一、人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达（论文文献综述）
林婷[1]（2020）在《人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究》文中研究说明单链抗体（scFv:the single-chain variable fragment of antibody）具有分子量小、半衰期短、免疫原性低、结构稳定等特点,在治疗与诊断、实验研究中被广泛应用。然而,scFv需从构建好的抗体库中筛选得到。scFv的生产则需要外源蛋白表达系统的参与。基于此,本人从以下两方面开展研究工作:（1）构建大库容及高多样性的scFv抗体库;（2）利用毕赤酵母表达系统高水平表达scFv。为了构建大库容及高多样性的scFv抗体库,我们收集了120份人体外周血,分离淋巴细胞并提取其RNA,扩增了抗体重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）片段的编码序列。通过多肽链（Linker）序列将重链与轻链成功拼接成scFv片段,scFv片段插入p CANTAB 5E噬菌粒载体后,电转入TG1大肠杆菌中复制,最后利用辅助噬菌体M13KO7感染TG1,形成噬菌体表面展示scFv抗体库。最终获得的人源scFv抗体库的库容为:9.10×105,噬菌体滴定后的库容为:2.15×109 pfu。对阳性TG1进行基因测序得到的结果与理论相符,序列中含有SfiⅠ与NotⅠ酶切位点、Linker（G4S）3、g3信号肽及E标签这5个元素,且阅读框正确。为了提高scFv在毕赤酵母中的蛋白表达量,探究了密码子对上下文序列对scFv表达量的影响。我们根据毕赤酵母密码子对使用情况设计开发了基于密码子对的优化软件。为了确定密码子对上下文序列在毕赤酵母中是否影响scFv的表达,本研究利用了两个蛋白（ADAM17和MT1-MMP）的scFv进行验证。通过开发的密码子对优化软件分别设计了一条得分最高与一条得分最低的序列,得分最低的ADAM17scFv序列没有检测到表达,得分最低的MT1-MMP scFv序列只检测到微弱表达,而ADAM17和MT1-MMP得分最高的scFv序列均有强烈的表达,表明在毕赤酵母中密码子对上下文序列严重影响scFv的表达。目前,在毕赤酵母中对外源蛋白表达序列的优化均基于密码子使用频率。为了比较密码子使用频率和密码子对上下文对scFv序列表达量的影响,设计合成了基于传统密码子使用频率的ADAM17和MT1-MMP scFv优化序列。表达结果显示,基于密码子对上下文进行优化的scFv序列表达水平显着高于基于传统密码子使用频率优化的序列,ADAM17 scFv表达量高出5.37倍,MT1-MMP scFv表达量高出7.37倍。结果表明,在毕赤酵母中表达scFv,密码子对上下文优化方案优越于密码子使用频率优化方案。本研究构建了不可复制的人源scFv抗体库,扩大了已有的scFv抗体库的库容,加大了获得抗新型抗原的人源性scFv的可能性,为后续开发新型人源scFv临床药物奠定了基础;密码子对优化软件的开发以及该策略的确定对于毕赤酵母表达系统具有重大的意义,提高了scFv序列在毕赤酵母中的表达产量,使scFv更容易大量获得,对该领域研究的发展和应用具有一定的推动作用。
周兵[2]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中研究说明感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
欧阳清[3]（2017）在《单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定》文中研究说明HER2(p185erb B2/neu)是EGFR家族的成员,在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞中高表达,是肿瘤恶性行为以及不良预后的标志。靶向治疗是HER2阳性肿瘤的重要治疗手段,主要包括靶向HER2的单克隆抗体、单链抗体偶联效应分子等策略。HER2治疗性单克隆抗体能够有效抑制肿瘤细胞增殖、延长生存期,是HER2阳性进展期乳腺癌及胃癌的一线疗法。这些HER2靶向的治疗性抗体都由鼠源单克隆抗体经人源化改造而来,长期应用未观察到严重的免疫原性相关副作用。HER2单链抗体来源于单克隆抗体,常与生物效应分子融合表达或者表达于T细胞表面（CAR-T）靶向杀伤肿瘤细胞,具有广泛的应用价值。对鼠源单链抗体的人源化改造,是以其为基础的肿瘤靶向杀伤策略走向临床的重要一环。本研究以本组前期系列验证的、靶向效果明确的鼠源单链抗体e23sFv为模板,拟解决两个关键问题:一是在探索单链抗体人源化的技术改进;二是评价该人源化单链抗体用于肿瘤靶向治疗的有效性。针对第一个关键问题,本研究进行了两方面新的摸索。首先,在传统的鼠源互补决定区（CDR）—人源框架区（FR）移植策略的基础上,拓宽了人源化改造FR模板的选择范围,既选了与e23sFv同源性最高的全人抗体特异序列,也选了与e23sFv同源性最高的全人抗体亚类的通用序列,并将二者对比,为抗体人源化的FR模板选择提供线索。其次,针对所选的人源抗体亚类通用序列,将FR关键残基突变回鼠源亲本,以维持抗原构象、避免丧失亲和力。传统的突变策略有两种:一是定点突变,前提是抗体结构信息必须明确;二是随机突变,虽然可提高亲和力的多样性,但筛选工作量大。我们尝试将这二者相结合,选择13个关键氨基酸位点分别设计定点突变引物,同时又通过设计同位点的不突变对照、引物的随机组合分组等方法,增加这13个位点随机突变与组合的几率,最终结合噬菌体抗体展示技术,建立了库容为213的突变抗体库,经4轮亲和力淘选和噬菌体ELISA筛选,获得4株高亲和力的人源化单链抗体。基于上述构建和筛选,本研究得到2株特异序列来源的人源化单链抗体SGF1、SGF2,4株通用序列来源的人源化单链抗体P1h2、P1h3、P2h2、P2h5。通过同源建模的方法,模拟了e23sFv、SGF1、P1h2的结构并与HER2分子进行对接,预测人源化单链抗体的识别表位位于HER2胞外段第IV结构域,且SGF1主链碳原子构象比P1h2更接近e23sFv,而P1h2与HER2相互作用能比SGF1更强。经过原核蛋白表达纯化、包涵体复性,获得蛋白纯度大于90%,进行功能评价:（1）亲和力:通过表面等离子共振实验（SPR）观察人源化单链抗体对人重组HER2的亲和力,结果显示P1h2、P1h3、SGF1比e23sFv提高约10倍,P2h2、P2h5则与e23sFv相当;细胞ELISA观察它们对细胞表面天然表达HER2的亲和力,结果与SPR实验一致。（2）识别表位:荧光素标记人源化单链抗体,竞争性流式细胞术观察到,人源化单链抗体的HER2识别表位与e23sFv相同。