一、Peripheral clonal deletion of MBP-specific T cells by intravenous au-toantigen: rapid reversal of ongoing, progressive experimental autoimmune encephalomyelitis（论文文献综述）
韩梦雨[1]（2021）在《中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究》文中提出(一)视神经脊髓炎相关性视神经炎患者临床特点及疗效分析目的:分析视神经脊髓炎相关性视神经炎（NMO-ON）患者的临床特点及针药联合改善NMO所致视神经萎缩的疗效。方法:对2016年1月至2019年12月就诊于中日友好医院的72例以ON为首发临床表现的NMO患者进行回顾性分析总结,包括一般资料、发病特点、病程进展、合并疾病、免疫学检验、治疗反应及预后等。结果:1.一般资料:72例NMO-ON患者,发病年龄中位数33岁;女性61例（84.72%）,男女比约为1:5.54;病程中位数67月,病程以“复发-缓解”为主,单相与复发比约1:5.8。2.临床特点:66例（91.67%）单独ON起病,ON累及单眼者59例（81.94%）;主要症状为急性或亚急性视力下降,可伴转动痛、视野缺损及色觉异常等;14例（19.44%）伴诱因,最常见为上呼吸道感染;11例（15.28%）伴系统性免疫性病,最常伴发干燥综合征及甲状腺疾病;59眼（75.64%）首发视力小于0.1,AQP4-IgG状态（P=0.032,OR=2.55）和发病年龄（P=0.037,OR=3.93）是影响患者首发视力的独立危险因素;整个病程中,44例（61.11%）双眼先后累及,ON发病次数中位数为2次,ON二次发作时间中位数是3月;1年、3年复发率分别约0.56（40/72）和0.74（53/72）;至末次随访时间,单侧致盲率约48.61%,致患者单侧致盲ON发作中位数为2次;53例（73.61%）出现其他神经系统的累及,脊髓（61.1 1%）是最常见的复发部位。3.实验室结果:80%（48/60）患者血清AQP4-IgG抗体阳性;25%（3/12）患者MOG-IgG阳性;18例（25%）伴其他系统性免疫性抗体,最常见伴ANA抗体阳性;4.影像学特点:NMO-ON多累及后视路,病变长度>1/2视神经;45例（84.91%）脊髓MRI病变≥3个锥体;47.17%（25/53）患者同时或相继发生颈髓和胸髓病变。5.针药联合改善NMO所致视神经萎缩:24眼治疗4周有8只眼视力提高≥2行,总有效率91.67%;动态视野平均缺损度（MD）及平均敏感度（MS）较前改善,但与治疗前相比,差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗8周有12眼视力提高≥2行,总有效率100%;视野MD显着下降（P<0.05）,MS明显提高（P<0.05）。结论:1.NMO-ON患者首次发病多ON单独起病,单侧累及,女性中青年高发,AQP4-IgG阴性患者更趋年轻化,急性期对患者视功能威胁巨大,恢复期多遗留较差的视力预后;最常见诱因为上呼吸道感染,漫长的病程多见双侧视神经受累及多次复发,脊髓是除视神经外最常见的复发部位;AQP4-IgG状态和发病年龄是影响NMO患者首次发病视功能的独立危险因素;2.大多数（80%）NMO-ON患者AQP4-IgG血清阳性,部分患者伴发以干燥综合征和甲状腺疾病为代表的系统性免疫性疾病,最常见伴有的血清学免疫性抗体是抗ANA抗体;3.NMO-ON患者视神经多累及后视路,病变长度>1/2视神经,脊髓损伤多为连续长节段,约一半患者同时或相继发生颈髓和胸髓病变;4.针药联合可显着提高NMO所致视神经萎缩患者的视功能,明显提高患者视力和动态视野MS,降低患者MD。（二）视神经脊髓炎相关视神经炎（NMO-ON）大鼠模型的构建与评价目的:通过将患者AQP4-IgG强阳性血清显微注射至大鼠视神经周围蛛网膜下腔,诱导视神经NMO样病变,从活体与病理、视神经及脊髓、大脑等多维度评价该模型,为探究药物防治NMO-ON提供模型基础。方法:SD雄性大鼠30只根据血清样本类型随机分为模型组、假手术组,上结膜入路暴露视神经后选择球后2mm处分别将AQP4-IgG强阳性血清和健康人血清缓慢注射到蛛网膜下腔。术后第3天免疫荧光法检测视神经AQP4-IgG表达;术前1天（第0天）、术后第7、14天分别行闪光视觉诱发电位（F-VEP）及瞳孔对光反射（PLR）检测;术后第14天分别处死两组大鼠行视网膜、视神经、大脑及脊髓等组织制片和病理学观察。结果:术后第3天模型组视神经AQP4-IgG强表达,假手术组未见表达（P<0.001）;与假手术组相比,AQP4和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在AQP4-IgG沉积区域表达也显着降低（P<0.001）;模型组N1-P1波振幅和PLR第7天、14天均明显降低,与假手术组相比差异均有统计学意义（P<0.001）;组织病理学观察:与假手术组相比,模型组视神经HE染色肿胀水肿、着色明显加深,轴突数量显着减少伴有不规则空洞化,其间见大量炎症细胞浸润等;RGCs水肿显着,数量明显减少,且大小不一,核仁不清晰;视神经LFB髓鞘染色,模型组可见到蓝色区域显着减少;模型组大鼠视神经电镜则可见到轴突数量明显减少且排列紊乱、横断面形态不规则,微管微丝大量溶解,髓鞘严重分层、结构不完整,且大多数髓鞘松解或者脱失、塌陷,甚至无髓鞘;免疫荧光染色发现,与假手术组相比,模型组神经丝蛋白L（NFL）表达量明显下降（P<0.001）及CD68表达显着升高（P<0.001）;脊髓组织HE发现,假手术组和模型组均未见到脊髓白质炎症浸润、轴突及髓鞘损伤等病理变化;脊髓组织LFB染色可见假手术组和模型组髓鞘染色成蓝色且均匀一致,未见到染色区域减少及白色未着色区等。