一、IL-18生物学作用研究进展（论文文献综述）
王萌[1]（2020）在《基于线粒体自噬研究小建中汤抑制NLRP3炎症小体活化治疗抑郁症的机制》文中研究说明目的:本研究旨在探讨在抑郁症发病过程中,NLRP3炎症小体通路的过度活化是否与其负向调控机制线粒体自噬失活有关;明确小建中汤是否具有抗抑郁作用,能否有效逆转CUMS大鼠抑郁样行为,以及小建中汤治疗抑郁症的药理机制是否与上调抑郁模型大鼠海马线粒体自噬水平,改善线粒体功能,抑制TLR4/NF-κB通路和NLRP3炎症小体活化有关;明确小建中汤对NLRP3炎症小体通路的抑制作用是否依赖于PINK-1/Parkin途径介导的线粒体自噬。进一步探讨小建中汤调摄阴阳、温健脾气、生发肝气之功对抑郁症的作用机理。方法:1.实验一:SD大鼠40只,除空白组大鼠（n=8）外,应用CUMS造模,3周后测试大鼠体重和蔗糖偏好率,判断造模是否成功,造模成功的大鼠随机分为模型组（n=8）、氟西汀组（n=9）和雷帕霉素组（n=9）。分别给予药物治疗3周,同时继续进行CUMS造模。治疗结束后对大鼠实施行为学检测,取海马组织和血清。RT-PCR检测mt DNA拷贝数,线粒体自噬相关m RNA（PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62）变化,NLRP3炎症小体相关m RNA（NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18）变化;Western-Blot检测线粒体自噬相关蛋白（PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62）变化,NLRP3炎症小体相关蛋白（NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18）变化;ELISA检测血清IL-1β、IL-18、DA和5-HT变化。2.实验二:SD大鼠60只,除空白组大鼠（n=7）外,应用CUMS造模,3周后测试大鼠体重和蔗糖偏好率,判断造模是否成功,造模成功的大鼠随机分为模型组（n=7）、氟西汀组（n=7）、小建中低剂量组（n=8）、小建中中剂量组（n=8）和小建中高剂量组（n=8）。分别给予药物干预3周,同时继续进行CUMS造模。治疗结束后对大鼠实施行为学检测,继而取海马组织和血清。尼氏染色检测海马CA3区锥体细胞形态,透射电镜观察海马CA3区锥体细胞和线粒体超微结构;RT-PCR检测mt DNA拷贝数,线粒体自噬相关m RNA（PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62）变化,NF-κB信号通路相关m RNA（TLR4、IκB-α、NF-κB1、RELA和TNFα）变化,NLRP3炎症小体相关m RNA（NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18）变化;Western-Blot检测线粒体自噬相关蛋白（PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62）变化,NF-κB信号通路相关蛋白（TLR4、p-IκB-α、p-p50和p-p65）变化;Western-Blot和免疫荧光检测NLRP3炎症小体相关蛋白（NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18）变化;ELISA检测血清IL-1β、IL-18、DA、5-HT、SOD和MDA变化。3.实验三:SD大鼠50只,除空白组大鼠（n=7）外,应用CUMS造模,3周后测试大鼠体重和蔗糖偏好率,判断造模是否成功,造模成功的大鼠随机分为模型组（n=8）、氟西汀组（n=8）、小建中组（n=8）和小建中+抑制剂组（n=8）。分别给予药物治疗3周,同时继续进行CUMS造模。治疗结束后对大鼠实施行为学检测,继而取海马组织。RT-PCR检测线粒体自噬相关m RNA（PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62）变化,NLRP3炎症小体相关m RNA（NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18）变化;Western-Blot检测线粒体自噬相关蛋白（PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62）变化,NLRP3炎症小体相关蛋白（NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18）变化。结果:1.CUMS模型大鼠行为学、线粒体自噬和NLRP3炎症小体通路变化1.1.行为学:与空白组相比,模型组大鼠体重和蔗糖偏好率明显下降（P<0.01）;从强迫游泳实验（FST）结果来看,模型组大鼠不动时间明显延长（P<0.01）;从旷场实验（OFT）结果来看,模型组大鼠水平得分、垂直得分、运动总距离、运动总时间均下降（P<0.01）。1.2.线粒体自噬:与空白组比较,模型组大鼠海马PINK-1、Parkinh和Beclin-1的m RNA相对表达量明显减少（P<0.01）,P62的m RNA相对表达量增多（P<0.01）;与空白组比较,模型组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1的蛋白表达水平明显下降（P<0.01）,P62蛋白表达明显上升（P<0.01）。CUMS大鼠海马线粒体自噬水平降低。1.3.NLRP3炎症小体通路:与空白组比较,模型组大鼠海马NLRP3（P<0.05）、ASC（P<0.01）、caspase-1（P<0.01）、IL-1β（P<0.05）和IL-18（P<0.01）的m RNA相对表达量明显增多;与空白组比较,模型组大鼠NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。在CUMS大鼠海马出现了NLRP3炎症小体活化和神经炎症反应。2.雷帕霉素对CUMS模型大鼠行为学、线粒体自噬和NLRP3炎症小体通路的作用2.1行为学:与模型组比较,雷帕霉素组大鼠的蔗糖偏好率显着升高（P<0.01）,FST不动时间显着降低（P<0.01）。雷帕霉素逆转了CUMS大鼠的抑郁样行为。2.2线粒体自噬:与模型组比较,雷帕霉素组大鼠海马PINK-1（P<0.01）、Parkin（P<0.05）、Beclin-1（P<0.05）的m RNA相对表达量增多,P62的m RNA相对表达量减少（P<0.01）;与模型组比较,雷帕霉素组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1的蛋白表达水平升高（P<0.01）,P62蛋白表达下降（P<0.01）。雷帕霉素上调了CUMS大鼠海马线粒体自噬水平。2.3 NLRP3炎症小体通路:与模型组比较,雷帕霉素组大鼠海马NLRP3（P<0.01）、caspase-1（P<0.05）、ASC（P<0.01）、IL-1β（P<0.01）和IL-18（P<0.01）的m RNA相对表达量减少;同时,雷帕霉素组大鼠NLRP3、caspase-1 p20、ASC、IL-1β和IL-18的蛋白表达下降（P<0.01）。雷帕霉素抑制了CUMS大鼠海马NLRP3炎症小体活化。3.小建中汤对CUMS模型大鼠行为学的影响与模型组比较,小建中低、中、高剂量组大鼠体重均显着增加（P<0.01）;与模型组比较,小建中低、中、高剂量组大鼠的FST不动时间明显减少（P<0.01）;与模型组比较,低剂量和中剂量组大鼠OFT水平得分也有所增加（P<0.05）,小建中低、中、高剂量组大鼠的垂直得分、运动总距离和运动总时间明显上升（P<0.01）。小建中汤显着逆转了CUMS大鼠抑郁样行为。4.小建中汤对CUMS模型大鼠线粒体自噬的调控与模型组比较,小建中汤低剂量组大鼠海马PINK-1（P<0.01）、Parkin（P<0.05）的m RNA相对表达量增多,P62（P<0.01）的m RNA相对表达量减少;小建中汤中剂量和高剂量组大鼠海马PINK-1（P<0.01）、Parkin（P<0.05）和Beclin-1（P<0.01,P<0.05）的m RNA相对表达量增多,P62的m RNA相对表达量减少（P<0.01）。与模型组比较,小建中汤低剂量组大鼠海马PINK-1、Parkin和Beclin-1的蛋白表达水平明显上调（P<0.01）,P62的蛋白表达水平下降（P<0.01）;小建中汤中剂量和高剂量组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1（P<0.01）的蛋白表达上调,P62的蛋白表达下降（P<0.01）。小建中汤通过PINK-1/Parkin途径上调了CUMS大鼠海马区线粒体自噬水平。5.小建中汤对CUMS模型大鼠mt DNA拷贝数的影响与空白组比较,模型组大鼠海马mt DNA拷贝数增多（P<0.01）。与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠海马mt DNA拷贝数明显增多（P<0.01）。小建中汤明显上调了CUMS大鼠海马神经元的线粒体拷贝数,增加了线粒体数量。6.小建中汤对CUMS模型大鼠血清SOD和MDA的影响与空白组比较,模型组大鼠血清SOD（P<0.01）表达量减少,MDA（P<0.01）表达量明显增多;与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠血清SOD（P<0.05,P<0.01,P<0.01）表达量明显减增多,MDA（P<0.01,P<0.05,P<0.01）表达量明显减少。小建中汤改善了CUMS大鼠脂质过氧化水平。7.小建中汤对CUMS模型大鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响与空白组比较,模型组大鼠海马TLR4、IκB-α、NF-κB1、RELA和TNF-α的m RNA相对表达量增多（P<0.01）;与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠海马TLR4（P<0.01）、IκB-α（P<0.01）、NF-κB1（P<0.01）、RELA（P<0.01）和TNF-α（P<0.01,P<0.01,P<0.05）的m RNA相对表达量减少。与空白组比较,模型组大鼠海马p-p50、p-p65、p-IκB-α和TLR4的蛋白表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠海马p-p50、p-p65、p-IκB-α和TLR4的蛋白水平降低（P<0.01）。小建中汤抑制了CUMS大鼠海马TLR4/NF-κB信号通路的激活。8.小建中汤对CUMS模型大鼠NLRP3炎症小体通路的作用与模型组比较,小建中汤低、中、高组大鼠海马NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的m RNA相对表达量和蛋白表达水平均降低（P<0.01）。小建中汤抑制了CUMS大鼠海马NLRP3炎症小体的活化。9.小建中汤对CUMS模型大鼠血清5-HT和DA的影响与空白组比较,模型组大鼠血清中DA（P<0.01）和5-HT的蛋白水平明显降低（P<0.01）;与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠血清DA和5-HT的表达上调（P<0.01）。小建中汤增加了CUMS大鼠血清5-HT和DA水平。10.小建中汤+线粒体自噬抑制剂对CUMS模型大鼠线粒体自噬的影响与小建中组相比,小建中+抑制剂组大鼠PINK-1（P<0.01）、Parkin（P<0.05）、Beclin-1（P<0.01）的m RNA相对表达量减少,P62（P<0.01）的m RNA相对表达量增多;与小建中组比较,小建中+抑制剂组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1的蛋白表达水平明显下降（P<0.01）,P62蛋白表达明显上升（P<0.01）。线粒体自噬抑制剂减弱了小建中汤对CUMS大鼠线粒体自噬的正向调控作用。11.小建中汤+线粒体自噬抑制剂对CUMS模型大鼠NLRP3炎症小体通路的影响与小建中组相比,小建中+抑制剂组大鼠海马NLRP3（P<0.01）、ASC（P<0.05）、caspase-1（P<0.01）、IL-1β（P<0.01）和IL-18（P<0.01）的m RNA和蛋白表达均上升。线粒体自噬抑制剂减弱了小建中汤对CUMS大鼠NLRP3炎症小体的抑制作用。结论:1.CUMS抑郁模型大鼠海马区同时存在线粒体自噬水平低下和NLRP3炎症小体通路的过度活化,这可能是抑郁症的重要机制之一。2.线粒体自噬激动剂雷帕霉素改善了CUMS大鼠的抑郁样行为,降低了NLRP3炎症小体各组分和下游炎症因子的表达水平。雷帕霉素通过上调线粒体自噬水平抑制了NLRP3炎症小体的过度活化。进一步验证了在抑郁症发病过程中,NLRP3炎症小体的活化可能与其负向调控机制线粒体自噬失活有关。3.小建中汤通过改善CUMS大鼠自主活动,减少CUMS大鼠强迫游泳不动时间,有效逆转了CUMS大鼠抑郁样行为,具有明确的抗抑郁作用。4.小建中汤治疗抑郁症的药理机制可能与上调CUMS大鼠海马区PINK-1/Parkin途径介导的线粒体自噬水平,增加mt DNA拷贝数,改善线粒体功能,抑制TLR4/NF-κB通路和NLRP3炎症小体活化,减少炎症因子的释放有关。5.小建中汤对NLRP3炎症小体的抑制作用依赖于其对PINK-1/Parkin途径介导的线粒体自噬的调节。
宋世斌[2]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中研究说明干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
杨君[3]（2020）在《副猪嗜血杆菌外膜囊泡蛋白质组分分析、致炎作用及lpxM基因缺失株构建的研究》文中认为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,H.parasuis）是存在于猪上呼吸道的条件致病菌,猪感染H.parasuis时发病主要是一系列炎症反应,死亡率高达50%,每年给猪的养殖业造成巨大损失。外膜囊泡（Outer membrane vesicles,OMVs）能携带多种蛋白质、脂多糖等病原相关分子模式（PAMPs）进入宿主细胞,诱导细胞炎症反应甚至死亡。H.parasuis能分泌OMVs,但其生物学特性及对宿主细胞作用还鲜有研究。本研究以血清5型强毒株H45为研究对象,以密度梯度离心法提纯OMVs,观察其结构及测定其粒径,进行蛋白质组学分析;研究OMVs和H.parasuis对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7的毒力和致炎作用,并研究caspase-11基因对OMVs介导细胞致炎作用的影响;利用同源重组技术构建H45的lpx M基因缺失株,研究该基因缺失对H45生长情况、抗血清杀菌能力、生物被膜形成能力、对细胞毒力作用和部分抗生素敏感性的影响。利用统计学方法对实验结果进行相关性分析,结果如下:1.从H45中提取的OMVs呈球形,粒径分布在60-70 nm之间,平均粒径为63.32nm,含有478种H.parasuis蛋白质,主要来源于细胞质、细胞质膜、周质和外膜,大多数蛋白质与菌株重要生命活动有关,GO功能注释结果显示47.9%蛋白参与生物学过程,29.8%蛋白参与分子功能,22.3%蛋白参与细胞组成,COG功能注释显示蛋白质主要参与翻译、核糖体结构和形成、氨基酸运输和代谢等,表明OMVs在H.parasuis生命活动中发挥重要作用。2.H45及其OMVs对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7具有强烈的毒力作用,引起细胞死亡,激活炎性小体,使细胞分泌出大量的炎症细胞因子IL-1β和IL-18。用OMVs刺激caspase-11表达稳定降低的细胞株,IL-1β和IL-18分泌水平降低,说明caspase-11在OMVs介导的细胞炎症反应中起到重要作用。3.成功构建H45的lpx M基因缺失株,并分析其生物学特性变化,发现缺失株生长速度在8 h前慢于野生株,之后保持一致;生物被膜形成能力下降;抗50%猪血清补体杀菌能力降低;对巨噬细胞毒力作用减弱;对头孢噻吩等11种抗生素感敏性不变,而对阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异恶唑由耐药变成敏感,氨苄西林从中介变成敏感。
