一、体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响（论文文献综述）
谭成光[1]（2017）在《双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究》文中研究指明肝癌系原发于人类肝脏组织及脏器的癌症,也是发生于肝细胞与肝内胆管上皮细胞的恶性病变,是临床肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,也是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一。肝癌细胞具有极强的浸润性,其恶性程度极高,预后极差,且临床确诊患者超过80%以上已是晚期不适宜再进行手术切除,尤其是肝癌患者常出现对多种药物抗药性与耐药性,故对目前放疗和化疗均不敏感。因此,目前临床一线及二线治疗的疗效大多并不满意和理想,致使其发病早期便可发生癌症的肝转移,生存率极低。目的:为了更加深入和系统地探寻和创建更加安全、更有疗效、更有特色、更具实用价值的临床中西医结合抗肝癌疗法,本课题希望通过建立双自杀基因逆转录病毒转移体系在转染人肝癌细胞HepG2的实验研究,观察它们对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用;同时,本课题还希望探索研究天然药物芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用以及它可否共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK,以提高和增加它们之间联合增效的抗癌作用效果;而且,本课题也希望通过此实验研究,探寻天然药物芪三酚共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK的最佳作用时间和剂量效应,为中西医结合应用在临床对人肝癌的有效治疗和早期干预提供新的研究思路和科学依据。方法:1、双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及共稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究的方法是:采用基因工程技术构建pWZLneoCDglyTK质粒,并将其转导至DH5α感受态菌中,再将扩增获得的大量质粒提取并通过脂质体载体进行介导,将含双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglyTK导入至病毒包装细胞PA317中,经过G418筛选带病毒PA317/CD+TK阳性克隆细胞株,进行扩增培养后收集培养液中病毒上清液进行浓缩,随后再在Polybrene介导下转染人肝癌细胞株HepG2;然后经过G418的再次筛选阳性克隆、并进行扩增培养,以获得稳定表达双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞株及建立稳定转染双自杀基因的HepG2细胞系,再采用RT-PCR检测双自杀基因的表达情况。2、双功能融合自杀基因CDglyTK对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及芪三酚协同增强杀伤效应的实验研究的方法:分别采用不同浓度的一种或两种联合的自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）、芪三酚、以及自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）与芪三酚组合物分次处理人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞,分别采用光镜和电镜观察其细胞形态学改变,采用凋亡小体细胞形态学、DNA Ladder、原位末端标记法（TUNEL）、凋亡相关基因检测、流式细胞检测观察其细胞凋亡情况;采用MTT检测和细胞克隆形成实验观察细胞增殖状况;采用流式细胞检测观察细胞周期变化,以综合观察、分析和评价它们分别或联合对人肝癌HepG2细胞和HepG2/CD+TK细胞的杀伤效果及其共济协同与联合增效的生物学作用。结果:第一部分:双自杀基因逆转录病毒转移体系建立及其稳定感染人肝癌细胞HepG2结果:1.双自杀基因逆转录病毒转移体系构建与稳定表达的结果:（1）pWZLneoCDglyTK质粒DNA含Amp抗性基因,其转化阳性菌株可在含Amp琼脂上生长,未转化菌无Amp抗性则不能生长,证实是含单一细菌克隆的转化菌落。（2）质粒pWZLneoCDglyTK经提取其DNA并纯化后检测清晰可见有质粒DNA存在。（3）含pWZLneoCDglyTK的质粒经BamH I单酶切后可形成1.19kb和6.9kb的两条电泳条带;经EcoR I单酶切后可形成8.09kb的一条电泳条带;经BamH I和EcoR Ⅰ双酶切后可形成1.19kb、1.31kb和5.59kb的三条电泳条带,证实此质粒为pWZLneoCDglyTK。另以提取的质粒DNA为模板,以CD和TK引物进行PCR扩增,可见扩增的CD和TK的阳性条带,证实此质粒是含CD和TK基因为pWZLneoCDglyTK质粒。构建的双自杀基因经DNA测序并与genebank标准序列比对后证明其序列正确。对质粒pWZLneoCDglyTK阳性转化菌大量扩增培养提取质粒后进行电泳分析,结果有明亮的阳性条带,证明该质粒大量提取成功,对大量提取pWZLneoCDglyTK质粒纯度及浓度测定计算,DNA浓度（μ g/μ 1）=5.25,DNA纯度=1.81,其与理论预估值1.80基本一致。（4）逆转录病毒载体转入病毒包装细胞PA317后第2天即有80%细胞贴壁,生长状态良好,增殖旺盛,细胞形态呈成纤维样,可见分裂相,细胞透明,细胞内无颗粒。用脂质体将pWZLneoCDglyTK质粒及pLXSN.GFP质粒转入PA317细胞48h后可见对照组细胞有绿色荧光产生,证明质粒转染成功,其转染效率在20-30%。（5）对未转染细胞PA317及转染细胞PA317CD+TK的基因组DNA电泳,清晰可见DNA电泳条带;CD、TK基因PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到PA317细胞的基因组上。（6）对提取转染PA317细胞的总RNA进行电泳,有RNA电泳条带存在,证明RNA提取成功;RNA逆转录后PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物在730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物在650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD,TK基因均为阴性,证明CD,TK基因已在PA317细胞中有表达。（7）将pWZLneoCDglyTK质粒以脂质体包裹后导入病毒包装细胞PA317,电镜可见培养上清液中有病毒颗粒散在或聚集成堆呈圆球形,边缘呈波状,直径约100nm大小,说明其逆转录病毒包装成功。2.双自杀基因逆转录病毒感染人肝癌细胞HepG2的结果:（1）人肝癌HepG2细胞复苏第2天可见大部分细胞贴壁,细胞生长良好,形态呈上皮样,多见分裂相,细胞较透明,高倍镜可见细胞内有少许颗粒及细胞器。（2）荧光显微镜下观察,转有对照组病毒上清液中人肝癌HepG2细胞可见大量绿色荧光产生,感染效率达60-70%。（3）对PA317/CD+TK细胞培养上清液中逆转录病毒感染HepG2细胞镜检,该细胞形态未变,用G418筛选,第2天有少数细胞皱缩、死亡、脱落、形成细胞碎片,继续用G418加压培养,存活细胞持续增殖,形成多个细胞克隆,且细胞克隆密切相连。（4）提取未转染人肝癌细胞HepG2及转染细胞HepG2/CD+TK的DNA,电泳后清晰可见DNA电泳条带,证明其基因组DNA提取成功。进行CD、TK基因PCR扩增电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,未经转染HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到HepG2细胞的基因组上。（5）对提取转染细胞的总RNA电泳,有RNA电泳条带存在,证明其RNA提取成功;将RNA逆转录后PCR扩增后电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物650bp处有一特异性条带,而HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已在HepG2/CD+TK细胞中得到了表达。3.人肝癌HepG2/CD+TK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较结果:将转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞及空白对照HepG2细胞进行传代、冻存、复苏后镜检,处于对数生长期的这两种细胞一般形态学基本相同,均呈上皮样生长,且它们的生长曲线也基本一致,无显着性差异（p>0.05）。流式细胞仪对这两种细胞的细胞周期检测,发现它们的细胞周期分布也无明显差异（p>0.05）。第二部分:双自杀基因前体药物联合芪三酚对人肝癌细胞HepG2细胞及转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的杀伤作用的实验研究结果1.双自杀基因前体药物分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h镜检结果:双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC无论单用或联用均对未转染自杀基因的人肝癌HepG2细胞无作用,但对转染自杀基因的HepG2/CD+TK细胞均有一定作用,联用效果较单一效果更好,且作用效果随前体药物浓度增加而增加,但不同自杀基因前体药物浓度作用HepG2/CD+TK细胞后尚未见死亡细胞增多。2.芪三酚作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:不同浓度芪三酚对人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞均有作用,且其作用效果随着芪三酚作用浓度而增加,杀伤作用呈剂量相关性和浓度依赖性,但相同浓度芪三酚分别作用两类靶细胞,其细胞形态及细胞死亡情况未见明显不同和差异。3.芪三酚联合自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:应用双自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对人肝癌HepG2细胞作用,其作用效果随药物浓度增加而增加,并与单用芪三酚作用无明显差别。应用双自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对转染双自杀基因HepG2/CD+TK细胞作用效果更明显,且影响程度也呈剂量效应和浓度依赖性。4.自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后镜检结果:（1）未转染自杀基因的HepG2细胞,在分别或联合应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）作用72h与作用24h时的情况基本相同;而对转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞在分别或联合应用自杀基因前体药物GCV和/或5-FC作用72h比作用24h时损伤目的细胞加重,且GCV和5-FC联合应用较两者单独作用的效果更好。5.芪三酚分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后的镜检结果:与24h作用相比,芪三酚作用72h对两类靶细胞损伤和杀伤均加重,且随药物浓度增加而增加。但芪三酚在同一浓度分别作用两类靶细胞,其细胞形态及死亡情况未见明显差异。6.芪三酚联合自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞后72h后的镜检结果:与24h相比,应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对HepG2细胞作用72h的效果更明显,且随着药物浓度增加而增加,但与单用芪三酚作用HepG2时无明显差别。