大脑组织HE和LFB染色也未发现炎症浸润及脱髓鞘等病理损伤;结论:1.我们通过在大鼠视神经蛛网膜下腔显微注射人类AQP4-IgG阳性血清成功构建了NMO-ON大鼠模型,该模型显示NMO-ON的特征性病理变化,包括星形胶质细胞破坏、炎症浸润、轴突损伤及脱髓鞘等;2.大鼠视神经蛛网膜下腔显微注射人类AQP4-IgG阳性血清构建NMO-ON模型,仅能启动局部视神经周围免疫,对脊髓及大脑等其他神经系统未产生病理损伤。（三）调肝活络法防治视神经脊髓炎相关性视神经炎（NMO-ON）的疗效及机制探究目的:通过动物模型的体内研究,观察调肝活络法的干预效果,并深入挖掘方药发挥作用的分子机制,为NMO-ON的临床治疗提供中西医协同的解决方案。方法:SD雄性大鼠60只随机分为模型组、假手术组、中药组、激素组、中药+激素组,显微注射法构建NMO-ON大鼠模型,分别给予无菌蒸馏水、中药、激素及中药+激素等灌胃干预21天,术前1天（第0天）、术后7天、14天及21天分别行F-VEP、PLR检测;第21天处死所有大鼠,制备视网膜、视神经切片,进行HE染色及超微电镜观察;免疫组织化学染色检测RGCs中Brn3a表达;免疫荧光染色检测GFAP、NFL、髓鞘碱性蛋白（MBP）和CD68表达;Western-blotting检测视神经IL-6、IL-10、TNF-α、p-NF-κB p65 蛋白表达。结果:1.视神经功能学评价:与同时间点模型组和激素组相比,中药组和中药+激素组在第7、14和21天均可显着提高视神经F-VEP的N1P1振幅（P<0.001）;在第21天,中药组、中药+激素组与模型组和激素组相比,PLR收缩程度也显着增加（P<0.001）;2.组织病理学评价:与模型组和激素组相比,中药组和中药+激素组视神经HE染色均可见轴突损伤减轻、视神经水肿消退及未见到明显炎症细胞浸润;电镜发现中药组轴突数量明显增加,神经纤维束状形态可循,可见微丝微管结构,髓鞘损伤也较之减轻;与激素组相比,中药+激素组见到更完整的神经轴突、髓鞘结构;免疫组化发现,与模型组和激素组相比,中药组和中药联合激素组RGCs的Brn3a表达量较之均显着升高（P<0.001）;视神经免疫荧光提示中药组及中药+激素组GFAP、MBP和NFL表达量较模型组表达量升高（P<0.001）。CD68视神经染色也发现,与模型组相比,中药组及中药+激素组可见到CD68表达显着降低（P<0.001）;3.Western Blotting:与假手术组相比,模型组大鼠视神经内p-NF-κB p65、TNF-α和IL-6显着升高（P<0.001）;与模型组相比,中药组、激素及中药+激素组均可见到p-NF-κB p65、TNF-α和IL-6降低（P<0.001）;与假手术组相比,模型组大鼠视神经内IL-10显着降低（P<0.001）;与模型组相比,中药组、激素及中药+激素组均可见到 IL-10 升高（P<0.001）。结论:1.调肝活络复方中药可以减轻NMO-ON大鼠模型视神经轴突丢失、髓鞘损伤及炎症浸润,进而提升和改善视觉诱发电位N1P1振幅及瞳孔对光反射收缩能力。2.调肝活络复方中药对NMO-ON视神经及视网膜发挥神经保护和治疗作用可能与其能抑制视神经内NF-κB蛋白磷酸化及调控相关炎症介质（IL-6、TNF-α及IL-10）的产生有关。
黄涛[2]（2021）在《细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究》文中研究指明CRL4作为E3泛素连接酶,可以结合不同的接头蛋白（称为DCAFs）,这些接头蛋白通过招募各自特定的底物到CRL4 E3泛素连接酶上发挥多种生理学功能。DCAF2（又称为CDT2或DTL）是CRL4的底物接头蛋白之一。CRL4DCAF2泛素连接酶是公认的细胞周期关键调节蛋白,对于促进细胞周期顺利通过S期和有丝分裂具有重要调控作用。CRL4DCAF2可以引发染色质复制起始蛋白（CDT1,SETD8）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21发生泛素化修饰并降解,从而促进细胞从S期顺利进入G2期。但由于缺乏可行的动物模型,CRL4DCAF2在体内尤其是免疫系统中的功能仍然未知。固有淋巴细胞和适应性免疫细胞在受到外来刺激后,会对细胞周期的进程产生不同的影响。T细胞接受到TCR和共刺激分子信号后,需要经历多个细胞周期进行快速增殖,而树突状细胞在经历模式识别受体介导的活化后,会退出细胞周期,并启动凋亡程序,这也体现在DCAF2的表达在树突状细胞激活地过程中迅速降低。NEDD靶向药物MLN4929,可以使CRL失活,其已经进行过多种类型的淋巴瘤和急性髓系白血病的治疗性临床试验。用MLN4924处理小鼠,会增加小鼠银屑病模型的严重程度,这与树突状细胞中缺失DCAF2造成的表型一致,说明DCAF2在自身免疫病中具有重要的负调控功能。通过转录组比对,我们发现DCAF2的缺失在树突状细胞中导致促炎细胞因子IL-23的表达特异性升高。进一步研究发现树突状细胞中的CRL4DCAF可以调节非经典NF-κB通路关键因子NIK的蛋白稳定性,进而负调节IL-23的产生。CRL4DCAF2会促进NIK的多聚泛素化修饰和随后的降解,我们发现这个过程不依赖于经典的TRAF2或TRAF3介导的NIK降解途径。另外,树突状细胞中条件性敲除DCAF2的年老小鼠表现出自身免疫性疾病倾向,在Aldara诱导的银屑病样皮肤炎症模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中,该小鼠相较于野生型小鼠也具有更高的敏感性。我们的研究表明,细胞周期分子CRL4DCAF2除了作为细胞周期调控因子外,在先天免疫细胞中对于非经典NF-κB通路关键蛋白NIK的稳定性也有至关重要的调控作用。我们的研究揭示了CRL4DCAF2在树突状细胞中特异性调控促炎细胞因子IL-23的表达,并进一步引发相关自身免疫疾病的分子机制,为自身免疫性疾病和炎症性疾病提供了潜在的治疗靶点。