高鑫鑫[4]（2020）在《视神经脊髓炎谱系疾病患者血清IL-18及IL-37的水平变化及临床意义》文中研究表明背景和目的视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitica optica spectrum disorders,NMOSD）是一组中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。血清水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP4）抗体是NMOSD的特异性标志物,也是其分层诊断的重要依据。随着对NMOSD的研究发现其主要是由体液免疫介导,其他多种免疫途径共同参与的中枢神经系统自身免疫性疾病。但NMOSD发病机制复杂,目前尚待继续探索阐明。有研究表明,在NMOSD中,炎性细胞和细胞因子起到了非常重要的作用。白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）是IL-1细胞因子超家族的成员之一,有着多种生物学功能,可促进T细胞的活化增殖、增强NK细胞的细胞毒作用,并可通过诱导干扰素-γ（Interferon-y,IFN-γ）的产生而发挥强烈的促炎作用,IL-18作为促炎因子参与多种自身免疫性疾病的发生发展,如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化等,故推测IL-18有可能在NMOSD疾病过程中发挥作用。白细胞介素-37（IL-37）作为IL-1家族的新成员,可抑制多种炎症细胞因子的表达,被称为天然的免疫应答抑制物。树突状细胞和及外周血单个核细胞可诱导产生IL-37,其在炎症组织中有着较高的表达水平,可抑制自身免疫性疾病的过度炎症反应。近年来,IL-37被发现在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫性疾病中均存在表达异常。而IL-37是否在NMOSD的发病、转归等过程中发挥作用,尚有待进一步探究。鉴于目前IL-18和IL-37在NMOSD的发病及转归过程中的作用尚未明确,我们拟通过检测NMOSD患者血清中IL-18及IL-37的浓度,分析此两种细胞因子与NMOSD其他各项临床指标的相关性,探索这两种细胞因子在NMOSD的发病及转归过程中可能起到的作用,以期为NMOSD的免疫治疗方案提供进一步的理论基础。方法本研究采取病例对照研究。选取于2017年9月-2019年12月就诊于郑州大学第一附属医院神经内科的视神经脊髓炎谱系疾病患者32例,其中女性27例,男性5例设为病例组,分别在发病的急性期、缓解期采集肘静脉血标本。所有入选患者均经过专科医师详细询问病史及进行神经系统专科检查,完整记录病史（包括姓名、性别、发病年龄、首发症状、诱因、急性期扩展残疾状态量表（Expanded disability status scale,EDSS）评分（详见附录二）、复发次数及间隔时间、辅助检查等）。同时选取同一时期来我院门诊体检的健康志愿者26例作为对照组,其中男性9例,女性17例,均留取外周静脉血标本。通过酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A）法测定病例组及对照组IL-18和IL-37的血清表达含量。采用SPSS21.0软件包处理所有数据,应用均数±标准差表示定量资料。运用两独立样本t检验进行两组独立样本定量资料的比较,运用配对t检验进行两组配对样本定量资料的比较,采用χ2检验比较两组二分类资料,运用Pearson及Spearman相关系数分析两组定量资料的相关性,若P<0.05,表示差异具有统计学意义。结果（1）NMOSD急性期血清IL-18水平分别为201.54±83.08ng/L,NMOSD组缓解期血清IL-18水平为159.54±35.34ng/L,健康对照组血清IL-18水平为131.01±20.96ng/L。NMOSD急性期IL-18水平高于缓解期,差异有统计学意义（P=0.001）;NMOSD组急性期IL-18水平高于健康对照组,差异有统计学意义（P<0.001）;NMOSD组缓解期IL-18水平高于健康对照组,差异有统计学意义（P=0.001）。NMOSD患者急性期血清中IL-18水平与EDSS评分呈正相关,r=0.679,P<0.001。NMOSD急性期血清中IL-18水平与患者脊髓病灶长度无相关性,r=0.063;P=0.755。AQP4阳性组及阴性组血清IL-18水平:无统计学差异（P=0.604）。（2）NNOSD急性期、缓解期及健康对照组血清IL-37水平分别为244.62±9.84pg/ml,261.74±32.94pg/ml,224.83±25.97pg/ml。NMOSD 缓解期 IL-37水平高于急性期,差异有统计学意义（P=0.008）;NMOSD急性期IL-37水平高于健康对照组,差异有统计学意义（P=0.001）;NMOSD组缓解期IL-37水平高于健康对照组,差异有统计学意义（P<0.001）。NMOSD急性期血清中IL-37水平与患者急性期EDSS评分呈正相关,r=0.536,P=0.002。NMOSD急性期血清中IL-37水平与患者脊髓病灶长度无明显相关性,r=0.103,P=0.608。AQP4阳性组及阴性组血清IL-37水平的比较,无统计学差异（P=0.187）。NMOSD患者急性期血清IL-37水平与IL-18水平呈正相关,r=0.354,P<0.05结论（1）IL-18水平在NMOSD的急性期与缓解期均升高,急性期更为显着,考虑其主要在起病及急性加重阶段起促炎作用,且与疾病严重程度有关,可考虑作为预测疾病严重程度的指标。（2）IL-37水平在NMOSD的急性期与缓解期均升高,考虑其急性期升高以下调过度炎症反应,而缓解期升高则更为显着,考虑其可能主要在疾病缓解期起抑炎性作用。（3）NMOSD急性期IL-37与IL-18水平呈正相关,考虑IL-18可促进IL-37的表达,二者可共同作为NMOSD疾病诊治的参考指标。
周静[5]（2020）在《IL-33在溃疡性结肠炎中的表达及相关性研究》文中认为研究背景炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一组病因尚未阐明的慢性复发性疾病,主要包含溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。IBD在西方发达国家常见,近年来随着人们生活饮食方式的改变、医务工作者对IBD的认识程度的增加及诊疗技术的提升,IBD在我国发病率呈上升趋势。IBD不仅可以造成腹痛、腹泻、肠梗阻等消化系统表现,也可累及肠外,出现关节炎、葡萄膜炎、血栓栓塞性疾病等,病情控制不佳可以发生肠道纤维化、狭窄、穿孔、癌变等严重并发症,显着影响了患者的生活质量,给患者及家庭带来很大困扰。目前有关IBD的发病机制仍在探索之中,主要认为是免疫失衡、环境因素、遗传因素、肠道微生态等共同作用的结果。主要治疗方法除了经典的氨基水杨酸类、免疫抑制剂外,近年来生物制剂、选择性白细胞吸附疗法、粪菌移植等新兴技术也逐渐应用于临床。然而,仍有部分患者病情控制欠佳,甚至无效,亟待出现新的治疗策略。白细胞介素-33（interleukin-33,IL-33）是近年来新发现的白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）家族分子,在先天性免疫及适应性免疫中均发挥重要的作用。有研究表明,UC患者中存在IL-33的表达异常,可能与UC的发病及病情严重程度有关。因此研究IL-33在UC中的表达有助于进一步阐明其发病机制、研发新的药物作用靶点。目的探讨IL-33的表达水平在UC中的变化及临床意义,以便更好地探究UC的发病机制,寻找潜在的治疗靶点。方法收集郑州大学第一附属医院2018年5月至2019年5月60例健康体检者和85例确诊的UC患者,采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）法检测其血清中IL-33的表达水平。然后使用8-10周龄的C57BL/6J雄性SPF级小鼠,随机分为2组,每组6只。正常对照组:自由进食饮水,不做特殊干预;DSS诱导的UC模型组:将小鼠每日饮用水更换为3%的DSS溶液,自由进食。每日观察记录小鼠的精神状态、体重波动、粪便性状改变,计算疾病活动指数（disease activity index,DAI）。第8天晨结束实验,处死小鼠。收集小鼠血清及结肠组织,对比两组小鼠的结肠长度,结肠中段组织切片,苏木素伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色,评估小鼠结肠组织学评分（histochemical score,HI）,鉴定造模成功后使用Elisa法检测两组小鼠血清的IL-33含量,实时荧光定量 PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）测定两组小鼠结肠组织中IL-33mRNA的表达是否存在差异。结果1.UC患者血清中IL-33的含量显着高于正常对照组,且IL-33的含量与UC疾病活动程度相关,轻度UC、中度UC、重度UC患者之间IL-33的表达存在显着性差异（P<0.05）。2.使用DSS饲养小鼠造模成功,对照组小鼠一般状况良好,体重轻度增加,DSS模型组小鼠活动量减少,毛色光泽度降低,进食量下降,第3-7天逐渐出现大便不成型、粪便隐血试验阳性、肉眼血便等。DSS模型组小鼠结肠长度缩短、结肠充血水肿,组织病理学发现DSS模型组小鼠结肠黏膜完整性破坏、大量炎细胞浸润、隐窝减少甚至消失,符合UC的病理学改变。3.DSS模型组小鼠血清IL-33表达较正常对照组增加,结肠组织中IL-33mRNA表达量增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.IL-33在UC患者中表达增加,且随疾病活动程度的加重有升高趋势,IL-33可能参与的UC的发生发展。2.IL-33在DSS诱导的C57BL/6J小鼠结肠炎模型中血清和结肠组织中表达水平升高,进一步验证了 IL-33在UC患者中表达异常,IL-33可能在UC的发生发展中发挥一定作用,但其具体作用机制有待进一步证实。
蒋少秋[6]（2020）在《基于iTRAQ技术对CNV的蛋白组学研究及TAB1对CNV的保护作用》文中提出研究背景及目的:年龄相关性黄斑变性是西方国家五十岁以上人群致盲的主要原因,脉络膜新生血管是其严重病理结局之一,也是导致黄斑区病理性损害以及严重视功能损害的常见原因。脉络膜新生血管起源于脉络膜的微小血管,突破Bruch’s膜长入RPE下或者视网膜神经上皮下,由于新生血管的结构和功能不完整,新生血管容易发生渗漏和出血,液体或血液在视网膜下形成积液,影响中心视力,成为致盲的主要原因之一。目前抗VEGF治疗为CNV的主流治疗方法,且在临床上取得了显着疗效。但抗VEGF治疗因为需要重复注射,甚至终身用药,有20%-25%患者对于抗VEGF药物反应差或者无反应,说明CNV的发生发展还存在其他的病理机制,需要我们进一步探索,以利于寻找新的治疗靶点。近年来有不少研究证实,CNV与不少免疫因子也有密切关系,例如IL-6,IL-18,TGF-β以及补体系统成分均被证实参与到CNV的发生发展过程中。众所周知,蛋白是生命功能的执行者。蛋白质组学的概念是在1995年提出,是指在特定的空间和时间下,一种细胞,一种组织或者一种生物的全部基因组的表达情况,包括所有亚型或者修饰后的蛋白质的表达情况,本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征。由于疾病的发生发展往往涉及多种细胞、多种蛋白,而非某一种特定的蛋白在疾病中单独起作用,所以依靠蛋白质组学技术对疾病发生发展的机制的研究探索以及在疾病标志物方面的应用也迅速发展起来。同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolutely quantification,iTRAQ）技术由美国应用生物系统公司（ABI）在2004年推出的一种体外的多肽标记技术。其工作的基本原理是将蛋白样品裂解为肽段,iTRAQ标记试剂与裂解后的肽段的N端或者肽段的赖氨酸的侧链发生反应,然后再进行一级二级质谱分析,报告基团的强度直接反映了所标记的肽段的相对丰度。因为iTRAQ蛋白组学具有灵敏度高,分辨率高,重复性好等特点,现已经被广泛应用于研究疾病的发生发展机制和寻找疾病的标志物等方面。尽我们所知,目前还未有对CNV动物模型的RPE-脉络膜-巩膜复合体蛋白进行iTRAQ蛋白组学分析的研究,而本课题组的研究即是为了对CNV大鼠及正常大鼠的RPE-脉络膜-巩膜复合体蛋白进行iTRAQ蛋白组学分析以及生物信息学分析,并在结果中寻找我们感兴趣的和炎症有关的蛋白及其表型和机制进行进一步探索。本课题的研究目的即是用iTRAQ标记的蛋白组学方法探索CNV大鼠和正常大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体的差异蛋白,并对差异蛋白进行生物信息学分析,从差异蛋白中选择部分感兴趣的蛋白质,用Western Blotting法进行验证;在验证成功的蛋白质中,选择我们感兴趣且有可能参与到CNV中的蛋白,对其在CNV中的作用进行探索,以助于丰富我们对CNV发病机制的理解和认知,以期为寻找新的治疗靶点提供思路和线索。方法:（1）激光造模:采用532激光对棕色挪威大鼠进行视网膜光凝造模,成功造模后,于造模后14天取9只CNV大鼠以及9只正常大鼠的RPE-脉络膜-巩膜复合体,以用于后续的iTRAQ蛋白组学检测。（2）ITRAQ蛋白标记及鉴定:SDT裂解法提取蛋白质然后进行蛋白质定量,酶解,脱盐,肽段冻干后复溶,肽段定量。按照AB SCIEX公司iTRAQ标记试剂盒说明书进行标记。将每组标记后的肽段混合,采用AKTA Purifier 100进行分级。LC-MS/MS数据采集。质谱分析原始数据为RAW文件,用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4进行查库鉴定及定量分析。（3）生物信息学分析:利用blast2GO对目标蛋白质集合进行GO注释,过程大致可以归纳为序列对比（Blast）、GO条目提取（Mapping）、GO注释（Annotation）、和InterProScan补充注释（Annotation Augmentation）等四个步骤。KEGG通路注释:利用KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）软件,对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释。GO注释和KEGG注释的富集分析:采用Fisher精确检验（Fisher’s Exact Test）,比较各个GO分类或KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况,对目标蛋白质集合进行GO注释或KEGG通路注释的富集分析。蛋白质聚类分析:首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理（归一化到（-1,1）区间）。然后,使用Complexheatmap R包（R Version 3.4）同时对样品和蛋白质的表达量两个维度进行分类（距离算法:欧几里得,连接方式:Average linkage）,并生成层次聚类热图。火山图:采用两组样本间的蛋白质表达差异倍数（Fold change）和T检验得到的P value两个因素共同绘制火山图,用于显示两组样本数据的显着性差异。