（3）内化活性:激光共聚焦显微镜观察结果表明,荧光素标记的人源化单链抗体P1h2、P1h3、SGF1能够特异性结合并内化进入HER2阳性细胞;P2h2、P2h5、SGF2则不能内化。（4）免疫原性:ELISPOT及抗体偶联磁珠技术检测人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平,结果表明,人源化单链抗体刺激PBMCs产生IFN-γ、TNF-α细胞因子的水平较鼠源单链抗体大幅下降,减少到鼠源单链抗体刺激水平的1/20。值得注意的是,特异序列来源的SGF1比通用序列来源的4株人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平更高,提示其免疫原性相对较强。综上,我们从6株不同序列来源的人源化单链抗体中,优选出两株免疫原性低、亲和力高并且具有内化活性的单链抗体P1h2和P1h3,进行后续功能研究。针对第二个关键问题,我们探索了P1h2和P1h3用于两种靶向治疗策略的有效性:一是基于补体依赖的细胞毒作用（CDC）的间接肿瘤杀伤;二是基于本组前期建立成熟的免疫促凋亡策略的直接肿瘤杀伤。（1）CDC策略:在人源化单链抗体的C端融合表达人IgG1Fc,构建获得系列scFv-Fc融合蛋白,进行真核系统表达纯化。流式细胞术和体外CDC实验结果表明,P1h2-Fc、P1h3-Fc融合蛋白均能与HER2阳性肿瘤细胞特异性结合,间接杀伤肿瘤细胞。HER2高表达的乳腺癌细胞及中度表达的肺癌细胞中,P1h2-Fc、P1h3-Fc的杀伤作用均强于e23sFv-Fc。（2）免疫促凋亡策略:将人源化单链抗体构建替换入课题组前期建立的免疫促凋亡分子,获得scFv-Fdt-tBid,进行原核系统可溶表达纯化。流式细胞术和细胞杀伤实验观察到,P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid能够特异性结合HER2阳性肿瘤细胞,有效抑制细胞增殖;在HER2高表达的乳腺癌细胞、胃癌细胞、中度表达的肺癌细胞中,二者对肿瘤细胞的增殖抑制与e23sFv-Fdt-tBid相当。体内实验分别采用NOD-SCID鼠的三种不同荷瘤模型（乳腺癌原位瘤、胃癌原位瘤、肺癌皮下移植瘤）,明确观察到人源化改构免疫促凋亡分子的体内抗肿瘤活性。在乳腺癌和胃癌模型中,P1h2-Fdt-t Bid、P1h3-Fdt-tBid的肿瘤抑制作用强于e23sFv-Fdt-tBid;而肺癌模型中,二者的抗肿瘤作用与e23sFv-Fdt-tBid相当。综上所述,本研究通过优化CDR移植策略,针对抗HER2鼠源单链抗体e23sFv进行人源化改构,成功筛选获得免疫原性降低、亲和力提高并具有内化活性的两株人源化单链抗体P1h2、P1h3,并通过体内外实验验证其用于CDC策略和免疫促凋亡策略的有效性,为单链抗体为导向的融合蛋白的人源化改造、安全性评价提供了实验依据。
谭成成[4]（2016）在《2种不同分泌信号对犬干扰素在毕赤酵母中分泌表达的影响》文中指出干扰素（Interferon IFN）不仅具有抗病毒作用,它还具有抗肿瘤和免疫调节活性,并以多种不同途径影响细胞代谢、生长和分化。IFN分为Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型。而Ⅰ型干扰素包括的IFN-α至少有20种以上的亚型,它们已被用于治疗病毒性传染病和某些代谢性疾病或变态反应性疾病。毕赤酵母表达系统已被用于犬干扰素α1（Canine Interferon alpha Ca IFN-α1）的表达,在醇氧化酶启动子（Alcohol Oxidase 1 promoter,p AOX1）的紧密调控下,外源蛋白可在胞内表达或在α-因子分泌信号引导下表达在细胞外。酿酒酵母的α-因子分泌信号分为前后两区,前区负责信号识别,引导初生蛋白进入内质网并折叠,随后它被信号肽酶切掉,后区则负责将蛋白质从内质网转运到高尔基复合体,随后在KR位点被内切蛋白酶Kex2p切掉,最后2个EA重复序列被STE13基因产物修剪。应用酿酒酵母的α-因子作为分泌信号引导犬干扰素α1在毕赤酵母中的表达已在多篇文献中所见,但是,对α-分泌信号进行突变后对毕赤酵母表达Ca IFN-α1的影响尚未见到相关报道,本文比较了2种不同分泌信号的重组犬干扰素Ca IFN-α1在毕赤酵母中的分泌表达,以确认2种不同分泌信号表达载体的孰优孰劣。毕赤酵母表达载体p PIC9K含有AOX1启动子和酿酒酵母α-因子分泌信号,本实验室曾经构建过犬干扰素α1的表达载体p PIC9K-Ca IFN-α1,在分泌信号的引导下,犬干扰素α1在细胞外分泌表达。本次研究在p PIC9K-Ca IFN-α1的基础上,通过突变手段,将酿酒酵母α-因子分泌信号末端的EAEA（Glu-Ala-Glu-Ala）重复序列删除,并将构建好的表达载体命名为p PIC9K-mu MFα-Ca IFNα1。将p PIC9K-Ca IFNα1与p PIC9K-mu MFα-Ca IFNα1均用SalⅠ限制性内切酶线性化,在相同条件下,各自电转化入Pichia pastoris GS115中,并筛选出同等浓度G418压力下2种带有不同分泌信号的酵母菌株。随后通过BMGY/BMMY培养重组菌株并诱导其表达,表达产物通过Lowry法测定了总蛋白含量,通过犬干扰素α检测试剂盒对靶蛋白进行了定性定量,将带有酿酒酵母α-因子分泌信号的重组菌称为r GS115A,将携带删除EAEA重复序列的的α-分泌信号的重组菌称为r GS115B。蛋白质含量检测结果表明,r GS115A和r GS115B两者的总蛋白分泌水平相近,前者为131mg/m L,后者为136mg/m L,两者无显着性差别（P>0.05）。但是,犬干扰素α1在2种菌株中的表达量却明显不同,在r GS115B的表达量为92mg/L,占总蛋白的67.7%,而在r GS115A的表达量为78mg/L,占总蛋白的59.5%,前者表达水平明显高于后者,两者相差具有显着性（P<0.05）。本研究进一步比较了2种菌株表达产物的生物学活性,主要是抗病毒活性,但也对其免疫学活性（通过E-玫瑰花环试验测T淋巴细胞百分率）进行了初步分析,并通过SDS-PAGE测定了表达产物的分子量。通过SDS-PAGE,测得两种携带不同分泌信号的毕赤酵母表达菌株分泌的Ca IFN-α1分子量约为25k Da,这与其理论值18.5k Da不符,分析其原因,犬干扰素α1含有两个N端糖基化位点,推测酵母表达的犬干扰素α1发生了糖基化修饰。通过VSV-MDCK微量病变抑制法,测得两种菌株的分泌产物其抗病毒效价分别为2.58×107 u/mg（携带未突变分泌信号）和1.01×108 u/mg（携带突变分泌信号）,后者的活性明显高于前者。通过E-玫瑰花环试验,测得两者均有促进犬外周血T淋巴细胞增殖的作用,但两者之间并无显着差别。综上所述,就本研究而言,删除EAEA重复序列的α-分泌信号引导的犬干扰素α1在毕赤酵母的分泌表达上,无论是其表达量还是其生物学活性,效果均明显高于携带未突变型α-分泌信号的重组犬干扰素α1毕赤酵母菌株。