但应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对HepG2/CD+TK细胞作用72h与作用24h相比,随着药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞形态和生长状态更差,细胞数量更减少,死亡细胞增多更明显等,且它们之间关系呈剂量效应和浓度依赖性。7.自杀基因前体药物和芪三酚对人肝癌细胞HepG2及HepG2/CD+TK的生长抑制作用:（1）分别单用或合用GCV或/和5-FC对人肝癌HepG2细胞作用时,对其生存与增殖影响不明显,而对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用则随药物浓度增加而增加。合用GCV和5-FC对该细胞生长抑制作用更明显。（2）应用芪三酚对HepG2和HepG2/CD+TK细胞的抑制作用均随药物浓度增加而增加,但抑制程度在这两类细胞间无显着性差异。（3）应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,但芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC应用,对该细胞增殖影响无明显差异,均与单独用芪三酚对该细胞增殖抑制情况相似。应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC,对该细胞增殖抑制无明显差异,但细胞抑制情况均明显高于单独应用芪三酚组。8.凋亡细胞的瑞氏染色光镜观察结果:分别或联合加入GCV和/或5-FC对HepG2细胞作用,该细胞生长与增殖均未受影响,也未见该细胞出现凋亡,且GCV、5-FC、GCV+5-FC之间以及各药物浓度间均未见HepG2细胞凋亡现象。加入低浓度芪三酚后也未见HepG2细胞凋亡;但随芪三酚浓度增加,HepG2细胞凋亡现象逐渐明显。芪三酚和自杀基因前体药物联用与单独使用芪三酚的结果基本类似。而分别或联合加入低浓度GCV和/或5-FC对HepG2/CD+TK细胞作用与干预后,未见HepG2/CD+TK细胞出现凋亡;但随自杀基因前体药物作用浓度增加,HepG2/CD+TK细胞出现明显凋亡;尤其是GCV+5-FC合用,该细胞凋亡较单用GCV或5-FC更明显。加入低浓度芪三酚作用未见HepG2/CD+TK细胞凋亡,但随芪三酚浓度增加,HepG2/CD+TK细胞凋亡逐渐明显。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CD+TK细胞凋亡非常明显,即使在低浓度下亦可出现凋亡现象,且随药物浓度增加,凋亡细胞数增加。9.凋亡细胞DNA Ladder检测结果:加入不同浓度GCV（8μg/ml和4μg/ml）和/或5-FC（160μg/ml和80μg/ml）作用HepG2细胞72h,只在加样孔附近发现DNA条带,但未见有DNA Ladder条带产生。而加入低浓度（0.04mmol/L）和高浓度（0.08mmol/L）芪三酚作用,可见微弱的HepG2细胞DNA Ladder产生,且随芪三酚浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚作用效果类似。而在HepG2/CD+TK细胞中加入不同浓度的 GCV（8μg/ml、4μg/ml）和/或 5-FC（160μg/ml、80μg/ml）72h 后,均可见DNA Ladder产生,随自杀基因前体药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder更明显,且GCV+5-FC较单用GCV或5-FC效果更明显。加入低浓度（0.04mmol/L）和高浓度（0.08mmol/L）芪三酚,可见有微弱的HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder产生,且随药物浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和自杀基因前体药物作用HepG2/CD+TK细胞,其DNA Ladder较单用芪三酚或自杀基因前体药物更明显。10.TUNNEL法检测细胞凋亡结果:在人肝癌HepG2中分别加入不同浓度GCV（8μg/ml 和 4 μ g/ml）和/或 5-FC（160 μ g/ml 和 80 μ g/ml）作用 72h,TUNEL 结果为阴性。加入芪三酚作用,TUNEL结果为弱阳性;同时加入芪三酚和前体药物共同作用,HepG2细胞大部分为弱阳性,最高浓度时有部分HepG2细胞为阳性。而HepG2/CD+TK中加入不同浓度 GCV（8μg/ml、4ug/ml）和/或 5-FC（160μg/ml、80ug/ml）作用,TUNEL 结果显示每种低浓度前体药物可使大部分HepG2/CD+TK细胞为弱阳性,但每种高浓度前体药物作用均可使少部分细胞为阳性;采用两种前体药物联用,细胞大部分为阳性。加入芪三酚有部分HepG2/CD+TK细胞的为弱阳性,高浓度芪三酚作用,其细胞核黄色加深。同时加入芪三酚和前体药物,HepG2/CD+TK细胞均为阳性,且在高浓度时为强阳性。11.流式细胞检测细胞凋亡结果:在HepG2细胞中分别加入前体药物GCV（8μg/ml）或5-FC（160μg/ml）作用72h后,其细胞凋亡率分别为5.43%和5.49%,结果基本相同;而当二者联用时,其细胞凋亡率可达到11.09%,这可能与自杀基因前体药物联合应用后的非特异性毒性有关。而当加入浓度为0.08mmol/L的芪三酚后,与前体药物组相比,HepG2细胞凋亡率可升至12.02%,说明芪三酚可引起HepG2细胞的凋亡。但当同时加入芪三酚和前体药物后,HepG2细胞凋亡率比单用芪三酚有增高,HepG2细胞的凋亡率为16.32%。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入前体药物GCV（8μg/ml）或5-FC（160μg/ml）作用72h,与HepG2细胞相比,细胞凋亡率明显增加,分别为11.11%和14.37%;当二者联用时,细胞凋亡率为17.89%。加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞凋亡率为15.81%,稍高于HepG2。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CDTK细胞凋亡率明显增高,可达到22.64%。12.细胞克隆形成的实验结果:在HepG2细胞中分别加入不同浓度前体药物GCV（8 u g/ml 和 4 u g/ml）和/或 5-FC（160 μ g/ml 和 80 μ g/ml）72h,各孔 HepG2 细胞克隆形成率均在90%以上,各孔间无显着差异,细胞克隆较大,每一克隆有数百细胞,且细胞克隆间距离近,有些紧密相连。加入芪三酚后与前体药物相比,HepG2细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加克隆形成率降低。芪三酚浓度0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,每一细胞克隆均明显缩小,每一细胞克隆内仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚的差别不大,在高浓度时的HepG2细胞克隆形成率近50%,细胞克隆内细胞数仅数十个。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入不同浓度前体药物 GCV（8μg/ml,4μg/ml）和/或 5-FC（160μg/ml,80μg/ml）作用 72h,与 HepG2 细胞相比,HepG2/CD+TK克隆形成率明显减少,随前体药物随浓度增加,克隆形成率降低;当增至高浓度时,细胞克隆形成率近50%;两种药物联用,克隆形成率降低更明显,仅为400%,且克隆内细胞数量也逐渐减少,当GCV8μg/ml+5-FC160μg/ml时,细胞数仅数十个。与HepG2细胞实验相似,加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加,克隆形成率降低,在芪三酚浓度为0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,细胞克隆也明显缩小,每一克隆仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物作用的HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显降低,当三者联用高浓度时,未见有细胞克隆产生。13.对相关基因表达水平影响的检测结果:HepG2细胞中分别加入GCV（8μg/ml）、5-FC（160μg/ml）及二者联用,对HepG2细胞凋亡抑制基因c-fos的表达水平影响不大,而bax基因几无表达,二者联用时仅有微弱bax基因表达;而加入芪三酚后的c-fos基因表达明显降低,而bax基因表达明显增高;但前体药物与芪三酚联用与芪三酚单用相比,c-fos基因表达水平变化不大,而bax基因均有较明显表达,但与单用芪三酚结果相比,无显着性差别（P>0.05）。在HepG2/CD+TK细胞中加入GCV（8μg/ml）,5-FC（160μg/ml）后,c-fos基因表达水平均降低,bax基因表达水平均增高。两种前体药物联用的c-fos基因表达降低更明显,而bax基因表达均高于其中任何单一前药使用;加入芪三酚后的c-fos基因表达水平与其对HepG2作用相差不大;但前体药物与芪三酚联用与单用芪三酚相比,c-fos基因表达降低更明显;当三者联用时,c-fos基因几乎无表达。加入芪三酚后,bax基因表达也明显增高;前体药物与芪三酚联用,bax基因表达水平有更明显升高,而三者联用时的bax基因表达水平最高。14.细胞迁移实验的观察结果:在HepG2细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,对该细胞迁移影响较小;加入芪三酚后可抑制HepG2细胞迁移。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距与单用芪三酚差别不大,对HepG2细胞起不到协同抑制细胞迁移的效果。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,该细胞划痕间距明显增大;当两种前药联用时,细胞划痕间距明显大于单种前药。同样,加入芪三酚后对HepG2/CD+TK细胞划痕间距加大,细胞形态变差。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距明显增大,细胞形态更差;当三者联用时的细胞划痕周围几乎无状态良好的细胞。15.流式细胞检测细胞周期结果:在HepG2细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞 G1、S、G2 期细胞比例分别为 22.95%、68.14%、8.91%或 30.31%、67.19%、2.50%,统计学处理差别不显着（P>0.05）,且S期细胞所占比例最多;二者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为32.68%、64.51%、2.82%,差别均无显着性意义（P>0.05）。加入芪三酚后该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为66.61%、33.39%、0%,S期细胞比例明显减少,而G1期细胞比例增多。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为91.83%、8.17%、0%,比单用芪三酚的G1期细胞比例有所增高;三者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为92.23%、5.72%、2.04%。HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为33.62%、47.32%、19.06%和39.22%、58.85%、1.96%,与HepG2细胞相比,S期细胞明显降低,G1期细胞明显增多;两种前药联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为47.57%、49.24%、3.19%,虽S期变化不大,但G1期细胞明显增多,说明两种前体药物联用可使更多HepG2/CD+TK细胞阻止在G1期,不能进一步合成DNA。