横坐标为差异倍数（以2为底的对数变换）,纵坐标为差异的显着性P-value（以10为底的对数变换）。（4）Western Blotting法对目标蛋白进行验证:根据ITRAQ蛋白组学实验结果,查阅相关文献,根据差异蛋白的变化倍数以及差异蛋白在既往的研究背景,在差异蛋白中筛选出8个候选蛋白,采用WB法进行验证。在验证成功的蛋白中,因为TAB1的功能与蛋白组学结果相符合,筛选到TAB1蛋白,作为后续体内及体外的研究靶标。（5）将BN大鼠随机分为CNV组、CNV+AAV组（AAV空载病毒组,带有GFP荧光标签）、CNV+AAV-TAB1组（TAB1过表达组）,对三组大鼠分别进行PBS视网膜下注射,AAV空载病毒视网膜下注射,AAV-TAB1过表达重组载体注射,于注射后3天进行视网膜激光光凝造模,造模后7天,14天,30天及60天进行心脏灌注FITC-dextran,多聚甲醛固定眼球2小时,去除眼前节及眼内容物及视网膜神经上皮层,将RPE-脉络膜-巩膜复合体放射状剪开,荧光显微镜下观察病灶大小,计算各组BN大鼠的CNV病灶面积。（6）ELISA法检测大鼠RPE-脉络膜-巩膜匀浆中IL-18和IL-6的含量,明确TAB1基因在大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体中,对IL-18及IL-6分泌的影响。（7）提取BN大鼠RPE原代细胞,将细胞分为Adv组（腺病毒空载病毒组）和Adv-TAB1组（TAB1过表达组）,以200μM CoCl2处理各组细胞,造成化学缺氧模型,模拟细胞缺氧状态。（8）CCK-8法检测各组细胞增殖情况,明确TAB1基因在缺氧环境下对大鼠RPE原代细胞增殖能力的影响;（9）在12小时,24小时,48小时及72小时后,ELISA法分别检测细胞上清中IL-18,IL-6的表达;（10）Werstern Blotting法检测非经典型Nf-kB信号通路分子的表达情况,探索TAB1影响大鼠RPE原代细胞增殖能力、IL-18及IL-6分泌的潜在机制。结果:（1）采用iTRAQ标记的蛋白质组学法,在正常大鼠及CNV模型大鼠的RPE-脉络膜-巩膜复合体中一共鉴定到4380个蛋白质,与正常组相比,CNV模型组中有49个蛋白表达上调,241个蛋白表达下调。（2）差异蛋白质GO功能富集分析结果显示,在生物学过程方面,差异蛋白主要参与有丝分裂,免疫应答相关的细胞表面受体信号通路,转录负调控,DNA复制,细胞死亡的负调控以及细胞因子的分泌等生物学过程;在分子功能方面,差异蛋白主要参与染色质结合,跨膜受体的激活,解旋酶的激活,激酶的调节,酶抑制剂的激活等分子功能;细胞外基质成分,COPII囊泡衣被,核外泌体,肽链内切酶等定位蛋白质发生了显着性变化。（3）对差异蛋白进行KEGG通路注释富集分析,结果显示人乳头状瘤感染信号通路,PI3K-AKT信号通路,单纯疱疹病毒感染,结核感染,以及癌症相关信号通路发生了显着变化。（4）根据查阅差异蛋白的表达量,以及差异蛋白的研究背景,在290个差异蛋白中筛选了8个候选蛋白,用WB法对其进行验证,这8个蛋白分别是MCM7,YES1,SEPT9,p27kip1,p57kip2,RPIA,TRIM32,TAB1。验证到发生变化的蛋白有MCM7,TRIM32,RPIA和TAB1,这4个蛋白均在CNV模型组中有明显下调（p<0.001）。（5）脉络膜血管网铺片显示造模后第14天,第30天,第60天时,CNV+AAV-TAB1组较CNV组的病灶面积有明显下降（p<0.01,p<0.001,p<0.001）,而CNV+AAV组较CNV组在任一时间点上,其病灶面积均无明显变化。（p>0.05）（6）ELISA结果显示激光光凝后第14天,30天及60天,CNV+AAV-TAB1组大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体中,IL-18的表达量较CNV对照组的表达量明显上调（p<0.01,p<0.001,p<0.01）,而在这四个时间点,IL-18的表达在CNV+AAV组与CNV组之间均无明显差异（p>0.05）。在IL-6方面,造模后第14天,30天及60天,CNV+AAV-TAB1组大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体中,IL-6的表达量较CNV对照组的表达量明显下调（p<0.01,p<0.01,p<0.001）,而在这四个时间点,IL-6的表达在CNV+AAV组与CNV组之间均无明显差异（p>0.05）。（7）CCK-8实验结果显示在CoCl2处理细胞24h,48h及72h后,Adv-TAB1组细胞的增殖情况高于Adv组（p<0.05,p<0.01,p<0.01）,而在12h这个时间点,两组细胞的数量无明显差异（p>0.05）（8）ELISA结果显示,在转染病毒后12h后,IL-18的表达在两组间无明显差异（p>0.05）,在转染病毒后24h,48h及72h后,IL-18的表达在Adv-TAB1组中明显高于Adv组（p<0.01,p<0.001,p<0.001）;IL-6方面,在转染后12h,两组间IL-6的表达无明显差异,而在转染后24h,48h及72h后,IL-6的表达在Adv-TAB1组中明显低于Adv组（p<0.01,p<0.01,p<0.01）。结论:（1）首次对CNV大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体进行蛋白组学分析,并鉴定到4380个蛋白质,在CNV中表达上调的有49个,下调的蛋白241个,说明iTRAQ蛋白组学的方法在大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体蛋白中的研究是可行的。（2）在差异蛋白中,很多蛋白参与到与细胞增殖、免疫相关的生物功能中,以及感染免疫相关的通路当中,说明细胞增殖和免疫效应在CNV当中起着重要作用。（3）从8个差异蛋白中验证到MCM7,TRIM32,RPIA,TAB1四个蛋白,为探索CNV的起病及发展机制提供了思路和线索,为寻找新的治疗靶点提供了思路。（4）体外实验中,TAB1在CNV大鼠视网膜下过表达,可明显减小CNV的病灶面积,并且上调IL-18的表达,下调IL-6的表达;在大鼠RPE原代细胞实验中,TAB1的过表达可提高细胞在缺氧环境中的的增殖能力和抗凋亡能力,并通过Nf-kB信号通路上调细胞的IL-18的分泌和下调IL-6的分泌,对CNV的发生发展起到抑制作用,对机体和RPE细胞起到保护作用,有望为治疗CNV提供新的思路和靶点。
赵倩[7]（2020）在《长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究》文中进行了进一步梳理第一部分:长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌中作用机制的研究研究背景肝癌由于每年约84万新确诊病例和74万死亡病例成为肿瘤致死的主要元凶之一,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）约占 85%-90%。肝癌的病因多种,包括酗酒,黄曲霉毒素污染饮食,肝炎病毒感染等。根据全球癌症研究署报告,引起肝癌的病因分布具有地域性差异,在我国HCC主要与慢性乙型肝炎病毒感染引起的慢性乙型肝炎有关。在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染过程中,肝细胞长期受到炎症刺激可出现肝硬化（Liver cirrhosis,LC）和HCC,被称为慢性HBV感染“三部曲”。HCC起病隐匿,恶性程度高,进展迅速,预后极差。近年来,针对HCC的治疗方法发展迅速,包括全身化疗,射频消融,微波消融,但是HCC晚期患者预后仍不理想。根据以往的研究报道,HCC的发生发展是一个极其复杂的过程,可涉及到多种基因以及信号通路异常。因此,研究HCC发生发展的分子机制,寻找和探索治疗HCC新靶点显得尤为重要。长非编码 RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是长度大于 200nt,不具有蛋白质编码功能的RNA。大量实验研究表明LncRNAs在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用,可以影响肿瘤进展中的许多生物学功能,包括上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）、侵袭、转移、增殖、凋亡和药物抗性。有研究报道 lncRNA-小核仁 RNA 宿主基因 3（Small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3）可参与恶性肿瘤发生发展过程中。SNHG3在多种恶性肿瘤内表达异常并且与疾病进展相关,比如结直肠癌、肺腺癌和神经胶质瘤。SNHG3表达异常还与恶性肿瘤预后相关,比如SNHG3在卵巢癌中表达增加常预示卵巢癌预后不良。SNHG3在HCC中表达升高并且在HCC进展过程中发挥作用,但是SNHG3在HCC中确切的分子机制尚不清楚。因此,进一步研究SNHG3的作用机制判断SNHG3是否可以作为新的治疗靶点十分重要。MicroRNA（miRNA）属于高度保守的小非编码RNA,其在恶性肿瘤中的生物学作用得到广泛认可,包括细胞增殖,侵袭,凋亡,代谢和信号转导。据报道,miRNA-326（miR-326）参与细胞凋亡、侵袭,胚胎发育,肿瘤生长,免疫调节,化疗药物抗药性和肿瘤发生。MiR-326在神经胶质瘤,子宫内膜癌和宫颈癌中通过靶向不同的mRNA起到肿瘤抑制剂的作用。MiR-326在HCC中低表达,并且可以促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭和肿瘤生长。研究报道许多lncRNA作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNAs,ceRNA）可以通过 microRNA 反应元件（microRNA response element,MRE）竞争性地结合miRNA,从而降低miRNA对靶mRNA的抑制作用。即miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默,而lncRNA可以作为ceRNA与mRNA竞争结合miRNA,从而抑制miRNA导致的基因沉默。然而,目前SNHG3和miR-326在HCC中的关系还没有研究报道。研究目的1.明确SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确SNHG3在肝细胞肝癌组织标本和肝癌细胞中的表达规律,分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3表达水平与临床病理参数之间的相关性。3.寻找SNHG3可以结合的miRNA。4.明确SNHG3作为miR-326的ceRNA发挥生物学功能。5.明确SNHG3对于miR-326的靶mRNASMAD3的调控。6.明确SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学功能。研究方法1.检测SNHG3在患者外周血单个核细胞中的表达情况本研究自2016年5月至2017年12月期间,在山东大学齐鲁医院肝病科住院病人中收集了 124例患者外周静脉血,其中30例慢性乙型肝炎患者、30例肝硬化患者、40例肝细胞肝癌患者以及24例健康志愿者作为对照。通过提取研究对象的外周血单个核细胞,利用qRT-PCR检测外周血单个核细胞中SNHG3表达水平。2.检测SNHG3在HCC组织标本和肝癌细胞系中的表达情况在2017年8月到2018年1月期间,我们在山东大学齐鲁医院手术患者中收集47对HCC患者肿瘤组织和癌旁对照组织。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中SNHG3表达水平,再利用统计学方法分析肿瘤组织中SNHG3表达水平与患者临床病理参数的相关性。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中SNHG3表达水平。3.寻找SNHG3相结合的miRNA及其检测其表达水平生物信息学软件预测可能与SNHG3结合的miRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测SNHG3与miR-326可以相互结合。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中miR-326表达水平。利用Pearson correlation分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3与miR-326表达水平之间的关系。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中miR-326表达水平。4.检测SNHG3作为miR-326的ceRNA对细胞生物学功能的影响在肝癌细胞中分别转染小干扰RNA si-SNHG3,共转染si-SNHG3和miR-326 mimic、感染慢病毒 pLVX-SNHG3、共转染 pLVX-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用MTT、Transwell、流式细胞术、qRT-PCR和western blot分别检测干扰和过表达SNHG3对细胞增殖、迁移、凋亡和EMT的影响以及检测miR-326过表达和低表达对SNHG3细胞生物学功能的影响。5.检测 SNHG3 对 miR-326 靶 mRNA SMAD3 的调控5.1 检测 miR-326 的靶 mRNA利用生物信息学软件预测miR-326的靶mRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测miR-326是否对SMAD3具有调节作用;利用qRT-PCR和western blot检测SMAD3在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平,以及在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平;在肝癌细胞中分别转染miR-326 mimic和miR-326 inhibitor,利用qRT-PCR和western blot检测过表达或者干扰miR-326对SMAD3 mRNA和蛋白表达水平的影响。5.2检测SNHG3通过吸附miR-326调控SMAD3在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒、共转染pLVX-SNHG3和miR-326 mimic、转染 si-SNHG3 和共转染 si-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用 qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3表达水平的影响以及SNHG3和miR-326相互结合后对SMAD3表达水平的影响6.检测SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学作用6.1检测ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达情况利用qRT-PCR检测ZEB1在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平;利用qRT-PCR和western blot检测ZEB1在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平。6.2检测SNHG3调控ZEB1表达在肝癌细胞中转染pLVX-SNHG3或者转染si-SNHG3,利用qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3下游基因ZEB1 mRNA和蛋白表达水平的影响。