冉庆森[3]（2020）在《以小胶质细胞自身免疫炎症调节为切入点探讨DHA在EAE模型小鼠中的药效及分子机制》文中研究指明1.研究背景及目的多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）是一种以髓鞘脱失和神经元变性为特点的中枢神经系统（central nervous system,CNS）自身免疫炎症性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE）是一种以CNS内小血管周边大量单个核细胞弥漫浸润及脱髓鞘为特点的MS动物实验模型。MS的致病因素多样,疾病进展的驱动机制复杂。近年来对中枢神经系统免疫微环境的研究结果表明,小胶质细胞在MS的疾病诱发和进展中起重要作用[1]。因此,聚焦中枢神经系统小胶质细胞的调控,改变中枢神经系统免疫微环境的属性和状态,对于包括MS在内的多种中枢神经系统疾病的治疗具有核心且共通性的研究价值。目前,MS的临床治疗处于“能缓不能治,治标不治本”的状态,在MS“高发与难治”的强烈对比下,MS的疾病机理认识与治疗手段拓展成为现代免疫学、神经生物学与新药研发的共同关注热点与应用焦点,具有明确的科学创新意义与实践应用价值。倍半萜类化合物双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）分子式为:C15H24O5分子量为284.35,物化性质为白色结晶或结晶性粉末[2]。随着对DHA研究的不断深入,DHA的药效药理学优势不仅仅只局限在治疗疟疾,其在抗炎免疫调节方面也显示出极大的应用前景。前期研究发现其在治疗免疫性疾病,特别是针对自身免疫病具有明确的有效性,并且初步明确了DHA能够通过调控Th17/Treg细胞平衡机制进而抑制自身免疫炎症性肠病（IBD）[3]。但目前上述研究仍存在关键科学问题的研究空白:（1）DHA调控免疫炎症的共通基础不明,疾病谱不清,特别是其在中枢神经系统自身免疫炎症调控中的应用有效性缺乏系统研究;（2）DHA调控T细胞平衡的免疫过程不明,其对免疫炎性微环境的调控活性缺乏系统的阐释和实验描述;（3）DHA发挥免疫调控活性的潜在分子机制不明,具体分子靶点和相关信号通路缺乏精细化的分析和揭示;基于上述分析,从药效评价、免疫功能揭示、分子机制探索三个方面开展DHA的全面系统研究,是提升DHA药物认识水平,促进DHA合理有效应用的关键研究内容。众所周知,T细胞的平衡调控是一个复杂而庞大的体系,而“抗原递呈细胞-T细胞”的整合作用单元在T细胞的免疫功能平衡调控中发挥着重要的作用,是自身免疫炎症损伤启动和持续激活的核心病理基础。而基于上述理论的DHA药物研究仍为空白。因此,本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。2.研究方法和内容1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究（1）建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解（RRMS）动物模型和继发进展（SPMS）动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙1mg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观测小鼠的状态变化。RRMS动物模型:连续给药23天后,小鼠步态仪进行步态行为检测小鼠机能动态变化。行为学检测后,一部分取出脑和脊髓组织进行组织学（LFB,透射电镜）检测;另一部分小鼠分离血清和脑脊液。SPMS动物模型:连续给药53天后,开始进行步态行为学检测小鼠机能动态变化。行为学实验结束后,采用脊髓和脑组织进行Olig 2的免疫组织化学检测。（2）RRMS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞（MNCS）,qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究（1）分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1 × 106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。（2）体外培养小鼠巨噬细胞株Raw 264.7和小鼠小胶质细胞株BV2,并且体外分离小鼠腹腔巨噬细胞（peritonealmacrophage,PM）。分别以DHA1,4μM为给药低,高剂量和LPS 50ng/ml为造模浓度,细胞经过药物处理24h。