加入芪三酚后,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为76.78%、23.22%、0%,该细胞DNA合成抑制。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为97.77%、2.23%、0%,三者联用时,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为99.93%、0.07%、0%,该细胞被阻止在G1期,几乎无DNA合成。16.细胞亚结构观察结果:在HepG2细胞中应用GCV和/或5-FC后,多数HepG2细胞表面光滑,无明显结构改变,且两种前体药物联合对HepG2细胞形态学影响不明显。应用芪三酚后的HepG2细胞表面微绒毛增粗,变成长而粗的细丝,说明HepG2细胞有凋亡。同时应用GCV和/或5-FC后的HepG2/CD+TK细胞膜上出现许多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。应用芪三酚后的HepG2/CD+TK细胞表面出现很多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡产生。联合应用前体药物和芪三酚的HepG2细胞膜表面出现一些穿孔现象,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。联合应用自杀基因前体药物和芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞出现更加明显的凋亡小体。结论:1.自杀基因前体药物作用于未转染有双自杀基因的人肝癌HepG2细胞,在本实验设计的浓度剂量和作用时间等条件下,均未能表现出明显的杀癌或抑癌的生物学作用。2.以逆转录病毒为载体将双自杀基因转染至人肝癌HepG2细胞后,再使用双自杀基因前体药物作用,可分别对人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞发生不同程度的损伤和杀伤,从而有效控制人肝癌细胞的增殖性进展。3.自杀基因前体药物均能有效地抑制或杀伤人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的增殖性生长,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,其作用浓度越高,则效果越显着。4.自杀基因前体药物能诱导人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的凋亡,且自杀基因前体药物联合应用对肝癌细胞的抑制与杀伤效果更好,表现出明显的协同增效作用,即与单独使用GC V或5-FC比较,联合使用GCV和5-FC能是人肝癌细胞存活率明显降低,表明双自杀基因较单自杀基因有更强的抑癌效果。5.芪三酚能影响人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的形态学,使其发生破坏性改变;同时,它还能有效抑制这两类细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性;且芪三酚能诱导这两类细胞的凋亡。6.自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚Res联合应用对人肝癌HepG2细胞具有单独使用芪三酚的生物学作用及类似细胞形态学改变;而它们联合应用对人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞能发生更明显的杀伤及破坏性改变,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,浓度越高效果越显着,且表现出双自杀基因前体药物与芪三酚联合应用后更好杀伤效果,呈现出明显的协同增效作用。7.双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚合理应用,特别是联合应用不仅能减低自杀基因前体药物的用量及副作用,还能发挥相互之间的协同效应,并且能发挥更好的效果,这很可能为今后中西医结合及天然抗癌药物与自杀基因及其前体药物的综合应用提供一种更加适应于临床肝癌治疗的新思路、新技术和新方法。
黄暨生[2]（2016）在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中认为恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段（如手术治疗、放疗、化疗等）后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能（GJIC）的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯（GJIC）功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP（tk+）细胞混合A375（tk-）细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高（P<0.05）,说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能（即缝隙连接机制）发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
邵丹[3]（2015）在《多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究》文中提出肝癌是严重危害我国人民健康的恶性肿瘤之一，尽管以手术切除为基础、并辅助化疗、热疗等综合治疗部分改善了肝癌的治疗效果，但是肝癌患者的长期存活率仍然较低。由于大多数原发性肝癌患者的病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅速导致早期诊断困难，而且治疗后的耐药、复发和转移成为了肝癌患者死亡的主要原因。因此，早期精确诊断、提高药物的靶向性、降低治疗的毒副作用成为目前肝癌诊治的挑战。近年来，纳米技术的兴起为攻克临床上肝癌诊治的难题带来了新的机遇，而作为纳米技术和生物医学的结晶，纳米医学已成为当前最具有转化潜力的交叉学科之一。纳米药物载体是为纳米医学领域研究的热点，其中无机纳米粒子作为纳米材料领域的后起之秀，以其独特的纳米结构和性能以及良好的稳定性、高产量、低成本等优势备受纳米医学工作者的关注。目前整合了诊断和治疗特点的多功能纳米平台引起了研究者们的广泛关注，此类多功能无机纳米材料须具备以下三个特点：（1）通过多种分子影像学手段实现对肿瘤的早期精确诊断。（2）联合多种治疗手段协同治疗肿瘤，在提高治疗效果的同时降低副作用。（3）对药物的肿瘤靶向运输、释放和治疗效果进行实时示踪，指导并调整给药剂量，实现肿瘤的个体化治疗。基于无机纳米材料的上述优点，本博士论文紧绕改善肝癌诊治效果这一中心目标，针对临床肝癌诊治中早期诊断难、传统化疗毒性大、效果差以及基因治疗靶向性差三大挑战，分别以量子点和磁性介孔二氧化硅两种无机纳米粒子为基础，发展智能分子设计、纳米特性控制、靶向分子修饰等纳米药物技术，构筑高效、安全的多功能纳米平台，开发具有靶向肝癌的基因治疗和降低肝癌化疗毒副作用的新型纳米药物，揭示其选择性杀伤肝癌细胞的分子机制；利用分子影像学技术对药物在体内的运输和释放过程进行实时示踪，并对肝癌治疗效果与生物安全性进行系统性评价；终而实现肝癌的诊治一体化。本论文主要创新性研究成果概括如下：（1）为了实时示踪HSV-TK/GCV自杀基因系统，我们成功的将量子点偶联TK基因，证实生物偶联既不影响量子点的发光特性，也不影响TK基因的生物学活性，实时示踪发现TK基因于转染24h进入胞核并表达TK蛋白，确定24h为GCV的最佳给予时间，并在体内外成功对HSV-TK/GCV自杀基因系统的抗肝癌效果进行监测，提示量子点可以作为示踪HSV-TK/GCV自杀基因系统的理想载体。（2）为了实现自杀基因的靶向肝癌治疗，我们成功构筑叶酸脂质体担载量子点自杀基因复合体（FL/QD-TK），证实其可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞，并可在体内外可视化示踪TK基因运输和治疗效果，同时具备了较好的生物安全性，提示FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米基因药物有望应用于肝癌的诊治一体化。（3）为了驾驭镉系量子点的生物毒性用于肝癌治疗，我们成功的制备出量子点脂质复合体（QD-LC），证实其可通过巨胞饮途径大量内吞进入肝癌细胞产生大量的ROS，通过线粒体依赖的Caspase凋亡途径选择性杀伤肝癌细胞。QD-LC还可抑制肝癌微小瘤灶的形成，并在实现肝癌荷瘤有效治疗的同时具备了较好的生物安全性，提示可利用镉系量子点内源性毒性实现肝癌的选择性治疗。（4）为了提高化疗药物治疗肝癌的有效性并降低毒副作用，我们通过优化反应条件制备出粒径合适、形貌均一的Janus型磁性介孔二氧化硅纳米粒子（M-MSNs），担载化疗药物DOX得到的Janus型M-MSNs-DOX具备了外加磁场介导的作用，证实Janus型M-MSNs-DOX可在体内外实现选择性肝癌治疗的效果，并具备了较好生物安全性。我们还证实外加磁场可增强Janus型M-MSNs-DOX的肝癌细胞内吞作用和在肿瘤部位的富集，且不影响其生物安全性。最后我们在体内外成功实现了肝癌诊治一体化的目标，提示Janus型M-MSNs有望解决肝癌化疗靶向性差、毒副作用大的弊端，实现肝癌的诊治一体化。综上所述，本论文通过构筑多功能纳米诊治平台，对肝癌靶向自杀基因治疗的监测、利用纳米毒性选择性治疗肝癌以及实现高效低毒的肝癌化疗策略进行了系统而又深入的研究，不仅成功实现了肝癌的诊治一体化，也为早日实现肝癌的早期诊断和个体化治疗提供新方法和新思路。
庄树彤,秦颖,朱宝和,廖允军,王成友,夏荣,刘美洲[4]（2010）在《AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究》文中进行了进一步梳理目的探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应。方法构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达,MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用。结果成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响。结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞。
