干酪乳杆菌对肠组织炎性因子基因表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 乳酸杆菌的分离培养与鉴定 |
| 2.4.2 干酪乳杆菌对仔兔肠道微生物、形态结构及相关基因表达水平的影响 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 低温螯合法分离家兔小肠绒毛和隐窝及分离效果鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验设计与螯合剂的配制 |
| 3.2.2 小肠绒毛和隐窝的洗脱分离 |
| 3.2.3 绒毛与隐窝细胞富集量、绒毛相对完整率与隐窝细胞相对活率测定 |
| 3.2.4 DNA与RNA提取和电泳 |
| 3.2.5 隐窝细胞的培养 |
| 3.2.6 数据统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 绒毛和隐窝细胞团的形态和纯度 |
| 3.3.2 各分离条件对绒毛富集率与绒毛相对完整率的影响 |
| 3.3.3 各分离条件对隐窝富集率与隐窝细胞相对活率的影响 |
| 3.3.4 绒毛和隐窝细胞DNA、总RNA保存完整 |
| 3.3.5 绒毛和隐窝细胞团差异表达基因检测 |
| 3.3.6 隐窝细胞在培养过程中相关基因表达量变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 干酪乳杆菌基因组DNA对原代分离培养的兔小肠隐窝细胞分泌功能的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验设计与方法 |
| 4.2.1 试验设计 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 干酪乳杆菌基因组DNA对仔兔小肠隐窝细胞的影响 |
| 4.3.2 酶切基因组序列与非甲基化CpG ODN对仔兔小肠隐窝细胞的影响 |
| 4.3.3 酶切基因组序列与非甲基化CpG ODN对炎性因子表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 基因组DNA与酶切核酸序列对隐窝细胞TLR 9 受体表达的影响 |
| 4.4.2 基因组DNA与酶切核酸序列对隐窝细胞炎性因子表达的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总体结论与创新点 |
| 5.1 总体结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）潘氏细胞及其防御素的研究进展（论文提纲范文）
| 1 潘氏细胞的分布和形态 |
| 1.1 潘氏细胞的分布 |
| 1.2 潘氏细胞的形态 |
| 2 潘氏细胞的生物学特点 |
| 2.1 潘氏细胞的更新 |
| 2.2 潘氏细胞脱颗粒 |
| 2.3 潘氏细胞的模式识别受体 |
| 2.4 潘氏细胞的抗菌功能 |
| 3 潘氏细胞防御素(Paneth cell defensin,PCD)的生物合成 |
| 3.1 潘氏细胞防御素的基因结构 |
| 3.2 α-防御素的生物合成 |
| 4 潘氏细胞防御素的功能 |
| 4.1 抗微生物作用 |
| 4.2 免疫调节功能 |
| 4.2.1 PCD的趋化功能 |
| 4.2.2 PCD调节并扩大获得性免疫反应 |
| 4.3 PCD与疾病 |
| 5 小结与展望 |
（9）隐窝素-1与隐窝素-4在溃疡性结肠炎小鼠模型肠道组织中的动态表达规律研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 防御素研究概况 |
| 1.1.1 防御素的结构特征 |
| 1.1.2 防御素功能的影响因素 |
| 1.1.3 防御素的生物学活性 |
| 1.1.4 防御素的应用前景 |
| 1.1.5 防御素的基因工程研究 |
| 1.1.6 小鼠潘氏细胞防御素概述 |
| 1.2 溃疡性结肠炎研究进展 |
| 1.2.1 UC 的发病机制 |
| 1.2.2 UC 的临床和病理表现 |
| 1.2.3 UC 的治疗 |
| 1.2.4 UC 动物模型研究进展 |
| 1.2.5 UC 与防御素 |
| 1.3 实时荧光定量PCR 研究进展 |
| 1.3.1 RealTimePCR 的原理 |
| 1.3.2 RealTimePCR 的检测方法 |
| 1.3.3 Real Time PCR的定量方法 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 小鼠cryptdin-1 与cryptdin-4 的克隆及序列鉴定 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 样品采集 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂溶液及配制方法 |