首先,RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）的方法在转录水平上检测Raw264.7和PM细胞中负性免疫共刺激分子PDL1的表达;间接免疫荧光技术检测Raw264.7,BV2和PM三种细胞表面免疫共刺激分子PDL1的蛋白表达水平;采用人外周血白血病T细胞JurkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,通过流式细胞技术检测在共培养体系中,DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平（FOXP3的表达）。（3）体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞（MNCS）,qRT-PCR的方法检测CCL5的表达;ELISA法检测EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量;趋化实验中,ELISA法检测BV2培养上清中CCL5的含量;transwell法验检测CCL5对小胶质细胞趋化能力变化。（4）体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞（MNCS）,qRT-PCR的方法检测AXL的表达;Western Blot法检测BV2细胞AXL的蛋白表达情况;吞噬试验中,先诱导PC12细胞凋亡,Annexin V-FITC双染法检测PC12细胞的凋亡率;间接免疫荧光方法检测BV2细胞对凋亡的PC12细胞的吞噬能力,并且采用荧光显微镜观察BV2细胞对凋亡PC12细胞的吞噬情况。3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究（1）为了在分子机制水平上验证DHA对AXL的依赖性,我们使用AXL的阻断剂SGI7079（0.2μM）阻断AXL的激活,我们首先采用BV2细胞吞噬凋亡PC12细胞的方法检测BV2细胞吞噬能力的变化;transwell法验检测CCL5对小鼠小胶质细胞BV2趋化能力变化;最后采用JurkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,间接免疫荧光法检测DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平（FOXP3的表达）。（2）Western Blot法检测BV2细胞经过DHA和LPS处理后AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达。在上述研究的基础上加入SGI7079作用后,同样检测AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1 的表达情况。（3）BV2细胞用DHA1和4 μM作用24h后,间接免疫荧光方法检测BV2细胞的PDL1,FOXP3,CYSE/F480的表达量,ELISA法检测BV2细胞上清中CCL5的含量,transwell法检测对BV2细胞的趋化能力。BV2细胞用IFN-β和STAT1阻断剂Fludarabine作用后,间接免疫荧光法检测CYSE+/F480+的表达量,Western Blot检测Phospho-STAT1,SOCS3,Total-AXL,Phospho-AXL的蛋白表达量。3.研究结果1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究模型验证:MOG35-55造模后,每日疾病评分逐渐增加;行为学步态等指标出现明确障碍。组织学水平和脊髓电镜超显微结构结果显示上伴随有髓鞘脱失。上述结果证明:EAE模型造模成功,满足用于药物评价的实验要求。1.1 DHA在EAE小鼠中具有机能改善和神经保护的作用RRMS动物模型药效验证:RRMS主要是发病的初期阶段,以中枢神经系统炎症为主并伴随有髓鞘脱失,因此,进行炎症损伤和神经保护检测。与EAE模型组相比,DHA各给药组和MET组能够改善EAE模型小鼠的技能活动障碍。并且在组织学水平上能够对髓鞘起到保护作用。在神经保护作用层面上,DHA中剂量效果明显优于MET组。SPMS动物模型药效验证:SPMS是发病的后期,主要是少突胶质细胞失活而导致髓鞘大量的脱失,Olig 2则是少突胶质细胞的活性标记物,因此通过检测Olig 2的表达来反映少突胶质细胞的活性。与EAE模型组小鼠相比,DHA各给药组和MET组均能够改善EAE模型小鼠的机能活动障碍。组织学水平上,DHA各个剂量组和MET组均能显着提高Olig 2的阳性表达率,并且DHA剂量组具有剂量依赖性。1.2 DHA能够抑制RRMS小鼠中枢神经系统炎症H&E结果显示DHA和MET均能显着降低脑组织和脊髓组织中的炎症细胞浸润水平;DHA各个给药组和MET组均能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达,相反,抑炎因子IL-10、TGF-β的转录明显激活;同时,DHA重塑炎症反应平衡的活性具有显着的剂量依赖性,并且DHA中,高剂量组均优于MET组。2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究2.1基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析细胞亚群分析:得到了 14个细胞亚群,而与EAE疾病模型进程相关性最大的两类细胞亚群分别是巨噬细胞和小胶质细胞。差异基因分析:在EAE模型小鼠的14个细胞亚群中筛选出受DHA调控的基差异基因共305个,而在巨噬细胞和小胶质细胞中富集了差异明显（Fold change>2）的基因共计25个。