李湘斌[5]（2009）在《磁性阳离子脂质体介导CD-TK双自杀融合基因靶向治疗肝癌的实验研究》文中认为目的:本课题探讨由CMV启动子、AFP增强子组成的高活性嵌合启动子,通过融合启动子的调控提高融合自杀基因CD/TK在靶细胞表达的特异性;并以生物相容性好的磁性阳离子脂质体为载体,将该自杀基因靶向导入肝癌细胞中,以达到提高基因治疗靶向性及安全性的目的。方法:本研究利用反相蒸发法法制备一种100nm大小、分散均匀的磁性阳离子脂质体,采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由CMV启动子、AFP增强子驱动的融合自杀基因AFPE-pTK-IRES-CD表达载体,并以该磁性阳离子脂质体为载体将PAFPE-pTK-IRES-CD质粒表达载体转染肝癌HepG2细胞系进行体外实验研究,荧光显微镜、流式细胞仪检测纳米的转染效率,分别用RT-PCR、Western-blot杂交等方法检测鉴定CD/TK融合自杀基因在HepG2细胞内的表达;MTT法检测5-FC、GCV对HepG2细胞的毒性;MTT法、克隆形成实验检测自杀基因前药系统对表达自杀基因的HepG2细胞的杀伤效应;绘制细胞生长曲线反映该系统对HepG2细胞生长的影响;免疫组化及免疫荧光检测治疗前后自杀基因蛋白表达水平的变化;用高效液相色谱（HPLC）法测定处理前后前体药物5-FC向5-FU转化效率的变化;结果:在经过正交优化实验后,磁性阳离子脂质体能与质粒DNA有效结合,通过复合体吸附在细胞膜上并进入细胞内,增加进入细胞内DNA量,提高基因转染的效率,并且质粒DNA与磁性阳离子脂质体形成的复合体能有效的抵抗血清中酶类对DNA分子的降解,有效的保护DNA分子的完整性;用绿色荧光蛋白（GFP）基因作报告基因,与磁性阳离子脂质体结合后转染常规培养的HepG2细胞,用荧光显微镜及流式细胞仪检测,发现磁性阳离子脂质体具有较高的转染效率;5-FC和GCV在高浓度（5-FC>60μg/ml,GCV>0.6μg/ml）时,对HepG2细胞亦有一定的杀伤作用;对于CD/TK阳性HepG2细胞,当5-FC的浓度为40μg/ml和80μg/ml时,细胞存活率分别是69.23%和18.02%;同时,结果显示,CD/TK阳性HepG2细胞在两种前体药物5-FC和GCV同时存在的条件下,并没有大多数文献报告的显示出协同杀瘤作用,其作用反而低于单独使用5-FC;200μg/ml,5-FC处理CD/TK阳性HepG2细胞24小时后,用高效液相色谱法测定细胞上清中5-Fu浓度是188μg/ml,5-Fc向5-Fu转化效率是94%;旁杀效应实验显示,在200μg/ml5-FC存在时,只要PAFPE-pTK-IRES-CD质粒有20%的转染效率,细胞的相对存活率将下降为49.6%,说明该融合自杀基因前药系统具有强大的“旁杀效应”。这说明磁性阳离子脂质体介导的自杀基因前药治疗均有明显的抑瘤作用。结论:1)磁性阳离子脂质体能有效介导PAFPE-pTK-IRES-CD自杀基因质粒载体转染HepG2细胞,且未显示明显毒副作用,因此该磁性阳离子脂质体可能成为一种新型的用于基因治疗的非病毒载体。2)5-FC与GCV对CD/TK阳性细胞均有明显杀伤作用,但二者无协同作用,其作用弱于单独5-FC而强于GCV。3)该融合自杀基因前药系统具有强大的“旁杀效应”4)该融合自杀基因前药系统,当前体药物浓度5-FC<200μg/ml,GCV<50μg/ml,在此浓度下,对不含自杀基因的HepG2细胞毒性很低。5)体外实验结果显示,以磁性阳离子脂质体为载体介导AFP调控下的自杀基因在肿瘤的治疗中显示良好的靶向杀伤效应。
杜珍武[6]（2009）在《人IL-12联合HSV-tk基因体外靶向特异性杀伤肝癌细胞的研究》文中提出本研究从肝癌基因治疗存在的有效性与安全性问题出发,采用HSV-tk与IL-12双基因联合的方法以提高肝癌基因治疗的有效性,而利用肝癌的特异性启动子启动联合基因在肝癌细胞内特异性表达,增强肝癌基因治疗的安全性。为此本研究利用基因重组技术构建联合基因靶向特异性治疗肝癌的载体,并在体外细胞水平验证该载体杀伤肝癌细胞的有效性与特异性。本论文取得了如下学术进展:1应用PCR技术成功从人外周血基因组中调取人甲胎蛋白基因启动子（pAFP）、增强子（eAFP）。并将克隆的pAFP与增强子eAFP先后连接入真核表达载体,构建成由pAFP与eAFP启动基因表达的载体。利用报告基因β-半乳糖甘酶基因（β-gal）验证了该启动子具有启动基因在肝癌细胞中表达的特异性。2成功应用连接肽将人IL-12基因的两个亚单位基因拼接为单链基因。应用核糖体进位位点（IRES）将IL-12基因与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）拼接在一起,构建成HSV-tk与IL-12融合的真核基因表达载体。通过体外实验研究结果表明,两个基因可以在肝癌细胞内同时表达,并具有相应的抗肿瘤与激活免疫细胞的功能。说明这两个基因在统一启动子控制下可实现共同表达,使免疫增强基因IL-12与肿瘤自杀基因HSV-tk同步共表达,增强两条途径杀伤肿瘤的协同作用。3成功构建了由人甲胎蛋白基因启动子（pAFP）、增强子（eAFP）控制下的IL-12与HSV-tk联合基因表达载体,将该载体体外转染肝癌细胞以及非肝癌细胞,实验结果表明IL-12与HSV-tk基因在肝癌细胞内有特异性的表达,表达HSV-tk基因的肝癌细胞对GCV有敏感性,并可产生杀伤肿瘤的旁观者效应。IL-12可以促进体外淋巴细胞的增殖,以及IFN-γ的分泌。这些研究结果说明克隆的人甲胎蛋白基因启动子（pAFP）、增强子（eAFP）可特异性启动IL-12与HSV-tk在分泌AFP肝癌细胞内特异性表达,并具有杀伤肝癌细胞功能。本研究在一个载体上实现了联合基因的共同表达以及基因表达的肝癌靶向性,为进一步利用该载体进行肝癌的基因治疗奠定了理论与实验基础。
刘刚[7]（2009）在《氧化铁磁性纳米粒介导HSV-TK自杀基因联合热疗治疗肝癌的体外实验研究》文中提出目的:研究利用氧化铁磁性纳米粒（Cationic-IONPs）作为非病毒基因载体,介导HSV-TK/GCV自杀基因系统协同热疗体外杀伤肝癌HepG2细胞的治疗效果。方法:以改进的共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米粒,并进行表面氨基基团的修饰和表征。以增强型绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1检测氧化铁磁性纳米粒（Cationic-IONPs）的转染效率。利用Cationic-IONPs介导pcDNA3.1-TK重组自杀基因转染人肝癌HepG2细胞,RT-PCR验证TK基因在mRNA水平的表达,G418筛选抗性细胞,获得稳定表达TK基因的HepG2/TK细胞。台盼兰拒染实验测定不同时间点GCV对HepG2/TK细胞的杀伤作用。对HepG2/TK细胞和未转染的HepG2细胞给予不同浓度的GCV作用72h,采用MTT法测定药物对细胞增殖的影响,观察旁观者效应。HepG2/TK细胞和HepG2细胞分为38℃、40℃、42℃、44℃、50℃五个温度组,使用电热恒温水浴箱分别作用15min、30min和1h,MTT法测定不同温度对两种细胞增殖的影响。设对照组、GCV单独治疗组和热疗协同GCV治疗组,热疗联合GCV治疗组分别设40℃、42℃、44℃共三个温度,热疗作用时间1h,共5组。对照组不做任何处理常规培养,余各组加入GCV终浓度为0.5μg/ml,72h后MTT法测定各组细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:1.成功制备稳定性好、单分散的Cationic-IONPs磁性纳米粒子,粒径32.1nm,在PH=7.0中性环境下呈正电性,Zeta电位为+13.5mV。Cationic-IONPs介导报告基因pEGFP-C1转染人肝癌HepG2细胞,转染效率为30.8%,略高于阳性对照组LipofectamineTM2000的转染效率（28.8%）,但两者差别无显着性（P＞0.05）。2.Cationic-IONPs介导pcDNA3.1-TK重组质粒转染HepG2细胞,利用G418筛选抗性细胞,获得稳定表达TK基因的HepG2/TK细胞。我们采用台盼兰拒染实验及MTT方法研究发现,GCV对HepG2-TK细胞的杀伤作用呈时间依赖性和浓度依赖性,并且具有明显的旁观者效应。HSV-TK基因的导入,显着提高了肝癌细胞对GCV的敏感性。单纯的亚高温热疗（38℃-40℃）对肝癌细胞体外生长增殖抑制效果不明显;单纯的高温热疗（42℃-50℃）可以抑制肝癌细胞的生长。3.实验设对照组、GCV单独治疗组和热疗协同GCV治疗组,对照组常规培养,单纯GCV治疗组增殖抑制率为34.5%,细胞凋亡率为10.2%;热疗联合GCV治疗组各温度组细胞抑制率均显着高于单独GCV治疗组（P＜0.01）,随着温度升高,作用越来越明显,热疗温度为44℃时,细胞增殖抑制率达到75.8%,流式细胞仪检测细胞凋亡率达到45.2%。结论:Cationic-IONPs具有较高的转染效率和较低的细胞毒性作用,可以成功将重组质粒pcDNA3.1-TK基因转导入HepG2细胞内,是一种良好的阳离子多聚体非病毒载体。HSV-TK自杀基因系统对肝癌HepG2细胞具有一定的杀伤作用,并可观察到旁观者效应。单纯的高温热疗（42℃-50℃）可以抑制肝癌细胞的生长。热疗（温度≥40℃）可以显着增强GCV对于HepG2/TK细胞杀伤作用的敏感性。
罗勇[8]（2009）在《纳米磁流体介导的重组pEGFP-AFP-TK对AFP表达阳性的肝癌细胞杀伤作用的体外实验》文中提出目的:1研究纳米磁流体作为重组质粒pEGFP-AFP-TK转染入肝癌细胞的一种基因载体。2探讨重组质粒pEGFP-AFP-TK对AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2的杀伤作用方法:通过纳米磁流体将前期已经构建成功的含AFP增强子和报告基因绿色荧光蛋白（EGFP）以及目的自杀基因TK的重组质粒pEGFP-AFP-TK分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的肝癌细胞SMMC7721。当转染20,40,60小时分别于荧光显微镜下动态观察绿色荧光蛋白基因的表达;取获得最佳转染效率的DNA/基因转染载体的复合物比例进行细胞转染,流式细胞计数以定量比较不同基因转染载体的转染效率。转染40小时后,用RT-PCR和Western-blot分析肝癌细胞HepG2中目的基因TK的表达情况。MTT法检测转染重组TK质粒后的HepG2细胞在更昔洛韦（GCV）作用下的存活率并观察旁观者效应,用流式细胞术分析HepG2细胞的凋亡结果:纳米磁流体能将重组质粒pEGFP-AFP-TK转入AFP表达阳性的HepG2细胞并获得表达,作为肝癌基因治疗的一种基因载体,其转染效率高于脂质体;采用AFP增强子可使目的基因在AFP表达阳性的HepG2细胞中特异性表达,RT-PCR及Western-blot证明了只有转染的HepG2细胞才有目的基因TK的表达;MTT及流式细胞术表明在前药更昔洛韦（GCV）的作用下,能使AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2被杀伤,以及发生凋亡及旁观者效应结论:1纳米磁流体能将重组质粒pEGFP-AFP-TK转染HepG2细胞并获得表达,可作为肝癌基因治疗的转染载体。2 AFP增强子能使目的基因TK在AFP阳性的HepG2肝癌细胞中特异性的表达,并且在前药GCV的作用下,能使HepG2发生凋亡及旁观者效应,而对AFP阴性SMCC7721却无明显作用。
李军[9]（2009）在《新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究》文中研究说明原发性肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一,目前尚无根治方法。自杀基因疗法,又名基因介导的酶-前药疗法,能特异性提高药物在肿瘤中的浓度,并具备独特的旁观者效应,是肿瘤基因治疗的重要方法之一。本研究将木薯来源的linamarase（lis）引入肝癌基因治疗中,利用其水解前体药物linamarin（lin）,并产生毒性代谢产物HCN的特性,从而实现对肝癌细胞的杀伤。通过建立lis稳转肝癌细胞系,发现其本身对细胞生长,细胞周期等特性并无影响。此外单独使用前体药物lin也未发现细胞毒性,从而提示了该策略的安全性。为提高目的基因的表达及针对肝癌的靶向性,我们以ViraPower?病毒载体系统为基础,分别构建CMV及AFP启动子转录的lis腺病毒载体。体外实验表明,含CMV启动子的腺病毒联合lin具备针对多种肿瘤细胞的强大抑制效应及旁观者效应。而含AFP启动子的病毒仅具备对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,从而体现了其针对肝癌的特异性和靶向性。动物实验提示lis能特异性表达于肝癌组织中,联合使用lin后能显着抑制肿瘤生长并延长动物存活时间。结果表明,lis/lin系统是一种潜在的肝癌基因治疗策略,值得进一步深入研究。目的:1.构建稳定转染lis基因的肝癌细胞系,实现lis酶在真核细胞中的活性表达,观察它对肿瘤细胞的体内、体外生物学特性的影响。初步了解lis基因及lin对肝癌细胞的作用;2.运用ViraPower?腺病毒载体系统,构建CMV启动子转录下的lis重组腺病毒载体,观察该病毒载体的感染效率及目的基因表达情况。应用重组病毒联合前体药物lin进行多种肿瘤细胞系的体内、体外治疗,探讨腺病毒载体介导的lis/lin系统的抑瘤效果及作用机理;3.克隆AFP启动子,检测其靶向转录活性。构建AFP启动子转录的lis重组腺病毒,通过体外实验及裸鼠荷瘤实验来检验该病毒前药体系针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,实现lis/lin系统治疗原发性肝癌转录水平上的靶向调控。