6.3检测SNHG3通过ZEB1发挥生物学功能在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒,共转染pLVX-SNHG3和si-ZEB1、转染si-SNHG3、共转染si-SNHG3和pLVX-ZEB1,利用MTT检测干扰和过表达ZEB1是否影响SNHG3对细胞增殖的作用,利用western blot检测干扰ZEB1是否影响SNHG3对细胞EMT的作用。6.4体内实验检测SNHG3作为miR-326的ceRNA可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥作用构建SNHG3干扰的肝癌细胞进行裸鼠皮下种植瘤实验,测量皮下种植瘤的大小,33天后解剖小鼠,观察裸鼠皮下种植瘤的生长状态。对小鼠皮下原位种植瘤组织切片进行Ki-67染色和Tunel染色,检测在体内干扰SNHG3对于细胞增殖和凋亡的影响,利用western blot检测SNHG3在体内对EMT的影响以及对于SMAD3和ZEB1蛋白表达水平的影响。研究结果1.SNHG3在研究对象外周血单个核细胞中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达水平显着高于慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组。SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组外周血单个核细胞中的表达水平无明显差异。2.SNHG3在HCC组织标本中和肝癌细胞系中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁对照组织,卡方检验显示SNHG3的表达水平与TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关,与年龄、性别无明显相关性。SNHG3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。3.SNHG3可以与miR-326相互结合及其miR-326的表达水平通过生物信息软件分析有16个miRNAs具有与SNHG3相互结合的序列,经查阅Pubmed发现miR-326在肝细胞肝癌中低表达并且和预后相关;双荧光素酶基因报告实验显示miR-326 mimic抑制SNHG3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SNHG3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响。MiR-326在肝细胞肝癌组织中表达水平明显高于癌旁对照组织,Pearson correlation分析在肝细胞肝癌组织中SNHG3与miR-326表达水平呈负相关。MiR-326在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显低于正常肝细胞L02。4.SNHG3作为miR-326的ceRNA促进细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡干扰SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力降低但是细胞凋亡能力升高,miR-326 inhibitor（anti-326）抑制SNHG3低表达产生的上述细胞生物学功能;过表达SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力升高但是细胞凋亡数量降低,miR-326 mimic抑制SNHG3过表达产生的上述细胞生物学功能。5.SNHG3 调控 miR-326 的靶 mRNA SMAD3 的表达5.1 miR-326 抑制靶 mRNA SMAD3 的表达生物信息学软件分析SMAD3是具有与miR-326具有相互结合序列的mRNA,双荧光素酶基因报告实验证实miR-326 mimic抑制SMAD3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SMAD3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响;QRT-PCR结果显示SMAD3在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织;QRT-PCR和western blot结果显示SAMD3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02;QRT-PCR和western blot结果显示miR-326过表达则SMAD3 mRNA和蛋白的表达降低,抑制miR-326则SMAD3 mRNA和蛋白的表达升高。5.2 SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达SNHG3过表达则SMAD3表达升高,共转染miR-326mimic则SMAD3表达下降;干扰SNHG3则SMAD3表达降低,共转染miR-326 inhibitor则SMAD3表达升高。6.SNHG3通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能6.1 ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达ZEB1在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织,在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。6.2 SNHG3促进ZEB1表达干扰SNHG3可以降低ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平,过表达SNHG3可以升高ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平。6.3 SNHG3通过ZEB1促进细胞增殖和EMT过表达SNHG3肝癌细胞增殖能力和EMT能力增加,同时干扰ZEB1则抑制SNHG3过表达导致的细胞增殖能力和EMT改变;干扰SNHG3则肝癌细胞增殖能力和EMT能力降低,同时过表达ZEB1则抑制SNHG3低表达导致的细胞增殖能力和EMT改变。6.4体内实验证实SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能干扰SNHG3可以抑制裸鼠皮下原位种植瘤的生长。对裸鼠皮下原位种植瘤组织切片染色,Ki-67染色程度明显降低,Tunel染色程度明显升高,western blot结果显示细胞EMT降低。此外,干扰SNHG3则SMAD3和ZEB1在蛋白水平的表达降低。研究结论在本实验中,我们发现SNHG3的表达水平在HCC患者外周血单核细胞、肝细胞肝癌组织和肝癌细胞系中明显升高,并且与患者TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关。SNHG3具有与miR-326结合位点并且可以相互结合,此外SNHG3与miR-326的表达水平呈现负相关。SNHG3作为miR-326的ceRNA可以促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡,miR-326抑制SNHG3的上述细胞生物学功能。MiR-326抑制靶mRNA SMAD3的表达,SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达。SNHG3通过调节SMAD3的下游基因ZEB1的表达进一步影响肝癌细胞的生物学效应。总之,SNHG3作为miR-326的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）促进 SMAD3 及其下游基因 ZEB1的表达,进而促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡。第二部分:长链非编码RNA SNHG3通过NLRP3影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭（Acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF）是在慢性乙型肝炎进展过程中,由于某些急性损伤导致部分患者在短时间内出现肝功能迅速恶化,以黄疸,凝血障碍为主要临床表现,并在四周内出现腹水和/或肝性脑病等症状。ACHBLF可以发生在慢性HBV感染的任何阶段,进展迅速,由于缺乏有效的临床治疗方法ACHBLF死亡率高达50%-90%。目前,国际上约有20多种关于评估肝衰竭预后的方法,其中终末期肝病积分（Model for end-stage liver disease,MELD）是最常用的关于肝衰竭预后的评估方法,由于导致肝衰竭的因素差异,MELD对于ACHBLF预后的评估不甚理想。因此,寻找更加有效的ACHBLF预后评估方法具有重要意义。慢加急性乙型肝炎肝衰竭在不同时相经历三重打击,包括免疫损伤,缺血缺氧性损伤和内毒素血症。在肝衰竭的发生过程中,炎症因子介导的免疫损伤起了重要作用。细胞因子失衡作为已知的ACHBLF病理机制越来越得到大家的重视,由于HBV感染和细胞毒效应介导的免疫紊乱,通过细胞因子失衡进一步促进ACHBLF的进展。此外,在肝衰竭发展过程中会出现肾上腺功能不全,因此早期利用糖皮质激素成为治疗早期慢加急性乙型肝炎肝衰竭的方法之一。糖皮质激素可以通过保护细胞膜,溶酶体酶和线粒体来防止肝细胞坏死和进行性急性恶化。糖皮质激素是一把双刃剑,正确应用可以极大提高患者的生存率。然而,在ACHBLF患者中使用糖皮质激素是否对细胞因子失衡产生影响尚且没有研究。在之前的研究中我们证实了 lncRNA SNHG3与miR-326在肝细胞肝癌中可以通过SMAD3信号通路促进肝细胞肝癌进展,然而miR-326还可以作为关键的促炎因子通过核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路参与多种炎症过程。NF-κB作为重要的转录因子可以调节NLRP3的表达。NLRP3（Nucleotide-binding oligomerisation domain-like receptors（NLRs）Family Pyrin Domain Containing 3）属于NLRs蛋白家族,被激活后通过活化caspase-1使细胞因子白介素1β前体（pro-interleukin（IL）-1β,pro-IL-1β）和白介素18前体（pro-interleukin（IL）-18,pro-IL-18）变为有活性的 IL-1β 和 IL-18。IL-1β 和 IL-18作为重要的促炎性分子,其表达紊乱可以导致细胞因子失衡。目前lncRNA SNHG3与miR-326在ACHBLF中的表达状态以及NLRP3与ACHBLF之间的关系尚不清楚。因此本研究首先检测SNHG3和miR-326在ACHBLF患者中的表达水平,再检测促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3的表达状态,接着分析糖皮质激素对于促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响以及与预后的关系。研究目的1.明确 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者和健康对照者（healthy controls,HCs）外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中的表达规律。3.明确NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs表达规律及与ACHBLF患者临床数据的相关性。4.研究糖皮质激素对于IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响。研究方法1.利用 qRT-PCR 检测 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、CHB 患者和 HCs外周血单个核细胞中的表达规律。2.利用ELISA和qRT-PCR检测ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达情况。3.利用qRT-PCR检测NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs外周血单个核细胞中的表达规律,利用Spearman线性相关分析NLRP3 mRNA水平与相关临床指标之间的关系。4.对接受28天糖皮质激素治疗的ACHBLF患者进行3个月随访,根据患者的生存状况分为生存组和死亡组。通过qRT-PCR检测两组患者外周血单个核细胞中NLRP3及其相关因子在接受糖皮质激素治疗过程中第7天和第28天的表达情况。研究结果1.SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显低于CHB患者和HCs;miR-326在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB和HCs患者。即在ACHBLF中,SNHG3表达降低对于miR-326的吸附作用下降。2.促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者血浆和外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB患者和HCs。3.NLRP3 mRNA在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB 患者和 HCs,并且与总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、MELD 评分（model for end-stage liver disease）呈正相关,与凝血酶原活动度（prothrombin activity,PTA）、白蛋白（Albumin,ALB）呈负相关,与谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、肌酐（Creatinine,Cr）无明显相关性。4.在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平明显低于死亡组。在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,生存组TBIL和PTA也明显低于死亡组。此外,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在接受糖皮质激素治疗过程中表达水平呈持续性下降,死亡组则无明显改变甚至有升高的表达趋势。研究结论LncRNA SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中表达下降,而其可以结合的miR-326则表达升高。在ACHBLF中miR-326可能通过NF-κB信号通路使NLRP3及其对应的促炎性细胞因子表达升高并且与患者的临床严重程度呈正相关。此外,糖皮质激素通过调节NLRP3表达水平影响ACHBLF预后。