王玉娇,卢雪梅,金小宝,朱家勇[5]（2015）在《肝靶向干扰素的研究进展》文中研究表明干扰素是一种具有广泛抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性蛋白,是目前治疗病毒性肝炎、肝癌的疗效药,被广泛应用于临床。但因其在肝脏中富集较少,肾脏清除率很高,导致药物有效浓度较低从而影响治疗效果。本文对肝靶向干扰素的研究进展进行综述。
刘丰[6]（2014）在《人抗乙肝表面抗体在毕赤酵母中的表达》文中提出如今，乙肝在全世界广泛流行，造成严重危害。乙肝抗体在预防和治疗方面的作用逐渐为人们所重视。现有乙肝抗体主要来源于血浆，存在潜在风险，所以采用发酵方式生产基因工程抗体即成为一种十分必要的选择。本研究将前期筛选获得的乙肝抗体轻链、重链基因分别重组到相应表达载体，获得完整乙肝抗体轻链、重链以及全抗体重组载体。分别采用全抗体重组载体转化酵母感受态细胞的一步转化法，以及轻链、重链抗体依次转化酵母细胞的两步转化法，构建乙肝完整抗体表达体系，诱导表达，获得了具有良好乙型肝炎表面抗原结合活性的完整分泌型抗体，为完整乙肝抗体的发酵生产奠定基础。
王友同,吴文俊,李谦,高美风[7]（2013）在《近年来我国生物技术药物研究进展和趋势》文中认为生物技术是21世纪世界各国竞相发展的经济、技术的制高点,作者站在世界生物技术药物发展总趋势的高度上,具体而微地调查和总结了我国近5年来生物技术药物研究所取得的成果,内容包括:细胞因子、其它蛋白质和多肽药物、融合蛋白、穿膜肽、酶、基因治疗、干细胞、单克隆抗体、治疗性疫苗及多糖药物等。调查发现,在攻克人类顽疾、保障人民身体健康、提高生活质量和发展我国生物技术药物产业方面,由于国内成批有创见的研究成果持续涌现,发展前景一片光明。该文可为有关部门科研规划、确定研究项目、企业锁定发展目标及生物制药人员选择专业发展方向提供参考。
刘洋[8]（2012）在《人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）属嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）正嗜肝DNA病毒属,HBV感染严重威胁人类生命健康,可引起急、慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化、肝癌以致死亡。全球约有30亿人曾经感染过HBV,将近3.5亿人为慢性HBV感染者。我国1992年和2006年全国HBV感染血清流行病学结果显示,随着乙肝疫苗预防接种纳入新生儿计划免疫后,一般人群的HBsAg阳性率已经明显下降,从92年的9.75%下降到06年的7.18%,使我国由原来的高流行区降为中度流行区,但仍可推算出约9300万乙肝携带者,其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者约有2000万例。在《中国病毒性肝炎的流行现状及其相关问题分析报告》中估算出我国每年因慢性乙肝（包括肝硬化、肝癌）的直接和间接医疗费用约6000亿元,给患者和国家造成了巨大的经济负担。乙型肝炎治疗任重而道远,在针对乙型肝炎的治疗药物中,诸如干扰素、胸腺肽α1、核苷类似物、多肽类药物、治疗性疫苗及中草药等,到目前为止,尚未发现能够根除乙肝病毒的药物。目前应用于临床的高效价免疫球蛋白（HBIG）采用健康人即抗-HBsAg阳性的人血制备的,可以中和并清除侵入人体的乙肝病毒,使机体免受乙肝病毒的感染。由于血源来源有限、制备成本高且存在病原体潜在感染的危险,限制了其在临床上的应用。抗体库技术能够筛选出高亲和力的特异性单克隆抗体,从而使大规模生产人源化乙肝抗体成为可能。基于此,本研究中筛选人源抗HBsAg抗体包括以下三部分内容：一、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库的构建和筛选选取5名乙肝表面抗体（HBsAb+）阳性的健康志愿者,接种国产乙肝疫苗进行加强免疫,两周后采集志愿者外周血并分离出淋巴细胞,提取细胞总RNA,使用Oligo dT引物逆转录合成cDNA,利用特异性的8对Lambda轻链子库引物、5对Kappa轻链子库引物和8对重链引物扩增出轻重链Fd片段,轻链和重链分别通过SacⅠ/XbaⅠ和Xhol/SpeⅠ酶切位点克隆到pComb3H载体中,成功电转构建4个Kappa子库和Lambda子库,细菌抗体库鉴定结果表明所构建Fab噬菌体抗体库库容量达到3×108以上,抗体基因插入率接近100%,符合筛库的标准。在成功构建了噬菌体抗体库的基础上,采用辅助噬菌体VCSM13包装成Fab噬菌体抗体库,利用商品化的乙肝表面抗原蛋白对抗体库进行富集筛选。并通过序列测定确定所获各株抗体的基因序列,与v-base database中抗体序列信息进行比较,确定其CDR区。序列测定结果显示共有20株轻重链系列均不相同的克隆株,通过ELISA实验证明这些抗体均为特异性HBsAg抗体,通过竞争性ELISA发现20株抗体可以竞争结合3个不同表位。二、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗体表达及功能鉴定在利用原核细胞XL1-Blue表达Fab抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和杆状病毒-昆虫细胞技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将筛选出的20株抗体中具有高滴度6株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因插入杆状病毒载体pAc-L-FcR中,然后将构建完成的重组质粒与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,同时将其轻重链可变区基因插入HL51-14哺乳动物细胞表达载体后,转染293T细胞。通过直接免疫荧光检测真核表达效果,收集昆虫细胞和哺乳动物细胞表达上清进行亲和层析纯化。利用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度、ELISA方法检测纯化后的抗HBsAgIgG全抗体的功能活性,结果表明纯化后的人源HBsAg单克隆抗体抗体纯度达到98%以上,并且具有良好的生物活性。