方法:1.PCR法从木薯cDNA中克隆并扩增lis cDNA,将该基因亚克隆至pcDNA3.1+质粒中,构建重组真核表达载体。脂质体转染及药物筛选相结合,构建稳定转染lis肝癌细胞系HepG2/lis。观察稳转细胞形态学变化,生长曲线,流氏细胞周期,裸鼠体内成瘤曲线等,并进行肿瘤细胞内lis酶活性分析。用不同浓度的lin培养HepG2细胞,观察lin本身对HepG2细胞生长的影响及细胞毒性;2.将lis cDNA亚克隆于ViraPower?腺病毒载体系统的入门克隆pENTRTM2B中,利用特异性LR反应将入门克隆中的lis导入腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST中（含CMV启动子） ,获得重组病毒骨架载体pAd/CMV/lis。线性化骨架载体并转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-CMV-lis。扩增并纯化重组腺病毒,TCID50法测定它的滴度。利用含报告基因的腺病毒Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞,摸索病毒的最佳感染复数。通过联合Ad-CMV-lis及前药lin进行多种肿瘤细胞系的体外及体内抑瘤实验,观查该系统的抑瘤活性及旁观者效应。用DNA片段化检测、Annexin-V/PI流式细胞分析、瘤组织病理学及TUNEL染色进一步探索lis/lin系统的抑瘤机理。3.RT-PCR法从HepG2（AFP+）细胞基因组中克隆并扩增AFP启动子,亚克隆入pEGFP-1质粒中,利用报告基因EGFP检测其特异性转录活性。用AFP启动子替换pcDNA3.1+质粒中的CMV启动子,然后将lis cDNA插入该质粒多克隆位点中,实现AFP启动子与lis的串联。通过构建病毒入门载体及LR反应,将AFP-lis序列定向克隆于pAd/PL-DEST腺病毒骨架载体中（不含启动子）,获得骨架载体pAd/AFP/lis。将其转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-AFP-lis。重组病毒经扩增、纯化后,联合lin进行体内、体外抑瘤实验,验证该体系对AFP阳性肿瘤细胞的特异性及靶向性杀伤。结果:1.成功构建lis稳转肝癌细胞系HepG2/lis。发现它与空质粒转染组及空白对照细胞相比,在细胞形态,生长曲线,细胞周期分布,体内成瘤生长曲线等方面差异不显着（P>0.05）。HepG2/lis细胞给予lin后,能产生代谢产物HCN,并随lin浓度的增加而增多,提示lis酶在真核细胞中能以活性方式表达。此外单独使用lin对细胞生长并无抑制作用。2.成功构建重组腺病毒Ad-CMV-lis。联合应用lin后能在体内、体外有效抑制多种肿瘤细胞的生长,抑瘤作用与lin呈明显的时间、剂量依赖效应。肿瘤细胞治疗后经DNA片段化检测未发现典型的凋亡DNA ladder, Annexin-V/PI流式细胞分析提示经治疗后凋亡及坏死细胞均增高,但以坏死细胞增高为主。瘤组织病理学观察发现Ad-CMV-lis/lin治疗组中出现大量的坏死区,并发现较多的TUNEL阳性染色细胞。3.克隆并重组了276bp的AFP启动子。EGFP报告基因分析提示,该启动子具备AFP阳性肝癌细胞的特异性转录活性。成功构建AFP启动子转录下的重组腺病毒Ad-AFP-lis,实现了lis在AFP阳性肝癌细胞系中的高效特异性表达。体外及动物治疗实验均证明,该病毒联合lin治疗,能特异性抑制AFP阳性肝癌细胞系的生长,并延长动物存活时间,而对AFP阴性肝癌细胞系无杀伤效果。结论:1.植物来源的lis cDNA能稳定表达于真核细胞中,并能正确包装出类似大小,具备β-葡萄糖苷酶活性的lis蛋白。lis cDNA在细胞中的稳定整合对细胞形态、生长特性、细胞周期、成瘤性等生物学特点并无明显影响。而前体药物lin对细胞也具有低毒性,因此lis/lin系统是一种安全的自杀基因治疗策略。2.通过重组腺病毒载体,发现腺病毒具有靶细胞感染率及目的基因表达水平高,包装使用方便,病毒滴度高,不整合到宿主基因组中等优点,因此能作为lis/lin自杀基因治疗的高效表达载体。3.重组腺病毒Ad-CMV-lis在体内、体外均表现出对多种肿瘤细胞系的抑制作用,提示lis/lin自杀基因系统具备较广的治疗适用范围。由于不同肿瘤的生物学特点不同,因此该系统在其他肿瘤中的应用潜能有待于进一步研究。4. 276bp的AFP启动子能调控lis/lin系统在肝癌中的靶向性转录,实现针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤。然而由于原发性肝癌中有少部分呈AFP阴性表达,因此改造现有的AFP启动子,提高其针对AFP阴性的肝癌细胞的转录水平,是值得深入研究的问题。
杨东[10]（2008）在《腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎滑膜细胞的杀伤作用》文中研究指明目的色素沉着绒毛结节性滑膜炎（pigmented villonodular synovitis,PVNS）是一种关节滑膜、滑囊和腱鞘的增殖性疾病,以滑膜高度增生、绒毛及结节形成和棕色含铁血黄素沉着为其特点,对关节组织具有明显的侵袭性,传统治疗方法包括手术治疗和放疗等疗效差,易复发。基因治疗,尤其是自杀基因疗法越来越多被应用到临床研究中,其中疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidinekinase,HSV—TK）基因转染结合抗病毒药更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）是最常用的自杀基因系统之一。本课题是利用自杀基因选择性作用于增殖活跃细胞的机理,观察腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎增殖活跃的滑膜细胞的作用,探求HSV—TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎的疗效,以探索一条有效的基因治疗途径。材料与方法1带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组腺病毒购自本元正阳公司,于我院中心实验室保存,Ad-TK滴度为3.2×1011pfu/ml。GCV购自湖北科益药业有限公司。2取色素沉着绒毛结节滑膜炎患者滑膜组织,按Goto方法分离并传代培养。倒置相差显微镜观察细胞生长情况。取第三代滑膜细胞接种于24孔板,分别加入不同滴度的Ad-TK,第1孔加入PBS进行空白对照,感染24h。荧光显微镜下计数表达GFP的细胞百分率来测定细胞的感染效率,绘制感染效率曲线。3取1×104个待测细胞,提取总的DNA,以HSV1基因组DNA为模板进行PCR扩增,以检测HSV-tk的表达。4将第三代滑膜细胞接种于96孔板,以MOI为120的AD-TK转染滑膜细胞,并以未转染滑膜细胞作为对照,24小时后分别加入不同浓度的GCV（0.01、0.1、1、10和100 ug/mL）,48小时后MTT法检测光吸收值,按以下公式测定细胞的存活率:存活率（%）=（实验孔A值/对照孔A值）×100%,绘制存活率曲线。5用MOI为120的Ad-tk转染滑膜细胞,24h后,将转染HSV-TK基因滑膜细胞（TK+细胞）与未转染HSV-TK基因细胞（TK-细胞）分别以不同比例（0,10%,25%,50%,75%,100%）混合,接种于96孔板,培养24h后,加入GCV10μg/ml的培养液,4d后,用MTT法计算细胞杀伤率,观察旁观者效应。6用MOI为120的Ad-tk转染滑膜细胞,24h后加入10μg/mlGCV,于12h、24h、48h分别置倒置显微镜下观察细胞形态变化;48h后用Hoechst33342/PI染色、固定,将细胞悬液滴在载玻片上,加盖玻片,用荧光显微镜观察、计数。7用MOI为120的Ad-tk转染滑膜细胞,24小时后加入GCV10μg/ml的培养液培养48小时,消化、离心、回收所有细胞,加入Annexin V FITC及PI,流式细胞仪上机检测。结果1滑膜细胞贴壁后,镜下主要可见两种类型的细胞,即巨噬细胞样细胞（MCs）和成纤维细胞样细胞（FCs）。当培养到第三代时,FCs占较大比例。细胞呈梭形,增殖活跃。转染腺病毒的滑膜细胞,表达GFP;MOI为120以上时,转染率可达100%。2 PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳显示,Ad-tk转染滑膜细胞后,可见长为1.13kb大小的特异性条带,而对照组则未见相关条带,表明HSV—TK基因已经整合到基因组中。3 Ad-tk/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用:用MOI为120的Ad-tk转染的滑膜细胞,加入不同浓度的GCV后,随着GCV浓度的增加,细胞的存活率逐渐减少,GCV对转染滑膜细胞呈现明显的剂量依赖性,10 ug/ml GCV杀伤80%,而100ug/ml GCV对未转染细胞仍无明显杀伤作用,说明Ad-tk/GCV系统对滑膜细胞具有明显的抑制作用。4转染HSV-TK基因滑膜细胞（TK+细胞）与未转染HSV-TK基因细胞（TK-细胞）分别以不同比例混合后,加入10 ug/m1 GCV,随着TK+细胞比例的增加,存活率进一步减低,当TK+细胞占75%时,混合细胞几乎全部死亡,表明该系统存在明显的旁观者效应。5滑膜细胞经HSV-TK/GCV系统作用后,倒置相差显微镜观察发现细胞由梭形转变为圆形,胞浆内出现空泡改变;24h后细胞开始萎缩,细胞核变得模糊不清;48h后部分细胞裂解为碎片。HSV-TK/GCV系统处理的滑膜细胞,用Hoechst33342/PI双染色后有三种细胞状态,分别为:正常细胞蓝色淡染,凋亡细胞为浓染或成颗粒状,坏死细胞为红色。6转染HSV-TK基因的滑膜细胞,并给予GCV作用48小时后,细胞出现明显的坏死和凋亡,坏死和凋亡比例分别为58.7%和23.4%,对照组无明显的坏死和凋亡。结论1含HSV-TK基因的重组腺病毒载体对体外培养PVNS滑膜细胞具有较高的转染效率。2 HSV-TK/GCV系统对体外培养的色素沉着绒毛结节滑膜炎滑膜细胞具有抑制作用,在一定范围内GCV有浓度依赖性,且存在旁观者效应。3细胞经HSV-TK/GCV系统作用后形态学发生变化:细胞变形、结构改变,最后死亡;双染色后荧光显微镜见细胞有坏死和凋亡。4流式细胞仪证实HSV-TK/GCV系统对体外培养PVNS滑膜细胞有明显抑制作用,坏死率高于凋亡率。
二、体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响（论文提纲范文）
（1）双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 相关文献研究 |
| 第一章 肝癌 |
| 1.1 原发性肝癌的病因学与病理学: |
| 1.2 原发性肝癌的治疗手段与技术方法 |
| 1.2.1 肝癌的外科手术治疗(术疗) |
| 1.2.2 肝癌的化学药物治疗(化疗) |
| 1.2.3 肝癌的放射治疗(放疗) |
| 1.2.4 肝癌的生物学疗法 |
| 1.2.5 肝癌的分子靶向治疗 |
| 1.2.6 肝癌的射频消融治疗 |
| 1.2.7 肝癌的中医中药学疗法 |
| 1.2.8 肝癌的中西医结合疗法 |
| 第二章 芪三酚 |
| 2.1 芪三酚的结构及性质 |
| 2.2 芪三酚的抗癌作用 |
| 2.2.1 诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.2.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 第三章 自杀基因 |
| 3.1 自杀基因的种类 |
| 3.2 自杀基因的作用及机制 |
| 3.3 自杀基因增效疗法 |
| 第四章 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及其稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株、质粒 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 具体操作方法 |
| 1.2.3 统计学方法: |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 质粒的转化、扩增及鉴定 |