| 3.1.5 PCR 引物的设计与合成 |
| 3.1.6 样品总RNA 的提取及检测 |
| 3.1.7 RT 与PCR 扩增反应 |
| 3.1.8 PCR 产物的回收与纯化 |
| 3.1.9 回收 PCR产物的连接转化 |
| 3.1.10 阳性转化子的筛选与菌液PCR鉴定 |
| 3.1.11 目的基因序列鉴定 |
| 3.2 cryptdin-1 与cryptdin-4 在DSS-UC 模型小鼠的肠道组织中的表达 |
| 3.2.1 试验动物分组 |
| 3.2.2 样品采集 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂及配制方法 |
| 3.2.5 DSS-UC 模型的建立与鉴定 |
| 3.2.6 UC 模型小鼠不同时期相关肠段组织mRNA 变化规律检测 |
| 3.2.7 数据统计方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 小鼠cryptdin-1 与cryptdin-4 的克隆及序列鉴定 |
| 4.1.1 总RNA 的提取 |
| 4.1.2 cryptdin-1与cryptdin-4 RT-PCR电泳结果 |
| 4.1.3 菌液鉴定阳性克隆 |
| 4.1.4 克隆片段的序列测定及分析 |
| 4.2 cryptdin-1 与cryptdin-4 在UC 模型中小鼠肠道组织中的表达 |
| 4.2.1 DSS-UC 肠炎模型的建立 |
| 4.2.2 DSS-UC肠炎模型不同时期cryptdin-1 与cryptdin-4 mRNA表达水平检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 小鼠肠道组织总 RNA的提取 |
| 5.2 PCR 反应条件的优化 |
| 5.3 小鼠cryptdin-1 与cryptdin-4 序列的克隆与分析 |
| 5.4 UC 模型的建立 |
| 5.5 cryptdin-1与cryptdin-4在UC模型小鼠的相关肠段组织中的表达变化规律 |
| 6 结论 |
| 7 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（10）潘氏细胞研究进展（论文提纲范文）
| 1 潘氏细胞是典型的浆液性腺上皮细胞 |
| 2 潘氏细胞是小肠黏膜屏障重要的效应细胞 |
| 2.1 潘氏细胞合成和分泌多种抗菌肽 |
| 2.2 潘氏细胞转运和分泌s Ig A |
| 2.3 潘氏细胞表达模式识别受体 |
| 2.4 潘氏细胞脱颗粒 |
| 3 潘氏细胞的其他生理功能 |
| 3.1 金属代谢 |
| 3.2 潘氏细胞与胰腺腺泡细胞的相似之处 |
| 3.3 潘氏细胞与白细胞的相似之处 |
| 4 潘氏细胞与疾病 |
| 4.1 克罗恩病 |
| 4.2 慢性胃炎等疾病中的潘氏细胞化生 |
| 4.3 其他 |
四、潘氏细胞防御素研究进展（论文参考文献）
- [1]扬子鳄β防御素基因家族的解析及其肠道微生物冬眠适应性宏基因组学研究[D]. 唐刻意. 浙江大学, 2019(02)
- [2]猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究[D]. 苏国旗. 四川农业大学, 2019
- [3]马、驴、马骡β-防御素1基因克隆、体内表达及原核表达研究[D]. 魏薇. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [4]潘氏细胞抗菌肽对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道损伤的影响及机制初探[D]. 刘丽燕. 南京医科大学, 2018(01)
- [5]ToxoDB#17型弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病特点及潘氏细胞损伤的研究[D]. 付晓莹. 河南农业大学, 2016(05)
- [6]兔源干酪乳杆菌对仔兔小肠潘氏细胞分泌功能的影响[D]. 沈雪梅. 西北农林科技大学, 2016(11)
- [7]潘氏细胞及其防御素的研究进展[J]. 杨玉荣,焦喜兰,梁宏德. 中国细胞生物学学报, 2010(06)
- [8]防御素在炎症性肠病中的作用机制[J]. 杨玉荣,刘占举,梁宏德. 世界华人消化杂志, 2010(29)
- [9]隐窝素-1与隐窝素-4在溃疡性结肠炎小鼠模型肠道组织中的动态表达规律研究[D]. 孙哲. 河南农业大学, 2010(05)
- [10]潘氏细胞研究进展[J]. 陶凯忠,唐庆娟,郑萍. 现代生物医学进展, 2009(04)