三、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原IgG全抗体亲和力研究将纯化后的抗HBsAg IgG全抗体分别利用非竞争性ELISA方法和BIAcoreSPR检测方法检测其亲和力,结果显示含有同一重链基因的各株抗体的亲和力较高,KD值达到10-9mol/L（abbr.M）,而两种表达系统表达的同一株抗体的亲和力活性无明显差异。综上所述,本研究通过基因工程抗体制备技术平台,运用噬菌体表面呈现技术,从乙肝疫苗加强免疫后的HBsAb+志愿者的外周血中获得Fab段抗体基因,成功构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库,容量为2×107克隆/ml,轻、重链基因插入率均接近100%。用商品化的乙肝病毒表面抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,经过特异性ELISA、序列测定证实共获得了20株特异性针对乙肝病毒表面抗原的人源Fab单抗,滴度测定后选取6株滴度较高的抗体进行全抗体表达。将重链基因不同的3株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因,分别克隆入昆虫细胞全抗体表达载体pAC-L-FcR,转染Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达；将重链相同的的4株Fab抗体轻链和重链可变区基因,分别克隆入哺乳动物全抗体表达载体HL51-14,转染,293T细胞,利用双质粒/哺乳动物细胞表达系统实现全抗体的分泌型表达。通过直接免疫荧光检测表达效果,收集上清进行纯化,共获得6株7种纯度较高的IgG全抗体。利用ELISA对获得的全抗体进行功能鉴定,结果表明7种人源IgG全抗体为特异性的抗乙肝表面抗原抗体,两种表达系统表达的抗体滴度显示293T细胞表达的抗体滴度更高。采用非竞争ELISA方法和BIAcore方法检测亲和力。采用非竞争ELISA固相法,Sf9细胞表达全抗的解离常数分别为1.06×10-8M、2.61×10-9M、2.50×10-10M,293T细胞表达全抗的解离常数分别为1.42×10-10M、1.61×10-10M、1.47×10-10M、3.57×10-10M,CHO-12-5的解离常数为1.93×10-10M。采用BIAcore法,Sf9细胞表达全抗的解离常数分别为5.80×10-8M、1.20×10-6M、5.47×10-9M,293T细胞表达全抗的解离常数分别为3.75×10-9M、9.53×10-9M、7.50×10-9M、7.75×10-9M。结果显示IgG3具有较高的亲和力,两种表达系统未显示出亲和力的差异而两种亲和力检测方法之间,较之ELISA方法的终点定量检测,Biacore法无须标记并且可以实时监测抗原抗体结合的速度、强度、特异性、稳定性和结合量等详细信息,说服力更好更保守。两种亲和力测定方法比较同一株抗体分别采用Sf9细胞稳定表达和293T细胞瞬时表达的差异,发现KD值相差一个数量级,可能是两种方法敏感性不同,有待于的进一步测定。本研究纯化出IgG3人源抗体,如果按优化比例和重组乙肝表面抗原组成抗原抗体复合物,或许会取得较好的治疗效果,亟待进一步实验结果的研究。
陆慧琦,宋杰,叶伟民,韩焕兴[9]（2011）在《抗HBs Fab-IFNα融合蛋白的制备与初步鉴定》文中进行了进一步梳理目的构建抗HBsAg的pComb Fab-IFNα载体,原核表达具双重生物活性的抗HBs Fab-IFNα融合蛋白。方法以pBAD-Fab和pBADIFNα作为模板,分别扩增Fd、λ和IFNα基因,经相应的限制性内切酶酶切后分3次克隆入pComBHss质粒,转化XL-1 Blue大肠埃希菌。限制性酶切和测序鉴定重组质粒,免疫蛋白印迹（Western blotting）和斑点印迹（Dot blotting）鉴定融合蛋白的表达及抗原结合活性。结果重组载体的酶切、电泳及测序表明抗HBs Fab-IFNα基因克隆正确。表达产物经12%SDS-PAGE电泳、转印,Western blotting显示该融合蛋白分子量约为65kD,Dot blotting显示其与HBsAg具有结合能力。细胞病变抑制法测定IFNα生物学活性为7.8×1045.1×105U/ml。结论该原核系统成功表达了抗HBs Fab-IFNα融合蛋白,表明其既具有抗HBsAg结合能力,又具备IFNα的生物活性,为进一步的系统表达和应用研究提供了条件。
刘运洪[10]（2011）在《人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究》文中进行了进一步梳理[背景]肿瘤的生长、侵袭和转移受诸多因素影响和制约,血管形成是其重要因素之一。肿瘤血管不仅提供了肿瘤生长所需的营养,而且也是癌细胞播散的途径。在血管内皮细胞的增殖和血管生成过程中,血管内皮生长因子受体2 （Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2）起重要作用。目前以肿瘤血管形成为靶点的抗肿瘤治疗研究正成为当前的热点。Fab抗体（fragment antigen binding, Fab）是由两条肽链,即轻链（LC）和重链Fd段（Fd）通过二硫键和非共价键结合在一起,相当于全长IgG1抗体的1/3,其无Fc段,免疫原性低、分子量小,更易到达病灶,半衰期长于单链可变区片断（scFv）,广泛用于与生物毒素等的融合表达,目前,成熟的噬菌体展示技术可以制备的完全人源化抗体Fab片断,其免疫排斥反应小,是极具潜力的免疫靶向治疗药物。但是,Fab在原核系统表达量普遍较低。本课题通过噬菌体展示技术成功建立全人源抗VEGFR2 Fab抗体,筛选获得较高亲和力的克隆,根据该Fab片断的特点,设计一段长约110bp的人工合成的linker基因,连接LC和Fd,使二者在一个起始子下翻译和表达,表达产物为一条肽链,形成单链Fab片断（single chain Fab fragment, scFab）,借助高效表达载体pET系列,构建分泌型表达重组载体pET25b（+）-scFab和插入HRV3C蛋白酶切位点的融合型表达重组载体pET32a-HRV3C-scFab,通过建立最适表达和纯化条件,提高抗体在大肠杆菌里的可溶表达产量。[方法]（1）从人外周淋巴细胞提取总RNA,逆转录为cDNA,通过PCR技术将LC和Fd基因克隆到噬菌体载体pComb3XSS上,构建抗人VEGFR2噬菌体抗体库,通过ELISA筛选亲和力和特异性高的克隆（抗体基因片段）。（2）利用PCR技术,从噬菌体抗体库中高亲和力的克隆中获得LC和Fd基因,在其两端引入酶切位点,以酶切-连接的方式克隆至设计含有linker基因质粒上linker的前后两端,以构建pGH-scFab重组载体方式将LC和Fd基因连接形成scFab基因片段。