| 1.3.2 逆转录病毒的包装、浓缩、鉴定 |
| 1.3.3 逆转录病毒感染HepG2肝癌细胞 |
| 1.3.4 感染细胞的鉴定 |
| 1.3.5 HepG2/CDTK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 双自杀基因联合芪三酚对肝癌细胞HepG2细胞杀伤作用的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验研究细胞 |
| 2.1.2 实验研究试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 细胞克隆形成率检测 |
| 2.2.4 凋亡相关基因检测 |
| 2.2.5 细胞迁移能力实验—细胞划痕法 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.7 细胞亚结构 |
| 2.2.8 统计学方法: |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 一般形态学 |
| 2.3.2 MTT法测定双自杀基因和芪三酚对肝癌细胞的生长抑制情况 |
| 2.3.3 细胞凋亡指标检测结果 |
| 2.3.4 细胞克隆形成实验结果 |
| 2.3.5 凋亡基因检测结果 |
| 2.3.6 细胞迁移实验结果 |
| 2.3.7 流式细胞检测细胞周期结果 |
| 2.3.8 细胞亚结构 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 芪三酚对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.2 肝癌自杀基因对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.3 肝癌双自杀基因与芪三酚联合应用对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.4 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 第一章 肿瘤基因治疗概述 |
| 一、 基因沉默疗法 |
| 二、 抑癌基因疗法 |
| 三、 免疫基因疗法 |
| 四、 自杀基因治疗 |
| 五、 抗肿瘤血管生成基因疗法 |
| 六、 肿瘤多药耐药基因疗法 |
| 第二章 肿瘤自杀基因治疗研究进展 |
| 一、 自杀基因及自杀基因治疗系统 |
| 二、 自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
| 三、 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
| 第三章 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
| 第四章 木犀草素、芹菜素及槲皮素药理作用及抗肿瘤作用 |
| 一、 木犀草素与肿瘤的相关研究 |
| 二、 芹菜素与肿瘤的相关研究 |
| 三、 槲皮素与肿瘤的相关研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 人黑色素瘤细胞HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 RT-PCR扩增人tk读码框 |
| 二、 慢病毒载体质粒pLV-tk/GFP的构建和鉴定 |
| 三、 细胞培养、传代、冻存、复苏 |
| 四、 重组慢病毒的包装与感染 |
| 五、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 六、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 七、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 三、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 第四节 讨论 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第二章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞间缝隙连接通讯的作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 A375生长曲线绘制 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法和流式细胞技术观察GJIC功能 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 五、 统计方法 |
| 第三节 结果 |
| 一、 A375细胞的增殖测定 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法及流式细胞术检测药物对A375细胞GJIC功能的影响 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 四、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 第四节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件Ⅰ：本论文中使用的缩略语 |
| 附件Ⅱ：pLXSN-tk质粒中tk基因测序图 |
| 附件Ⅲ：已在国内外学术期刊上发表的相关论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（3）多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肝癌的诊治现状 |
| 1.3 基于纳米平台的肿瘤诊治一体化 |
| 1.4 选题依据和研究思路 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 量子点标记自杀基因靶向治疗肝癌的体内外研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 肝癌的自杀基因治疗 |
| 2.1.1.1 自杀基因治疗的分类及原理 |
| 2.1.1.2 HSV-TK 自杀基因治疗的应用 |
| 2.1.1.3 自杀基因治疗肝癌的挑战 |
| 2.1.2 量子点的在基因治疗中的应用 |
| 2.1.2.1 量子点的性质、修饰和标记 |
| 2.1.2.2 量子点示踪基因的运输和表达 |
| 2.1.2.3 量子点在诊治一体化的肿瘤基因治疗中的应用 |
| 2.1.3 叶酸脂质体在肿瘤基因治疗中的应用 |
| 2.1.3.1 叶酸受体的分布和性质 |
| 2.1.3.2 叶酸脂质体的特性和靶向策略 |
| 2.1.3.3 叶酸脂质体在基因治疗中的应用 |
| 2.1.4 肝癌自杀基因治疗中当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
| 2.1.5 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
| 2.1.5.1 研究目的 |
| 2.1.5.2 研究内容 |
| 2.1.5.3 创新性 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 主要药品和试剂 |
| 2.2.1.2 仪器 |
| 2.2.1.3 试剂配制 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 CdTe/CdS 核壳 QD 的合成 |
| 2.2.2.2 JM109 感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.3 HSV-TK 质粒的转化与提取 |
| 2.2.2.4 QD-TK 的偶联 |
| 2.2.2.5 FL/QD-TK 的制备 |
| 2.2.2.6 QD-TK 和 FL/QD-TK 的表征 |
| 2.2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.2.8 分组给药和细胞活性检测 |
| 2.2.2.8.1 细胞转染 |
| 2.2.2.8.2 CdTe/CdS 核壳量子点细胞毒性的分组和给药 |
| 2.2.2.8.3 CdTe/CdS QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤的分组和给药 |
| 2.2.2.8.4 近红外量子点细胞毒性的分组和给药 |
| 2.2.2.8.5 近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤的分组和给药 |
| 2.2.2.8.6 FL/QD-TK 细胞毒性的分组和给药 |
| 2.2.2.8.7 FL/QD-TK 联合 GCV 抗肝癌的分组和给药 |
| 2.2.2.8.8 MTT 法检测细胞活性 |
| 2.2.2.9 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞和治疗效果 |
| 2.2.2.9.1 激光共聚焦荧光显微镜检测 QD-TK 细胞内吞 |
| 2.2.2.9.2 激光共聚焦荧光显微镜检测 FL/QD-TK 内吞 |
| 2.2.2.9.3 激光共聚焦荧光显微镜观察 QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤作用 |
| 2.2.2.10 流式细胞术定量检测细胞凋亡率 |
| 2.2.2.11 Western Blot 法分析 TK 蛋白表达 |
| 2.2.2.12 动物饲养和裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的构建 |
| 2.2.2.12.1 动物饲养 |
| 2.2.2.12.2 BALB/c 裸小鼠人肝癌皮下荷瘤模型的建立 |
| 2.2.2.13 HepG2 微小瘤灶形成实验 |
| 2.2.2.14 Bel-7402 荷瘤裸鼠活体成像及生物分布检测 |
| 2.2.2.15 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组和给药 |
| 2.2.2.16 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组治疗效果和安全性评价 |
| 2.2.2.16.1 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组治疗效果 |
| 2.2.2.16.2 Bel-7402 皮下移植瘤模型的安全性评价 |
| 2.2.2.17 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CdTe/CdS QD-TK 的合成和表征 |
| 2.3.2 CdTe/CdS QD-TK 的细胞毒性研究 |
| 2.3.3 CdTe/CdS QD-TK 联合 GCV 对 Hela 细胞的杀伤作用研究 |
| 2.3.4 细胞水平监测 CdTe/CdS QD-TK 对 Hela 细胞的杀伤作用 |
| 2.3.5 近红外 QD-TK 的合成、表征和细胞毒性 |
| 2.3.6 近红外 QD-TK 的细胞分布和表达研究 |
| 2.3.7 细胞水平评价和监测近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肝癌作用 |
| 2.3.8 整体水平监测和评价近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肝癌作用 |
| 2.3.9 FL/QD-TK 的合成和表征 |
| 2.3.10 FL/QD-TK 的细胞毒性作用检测 |
| 2.3.11 FL/QD-TK 的肝癌细胞靶向性研究 |
| 2.3.12 FL/QD-TK 联合 GCV 选择性杀伤肝癌细胞的研究 |
| 2.3.13 FL/QD-TK 体内肝癌靶向成像和生物分布研究 |