最后,通过文献挖掘与分子验证,选择富集度最高的并且与EAE疾病进程关系较为密切的候选基因基因:AXL和CCL5,进行进一步的药理学分子机制研究;同时,基于前期研究提示和最新的免疫学研究进展,聚焦“小胶质细胞-T细胞整合调控单元”,从抗原递呈的双信号系统入手,从另一个角度开展药理学研究。2.2 DHA对自身免疫抗原递呈的药物活性研究首先,在分子水平,以Raw264.7和腹腔巨噬细胞为模型,DHA能够显着上调PDL1在细胞表面的表达水平;同时,在功能水平,DHA还能够促进Jurkat T细胞分化成Treg细胞,上调Treg表面标记分子FOXP3的表达。2.3 DHA对自身免疫炎性趋化的药物活性研究体内实验中,qRT-PCR结果表明,在MNCS中,DHA和MET均能够在转录水平抑制CCL5的表达,并且具有剂量依赖性,DHA效果优于MET组。ELISA结果说明,DHA能够减少EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量。体外实验中,ELISA结果显示,LPS能够升高BV2细胞培养上清中CCL5的含量,而DHA能够减少CCL5的含量;transwell的检测结果中,DHA能够减弱对BV2细胞的趋化能力。2.4 DHA对自身免疫炎症原清除的活性研究体内实验中,qRT-PCR结果表明,在MNCS中,DHA和MET均能够上调吞噬核心介导分子AXL的表达。Western Blot检测表明,DHA可以显着上调BV2细胞中AXL的表达;同时,通过凋亡细胞清除实验,荧光显微镜观察与流式细胞分析分别从定性与定量的双重角度证明:在PC12细胞诱导凋亡成功有效的前提下,DHA能够促进小胶质细胞对凋亡细胞的胞葬能力,促进凋亡细胞碎片的有效清除。3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究3.1基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究在进一步的机制研究中发现,BV2细胞在AXL的阻断剂SGI7079干预后,间接免疫荧光结果显示,DHA对自身免疫抗原递呈的能力可被SGI7079所消除;荧光显微镜观察和间接免疫荧光检测可发现,DHA对自身免疫炎症原清除能力也被SGI7079所抑制;transwell检测表明,自身免疫炎性趋化能力也被SGI7079所阻断。3.2 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究机制通路水平的研究中,Western Blot检测表明,DHA分别能够上调Total-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达,差异具有统计学意义。而加入SGI7079作用后,DHA在上调Total-AXL的表达的情况下,其他Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达均被抑制。3.3 DHA对炎症“促-抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探间接免疫荧光结果表明,与NC组相比,DHA单独干预对自身免疫抗原递呈,自身免疫炎性趋化,自身免疫炎症原清除能力均无显着性差异;BV2细胞在IFN-β干预后,间接免疫荧光结果显示DHA可以增加CYSE+/F480+的细胞亚群的数量,促进BV2的吞噬能力,Fludarabine干预后BV2的吞噬能力则消失了。Western Blot检测表明,在IFN-β干预下,DHA就能上调Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达,当Fludarabine加入后,DHA对以上蛋白表达均无显着性差异。4.结论1.DHA可以改善EAE小鼠的运动机能障碍;并且在组织学水平上具有神经保护和调节炎症的作用,进一步缓解EAE模型小鼠的中枢神经系统炎症;2.中枢神经系统巨噬细胞及小胶质细胞是DHA在EAE模型中的主要效应细胞,同时小胶质细胞中AXL、CCL5等相关炎症分子的变化构成了DHA发挥药效的主要分子基础;3.DHA在中枢神经系统中对自身免疫性炎症的抗原递呈、炎症趋化、抗原清除发挥了系统而多样的调节活性,最终实现了自身免疫炎症反应的平衡重塑和髓鞘保护。分别总结如下:（1）DHA可以调节抗原加工递呈过程,降低T细胞对自身抗原的高反应状态。促进免疫共抑制分子PDL1的表面表达,逆转中枢神经系统自身免疫性炎症的过激状态,重塑T细胞（Th17/Treg）炎症促抑平衡。（2）DHA可以减少炎性趋化,降低CNS中炎性细胞的募集浸润水平。DHA能显着抑制炎性趋化因子CCL5的表达和分泌,减少炎症损伤部位炎性细胞的浸润,降低炎性细胞的运动趋化能力,进而延缓炎症损伤进展。（3）DHA能够增加小胶质细胞对损伤髓鞘的有效清除,促进炎症进程的主动消散。DHA能够显着且特异性的上调吞噬受体AXL的表达,加强病灶内凋亡细胞碎片的清除能力,减少自身免疫炎症原的暴露,削弱炎症反应的诱发水平。4 DHA对自身免疫炎症反应的调节活性聚焦于对AXL这一分子靶点的有效调控并依赖于“IFNAR-STAT1-SOCS3”信号通路的高水平活化状态。上述分子机制研究也为DHA治疗自身免疫炎症提供了病理选择性和药效特异性的初步实验提示。