（3）选择pGH-scFab重组载体上合适的酶切位点,以酶切-连接的方式将scFab克隆至pET25b（+）载体上,构建pET25b（+）-scFab重组载体,转化3种不同的表达型宿主菌BL21（DE3）、Origami2（DE3）和Rosetta-gami 2（DE3）,检测蛋白的表达形式,通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET25b（+）-scFab的最佳表达条件。（4）选择scFab两端合适的酶切位,以酶切-连接的方式克隆至设计含有HRV3C蛋白酶切位点的质粒上HRV3C基因下游,再以以酶切-连接的方式将HRV3C-scFab基因片段克隆至含硫氧还蛋白（Trx）的融合表达载体pET32a上,构建pET32a-HRV3C-scFab重组载体,转化表达型宿主菌Rosetta gami 2（DE3）,通过在不同温度、不同诱导起始OD600值、不同诱导剂IPTG浓度的条件下,研究pET32a-HRV3C-scFab的最佳表达条件。（5）在最佳表达条件下,大量表达scFab抗体蛋白,按照镍柱亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,凝胶层析的先后顺序纯化scFab,用超滤离心浓缩和BCA蛋白定量调整scFab蛋白浓度,再通过ELISA以及流式细胞术检测scFab的亲和力和特异性。[结果]（1）构建了人源抗VEGFR2 Fab噬菌体抗体库,并通过4轮筛选获得了亲和力高的克隆pComb3XSS-Fab（33#）。（2）构建了pGH-scFab重组载体,成功地将LC和Fd基因在质粒上连接形成scFab基因片段。（3）构建了pET25b（+）-scFab分泌型表达重组载体,研究显示：最佳表达型宿主菌为Rosetta gami 2（DE3）,主要为包涵体表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.4,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。（4）构建了pET32a-HRV3C-scFab融合型表达重组载体,用表达型宿主菌为Rosetta gami 2（DE3）进行表达时,主要为可溶表达,最佳诱导温度为20℃,最佳诱导起始OD600值为0.8,最适诱导剂IPTG浓度为0.5mM。（5）先后通过镍柱的亲和层析纯化,HRV3C蛋白酶切,分子筛过滤纯化,超滤离心浓缩,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白。蛋白浓度为0.1mg/m1时,直接法ELISA的OD450/570nm值为1.583,竞争抑制ELISA显示其对VEGF有53%抑制率,流式细胞术检测显示对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）有39.62%的结合力。[结论]（1）噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的有效途径,并且通过反复筛选可以得到高亲和力的克隆。（2）与Overlap PCR技术相比,在质粒上进行两个基因片段连接操作可行性更高,尤其是在像本实验中不易设计引物的情况下。（3）pET25b（+）-scFab和pET32a-HRV3C-scFab重组表达载体的表达条件研究显示：使用含大肠杆菌稀有密码子的宿主菌能显着增加scFab的表达；在没有分子伴侣的条件下,scFab主要以包涵体形式表达,硫氧还蛋白（Trx）的融合scFab进行表达能显着增加scFab的可溶表达量；此外低温、合适的诱导剂IPTG和起始起始OD600值都有利于增加scFab表达量。（4）本实验通过合适的纯化方式组合,最后得到高纯度的scFab抗体蛋白,HRV3C蛋白酶切是在低温（4℃）下进行,这既去除了分子伴侣,又保证了目的蛋白的活性。（5） scFab抗体蛋白的功能检测结果显示：linker的设计,对Fab的空间结构尤其是功能改变不大,但是能显着提高Fab抗体的产量。（6）本实验的研究结果为肿瘤血管靶向治疗动物实验及临床试验奠定基础,为Fab抗体的生产提供一个新的思路,也为本实验室建立了一个高效的原核融合表达平台。
二、人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达（论文提纲范文）
（1）人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 SCFV的国内外研究进展 |
| 1.1.1 抗体分子 |
| 1.1.2 抗体多样性依赖于基因重排 |
| 1.1.3 抗体库的类型 |
| 1.1.4 scFv的发展 |
| 1.1.5 scFv的应用进展 |
| 1.2 SCFV的表达研究进展 |
| 1.2.1 scFv的表达系统 |
| 1.2.2 scFv在毕赤酵母中的表达情况 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达菌株 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达载体 |
| 1.4 毕赤酵母的密码子偏好性 |
| 1.5 ADAM17 SCFV及 MT1-MMP SCFV |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 人源单链抗体库的构建 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、噬菌体及血液来源 |
| 2.1.2 常用的培养基 |
| 2.1.3 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 常用仪器 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 人淋巴细胞的分离纯化 |
| 2.2.2 人血淋巴细胞中总RNA提取 |
| 2.2.3 c DNA的合成 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 DNA片段纯化回收 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 噬菌粒p CANTAB5E与 scFv片段的连接 |
| 2.2.8 大肠杆菌TG1 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 辅助噬菌体扩增 |
| 2.2.10 辅助噬菌体的滴定 |
| 2.2.11 大肠杆菌TG1 的电转化 |