| 2.3.14 FL/QD-TK 联合 GCV 体内靶向抗肝癌作用和生物安全性研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第2章 量子点脂质复合体选择性治疗肝癌的体内外研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 镉系量子点与生物系统的相互作用 |
| 3.1.1.1 镉系量子点的暴露途径 |
| 3.1.1.2 镉系量子点的生物分布、代谢、排泄过程 |
| 3.1.1.3 镉系量子点的细胞内吞和分布 |
| 3.1.2 镉系量子点的生物毒性和分子机制 |
| 3.1.2.1 镉系量子点的细胞毒性 |
| 3.1.2.2 镉系量子点的体内毒性 |
| 3.1.2.3 镉系量子点的毒性机制 |
| 3.1.2.4 展望和小结 |
| 3.1.3 利用纳米粒子内源毒性治疗肿瘤 |
| 3.1.3.1 肿瘤细胞——微环境的同与不同 |
| 3.1.3.2 纳米粒子——打破肿瘤微环境平衡 |
| 3.1.3.3 以毒攻毒——肿瘤治疗的新策略 |
| 3.1.4 利用量子点选择性治疗肝癌当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
| 3.1.5 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
| 3.1.5.1 研究目的 |
| 3.1.5.2 研究内容 |
| 3.1.5.3 创新性 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 主要药品和试剂 |
| 3.2.1.2 仪器 |
| 3.2.1.3 试剂配制 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 QD-LC 的合成和表征 |
| 3.2.2.2 细胞培养 |
| 3.2.2.3 分组给药和细胞活性检测 |
| 3.2.2.4 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞 |
| 3.2.2.5 流式细胞术定量检测细胞内吞 |
| 3.2.2.6 流式细胞术定量检测细胞凋亡率 |
| 3.2.2.7 ELISA 定量检测 ROS 水平 |
| 3.2.2.8 Western Blot 法分析蛋白表达 |
| 3.2.2.9 动物饲养和小鼠肝癌皮下移植瘤模型的构建 |
| 3.2.2.9.1 动物饲养 |
| 3.2.2.9.2 ICR 小鼠肝癌 H22 皮下荷瘤模型的建立 |
| 3.2.2.10 H22 微小瘤灶形成实验 |
| 3.2.2.11 激光共聚焦荧光显微镜研究 QD-LC 在 H22 皮下移植瘤重分布研究 |
| 3.2.2.12 H22 皮下移植瘤模型的分组和给药 |
| 3.2.2.13 H22 皮下移植瘤模型的分组治疗效果和安全性评价 |
| 3.2.2.13.1 H22 皮下移植瘤模型的分组治疗效果 |
| 3.2.2.13.2 H22 皮下移植瘤模型的安全性评价 |
| 3.2.2.14 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 QD-LC 的合成和表征 |
| 3.3.2 QD-LC 的细胞毒性作用研究 |
| 3.3.3 QD-LC 对细胞的内吞作用和机制研究 |
| 3.3.4 QD-LC 对杀伤肝癌细胞机制研究 |
| 3.3.5 QD-LC 对微小瘤灶生长影响的研究 |
| 3.3.6 QD-LC 对小鼠肝癌 H22 皮下移植瘤的治疗作用研究 |
| 3.3.7 QD-LC 治疗小鼠肝癌 H22 皮下移植瘤的安全性评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 磁性介孔二氧化硅在肝癌诊治一体化中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 M-MSNs 的分类和合成 |
| 4.1.1.1 核壳 M-MSNs |
| 4.1.1.2 空心 M-MSNs |
| 4.1.1.3 卫星 M-MSNs |
| 4.1.1.4 沉积 M-MSNs |
| 4.1.2 M-MSNs 与成像 |
| 4.1.2.1 M-MSNs 与核磁共振 T1 加权成像 |
| 4.1.2.2 M-MSNs 与核磁共振 T2 加权成像 |
| 4.1.2.3 M-MSNs 与多模式成像 |
| 4.1.3 M-MSNs 与治疗 |
| 4.1.3.1 M-MSNs 用于磁靶向输送药物 |
| 4.1.3.2 M-MSNs 用于可控释放药物 |
| 4.1.3.2.1 基于磁核的 M-MSNs 磁热响应性释药 |
| 4.1.3.2.2 基于介孔表面功能化的 pH、酶、氧化还原响应性释药 |
| 4.1.3.2.3 基于 M-MSN 外表面的质子泵响应释药 |
| 4.1.3.3 M-MSNs 用于磁热治疗 |
| 4.1.3.4 M-MSNS 用于诊治一体化 |
| 4.1.4 Janus 型 M-MSNs |
| 4.1.4.1 Janus 型纳米粒子 |
| 4.1.4.2 Janus 型 M-MSNs |
| 4.1.5 肝癌化疗中当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
| 4.1.6 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
| 4.1.6.1 研究目的 |
| 4.1.6.2 研究内容 |
| 4.1.6.3 创新性 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 主要药品和试剂 |
| 4.2.1.2 仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 Fe3O4纳米粒子的合成 |
| 4.2.2.1.1 Fe3O4纳米粒子的合成原理 |
| 4.2.2.1.2 Fe3O4纳米粒子的合成步骤 |
| 4.2.2.2 Janus 型 M-MSNs 的合成 |
| 4.2.2.2.1 Janus 型 M-MSNs 的合成原理 |
| 4.2.2.2.2 Janus 型 M-MSNs 的合成步骤 |
| 4.2.2.3 FITC 标记的 Janus 型 M-MSNs 的合成达 |
| 4.2.2.4 羧基化的 JANUS 型 M-MSNS 的合成 |
| 4.2.2.5 PEG 化的 Janus 型 M-MSNs 的合成 |
| 4.2.2.6 药物吸附、释放和浓度测定 |
| 4.2.2.6.1 DOX 吸附实验 |
| 4.2.2.6.2 DOX 释放试验 |
| 4.2.2.6.3 DOX 浓度测定 |
| 4.2.2.6.4 DOX 与 M-MSNs-PEG 作用测定 |
| 4.2.2.7 Janus 型 M-MSNs-DOX 表征 |
| 4.2.2.8 细胞培养 |
| 4.2.2.9 分组给药和细胞活性检测 |
| 4.2.2.9.1 M-MSNS 的分组和给药 |
| 4.2.2.9.2 M-MSNs-DOX 的分组和给药 |
| 4.2.2.9.3 SRB 法检测细胞活性 |
| 4.2.2.10 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞和药物释放 |
| 4.2.2.10.1 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞 |
| 4.2.2.10.2 激光共聚焦荧光显微镜检测 DOX 释放 |
| 4.2.2.11 流式细胞术检测细胞内吞和药物释放 |
| 4.2.2.11.1 流式细胞术定量检测细胞内吞 |
| 4.2.2.11.2 流式细胞术检测细胞内吞机制 |
| 4.2.2.11.3 流式细胞术检测定量 DOX 的释放 |
| 4.2.2.12 普鲁士蓝染色法检测细胞内吞 |
| 4.2.2.13 生物透射电镜研究细胞内吞 |
| 4.2.2.14 动物饲养和小鼠肝癌模型的构建 |
| 4.2.2.14.1 动物饲养 |
| 4.2.2.14.2 BALB/c 裸小鼠人肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的建立 |
| 4.2.2.14.3 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型的建立 |
| 4.2.2.15 小鼠肝癌核磁共振成像 |
| 4.2.2.16 小鼠肝癌模型的分组和给药 |
| 4.2.2.16.1 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的分组和给药 |
| 4.2.2.16.2 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型的分组和给药 |
| 4.2.2.17 小鼠肝癌模型治疗效果的评价 |
| 4.2.2.17.1 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型治疗效果的评价 |
| 4.2.2.17.2 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型治疗效果的评价 |
| 4.2.2.18 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型安全性评价 |
| 4.2.2.19 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的生物分布检测 |
| 4.2.2.19.1 普鲁士蓝染色法检测组织脏器铁分布 |
| 4.2.2.19.2 ICP-OES 检测组织脏器铁含量 |
| 4.2.2.19.3 激光共聚焦荧光显微镜检测 M-MSN-FITC 组织脏器分布 |
| 4.2.2.19.4 激光共聚焦荧光显微镜检测 DOX 组织脏器分布 |
| 4.2.2.20 M-MSN-DOX 溶血性评价 |
| 4.2.2.21 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 不同形貌 M-MSNs 的生物分布和溶血性研究 |
| 4.3.2 M-MSNs-PEG 的合成与表征 |
| 4.3.3 M-MSNs-PEG 的细胞毒性作用检测 |
| 4.3.4 M-MSNs-PEG 的细胞内吞作用检测和机制研究 |
| 4.3.5 磁场增强 M-MSNs-PEG 的细胞内吞研究 |
| 4.3.6 M-MSNs-PEG 的载药和释药研究 |
| 4.3.7 磁场增加 M-MSNS-DOX 体外抗肿瘤作用研究 |
| 4.3.8 M-MSNs-DOX 增强肝癌体内 MR 成像效果研究 |
| 4.3.9 磁场增强 M-MSNs-DOX 治疗裸鼠肝癌皮下移植瘤的效果研究 |
| 4.3.10 M-MSNs-DOX 治疗肝癌皮下移植瘤的安全性评价和生物分布研究 |
| 4.3.11 磁场增强 M-MSNs-DOX 治疗小鼠原位肝癌的效果和药物分布研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 全文总结与研究展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 不足之处 |
| 5.3 研究展望 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 作者简介 |
| 在学期间发表的学术论文 |
| 在学期间主要承担和参与的项目 |
| 在学期间获得的专利 |
| 在学期间获得的奖励 |
| 在学期间参加的会议和活动 |
| 致谢 |
（5）磁性阳离子脂质体介导CD-TK双自杀融合基因靶向治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 嵌合AFP增强子-TK/CD双自杀基因真核表达载体构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要分子生物实验 |
| 2.2 嵌合增强子AFP的克隆 |
| 2.3 TK/CD基因的克隆和载体AFPE-pTK-IRES-CD的构建 |
| 2.4 AFP增强子在肝癌细胞阳性表达的证实及其作用 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 基因的扩增 |