谢登峰[4]（2020）在《应用诱导性少突胶质细胞祖细胞治疗小鼠自身免疫性脑脊髓炎的研究》文中研究指明多发性硬化症（Multiple sclerosis,MS）是一种中枢神经脱髓鞘疾病,影响着全球数百万人的身体健康,病重者甚至因此瘫痪残疾。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是研究该病的常用模型,能够很好地模拟MS的临床和病理表现。少突胶质细胞（Oligodendrocytes,OLs）是中枢神经的成髓鞘神经胶质细胞,由少突胶质细胞祖细胞（Oligodendrocyte precursor cells,OPCs）分化而来,具有修复髓鞘损伤的作用。鉴于OLs为已分化细胞,细胞增殖能力非常有限,难以满足细胞移植治疗的数量需求,OPCs成为了治疗髓鞘疾病的潜在有效细胞资源。然而,原代OPCs的分离和增殖培养较为困难。采用间接谱系转化技术将自身体细胞重编程成为OPC样的诱导性少突胶质细胞祖细胞（induced oligodendrocyte precursor cells,iOPCs）,可以获得大量的OPCs用于细胞治疗,降低免疫排斥反应,有效避免多能干细胞移植的细胞异质性和致瘤性,比利用诱导性多能干细胞分化获得OPCs的途径更为简单。因此,本试验利用药物诱导建立了小鼠EAE模型,采用间接谱系转化技术将NIH/3T3细胞转化成为iOPCs,并利用microRNA（miRNA）转染iOPCs,体外验证其分化成为成熟iOLs的能力。结合芬戈莫德（FTY720）抑制EAE的病程,改善病变处微环境的功能,通过侧脑室注射移植iOPCs进入EAE小鼠脑内,探究其治疗效果,为脱髓鞘疾病的细胞治疗、药物开发等提供参考。试验一小鼠EAE模型的构建及鉴定小鼠EAE是研究MS发病机理和研发其防治策略的理想动物模型,成功构建稳定的EAE模型是研究MS的基础。本试验采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG）与完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）混合乳化后,皮下注射C57BL/6小鼠,并在注射后的0 h和48 h腹腔注射百日咳毒素（Pertussis toxin,PTX）,诱导EAE模型。结果表明:（1）每只小鼠于背部皮下六点注射100μg MOG35-55时,EAE的发病率最高,可达66.7±5.77%;（2）小鼠于注射后第12天开始陆续发病,表现出体重减轻,尾巴和后肢无力,临床评分开始达到1分;随后体重一直下降,病情逐渐加重,后肢逐渐失去行动能力而导致瘫痪,大多数小鼠在第21天左右的临床评分可达到3分;之后症状逐渐缓解,在28天左右会再次复发,体重也随之波动;（3）病理组织切片经HE染色后呈现出明显的小胶质细胞增生聚集现象,脊髓经Luxol Fast Blue染色后可观察到髓鞘脱失现象,表明EAE小鼠构建成功。因此,利用100μg MOG35-55、CFA以及PTX可以高效、稳定地建立小鼠EAE模型。试验二miRNA对iOPCs体外分化成熟的影响为了突破髓鞘形成障碍性疾病治疗中植入干细胞或祖细胞的分化容易卡在OPCs与OLs之间的瓶颈,提高能够生成髓鞘的成熟OLs的获取效率,改善这类疾病的治疗效果,本研究采用间接谱系转化技术重编程NIH/3T3细胞成为iOPCs,并采用不同组合的miRNA（miR23a、miR138和/或miR219）转染iOPCs,通过分析OLs标志蛋白——髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）的表达,探讨体外促使iOPCs分化成熟的策略。结果表明:（1）利用Lipofectamine LTX介导Olig2、Nkx6.2和Sox10转录因子的过表达,可以成功地将NIH/3T3细胞重编程为两极突起、A2B5阳性的OPC样细胞,且A2B5阳性率可达到71.24±3.21%;（2）免疫细胞化学染色结果表明各miRNA转染处理组细胞的MBP平均阳性率达到85%以上,且各组之间无显着差异（P>0.05）;RT-qPCR的结果表明转染有miR138的处理组来源iOLs的MBP表达量极显着高于对照组（P<0.01）。在单独转染miR23a或miR219的处理中,iOLs的MBP表达量与对照组没有显着性差异（P>0.05）。同时转染了miR23a、miR138和miR219的处理组中,iOLs的MBP表达量最高。因此iOPCs同时转染miR23a、miR138和miR219有利于促进其分化成为成熟的iOLs。试验三芬戈莫德结合iOPCs移植治疗小鼠EAE的研究鉴于芬戈莫德具有阻止EAE病程进展和改善局部疾病微环境的作用,能为移植iOPCs治疗EAE创造良好的条件,结合转染有miRNA的iOPCs能够分化成为功能性OLs,修复受损髓鞘,达到治疗脱髓鞘疾病的目的,本研究先用FTY720灌胃EAE小鼠,再经侧脑室注射转染有miRNA的iOPCs,通过临床观察、流式细胞术、ELISA检测、磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）、Western Blot检测等技术评估EAE小鼠的治疗效果。结果表明:（1）EAE小鼠经FTY720治疗后,临床评分不再升高。流式细胞术结果显示对照组EAE小鼠外周血液中CD4+、CD8+T细胞比例极显着高于正常小鼠（P<0.01）,FTY720治疗组EAE小鼠CD4+、CD8+T细胞比例极显着低于对照组（P<0.01）,且显着低于正常组小鼠（P<0.05）;ELISA结果显示对照组与FTY720治疗组中的IL-17含量分别为384±8ng/L和375±15 ng/L,两者并无显着差异（P>0.05）,但都极显着高于正常小鼠中IL-17的含量（251±5 ng/L）（P<0.01）,说明FTY720通过减少外周血中T淋巴细胞数量对EAE有明显的抑制作用,但对炎症因子IL-17的分泌并无明显抑制效果;（2）在FTY720与iOPCs联合治疗处理组中,EAE小鼠后肢在治疗一周后能在一定程度上恢复抓握能力,MRI检测显示正常小鼠脑部无明显损伤,FTY720治疗组小鼠脑部损伤明显,FTY720与iOPCs联合治疗处理组的损伤情况优于FTY720治疗组,但与正常组相比,仍有较明显的损伤;Western Blot检测也表明FTY720结合iOPCs移植治疗EAE小鼠,其MBP蛋白含量要显着高于FTY720治疗组（P<0.05）,极显着低于正常组（P<0.01）。