| 2.2.12 辅助噬菌体感染TG1 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 人淋巴细胞的分离纯化及总RNA提取 |
| 2.3.2 抗体VH与VL片段的获得 |
| 2.3.3 ScFv片段的获得 |
| 2.3.4 噬菌体scFv抗体库的构建 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 第三章 单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及质粒来源 |
| 3.1.2 常用培养基 |
| 3.1.3 常用试剂及试剂盒 |
| 3.1.4 常用仪器 |
| 3.1.5 引物序列 |
| 3.1.6 重组质粒与菌株 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 PCR反应 |
| 3.2.2 酶切反应 |
| 3.2.3 GS115 感受态细胞的制备 |
| 3.2.4 毕赤酵母电转化 |
| 3.2.5 毕赤酵母外源蛋白诱导表达及收集 |
| 3.2.6 酵母基因组提取 |
| 3.2.7 Western Blot |
| 3.2.8 A17-scFv(HS)的纯化 |
| 3.2.9 A17-scFv(HS)的活性检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 毕赤酵母密码子对优化软件的开发 |
| 3.3.2 ADAM17 scFv及 MT1-MMP scFv基因序列的优化 |
| 3.3.3 密码子对偏好性影响scFv的表达 |
| 3.3.4 ScFv片段密码子对优化相比于传统密码子优化的序列在毕赤酵母中的表达量高 |
| 3.3.5 同义密码子在密码子及密码子对优化序列中的使用情况不同 |
| 3.3.6 在密码子优化序列中存在许多得分低的密码子对 |
| 3.3.7 毕赤酵母表达的A17-scFv具有生理活性 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、HER2阳性肿瘤及其靶向治疗 |
| 二、抗体药物的免疫原性 |
| 第一部分 单链抗体e23s Fv的人源化基因构建及噬菌体筛选 |
| 第二部分 人源化单链抗体的原核表达、纯化和功能分析 |
| 第三部分 人源化单链抗体P1h2、P1h3在HER2靶向肿瘤杀伤中的应用 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）2种不同分泌信号对犬干扰素在毕赤酵母中分泌表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究的目的意义 |
| 1.2 研究的主要内容 |
| 1.3 研究的技术路线 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 干扰素研究概况 |
| 2.1.1 IFN的起源、分布、发现和分类 |
| 2.1.2 IFN的理化性质和分子结构 |
| 2.1.3 IFN的活性与作用机制 |
| 2.1.4 IFN基因工程研究进展 |
| 2.1.5 重组犬IFN的研究进展 |
| 2.1.6 展望 |
| 第3章 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 3.1 PICHIA PASTORIS表达系统的优越性 |
| 3.2 PICHIA PASTORIS表达系统的组成和最新研究进展 |
| 3.3 PICHIA PASTORIS表达载体启动子与分泌信号的研究进展 |
| 3.4 PICHIA PASTORIS宿主菌株研究进展 |
| 3.5 PICHIA PASTORIS表达IFN的研究进展 |
| 3.6 展望 |
| 第4章 研究内容 |
| 前言 |
| 4.1 方法 |
| 4.1.1 α-分泌信号突变型表达载体构建策略与引物设计 |
| 4.1.2 PCR扩增目的基因 |
| 4.1.3 PCR扩增DNA片段的回收与鉴定 |
| 4.1.4 pPIC9K载体的扩增 |
| 4.1.5 扩增DNA片段的酶切与连接 |
| 4.1.6 连接产物的转化与鉴定 |
| 4.1.7 表达载体转化Pichia Pastoris GS115 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PCR扩增CaIFN-a1及分泌信号DNA |
| 4.2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒测序结果 |
| 4.2.4 多拷贝插入重组子的筛选 |
| 4.2.5 转化子的PCR鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 方法 |
| 4.4.1 重组Pichia pastoris（His~+ Mut~+表型）的诱导表达 |
| 4.4.2 硫酸铵沉淀总蛋白 |
| 4.4.3 总蛋白浓度测定 |
| 4.4.4 靶蛋白（CaIFN-α1）含量测定 |
| 4.4.5 统计学处理 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 表达产物的总蛋白浓度 |
| 4.5.2 靶蛋白（CaIFN-α1）含量 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 方法 |
| 4.7.1 SDS-PAGE分析 |
| 4.7.2 生物学活性分析 |
| 4.8 结果 |
| 4.8.1 SDS-PAGE结果 |
| 4.8.2 犬干扰素α1 的生物学活性 |
| 4.9 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）肝靶向干扰素的研究进展（论文提纲范文）
| 1 脂质体干扰素 |
| 2 糖基化肝靶向干扰素 |
| 3 与HBs Ab交联干扰素 |
| 4 其他 |
| 4.1 肝靶向肽干扰素 |
| 4.2 人血清白蛋白干扰素 |
| 4.3 由血红细胞运载的干扰素 |
| 5 结语 |
（6）人抗乙肝表面抗体在毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 研究背景 |
| 一、抗体的结构与生物学功能 |
| 1. 抗体的结构 |
| 1.1 重链 |
| 1.2 轻链 |
| 1.3 CDRs、Fv、Fab、Fc 结构域 |
| 2.抗体的功能 |
| 2.1 抗原结合 |
| 2.2 效应功能 |
| 二、抗体的研究进展 |