张琛[8]（2020）在《骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究》文中指出第一部分急性髓性白血病骨髓微环境中神经破坏与Th免疫失衡的研究研究背景急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一组异质性恶性疾病,其特征是白血病干细胞和/或祖细胞的过度增殖造成大量白血病细胞累积并抑制正常造血。即使采用目前临床应用强化的化疗方案和干细胞移植,AML的总体生存率仍然很差。恶性白血病细胞的微环境会被重塑成有利于白血病生存的环境,这样的骨髓微环境可以保护AML细胞免受化疗药诱导的细胞死亡。探究骨髓微环境中可以促进白血病发生发展、保护白血病细胞免受化疗药杀伤的因素,以期能够发现针对AML治疗的有效靶点。骨髓局部区域里的交感神经系统与造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSC）通过直接接触或者通过分泌细胞因子的形式,调节骨髓龛内造血干细胞的存活和休眠状态的转化来调控骨髓的正常造血功能。当破坏小鼠交感神经后,使骨髓局部缺乏交感失神经分布,会使得骨髓中造血干细胞数量的急剧下降,使正常的造血功能受到一定程度的抑制。骨髓局部的交感神经组织对骨髓中的造血和免疫平衡的维持具有极为重要地调控作用。然而,骨髓交感神经损伤与血液系统疾病的发生发展也有着密不可分的关系。有研究发现骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative Neoplasms,MPN）患者及模型小鼠的骨髓中,交感神经纤维有明显受损,这些损伤可以使得正常HSC的凋亡。CD4+T细胞是免疫系统中一个不可忽略的组成成分,其分化的Th（T helper）亚群在许多实体瘤的发生发展中也扮演着关键的角色。课题组前期发现AML患者骨髓中交感神经特异性分子酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、Nestin等的表达水平与Th细胞分泌的特异性细胞因子IL-17A表达呈正相关,而与Foxp3/IL-17A比值呈负相关。因此,我们推测在AML的发生发展中,骨髓交感神经发生病理性改变,引起骨髓区域微环境Th细胞免疫网络的异常,造成骨髓微环境中免疫平衡受到抑制,进而使得白血病病程进展。然而,AML中骨髓交感神经损伤是通过何种机制改变骨髓Th细胞免疫网络,以及Th细胞免疫异常如何促进白血病细胞的发生发展,这些问题亟待进一步研究。研究目的1.明确AML患者骨髓局部存在神经破坏并分析其与患者临床特征之间的相关性。2.检测骨髓局部微环境中Th亚群的改变,明确在AML患者中存在骨髓Th亚群的免疫失衡,并通过系统生物学的分析推测其中作用的关键点。3.探究在白血病动物模型中破坏交感神经后,其Th的变化情况。4.应用髓腔注射的方法,破坏白血病动物模型骨髓局部的交感神经,旨在明确骨髓局部神经受到破坏后对白血病发生发展的作用。研究方法1.标本收集:本研究采集就诊于山东大学齐鲁医院的63例初诊急性髓性白血病病患及16例对照组的骨髓液;分离骨髓中的单个核细胞并用MACS方法分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.AML患者骨髓局部存在神经破坏:应用RT-PCR方法检测患者和对照组骨髓细胞中神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的相对表达水平。3.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:应用RT-PCR方法检测骨髓局部β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR在患者和对照组中的表达差异,并分析其与临床特征之间的相关性。4.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:流式细胞术检测AML患者与对照组骨髓局部Th亚群比例,包括Th1、Th2、Th17、Th9、Th22和Treg;应用RT-PCR技术检测Th亚群特异性转录因子T-bet、RORc、GATA3、AHR和Foxp3的mRNA水平;采用ELISA方法检测骨髓上清中细胞因子IFN-γ、IL-17A、TGF-β、IL-22、IL-10 和 IL-4 的浓度。5.系统生物学方法分析:我们利用系统生物学方法中的贝叶斯网络对白血病患者和对照组骨髓微环境中检测的Th亚群以及Th亚群的关键性转录因子进行分析。6.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的影响:应用MLL-AF9细胞尾静脉注射到C57BL/6J背景的野生型雌鼠体内建造AML小鼠模型;分别进行 6-羟基多巴胺氢溴酸盐（6-Hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA）和 4-甲基儿茶酚（4-Methylcatechol,4-MY）的腹腔注射对小鼠进行神经破坏和神经保护的干预;应用流式细胞术的方法对动物模型骨髓局部Th亚群的比例进行测定。7.骨髓局部交感神经破坏对白血病的影响:应用髓腔注射6-OHDA的方法对小鼠骨髓局部的神经进行破坏。研究结果1.AML患者骨髓局部存在神经破坏:通过比较患者和对照组骨髓局部的基因相对表达量发现,神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的mRNA水平在白血病患者中均低于对照组,提示AML患者骨髓局部微环境中存在交感神经的破坏。2.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:通过检测β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR,我们发现除β1亚型在白血病患者骨髓局部的相对表达量较低,β2和β3亚型在白血病患者的骨髓局部均有着较高的相对表达水平。并且,β2-ADR亚型的表达量远高于β1-ADR和β3-ADR亚型。通过分析其与临床特征的关系,AML-M4和AML-M5亚型高表达β3-ADR,而其中高表达β1-ADR的病患出现髓外浸润的几率更大。3.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:（1）.与对照组相比,AML患者骨髓局部Th1和Th17的比例出现显着地降低,Treg和Th22的比例显着增高:（2）.AML患者骨髓中Th亚群的下游转录因子T-bet、RORc和GATA3的mRNA表达量较对照组明显降低,而Treg的下游转录因子Foxp3和Th22的转录因子AHR有所增高;（3）.AML患者Th亚群分泌的细胞因子中,IFN-γ、IL-17A、TGF-β和IL-22均低于对照组,而IL-10和IL-4的分泌量高于对照组;（4）.将上述结果通过贝叶斯网络进行分析发现,对照组中贝叶斯网络的终点指向IFN-γ和IL-4,而在AML患者中网络的终点变为IL-17A和IL-10。4.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的作用:（1）.AML模型鼠的生存期均短于正常对照组小鼠,且神经破坏剂组AML小鼠生存期短于其他组小鼠生存期;（2）.神经破坏剂组小鼠的白血病负荷明显高于其他组,而神经保护剂组小鼠的白血病负荷明显低于其他组;（3）.骨髓局部微环境中,Th1和Th17在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低,Treg和Th2在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均升高。Th17/Treg比值在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低。5.骨髓局部交感神经破坏对白血病及Th亚群的影响:在利用髓腔注射的方法对白血病模型小鼠单只股骨的局部交感神经进行破坏后,观察其白血病负荷情况发现,被破坏交感神经一侧的髓腔内的白血病负荷明显高于未进行神经破坏一侧的负荷量。研究结论1.AML病患骨髓局部存在交感神经破坏,且β-肾上腺素受体在AML病患骨髓局部存在高表达。2.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡,Th1及Th17的比例明显降低,Treg等免疫抑制亚群的比例明显增高。3.AML小鼠模型组,神经破坏剂组生存期明显变短且白血病负荷增加,而神经保护剂组生存期更长且白血病负荷更少;AML及神经破坏组的骨髓中存在免疫失衡。4.局部破坏AML小鼠单侧的骨髓交感神经发现,被破坏一侧髓腔中白血病负荷明显高于神经完整的一侧髓腔,证明神经破坏会促进急性髓性白血病进展。第二部分 交感神经递质对Th亚群及急性髓性白血病细胞作用的研究研究背景急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种生物学和临床表现上的存在高度异质性疾病。尽管支持治疗和预后风险分层的进展已优化了既定疗法,但总体长期生存率仍然很低,所以明确能够影响疾病发生发展的因素是十分必要的。众所周知急性应激反应是人体会对外界刺激作出的积极地反应,而慢性应激通常是有害的,并可能导致严重的健康并发症。应激会触发中枢神经系统特定部位控制下的神经内分泌链反应,其中主要包括肾上腺和交感神经系统分泌儿茶酚胺和糖皮质激素。儿茶酚胺（catecholamines）是最早对压力作出反应的信号分子,也是主要发挥作用的分子。尽管儿茶酚胺（主要是表肾上腺素和去甲肾上腺素）的主要功能是作用于心脏功能,但新近的研究表明这些应激激素也显示出在癌症中的重要作用。肿瘤坏死因子α（TNFα）是巨噬细胞/单核细胞在急性炎症过程中产生的炎症细胞因子,负责细胞内各种信号事件。TNFα结合TNFR触发各种MAPK等细胞内信号途径,参与到调节炎症和肿瘤中。T辅助（Th）亚群是CD4+T细胞在激活后会分化出不同的亚群,是各种免疫应答中重要的组成部分。不管是早期发现的Thl和Th2亚群还是新近的研究热门Th17及Treg亚群都被认为参与到了诸如卵巢癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中的发病机制中。Th亚群的免疫失衡在疾病中被认为是导致疾病发生的关键因素。而且,有证据表明,诸如淋巴细胞等的膜表面上会存在多种神经递质的受体,而交感神经递质不仅会抑制免疫系统,还会导致Th1/Th2的细胞平衡向以Th2为主的反应发生转变并诱导了哮喘和过敏性疾病的发生。然而,交感神经递质以何种方式参与AML发生发展还尚不明确。依据前期检测到AML骨髓局部中存在着一定程度的神经损害以及Th亚群的免疫失衡,我们推测,在AML骨髓区域微环境中,交感神经递质会造成Th17、Treg、Th1、Th2等多个Th细胞免疫的失衡,最终促进AML白血病的发生发展。研究目的1.探究骨髓局部的交感神经递质对Th亚群免疫平衡的影响,明确其具体的作用机制。2.探究交感神经递质在不同浓度下对原代及白血病细胞系的影响,明确其如何通过改变Th亚群免疫平衡进而促进白血病发生发展。3、明确交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体抑制CD4+T向免疫保护亚群Th1及Th17亚群分化,进而造成了骨髓局部的免疫抑制。4、进一步探究神经递质抑制了Th1及Th17亚群杀伤白血病细胞的作用,进而促进白血病的进展。研究方法1.标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院初诊AML患者骨髓液;分出骨髓中的单个核细胞并用MACS分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:选取AML细胞系MV4-11和THP-1以及初诊急性髓性白血病患者的原代细胞;应用CCK8检测不同浓度的肾上腺素和去甲肾上腺素在24小时和48小时时间点对其促增殖情况。3.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:应用RT-PCR技术检测不同细胞上β1/β2/β3-肾上腺素受体受体mRNA的表达情况。4.不同浓度的交感神经递质对Th亚群的影响:设置浓度梯度0、10-8M,10-7M、10-6M、10-5M和10-4M的肾上腺素及去甲肾上腺素作用于CD4+T细胞;应用MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-17A细胞因子的浓度。5.交感神经递质通过β-肾上腺素受体影响Th亚群的免疫平衡:MACS免疫磁珠法分选小鼠CD4+T细胞;琼脂糖凝胶DNA电泳明确β-肾上腺素受体敲除鼠的基因型;流式细胞术检测小鼠Th亚群的变化;ELISA检测培养后的细胞上清中IFN-γ和IL-17A的浓度。6.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;CCK8方法用于检测细胞增殖情况。研究结果1.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:分别应用不同浓度梯度等肾上腺素以及去甲肾上腺素,分别作用于初诊AML患者的原代细胞和MV4-11及THP-1两种AML细胞系,在24小时和48小时两个时间点应用CCK8方法检测其增殖情况,随着浓度的增加交感神经递质促进白血病细胞增殖的效果越明显。肾上腺素及去甲肾上腺素均在10-4M浓度时促增殖效果最明显,且肾上腺素促白血病细胞增殖效果优于去甲肾上腺素。2.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:（1）应用RT-PCR技术检测了 HL60、THP-1、U937、Kasumi四种不同的AML细胞系以及CD4+T细胞和Hela细胞系表面β-肾上腺素受体的表达情况。其中β2-肾上腺素受体表达量远高于其他两种亚型,而β3-肾上腺素受体的相对表达量低于其他两种亚型,且AML细胞系及CD4+T细胞均有较高的β-肾上腺素受体。（2）同时检测了小鼠脾脏、骨髓、外周血、分选的CD4+T细胞以及骨骼肌细胞的β-肾上腺素受体受体表达情况。β2-肾上腺素受体表达量在各个组织里仍远高于其他两种亚型,β3-肾上腺素受体表达量也是最低的一种。其中CD4+T细胞上β2-肾上腺素受体的表达量最高,接近骨骼肌中表达量的水平。3.低浓度的交感神经递质对Th亚群的免疫平衡无明显影响:（1）分别加入10-8M-10-5M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素于CD4+T细胞的培养体系中,3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的比例及其比值关系。研究发现在10-8M-10-5M浓度区间,Th亚群及Th1/Th2、Th17/Treg相比于空白对照组均无统计学差异。（2）取培养后的上清,应用酶联免疫标记法（ELISA）测定分泌IFN-γ和IL-17A细胞因子的量,不同浓度梯度组与对照组之间的差别亦无统计学意义。4.高浓度的交感神经递质可改变Th亚群的免疫平衡:（1）CD4+T细胞的培养中分别添加10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的百分比及其比值关系。研究发现,肾上腺素及去甲肾上腺素均能明显降低Th1及Th17的比例,并且能升高Treg的比例。（2）应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测培养后的细胞上清,肾上腺素及去甲肾上腺素培养后上清中IFN-γ及IL-17A细胞因子的浓度明显减低。5.交感神经递质亦改变小鼠Th亚群的免疫平衡:分选小鼠CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测发现Thl和Th17在对照组中的比例明显降低,Treg的比例明显增高。RT-PCR技术检测IFN-γ和IL-17A的mRNA水平明显低于对照组。6.交感神经递质通过β-肾上腺素受体改变Th亚群的免疫平衡:（1）检测β1/β2-肾上腺素受体敲除鼠的基因型,明确β1及β2-肾上腺素受体敲除成功。（2）分选肾上腺素受体敲除小鼠的CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测Th1、Th17和Treg的比例,结果发现Th1及Th17亚群未被交感神经递质所抑制。证明交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体发挥改变Th的作用。