因此,每只小鼠按0.5 mg/kg·d的量灌胃FTY720一周后,再移植2×105个iOPCs的联合治疗,能够对EAE小鼠损伤的髓鞘产生一定的修复作用。结论:采用100μg MOG35-55多肽结合CFA和PTX可以有效地构建出EAE小鼠模型,注射后第12天开始发病,临床评分最高可达3分;通过过表达转录因子Nkx 6.2、Olig 2和Sox 10获得iOPCs后,转染mi R23a、miR138和miR219可以促使iOPCs向成熟iOLs方向分化;利用FTY720抑制EAE炎症反应后,通过侧脑室注射转染了miRNA的iOPCs,能够在一定程度上修复受损髓鞘,降低EAE评分,这为脱髓鞘疾病的治疗提供了新策略。
段若楠[5]（2020）在《PADMAL变异型的致病基因验证以及SMEK1在中枢神经损伤中的病理机制研究》文中研究指明第一部分COL4A1突变导致遗传性脑小血管病PADMAL的研究研究背景常染色体显性遗传微血管病变伴桥脑及脑白质病变（Pontine autosomal dominant microangiopathy and leukoencephalopathy,PADMAL）是一类 COL4A13’端非转录区突变引起的脑小血管病。PADMAL的遗传特质与其他脑小血管病如常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病（Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL）、脑视网膜血管病变（Retinal vasculopathy with cerebral leukodystrophy,RVCL）完全不同,作为COL4A1相关脑小血管病,PADMAL与COL4A1转录区突变所致疾病的表现也不相同,但其与瑞典遗传性多发性梗死性痴呆（hereditary multi-infarct dementia,hMID）在临床表现及遗传基因方面有较多相似性。PADMAL的临床诊断主要依赖于核磁共振（MRI）中桥脑更易受累,而颞叶受累罕见。与CADASIL相比,PADMAL患者颅内微出血较少见。研究目的1、鉴定一中国PADMAL家系的致病基因。2、比较PADMAL与瑞典hMID疾病临床特点、遗传因素的异同。研究方法1、对家系患者进行病史采集及神经系统查体。2、采集家系成员外周血后提取DNA,对患者DNA行全外显子组测序,Sanger测序验证可能的致病基因。3、对家系患者行颅脑及颈髓核磁共振扫描。4、对患者行皮肤活检并用电镜观察血管病理改变。研究结果1、家系患者于40岁左右时起病,临床表现以急性脑梗死引起的肢体无力及进行性痴呆为主。2、全外显子组测序提示家系患者COL4A1 3’端非转录区的一处杂合突变（c.*32G>A）。Sanger测序验证该突变位点在家系成员中共分离。3、家系患者颅脑及颈髓核磁共振成像中可见双侧脑白质病变及桥脑、颈髓腔隙性梗死灶。4、皮肤活检电镜中可见血管内皮细胞与平滑肌细胞之间有纤维沉积,皮肤小血管管腔变窄。结论1、报道中国人群中第一例常染色体显性遗传微血管病变伴桥脑及脑白质病变（PADMAL）,家系患者致病基因为COL4A1（c.*32G>A）。2、新发现家系患者颈髓病变,根据家系患者的临床特点、影像学表现、病理改变及致病基因,将PADMAL与瑞典hMID归类于同一疾病。第二部分SMEK1通过影响微管稳定性导致神经退行性病变的机制研究研究背景蛋白磷酸酶4（Protein phosphatase 4,PP4）是一种广泛表达于各组织器官中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。PP4参与了细胞中生物过程及信号通路,其中包括核转录因子κB（NF-κB）信号通路、氨基末端激酶（JNK）信号通路、凋亡传导通路、胰岛素受体底物4（IRS4）及雷帕霉素机制靶点（mTOR）通路。作为催化酶复合体,PP4包含催化亚基PP4C和调节亚基PPP4R3A（Protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A,SMEK1）和 PPP4R3B（Protein phosphatase 4 regulatory subunit 3B,SMEK2）。PPP4R3A又名 SMEk1（Suppressor Of mitogen-activated protein kinase 1 null）编码保守表达的 Smek1 蛋白,广泛存在于神经系统中,其主要定位于细胞核内、核周及细胞骨架处。根据细胞所处的分裂周期,Smek1的亚细胞定位会发生相应改变,在分裂间期、前期时Smek1大多定位于细胞核内,而前中期至后期时进入细胞质中,这与Smek1的核定位功能域相关。研究表明Smek1在神经发生中起重要作用。在神经前体细胞及神经干细胞中,Smek1可以通过Mbd3、Par3和Ryk调节神经细胞的分化和增殖,从而影响神经发生。