| 1. 多克隆抗体 |
| 2. 单克隆抗体 |
| 3. 基因工程抗体 |
| 3.1 鼠单克隆抗体人源化 |
| 3.2 小分子抗体 |
| 3.3 双（多）价及双特异抗体分子 |
| 3.4 抗体融合蛋白 |
| 4. 抗体库技术 |
| 三、抗体的表达 |
| 1. 大肠杆菌表达体系 |
| 2. 酵母表达体系 |
| 3. 哺乳动物细胞表达体系 |
| 4. 植物表达体系 |
| 5. 转基因动物表达系统 |
| 四、抗体在临床上的应用 |
| 1. 肿瘤的治疗 |
| 1.1 注射用曲妥珠单抗 HERCEPTIN (TRASTUZUMAB FOR INJECTION) |
| 1.2 美罗华 (rituximab,rituxan,mabthera) |
| 1.3 Panorex (mAb17-1A) |
| 2. 作为免疫抑制剂方面的应用 |
| 3. 乙型肝炎的免疫治疗 |
| 研究目的 |
| 研究方案 |
| 1. 技术路线图 |
| 2. 备注 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 所用仪器 |
| 1.2 主要药品 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 完整抗-HBs 抗体表达载体的构建 |
| 2.2 完整抗-HBs 抗体的表达 |
| 2.3 两步转化法建立完整抗体表达体系 |
| 2.4 重组抗体的发酵及纯化 |
| 实验结果 |
| 3.1 重组载体的鉴定 |
| 3.2 完整抗-HBs 抗体转化子的鉴定 |
| 3.3 完整抗-HBs 抗体的诱导表达 |
| 3.4 两步转化法建立完整抗体表达体系 |
| 3.5 重组抗体的纯化与鉴定 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 致谢 |
（7）近年来我国生物技术药物研究进展和趋势（论文提纲范文）
| 1 细胞因子[3-9] |
| 1.1 白细胞介素 (IL) |
| 1.1.1 h IL-10 |
| 1.1.2 h IL-31 |
| 1.1.3 h IL-32 |
| 1.2 干扰素 (IFN) |
| 1.2.1 新型人复合IFNα |
| 1.2.2 集成IFNα突变体Ⅱ (IFN2-Con-m2) |
| 1.2.3 人共同IFNα (IFN-Con1) |
| 1.3 人干细胞生长因子-α (rhSCGF-α) |
| 1.4 人胰岛素样生长因子1 (hIGF-1) |
| 1.5 人血管内皮生长因子 (h VEGF165) |
| 1.6 人内皮抑素 (rhEndostatin) |
| 1.7 人血管能抑素 (canstatin) |
| 2 蛋白质、多肽[10-12] |
| 2.1 水蛭素Ⅲ (HVⅢ) |
| 2.2 人胰高血糖素样肽-2类似物[ (PP-h|Gly 2|GLP-2 (1-35) ] |
| 2.3 人β-2 glycoprotein I |
| 2.4 MAP30蛋白 |
| 2.5 Exendin-4类似物 |
| 2.6 新型Ⅱa类细菌素 |
| 2.7 截短肠毒素C2 |
| 2.8 胰生定多肽 (EXf) |
| 2.9 CKLF-C19 |
| 2.10 人胰岛新生相关蛋白 (INGAP) |
| 2.11 人源肝星状激活相关蛋白 (STAP) |
| 2.12 人凋亡素α-配体 (rh-Apoα) |
| 2.13 人胸腺素β16 |
| 2.14 神经保护肽 ([Gly-14]-Humanin) |
| 2.15 鲨肝活性蛋白 (rSHAP) |
| 2.16 抗癌多肽A38 |
| 2.17 抗纤维化小肽AcSDKP |
| 2.18 血管紧张素1-7改构体 |
| 2.19 抗肿瘤多肽AP25 |
| 2.20 酪丝亮肽 |
| 3 融合蛋白[13-17] |
| 3.1 双 (多) 功能融合蛋白 |
| 3.2 HSA修饰的融合蛋白 |
| 3.3 穿膜肽修饰的融合蛋白[18] |
| 3.4 蛋白质分子PEG后修饰[19] |
| 4 穿膜肽 (CPPs) |
| 5 酶 |
| 5.1 重组蛇毒纤溶酶 (ralfimeprase, ALF) |
| 5.2 蛇毒类凝血酶 (ancrod) |
| 5.3 蚯蚓纤溶酶 (EFE) |
| 5.4 嗜血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 (Bat-PA) |
| 5.5 人过氧化氢酶 (CAT) |
| 5.6 海刺参i型溶菌酶 (rSjLys) |
| 5.7 人纤溶酶原 |
| 5.8 含精-甘-天冬酰胺三肽人纤溶酶原K区缺失突变体 (RGD-hPLG-K) |
| 5.9 人溶菌酶 (hLYZ) |
| 5.10 尿酸氧化酶 (Uricase) [21] |
| 5.11 人源基质蛋白酶-2 (MMP-2) 的C端类血红素结合域片段 (PEX) |
| 5.12 β-内酰胺酶[22] |
| 6 基因治疗 |
| 6.1 siRNA[23-27] |
| 6.2 反义核酸 |
| 6.3 治疗基因 |
| (1) 抑瘤素M (OSM) 重组腺病毒载体 (Ad-OSM) |
| (2) miR29C重组腺病毒 (Ad5F11p-miR29C) |
| (3) 人肝细胞生长因子重组质粒 (pUDK-HGF) [30] |
| (4) 腺病毒Ela基因-P1b抑癌基因 (AdCMV-P16) |
| (5) 新型增殖型腺病毒 (CNHK500-hγ) [31] |
| 7 干细胞 |
| 7.1 国家SFDA批准临床的干细胞项目 |
| 7.2 干细胞治疗是一种医疗技术还是细胞药物 |
| 7.3 用于临床的干细胞 |
| 7.4 我国近期干细胞临床和药理学药效学研究 |
| 7.4.1 临床研究[32-35] |
| 7.4.2 药理药效学研究 |
| 8 单克隆抗体 |
| 8.1 我国批准的单抗 |
| 8.2 正在临床研究的单抗 |
| 8.3 正在进行临床前研究的单抗 |
| 8.4 单抗阶段性研究[36-38] |
| 9 治疗性疫苗 |
| 9.1 10个世界上正在开发的热点治疗性疫苗 |
| 9.2 我国治疗性疫苗的进展 |
| 9.2.1 口服幽门螺旋杆菌疫苗 |
| 9.2.2 乙肝治疗性疫苗 |
| 9.2.3 子宫颈癌治疗疫苗 |
| 9.2.4 艾滋病疫苗 |
| 9.2.5 疟原虫感染与肺癌DNA疫苗联用 |
| 9.2.6 其它的基因疫苗的研究成果[39-42] |
| 9.2.7 细胞疫苗 |
| 10 多糖 |
| 10.1 毛细管电泳法分析肝素 |
| 10.2 低分子硫酸皮肤素 (LMWDS) [44] |