7.TNF-α能通过TNFR2促进Treg的比例:TNFR2是TNF-α主要的发挥作用的受体,于是我们应用流式细胞学的方法对初诊的急性髓性白血病患者和对照组中CD4+T细胞及Treg细胞表面的TNFR2表达量进行测定。初诊白血病患者的CD4+T细胞和Treg细胞表面均高表达TNFR2受体。随后,我们在CD4+T细胞的培养体系中加入TNF-α进行培养,在添加了 TNF-α后,Treg的比例明显增加,然而在预先添加TNFR2拮抗剂后再添加TNF-α进行培养则可以降低Treg的比例。8.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:CD4+T细胞的培养体系中分别加入10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后将CD4+T细胞与白血病细胞进行共培养,于24小时和48小时用CCK8方法检测AML细胞增殖情况。肾上腺素及去甲肾上腺素均能通过改变Th亚群平衡进而促进AML的增殖,其中肾上腺素作用更为明显。研究结论1、交感神经递质肾上腺素和去甲肾上腺素均能在24小时和48小时促进原代白血病细胞及白血病细胞系的增殖,且随浓度的增加其促进白血病细胞增殖的效果更加显着。2、交感神经递质可以抑制人和小鼠CD4+T细胞向Th1和Th17方向分化。3、敲除β-肾上腺素受体后,交感神经递质不能改变小鼠Th1及Th17的比例。4、TNF-α能通过TNFR2受体促进Treg的比例。5、交感神经递质通过抑制Th1和Th17的比例进而抑制其对白血病细胞杀伤作用。第三部分NLRP3炎性小体相关基因单核苷酸多态性在急性淋巴细胞白血病中的研究研究背景急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）是一种血液恶性肿瘤,由于骨髓和其他组织中的淋巴样干祖细胞的恶性增殖和积累所致。尽管最常见的ALL是儿童急性淋巴细胞白血病（占ALL 80%的病例）,但成人急性淋巴细胞白血病的治愈率仅有20%-40%。在过去的十年中,尽管在改善预后以及开发针对特定亚型的新疗法方面取得了一定进展,但了解疾病的发病机制仍是改变ALL治愈率的关键点。炎性小体是固有免疫中公认的重要角色。其中研究最透彻的是NLRP3炎性小体,NLRP3炎性小体复合物属于核苷酸结合和寡聚化域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs）的家族,也被称为“含pyrin域的蛋白3”。NLRP3炎性小体与许多疾病密切相关,包括多发性硬化症、炎症性肠病以及其他自身免疫性和自身炎性疾病。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）是一种 DNA 序列的多态性,是由于单个核苷酸在基因组水平上的变异而引起的。SNP在至少1%的人群中有差异,占正常人类遗传变异的大部分。虽然大多数SNP没有明显的表型作用,然而仍有很多的SNP被认为可能促进疾病发生发展以及影响药物治疗的功效。NLRP3相关分子的SNP在许多肿瘤和慢性病的发病及疾病进展过程中都有很大的作用。例如,已有文献表明CARD8（rs2043211）与心血管疾病的发生有关,NF-κB-94ins/del ATTG多态性则与胃癌、肝细胞癌和肺癌等癌症的发生密切相关,NLRP3效应分子之一IL-18的单核苷酸多态性rs1946518已显示与牙周炎和肝细胞癌的发病有关,而IL-1β rs16944被认为可能导致宫颈癌和胃炎。因此,NLRP3炎性体相关基因的多态性与恶性肿瘤的发生关系密切。NLRP3己广泛涉及各种血液疾病的发生和发展。然而,NLRP3炎性小体如何促进ALL的发生发展仍然未知。因此,我们探究了 ALL患者的骨髓中NLRP3炎性小体的单核苷酸多态性及其相关基因的表达情况,以期明确其在ALL发生发展中的作用。研究目的探索NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与ALL易感性的关系;分析不同模式下NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与临床特征之间的关系;为明确NLRP3单核苷酸多态性具体作用机制,探索其对NLRP3各组分表达水平及下游因子表达和细胞因子分泌的影响。研究方法1、PCR 检测 ALL 病人及健康对照组中的 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG 基因的单核苷酸多态性。2、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组和正常对照组 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与ALL易感性之间的关联。3、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组中CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与预后有关的临床特征的关联。4、RT-PCR测定ALL患者IL-1β、IL-18 mRNA的相对表达,并分析其与患者NLRP3炎性小体相关基因SNPs之间的关系。5、ELISA测定ALL患者血清中IL-1β、IL-18的含量,并分析其与NLRP3炎性小体相关基因SNPs的关系。研究结果1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关:检测ALL患者组和对照组NLRP3相关成分的单核苷酸多态性,我们发现CARD8（rs2043211）在显性模式下的AT/TT基因型和共显性模型下的TT基因型与ALL易感性明显相关。此外,NF-κB-94ins/del ATTG中D等位基因的频率和显性模式下的DD基因型均与ALL易感性显着相关。我们采用单因素逻辑回归分析法分析NF-κB和CARD8,研究发现NF-κB单核苷酸的多态性表现为保护作用,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型却极大的增加了 ALL的易感性。2、表达NF-KB-94ins/del ATTG DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关:根据《NCCN急性淋巴细胞白血病指南》,一些临床检查指标可以给临床提供预后信息。我们的研究分析了这些预后指标与NLRP3炎性小体相关基因的四个SNP之间的关联,旨在弄清NLRP3遗传多态性与ALL预后之间的相关性。依据指南,WBC计数超过30×109/L被认为是不良的预后指标,而我们研究发现表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有更低的WBC计数。ALL的免疫表型主要分为T细胞免疫表型和B细胞免疫表型,T细胞免疫表型也是一个预后不良因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关性更强。因此,我们认为NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型显示为保护因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与预后不良相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG,IL-18（rs1946518）和 IL-1β（rs16944）与 ALL 患者的临床特征相关性分析:对于NF-κB-94ins/del ATTG在隐性模式下的WW/WD基因型相比,DD基因型与较低的血红蛋白含量相关。共显性模型中的DD基因型及D等位基因发生脾肿大概率更高。IL-18（rs1946518）在隐性模式下TT基因型与脾肿大和血清中的高AST浓度具有统计学相关性。另外,在共显性模型中的TT基因型和T等位基因与较高水平空腹血糖有关。而IL-1β（rs16944）中的多态性与肌酐浓度有关。在隐性模式中,TT基因型比GG/GT基因型和高肌酐浓度更为相关。关于等位基因的频率方面,G等位基因也与高肌酐浓度显着相关。4、NLRP3炎性小体单核苷酸多态性与其相关基因表达的关系:关于CARD8（rs2043211）的AT基因型会表达较高NLRP3和ASC。TT基因型比AA和AT基因型会有更高的caspase-1 mRNA表达量。关于IL-1β（rs16944）多态性,相较于GG和TT基因型,GT基因型与IL-18表达量密切相关。并且相较于TT基因型,GT基因型会有更高的ASC表达量并分泌更多的IL-1β。与GG基因型相比,IL-18（rs1946518）多态性的TT基因型也与IL-1β和IL-18浓度相关。然而,IL-18多态性的GT基因型与NLRP3和ASC的较高水平有关。研究结论1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关。2、表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG与较低的血红蛋白含量以及脾肿大相关;表达IL-18（rs 1946518）基因型的ALL患者更易出现脾肿大及高的AST浓度和高的空腹血糖;而IL-1β（rs16944）基因型的ALL患者更易出现高肌酐浓度。4、CARD8（rs2043211）的 AT 和 TT 基因型、IL-1β（rs16944）的 GT 和 TT 基因型和IL-18（rs1946518）的TT基因型与NLRP3相关基因的mRNA高表达和分泌的细胞因子有关。
王兰芝[9]（2020）在《中国大鲵白介素18鉴别与免疫功能研究》文中研究说明中国大鲵（Andrias davidianus）是我国特有的目前世界上现存最大从水生脊椎动物过渡到陆生脊椎动物的两栖动物类群[1,2],所以中国大鲵在研究动物发育、生物进化和基因变异方面具有重要意义。目前中国大鲵的人工养殖技术正逐渐成熟,但外界病原菌的感染仍给中国大鲵人工养殖业带来了严重影响。白介素18（Interleukin-18,IL-18）是白介素 1（Interleukin-1,IL-1）细胞因子超家族的成员,是一种重要的促炎细胞因子,在先天性免疫和获得性免疫方面均具有多种功能[3]。然而,IL-18的特征和功能作用在被归类为脊椎动物的主要群体两栖动物中仍然是未知的。在本研究中,首先从中国大鲵中克隆并鉴定了两个IL-18基因（AdIL-18A和AdIL-18B）和四个转录物（AdIL-18Al、AdIL-18A2、AdIL-18B1 和 AdIL-18B2）。据我们所知,这是物种中存在多个IL-18基因拷贝或两个以上转录本的首次报道。AdIL-18A1、AdIL-18A2、AdIL-18B1和AdIL-18B2的完整开放阅读框长度分别为588bp、603bp、591bp和606bp。推定的AdIL-18蛋白具有典型的IL-1结构域,系统进化分析表明AdIL-18s与其他脊椎动物IL-18聚在一起。分别在嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌和模拟病毒Poly（I:C）的刺激下研究了AdIL-18s的表达情况,结果表明AdIL-18s参与了中国大鲵针对细菌和病毒感染的免疫应答。此外,在AdIL-18A1/A2沉默的中国大鲵病原菌刺激的外周血白细胞中,两种NF-κB（P100和P105）和四种促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ）的表达水平受到抑制;当用重组AdIL-18A1或AdIL-18A2蛋白处理中国大鲵外周血白细胞时,两种NF-κB（P100和P105）和四种促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ）的转录水平被明显诱导,由此表明AdIL-18参与诱发NF-κB信号传导和促炎反应。上述结果可能为两栖动物甚至脊椎动物中IL-18的起源或进化提供新的见解。
张爱凤[10]（2019）在《MicroRNA-138在子宫内膜异位症中的作用和机制研究》文中研究表明研究背景:子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）是育龄期女性中常见的妇科疾病,以疼痛、不孕、月经异常、盆腔包块为主要临床表现,严重影响女性健康和生活质量。其特征是病变广泛,形态多样;极具浸润性,可形成广泛而严重的粘连;具有激素依赖性,易于复发。近年来发病率呈明显上升趋势,在临床治疗上具有一定难度。在子宫内膜异位症的发病和疾病进展过程中,涉及黏附、入侵、增殖、侵袭、血管生成等诸多方面调控异常,发病机制目前尚不明确。核转录因子-kappaB（nuclear factor-KB,NF-κB）是一种重要的核转录因子,存在于多种细胞类型中,广泛参与多项生理和病理过程的基因调控,包括炎症、免疫、细胞增殖、凋亡和胚胎发生等。在子宫内膜异位症中,有研究人员发现NF-κB介导的信号通路可以诱导子宫内膜异位症的发生。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是血小板衍生的生长因子,在内异位症病灶的形成过程中发挥重要作用,参与子宫内膜细胞异位定植过程中的血管形成,为子宫内膜细胞提供营养支持。MicroRNAs（miRNAs）是一类小的内源性RNA分子,长度为22-23个核苷酸且具有重要的调节功能,近年来已在真核生物中鉴定出多种发挥重要功能miRNAs,它们广泛参与细胞的增殖分化、细胞凋亡、器官发育、代谢等生理过程,同时与肿瘤细胞的生物学行为及特性密切相关。研究表明,miRNAs在子宫内膜异位症中扮演着重要的角色,研究子宫内膜异位症发生发展过程中具有重要功能的miRNA可以为子宫内膜异位症的诊断、治疗和预后提供有效的帮助。miR-138是近年来新发现miRNA家族成员,在多种不同类型的肿瘤组织中呈现低表达,具有肿瘤调控作用,但目前其在子宫内膜异位症中的研究甚少。在本研究中,我们将从子宫内膜异位症的动物模型出发,利用miRNA基因芯片筛查子宫内膜异位症中异常表达的miRNA,并通过qRT-PCR的方法证实miR-138在子宫内膜异位症中表达情况。在生物学功能方面,我们利用细胞模型研究miR-138在子宫内膜异位症中对细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。在具体作用机制方面,我们通过分子生物学实验探讨miR-138在子宫内膜异位症中可能的潜在机制。具体研究如下:第一部分 MicroRNA-138在子宫内膜异位症中的表达变化研究目的:研究miR-138在子宫内膜异位症中的表达情况,检测子宫内膜异位症动物模型中炎症相关细胞的变化。研究对象:16只重症联合免疫缺陷SCID小鼠（20±2g;雌性;8-9周龄）在标准条件下（22-24℃）以12小时的光/暗循环常规饲养。通过随机化数字表的方式进行随机分组,分为实验组（Ems组）和对照组,每组8只重症联合免疫缺陷小鼠。研究方法:通过构建子宫内膜异位症动物模型,利用miRNA基因芯片的方法高通量地检测子宫内膜异位症中差异表达的miRNA,并利用实时定量 PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）方法验证 miR-138 在子宫内膜异位症中的表达情况。利用流式细胞仪检测子宫内膜异位症动物模型腹腔液中CD11b阳性细胞的数量。研究结果:1.采用miRNA基因芯片方法高通量检测了子宫内膜异位症模型小鼠中miRNAs的表达情况,发现miR-138在子宫内膜异位症组织中的表达显着低于对照组织中的表达（P<0.05）。2.选取 miR-138、miR-231、miR-177、miR-189、miR-241 以及 miR-412六种miRNAs进行qRT-PCR检测验证,与芯片检测结果一致,miR-13 8在子宫内膜异位症组织中的表达明显低于对照组织中的表达,差异具有统计学差异（P<0.05）。而 miR-231、miR-1 77、miR-1 89、miR-241 以及 miR-412在子宫内膜异位症组织以及对照组织中的表达无明显差异（P>0.05）。3.与对照组相比,子宫内膜异位症小鼠腹腔液中CD11b阳性细胞数量显着升高（P<0.05）,这说明腹腔液中巨噬细胞增多。