| 3.2 AFP增强子克隆的酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒AFPE-pTK-IRES-CD PCR鉴定 |
| 3.4 重组质粒AFPE-pTK-IRES-CD酶切鉴定 |
| 3.5 重组质粒AFPE-pTK-IRES-CD基因测序 |
| 3.6 间接免疫荧光检测HpG2和HeLa细胞内AFP表达 |
| 3.7 Western blot检测HepG2和HeLa细胞AFP表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 磁性阳离子脂质体基因载体的制备及与质粒DNA的连接 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与药品 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 磁性阳离子脂质体的制备 |
| 2.2 磁性阳离子脂质体的理化性质测定 |
| 2.3 磁性阳离子脂质体的生物学性能测试 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 磁性阳离子脂质体的形态、粒径和Zeta电位 |
| 3.2 磁性阳离子脂质体的生物学性能测试结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 磁性阳离子脂质体介导的AFPE-pTK-IRES-CD系统对肝癌基因治疗的体外实验研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 细胞系和培养条件 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 体外转染实验 |
| 2.2 G418正筛选转染细胞 |
| 2.3 G418筛选出的细胞克隆的扩大培养 |
| 2.4 GCV和5-FC负筛选转染细胞 |
| 2.5 RT-PCR鉴定目的基因表达 |
| 2.6 Westem Blot鉴定目的基因表达 |
| 2.7 免疫荧光试验 |
| 2.8 不同前体药物及浓度组合对HepG2细胞和CD/TK阳性细胞的杀伤作用 |
| 2.9 集落形成实验法测定CD/TK融合自杀基因前药系统对HepG2细胞克隆形成率的影响 |
| 2.10 CD/TK自杀基因前药系统旁观者效应实验 |
| 2.11 以磁性阳离子为载体介导自杀基因CD/TK对肝癌细胞的杀伤效应 |
| 2.12 细胞上清中5-FU的测定及在细胞中的产生规律的初步分析 |
| 2.13 免疫组化法测定HepG2细胞中CD/TK基因在蛋白水平的表达差异 |
| 2.14 丫啶橙和溴化乙啶双染色结合荧光显微镜技术观察细胞凋亡形态 |
| 2.15 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 CDglyTK mRNA在Hela和HepG2中的表达 |
| 3.2 阳性细胞的筛选 |
| 3.3 免疫荧光结果: |
| 3.4 Western-blotting结果 |
| 3.5 前体药物5-FC对HepG2细胞毒性检测 |
| 3.6 CD/TK基因前药系统对HepG2细胞克隆形成率的影响 |
| 3.7 自杀基因系统的旁杀效应 |
| 3.8 磁性阳离子脂质体介导自杀基因pAFPE-pTK-IRES-CD体外治疗肝癌 |
| 3.9 细胞上清中5-FU的测定及在细胞中的产生规律的初步分析 |
| 3.10 细胞免疫组化染色检测 |
| 3.11 丫啶橙和溴化乙啶双染色结合荧光显微镜技术观察细胞凋亡形态 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（6）人IL-12联合HSV-tk基因体外靶向特异性杀伤肝癌细胞的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词表 |
| 第1篇 综述 |
| 第1章 甲胎蛋白启动子调控治疗基因靶向肝癌细胞表达的研究进展 |
| 1.1 AFP 基因上游调控元件 |
| 1.2 AFP 启动子调控基因靶向特异性治疗肝癌的研究 |
| 1.3 提高AFP 调控基因表达的效率 |
| 第2章 IL-12 治疗肿瘤的临床应用研究进展 |
| 2.1 IL-12 重组蛋白的临床应用 |
| 2.2 IL-12 基因治疗的临床应用 |
| 2.3 结束语 |
| 第3章 HSV-tk/GCV 系统治疗肿瘤的临床研究进展 |
| 3.1 HSV-tk/GCV 系统的临床应用研究 |
| 3.2 HSV-tk/GCV 系统联合基因治疗 |
| 第2篇 实验研究 |
| 前言 |
| 第1章 AFP 启动子和增强子的克隆以及表达载体的建立 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 IL-12 联合HSV-tk 基因特异性外杀伤肝癌细胞的研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 博士期间发表的论文以及参与课题 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（7）氧化铁磁性纳米粒介导HSV-TK自杀基因联合热疗治疗肝癌的体外实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验部分 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）纳米磁流体介导的重组pEGFP-AFP-TK对AFP表达阳性的肝癌细胞杀伤作用的体外实验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1.自杀基因治疗肝癌 |
| 2.肝癌细胞特异性基因表达系统 |
| 3.肝癌基因治疗载体系统的选择 |
| 纳米磁流体介导重组质粒PEGFP-AFP-TK转染肝癌细胞HEPG2的体外杀伤作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（9）新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1. 原发性肝癌基因治疗现状 |
| 2. 原发性肝癌自杀基因治疗现状 |
| 3. 新型自杀基因linamarase/linamarin系统研究现状 |
| 正文 |
| 实验一 linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 真核表达载体pcDNA-lis的构建和鉴定 |
| 2.2 稳定转染肝癌细胞系HepG2/lis的建立 |
| 2.3 稳转细胞HepG2/lis的鉴定 |
| 2.4 稳转细胞lis酶活性检测 |
| 2.5 HepG2/lis细胞生物学特性分析 |
| 2.6 lin的细胞毒性分析 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 lis cDNA的克隆及真核表达载体构建 |
| 3.2 稳定转染细胞系的鉴定 |
| 3.3 稳定转染细胞lis酶活性鉴定 |
| 3.4 稳转细胞形态学观察 |
| 3.5 生长曲线及细胞周期分析 |
| 3.6 稳转细胞系体内成瘤活性 |
| 3.7 lin对HepG2 的细胞毒性分析 |
| 4 讨论 |
| 实验二 重组腺病毒介导lis/lin自杀基因系统对多种肿瘤细胞系的体内外杀伤 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 构建基于ViraPower?载体系统的重组腺病毒 |
| 2.2 重组腺病毒体外杀伤实验 |
| 2.3 重组腺病毒体外旁观者效应 |
| 2.4 lis/lin系统抑制肿瘤作用机理 |
| 2.5 重组腺病毒体内抑瘤实验 |
| 2.6 肿瘤组织病理学检查 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.2 重组腺病毒感染MOI的确定 |
| 3.3 重组腺病毒感染后lis的表达 |
| 3.4 重组腺病毒体外杀伤及旁观者效应 |
| 3.5 lis/lin系统杀伤机理 |
| 3.6 重组腺病毒体内抑瘤实验 |
| 3.7 移植瘤组织学检查 |
| 4 讨论 |
| 实验三 AFP启动子调控lis/lin重组腺病毒系统靶向治疗原发性肝癌 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株及动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 AFP启动子的克隆、重组及鉴定 |
| 2.2 AFP启动子与lis cDNA的连接重组 |
| 2.3 含AFP启动子的lis重组腺病毒的构建及鉴定 |
| 2.4 重组腺病毒体外杀伤实验 |
| 2.5 重组腺病毒体外旁观者效应 |
| 2.6 重组腺病毒体内实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AFP启动子的克隆、重组及鉴定 |
| 3.2 AFP启动子转录活性鉴定 |
| 3.3 构建AFP启动子引导的lis重组质粒 |
| 3.4 重组腺病毒 Ad-AFP-lis 的构建、扩增及纯化 |
| 3.5 重组腺病毒体外感染及目的基因表达测定 |
| 3.6 重组腺病毒体外抑瘤实验 |
| 3.7 重组腺病毒体内实验 |
| 3.8 肿瘤组织病理及免疫组化分析 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎滑膜细胞的杀伤作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验一 PVNS滑膜细胞的分离、培养和含GFP的腺病毒载体在体外培养的滑膜细胞中表达的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验二 HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的体外杀伤作用的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验三 HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的作用的形态学观察和定量分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响（论文参考文献）
- [1]双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究[D]. 谭成光. 广州中医药大学, 2017(05)
- [2]木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学, 2016(11)
- [3]多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究[D]. 邵丹. 吉林大学, 2015(08)
- [4]AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究[J]. 庄树彤,秦颖,朱宝和,廖允军,王成友,夏荣,刘美洲. 热带医学杂志, 2010(05)
- [5]磁性阳离子脂质体介导CD-TK双自杀融合基因靶向治疗肝癌的实验研究[D]. 李湘斌. 中南大学, 2009(02)
- [6]人IL-12联合HSV-tk基因体外靶向特异性杀伤肝癌细胞的研究[D]. 杜珍武. 吉林大学, 2009(08)
- [7]氧化铁磁性纳米粒介导HSV-TK自杀基因联合热疗治疗肝癌的体外实验研究[D]. 刘刚. 中南大学, 2009(04)
- [8]纳米磁流体介导的重组pEGFP-AFP-TK对AFP表达阳性的肝癌细胞杀伤作用的体外实验[D]. 罗勇. 中南大学, 2009(04)
- [9]新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究[D]. 李军. 第四军医大学, 2009(12)
- [10]腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎滑膜细胞的杀伤作用[D]. 杨东. 山东大学, 2008(01)