| 10.3 羧甲基壳聚糖钙 |
| 10.4 低分子壳聚糖衍生物 |
| 10.5 海参岩藻聚糖硫酸酯 (SC-FUC) |
| 10.6 海洋硫酸多糖 |
| 10.7 岩藻硫酸酯 |
（8）人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：人源抗乙肝病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库的构建与筛选 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分：人源抗乙肝病毒表面抗原全抗体表达及功能鉴定 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分：人源抗乙肝病毒表面抗原全抗体亲和力测定 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 引用文献 |
| 综述 |
| 引用文献 |
| 致谢 |
（10）人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 实验路线总图 |
| 第一部分 人源抗VEGFR2 Fab的抗体库构建及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 内切酶位点选择 |
| 3.2 引物设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 人外周血淋巴细胞的分离 |
| 4.2 Trizol试剂提取人外周血淋巴细胞总RNA |
| 4.3 cDNA的合成 |
| 4.4 PCR扩增Fab抗体基因 |
| 4.5 轻链抗体基因重组载体的构建 |
| 4.6 Fab噬菌体抗体库的构建 |
| 4.7 Fab噬菌体抗体库的筛选 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第二部分 人源抗VEGFR2 scFab的克隆表达 |
| 第一章 人源抗VEGFR2 scFab基因的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 连接序列linker的设计 |
| 3.2 环式PCR法突变内切酶位点设计 |
| 3.3 用于scFab表达载体构建的引物的设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pGH-linker质粒的制备 |
| 4.2 环式PCR突变内切酶位点 |
| 4.3 △LC和△Fd基因片段的获取 |
| 4.4 pGH-linker-△LC的构建 |
| 4.5 pGH-linker-scFab的构建 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第二章 人源抗VEGFR2 scFab在pET25b(+)-scFab中的表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 酶切位点的设计 |
| 3.2 表达条件确定的先后顺序设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pET25b(+)-scFab重组质粒的构建 |
| 4.2 表达条件研究 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第三章 人源抗VEGFR2 scFab在pET32a-HRV3C-scFab中的融合表达研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 HRV3C的设计 |
| 3.2 scFab转移酶切位点的设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pGH-HRV3C-scFab重组质粒的构建 |
| 4.2 pET32a-HRV3C-scFab重组质粒的构建 |
| 4.3 表达条件研究 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 第三部分 人源抗VEGFR2 scFab的纯化和特异性检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验流程图 |
| 3 实验设计 |
| 3.1 表达条件设计 |
| 3.2 纯化方案设计 |
| 4 实验步骤 |
| 4.1 pET32a-HRV3C-scFab优化条件下大量表达 |
| 4.2 使用His·Bind purification Kit纯化蛋白 |
| 4.3 HRV3C蛋白酶酶解 |
| 4.4 凝胶层析纯化 |
| 4.5 浓缩和保存 |
| 4.6 抗体活性检测 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 参考文献 |
| 8 小结 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达（论文参考文献）
- [1]人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究[D]. 林婷. 福建师范大学, 2020(12)
- [2]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [3]单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定[D]. 欧阳清. 第四军医大学, 2017(02)
- [4]2种不同分泌信号对犬干扰素在毕赤酵母中分泌表达的影响[D]. 谭成成. 吉林大学, 2016(09)
- [5]肝靶向干扰素的研究进展[J]. 王玉娇,卢雪梅,金小宝,朱家勇. 广东药学院学报, 2015(03)
- [6]人抗乙肝表面抗体在毕赤酵母中的表达[D]. 刘丰. 吉林大学, 2014(10)
- [7]近年来我国生物技术药物研究进展和趋势[J]. 王友同,吴文俊,李谦,高美风. 药物生物技术, 2013(01)
- [8]人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究[D]. 刘洋. 中国疾病预防控制中心, 2012(08)
- [9]抗HBs Fab-IFNα融合蛋白的制备与初步鉴定[J]. 陆慧琦,宋杰,叶伟民,韩焕兴. 解放军医学杂志, 2011(05)
- [10]人源抗VEGFR2单链Fab抗体克隆表达研究[D]. 刘运洪. 昆明医学院, 2011(10)