研究结论:MiR-138在子宫内膜异位症组织中低水平表达,在子宫内膜异位症的发生发展中可能具有调节作用,并且miR-138在子宫内膜异位症中的生物学作用可能与免疫炎症反应相关。第二部分 MicroRNA-138对子宫内膜细胞生物学行为及炎症反应的影响研究目的:探索miR-138在子宫内膜异位症中的细胞生物学功能以及与炎症相关因子表达的关系。研究对象:子宫内膜干细胞（Endometrial stem cells,ESCs）、人白血病单核细胞系THP-1。研究方法:采用子宫内膜干细胞ESCs和THP-1细胞共培养的方法构建子宫内膜异位症的体外细胞模型,模拟子宫内膜异位症的细胞生存环境及状态。登录 miRBase（http://www.mirbase.org/）miRNA 数据库,查询得到miR-138成熟体的序列全长,设计合成miR-138 mimics过表达模拟物和anti-miR-138抑制剂,通过细胞转染的方法构建miR-138过表达细胞模型和miR-138干扰细胞模型。利用MTT实验、LDH实验、细胞凋亡实验探索miR-138过表达或干扰对子宫内膜异位症细胞增殖、细胞毒性以及凋亡能力的影响;利用酶联免疫吸附测定实验（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）探索miR-138过表达或干扰对子宫内膜异位症细胞炎症相关因子表达的影响。研究结果:1.转染miR-138 mimics后,miR-138在细胞中的相对表达量显着上调（P<0.05）,可以成功构建miR-1 38过表达的子宫内膜细胞模型;转染anti-miR-138后,miR-138在细胞中的相对表达量显着下调（P<0.05）,可成功构建miR-138低表达的子宫内膜细胞模型。2.miR-138的上调抑制了子宫内膜细胞的增殖并提高了 LDH活性,且均具有统计学差异（P<0.05）,miR-138的上调可明显促进子宫内膜细胞的凋亡,与凋亡相匹配,miR-138的上调可明显提高caspase-3和caspase-9的表达水平,且均具有统计学差异（P<0.05）。3.miR-138的下调促进了子宫内膜细胞的增殖并抑制了 LDH活性,且均具有统计学差异（P<0.05）,miR-138的下调可明显抑制子宫内膜细胞的凋亡,与此同时,miR-138的下调可明显降低caspase-3和caspase-9的表达水平,且均具有统计学差异（P<0.05）。4.miR-138上调可显着抑制子宫内膜异位症细胞模型中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6 以及 IL-18 的表达（P<0.05）;反之,miR-138 的下调则能够促进子宫内膜异位症细胞模型中炎症反应因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达（P<0.05）。研究结论:MiR-138可以显着抑制子宫内膜细胞的增殖,促进子宫内膜细胞的凋亡;并可调控子宫内膜异位症细胞模型中炎症相关因子的表达。由此推断,miR-138在子宫内膜异位症中对细胞增殖、凋亡及免疫炎症反应等具有重要调节作用。第三部分 MicroRNA-138对子宫内膜细胞生物学行为及炎症反应影响的分子调控机制研究目的:探索miR-138在子宫内膜异位症中的下游靶基因,研究miR-138在子宫内膜异位症细胞模型中发挥细胞功能可能的分子作用机制。研究对象:由子宫内膜干细胞（Endometrial stem cells,ESCs）和人白血病单核细胞系THP-1共同培养构建的子宫内膜异位症体外细胞模型。研究方法:利用生物信息学预测miR-138下游可能的靶基因。细胞免疫荧光实验验证miR-138对靶基因蛋白表达的调控作用。通过细胞转染的方法构建miR-138过表达细胞模型和miR-138干扰细胞模型。利用免疫印迹的方法（Western Blot）检测miR-138对Bax,NF-κB和VEGF蛋白表达的影响。利用NF-κB抑制剂及表达载体对NF-κB蛋白功能进行恢复,观察NF-κB对miR-138的回复作用。利用VEGF抑制剂及表达载体对VEGF蛋白功能进行恢复,观察VEGF对miR-138的回复作用。研究结果:1.生物信息学预测的方法发现miR-138可以靶向作用于p65基因mRNA的3’-非翻译区。细胞免疫荧光实验显示miR-138表达的上调可以明显抑制THP-1细胞中NF-κB P65蛋白亚型的表达。2.上调miR-138可以抑制NF-κB信号通路中Bax,NF-κB和VEGF蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）;下调miR-138的表达可以促进NF-κB信号通路中Bax,NF-κB和VEGF蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.单独上调miR-138可显着抑制TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达,抑制子宫内膜细胞的增殖,促进细胞凋亡,且均具有统计学差异（P<0.05）。在上调miR-13 8表达的同时过表达NF-κB蛋白或VEGF蛋白,与单独上调miR-138相比,Bax、NF-κB和VEGF蛋白的表达抑制作用部分得到解除,TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达显着上调,细胞的增殖和凋亡也得到一定程度的恢复,且均具有统计学差异（P<0.05）。4.单独下调miR-138可以显着促进TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18的表达,促进子宫内膜细胞的增殖,抑制细胞凋亡,且均具有统计学差异（P<0.05）;下调miR-138表达的同时加入NF-κB抑制剂或VEGF抑制剂处理细胞,与单独下调miR-138相比,TNF-α IL-1β、IL-6以及IL-18的表达显着降低,细胞的增殖和凋亡得到一定程度的恢复,且均具有统计学差异（P<0.05）。研究结论:miR-138可以靶向作用于p65基因mRNA的3’-非翻译区,从而负向调控NF-κB P65蛋白亚型的表达。在子宫内膜异位症中miR-138可以通过NF-κB/VEGF信号通路对细胞的增殖、凋亡以及炎症反应产生作用。因此,miR-138在子宫内膜异位症中的发生发展具有重要调控作用。
二、IL-18生物学作用研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IL-18生物学作用研究进展（论文提纲范文）
（1）基于线粒体自噬研究小建中汤抑制NLRP3炎症小体活化治疗抑郁症的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 研究思路 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.中医郁病理论的源流与发展 |
| 1.1 秦汉时期 |
| 1.1.1 《黄帝内经》 |
| 1.1.2 《伤寒杂病论》 |
| 1.2 魏晋南北朝隋唐时期 |
| 1.3 宋金元时期 |
| 1.4 明清时期 |
| 1.5 近现代 |
| 2.抑郁症的病因病机 |
| 2.1 病因病机 |
| 2.1.1 五脏精气虚弱 |
| 2.1.2 体质偏颇 |
| 2.1.3 情志刺激 |
| 2.1.4 劳神过度 |
| 2.2 各家论点 |
| 2.2.1 肝气郁结 |
| 2.2.2 肺气郁结 |
| 2.2.3 脾虚 |
| 2.2.4 肝郁脾虚 |
| 2.2.5 胆失决断 |
| 2.2.6 肾阳虚 |
| 2.2.7 肝阳气虚 |
| 2.2.8 肾精不足 |
| 2.2.9 肝肾不足 |
| 2.2.10 “脑神”不用 |
| 3.抑郁症的发病机制 |
| 3.1 单胺类神经递质 |
| 3.2 下丘脑-垂体-肾上腺轴 |
| 3.3 神经可塑性 |
| 3.4 谷氨酸能失衡 |
| 3.5 线粒体假说 |
| 3.6 神经炎症反应 |
| 3.7 Micro RNA |
| 3.8 肠道微生态 |
| 4.本研究立题依据 |
| 4.1 抑郁症与神经炎症反应密切相关 |
| 4.2 NLRP3炎症小体活化是抑郁症的重要机制之一 |
| 4.3 线粒体自噬是调控NLRP3炎症小体的关键 |
| 4.4 抑郁症发病机制的线粒体自噬假说 |
| 4.5 抑郁症与脾虚密切相关 |
| 4.5.1 脾之生理为神志活动提供基础 |
| 4.5.2 抑郁症与脾虚 |
| 4.5.3 线粒体自噬水平低下可能为脾虚气化不足的生物学基础 |
| 4.6 肝脾不和是抑郁症的重要病机 |
| 4.6.1 脾虚肝郁 |
| 4.6.2 脾虚肝虚 |
| 4.7 小建中汤的选方依据 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 线粒体自噬对抑郁模型大鼠海马NLRP3炎症小体的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品及试剂 |
| 1.2.1 药品 |
| 1.2.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖水训练和蔗糖偏好率测试 |
| 2.2 CUMS大鼠抑郁模型制备 |
| 2.3 实验分组及给药 |
| 2.4 标本采集及制作 |
| 2.5 指标检测方法 |
| 2.5.1 行为学检测 |
| 2.5.2 ELISA检测 |
| 2.5.3 RT-PCR检测 |
| 2.5.4 Western-blot检测 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 行为学变化 |
| 3.1.1 体重变化 |
| 3.1.2 SPT变化 |
| 3.1.3 FST不动时间变化 |
| 3.2 MtDNA拷贝数变化 |
| 3.3 线粒体自噬相关指标含量的变化 |
| 3.3.1 线粒体自噬相关mRNA表达变化 |
| 3.3.2 线粒体自噬相关蛋白变化 |
| 3.4 NLRP3炎症小体相关指标变化 |
| 3.4.1 NLRP3 炎症小体m RNA表达变化 |
| 3.4.2 炎症因子mRNA表达变化 |
| 3.4.3 NLRP3炎症小体以及下游炎症因子蛋白水平变化 |
| 3.5 血清炎症因子变化 |
| 3.6 血清DA和5-HT水平变化 |
| 实验二 小建中汤抗抑郁研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品及试剂 |
| 1.2.1 药品 |
| 1.2.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖水训练和蔗糖偏好率测试 |
| 2.2 CUMS大鼠抑郁模型制备 |
| 2.3 实验分组及给药 |
| 2.4 标本采集及制作 |
| 2.5 指标检测方法 |
| 2.5.1 行为学检测 |
| 2.5.2 ELISA检测 |
| 2.5.3 SOD和 MDA检测 |
| 2.5.4 尼氏染色 |
| 2.5.5 透射电镜观察海马CA3区细胞超微结构 |
| 2.5.6 RT-PCR检测 |
| 2.5.7 Western-blot检测 |
| 2.5.8 免疫荧光 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 行为学变化 |
| 3.1.1 体重变化 |
| 3.1.2 SPT基线 |
| 3.1.3 OFT变化 |
| 3.1.4 FST变化 |
| 3.2 MtDNA拷贝数变化 |
| 3.3 海马区神经元形态学变化(附图1.1) |
| 3.4 海马区神经元超微结构变化(附图1.2) |
| 3.5 血清SOD和 MDA变化 |
| 3.6 线粒体自噬相关指标变化 |
| 3.6.1 线粒体自噬相关mRNA表达变化 |
| 3.6.2 线粒体自噬相关蛋白表达变化 |
| 3.7 NF-κB信号通路相关指标变化 |
| 3.7.1 NF-κB信号通路相关m RNA表达变化 |
| 3.7.2 NF-κB信号通路相关蛋白表达变化 |
| 3.8 NLRP3炎症小体相关指标变化 |
| 3.8.1 NLRP3 炎症小体相关m RNA表达变化 |
| 3.8.2 NLRP3炎症小体相关蛋白表达变化 |
| 3.9 血清炎症因子变化 |
| 3.10 血清DA、5-HT变化 |
| 实验三 小建中汤介导线粒体自噬抑制NLRP3炎症小体活化研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品及试剂 |
| 1.2.1 药品 |
| 1.2.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖水训练和蔗糖偏好率测试 |
| 2.2 CUMS大鼠抑郁模型制备 |
| 2.3 实验分组及给药 |
| 2.4 标本采集及制作 |
| 2.5 指标检测方法 |
| 2.5.1 行为学检测 |
| 2.5.2 RT-PCR检测 |
| 2.5.3 Western-blot检测 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 行为学变化 |
| 3.1.1 体重变化 |
| 3.1.2 FST变化 |
| 3.2 线粒体自噬相关指标变化 |
| 3.2.1 线粒体自噬相关mRNA表达变化 |
| 3.2.2 线粒体自噬相关蛋白表达变化 |
| 3.3 NLRP3炎症小体相关指标变化 |
| 3.3.1 NLRP3 炎症小体相关m RNA表达变化 |
| 3.3.2 NLRP3炎症小体相关蛋白表达变化 |
| 讨论 |
| 1.CUMS模型的选择 |
| 2.对照药氟西汀和激动剂雷帕霉素的选择 |
| 3.上调线粒体自噬对CUMS大鼠的作用 |
| 3.1 RAPA上调了CUMS大鼠线粒体自噬水平 |
| 3.2 上调线粒体自噬对CUMS大鼠行为学影响 |
| 3.3 上调线粒体自噬对CUMS大鼠线粒体DNA拷贝数的影响 |
| 3.4 上调线粒体自噬对CUMS大鼠NLRP3 炎症小体及炎症因子的影响. |
| 3.5 上调线粒体自噬对CUMS大鼠5-HT和 DA的影响 |
| 4.小建中汤治疗抑郁症的机制探讨 |
| 4.1 小建中汤对CUMS大鼠行为学影响 |
| 4.2 小建中汤对CUMS大鼠海马神经元形态的影响 |
| 4.2.1 尼氏染色 |
| 4.2.2 超微结构 |
| 4.3 小建中汤对CUMS大鼠线粒体自噬的影响 |
| 4.3.1 小建中汤对CUMS大鼠海马mt DNA拷贝数影响 |
| 4.3.2 小建中汤对CUMS大鼠血清SOD和 MDA的影响 |
| 4.3.3 小建中汤上调CUMS大鼠海马线粒体自噬水平 |
| 4.4 小建中汤对CUMS大鼠海马炎症的影响 |
| 4.4.1 小建中汤抑制CUMS大鼠TLR4/NF-κB信号通路活化 |
| 4.4.2 小建中汤抑制CUMS大鼠NLRP3 炎症小体通路活化 |
| 4.5 小建中汤对CUMS大鼠5-HT和 DA的影响 |
| 4.6 小建中汤通过介导线粒体自噬抑制NLRP3炎症小体活化 |
| 5.小建中汤健脾调肝治疗抑郁症作用探讨 |
| 5.1 小建中汤温健脾气、调摄阴阳 |
| 5.2 小建中汤生发肝气 |
| 5.3 小建中汤健脾调肝的生物学基础 |
| 结论 |
| 特色与创新性 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 附图 |
| 1.1 实验二海马尼氏染色(200×) |
| 1.2 实验二海马超微结构 |
| 1.3 实验二NLRP3炎症小体通路蛋白表达(免疫荧光) |
| 2 动物实验伦理审查意见表 |
| 3 综述 NF-κB/NLRP3 信号通路在抑郁症及中药作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（2）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（3）副猪嗜血杆菌外膜囊泡蛋白质组分分析、致炎作用及lpxM基因缺失株构建的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写表 |
| 第一章 :绪论 |
| 1.1 副猪嗜血杆菌 |
| 1.1.1 副猪嗜血杆菌致病机制研究进展 |
| 1.1.2 副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展 |
| 1.2 外膜囊泡的研究进展 |
| 1.2.1 外膜囊泡的组分 |
| 1.2.2 外膜囊泡的功能 |
| 1.2.3 外膜囊泡对宿主细胞致炎作用研究 |
| 1.3 脂多糖的研究进展 |
| 1.3.1 脂多糖的合成 |
| 1.3.2 脂多糖结构对细菌毒力的影响 |
| 1.3.3 lpxM基因的研究进展 |
| 1.4 本课题的研究意义及主要内容 |
| 第二章 副猪嗜血杆菌外膜囊泡的提取、纯化及蛋白质组分分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和仪器设备 |
| 2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2 实验仪器和设备 |
| 2.2.3 实验试剂耗材 |
| 2.2.4 常用试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验菌株的鉴定及分型 |
| 2.3.2 OMVs的分离与纯化 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析OMVs蛋白质组成 |
| 2.3.4 透视电镜观察OMVs结构及其粒径测定 |
| 2.3.5 BCA法测定OMVs蛋白质浓度 |
| 2.3.6 LC-MS/MS联用分析OMVs蛋白质组成 |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HPS的鉴定及血清分型结果 |
| 2.4.2 OMVs的 SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果 |
| 2.4.3 OMVs的电镜观察结构及粒径大小分布 |
| 2.4.4 OMVs的蛋白质浓度测定结果 |
| 2.4.5 OMVs的蛋白质组分分析结果 |
| 2.5 结果讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 :副猪嗜血杆菌外膜囊泡对RAW264.7细胞致炎作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和仪器设备 |
| 3.2.1 实验菌株及细胞 |
| 3.2.2 实验仪器和设备 |
| 3.2.3 实验试剂耗材 |
| 3.2.4 常用试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 副猪嗜血杆菌外膜囊泡的提取纯化 |
| 3.3.2 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 3.3.3 OMVs对细胞的毒力作用 |
| 3.3.4 OMVs对细胞的致炎作用 |
| 3.3.5 不同剂量的OMVs对细胞致炎作用的影响 |
| 3.3.6 RAW264.7 细胞caspase-11 基因的沉默 |
| 3.3.7 Caspase-11 沉默后对OMVs致炎作用的影响 |
| 3.3.8 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HPS和 OMVs对细胞毒力比较 |
| 3.4.2 HPS和 OMVs刺激细胞炎性小体m RNA转录水平变化 |
| 3.4.3 HPS和 OMVs刺激细胞不同时间分泌IL-1β和 IL-18 的变化 |
| 3.4.4 不用剂量OMVs刺激细胞分泌IL-1β和 IL-18 的变化 |
| 3.4.5 Caspase-11 基因沉默效果 |
| 3.4.6 Caspase-11 沉默对OMVs介导细胞致炎作用的影响 |
| 3.5 结果讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 :副猪嗜血杆菌lpxM基因缺失株的构建及部分生物学特性分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和仪器设备 |
| 4.2.1 实验菌株、质粒和细胞 |
| 4.2.2 实验仪器和设备 |
| 4.2.3 实验试剂耗材 |
| 4.2.4 常用试剂的配制 |
| 4.2.5 引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 HPS菌株的培养及基因组DNA的提取 |
| 4.3.2 HPS的 lpx M基因缺失株的构建 |
| 4.3.3 缺失株与野生株生长情况比较 |
| 4.3.4 缺失株与野生株生物被膜形成能力比较 |
| 4.3.5 缺失株与野生株抗血清杀菌能力比较 |
| 4.3.6 缺失株与野生株对RAW264.7细胞毒力作用比较 |
| 4.3.7 缺失株和野生株对抗生素敏感性比较 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 lpxM基因缺失株的鉴定 |
| 4.4.2 lpx M基因缺失对HPS生长情况的影响 |
| 4.4.3 lpx M基因缺失对HPS生物被膜形成能力的影响 |
| 4.4.4 lpx M基因缺失对HPS血清抗性的影响 |
| 4.4.5 lpx M基因缺失对RAW264.7 细胞致毒性的影响 |
| 4.4.6 lpx M基因缺失对HPS抗生素敏感性的影响 |
| 4.5 结果讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）视神经脊髓炎谱系疾病患者血清IL-18及IL-37的水平变化及临床意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 IL-18及IL-37的研究进展及其在相关疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（5）IL-33在溃疡性结肠炎中的表达及相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 1 研究对象和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白介素-1家族与炎症性肠病关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在校期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（6）基于iTRAQ技术对CNV的蛋白组学研究及TAB1对CNV的保护作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| References |
| 第一部分 基于iTRAQ标记技术的大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体的蛋白组学研究 |
| 第一节 基于iTRAQ技术的大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体的蛋白组学检测 |
| 1.材料和方法 |
| 2.主要实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| References |
| 第二节 Western Blotting法对候选差异蛋白的验证 |
| 1.材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| References |
| 第二部分 TAB1 过表达对CNV大鼠的血管新生的抑制作用及免疫保护作用 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 成功进行视网膜下腔注射AAV-TAB1 过表达载体 |
| 2.2 Western Blotting法检测各个时间点TAB1 的过表达情况 |
| 2.3 RPE-脉络膜-巩膜铺片测量CNV面积 |
| 2.4 各组大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体IL-18表达情况 |
| 2.5 各组大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体IL-6表达情况 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| References |
| 第三部分 TAB1 过表达对大鼠RPE细胞的促进增殖作用及免疫保护作用及其潜在机制 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 提取和培养BN大鼠RPE原代细胞 |
| 2.2 检测TAB1 腺病毒过表达载体在大鼠RPE细胞中的转染效率 |
| 2.3 检测各组细胞上清液IL-18、IL-6的含量 |
| 2.4 CCK-8法检测各组细胞的增殖情况 |
| 2.5 Nf-kB信号通路分子p52及RelB在各组细胞中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| References |
| 综述 |
| References |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果和发表的学术论文 |
（7）长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌中作用机制的研究 |
| 一 前言 |
| 二 材料与方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 附图表 |
| 七 参考文献 |
| 第二部分 长链非编码RNA SNHG3通过NLRP3影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后 |
| 一 前言 |
| 二 材料与方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 附表图 |
| 七 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（8）骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 急性髓性白血病骨髓微环块中神经破坏与Th免疫失衡的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 交感神经递质对Th亚群及急性髄性白血病细胞作用的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NLRP3炎性小体相关基因单核苷酸多态性在急性淋巴细胞白血病中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（9）中国大鲵白介素18鉴别与免疫功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 中国大鲵的研究进展 |
| 1.1.1 中国大鲵的地理分布 |
| 1.1.2 中国大鲵的人工养殖现状 |
| 1.1.3 中国大鲵主要病害 |
| 1.2 白介素18的研究进展 |
| 1.2.1 白介素18的分子结构与形成 |
| 1.2.2 白介素18的信号转导途径 |
| 1.2.3 白介素18的生物学功能 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 试验材料及方法 |
| 2.1 试验材料及仪器设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要化学试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验技术路线 |
| 2.2.2 目的片段获得 |
| 2.2.3 基因组DNA提取 |
| 2.2.4 基因序列分析 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 中国大鲵外周血白细胞分离培养 |
| 2.2.7 AdIL-18重组蛋白表达与纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白功能验证 |
| 2.2.9 siRNA干扰试验 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 AdIL-18基因克隆及序列分析 |
| 3.1.1 基因克隆与序列分析 |
| 3.1.2 多序列比较分析 |
| 3.1.3 进化树分析 |
| 3.2 AdIL-18基因表达分析 |
| 3.2.1 组织表达分析 |
| 3.2.2 不同胁迫下的组织表达 |
| 3.3 AdIL-18重组蛋白诱导表达及活性检测 |
| 3.3.1 重组蛋白表达与纯化 |
| 3.3.2 浓度刺激试验 |
| 3.3.3 时间刺激试验 |
| 3.4 基因干扰 |
| 3.4.1 AdIL-18s基因干扰效果 |
| 3.4.2 AdIL-18s基因沉默后病原体刺激AdIL-18s下游免疫基因的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 已发表的相关论文 |
（10）MicroRNA-138在子宫内膜异位症中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 MICRORNA-138在子宫内膜异位症中的表达变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 MICRORNA-138对子宫内膜细胞生物学行为及炎症反应的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 MICRORNA-138对子宫内膜细胞生物学行为及炎症反应影响的分子调 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
四、IL-18生物学作用研究进展（论文参考文献）
- [1]基于线粒体自噬研究小建中汤抑制NLRP3炎症小体活化治疗抑郁症的机制[D]. 王萌. 成都中医药大学, 2020(02)
- [2]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [3]副猪嗜血杆菌外膜囊泡蛋白质组分分析、致炎作用及lpxM基因缺失株构建的研究[D]. 杨君. 华南理工大学, 2020(02)
- [4]视神经脊髓炎谱系疾病患者血清IL-18及IL-37的水平变化及临床意义[D]. 高鑫鑫. 郑州大学, 2020(02)
- [5]IL-33在溃疡性结肠炎中的表达及相关性研究[D]. 周静. 郑州大学, 2020(02)
- [6]基于iTRAQ技术对CNV的蛋白组学研究及TAB1对CNV的保护作用[D]. 蒋少秋. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究[D]. 赵倩. 山东大学, 2020(09)
- [8]骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究[D]. 张琛. 山东大学, 2020(08)
- [9]中国大鲵白介素18鉴别与免疫功能研究[D]. 王兰芝. 浙江大学, 2020(01)
- [10]MicroRNA-138在子宫内膜异位症中的作用和机制研究[D]. 张爱凤. 山东大学, 2019(02)