为了进一步研究SMEK1在成年小鼠神经系统中的作用,本研究通过构建Smek1 flox/flox C57BL/6小鼠,利用Cre-LoxP重组酶系统将SMEK1全身敲除,探讨SMEK1在神经系统尤其是神经退行性改变中的潜在分子机制。研究方法1、探究Smek1在神经系统中的表达特性（1）利用公共数据库数据分析SMEK1在神经系统中的表达模式。（2）确定小鼠特定脑区中Smek1的表达情况及亚细胞定位。2、构建Smek1敲除小鼠（1）构建基因打靶所需的载体:通过同源重组在SMEK1线性化载体的第二外显子两端插入loxP位点,同时引入Neo标签以便筛选;（2）重组载体通过电转技术导入胚胎干细胞,经过药物筛选、PCR扩增、Southern blot筛选同源重组的胚胎干细胞;（3）制备嵌合型小鼠:将含目的质粒的胚胎干细胞通过显微注射入囊胚中,经注射的囊胚在假孕母鼠的子宫中生长得到嵌合型小鼠;（4）获得杂合突变小鼠:将杂合突变的嵌合型小鼠与野生型C57BL/6交配,利用PCR技术鉴定子代小鼠基因型得到F1代杂合突变小鼠;（5）获得纯合突变小鼠:将F1代杂合突变小鼠互交,获得F2代Smek1 flox/flox小鼠;（6）获得全身敲除小鼠:将Smek1 flox/flox小鼠与Sox2-Cre C57BL/6小鼠杂交,获得F1代Smek1-/+全身敲除杂合小鼠,将F1代杂合突变小鼠互交,获得F2代小鼠;（7）获得C57BL/6-1CR混合遗传背景敲除小鼠:将F1代Smek1-/+小鼠与野生型ICR小鼠交配,取子代小鼠中Smek1-/+小鼠互交得到混合背景的野生、杂合及纯合敲除小鼠。3、Smek1敲除小鼠的表型观察及行为学研究（1）观察并记录小鼠的出生率及生存期,记录第4-12周小鼠体重;（2）记录小鼠运动行为及认知行为:后肢抱握、转棒试验、跑台试验、旷场试验、T型水迷宫及筑巢试验。4、Smek1敲除小鼠神经系统病理改变（1）取2月龄小鼠脑切片行尼氏染色;（2）取12月龄小鼠脑、脊髓切片行NeuN、GFAP、MBP免疫荧光染色、BDNF免疫组化染色、尼氏染色及Bielschowsky银染;（3）12月龄小鼠腓肠肌肌肉H&E染色。5、敲除SMEK1后对微管稳定性的影响（1）构建敲低SMEK1、过表达SMEK1的SH-SY5Y稳筛细胞系;（2）利用Smek1与微管标志蛋白共染,显示Smek1在坐骨神经和SH-SY5Y细胞系中的定位;（3）取12月龄小鼠坐骨神经及视神经行电镜检测;（4）利用SH-SY5Y细胞系验证Smek1缺失对微管的影响。6、Smek1通过调控Kif2a及Tau影响神经退行性病变的机制（1）Co-IP和Duolink实验验证Smek1与Kif2a的相互作用;（2）利用质核分离手段鉴定Kif2a的亚细胞定位特征;（3）免疫荧光检测Kif2a在脑组织中的表达情况;（4）利用Western blot检测稳筛细胞系PI3K-AKT信号通路变化。7、SMEK1减少引发线粒体运输异常及细胞凋亡（1）利用mitoTracker显示线粒体在SH-SY5Y稳筛细胞系中的定位;（2）电镜显示坐骨神经中的线粒体与微管的关系;（3）小鼠肌肉组织NADH染色;（4）利用CCK8检测细胞的增殖情况及线粒体活性;（5）TUNEL染色显示老年鼠脑组织凋亡情况;（6）PI染色检测稳筛细胞系的凋亡水平。实验结果1、SMEK1广泛表达于中枢神经系统SMEK1在大脑的海马、皮层、黑质、纹状体等多个脑区中有较高的表达量。相比于青年人,老年人的前额皮层及海马组织中SMEK1的表达量降低。2、SMEK1缺失影响小鼠的胚胎、幼鼠的发育及衰老过程C57BL/6 SMEK1-/+小鼠自交后,共获得353只子代小鼠,其中纯合小鼠仅有15只;C57BL/6与ICR混合遗传背景的SMEK1-/+自交后得到90只小鼠,其中纯合小鼠9只,以上2种交配方案得到的子代数目均不符合孟德尔分离率,这提示敲除SMEK1后可导致大部分胚胎死亡。C57BL/6纯合小鼠体重轻,生存期短,杂合及纯合子从6月龄开始出现运动能力下降,纯合小鼠的运动障碍较杂合小鼠更为明显,并随着年龄增长下降而加重。同时小鼠在6月龄以后出现轻度的认知功能下降。3、SMEK1缺失可导致神经系统退行性改变12月龄Smek1敲除小鼠的海马及运动皮层、脊髓前角存在神经元丢失及星形胶质细胞激活。SMEK1减少时星形胶质细胞合成脑神经营养因子减少。腓肠肌肌肉染色提示失神经改变,脑和脊髓中未见明显的脱髓鞘。4、SMEK1缺失时神经元轴突微管稳定性下降Smek1在坐骨神经及神经母细胞瘤细胞系中与微管共定位。Smek1敲除鼠的脑组织中神经纤维减少,小鼠坐骨神经及视神经的微管明显减少,同时在敲低SMEK1的稳筛细胞系中细胞骨架和微管稀疏,而过表达SMEK1时相应蛋白表达增多。5、Smek1通过调控Kif2a及Tau影响神经退行性病变的机制Kif2a可通过微管解聚使神经元的轴突变短,Smek1与Kif2a在细胞核和细胞质中均存在相互结合,且Smek1敲低时Kif2a入核减少,在Smek1表达减少时,影响微管稳定性的Tau蛋白磷酸化水平增加,而其上游的PI3K-AKT通路也相应改变。6、SMEK1维持了微管稳定性、线粒体运输和功能、神经元的存活坐骨神经电镜显示纯合敲除小鼠线粒体的运输存在异常,在SH-SY5Y稳筛细胞系中发现SMEK1敲低时线粒体主要定位于胞核周围,而高表达时线粒体可运输至细胞突起远端。同时SH-SY5Y稳筛细胞系线粒体膜电位下降,CCK8检测示线粒体功能下降。TUNEL染色显示敲除小鼠脑组织中有凋亡信号,稳筛细胞系的PI染色显示敲低SMEK1时凋亡细胞增多。结论1、SMEK1缺失可加速小鼠神经系统衰老,表现为运动及认知执行能力下降。2、SMEK1通过影响神经微管的稳定性,进而影响线粒体的微管运输及功能。3、Smek1敲除小鼠中枢内提前出现神经元丢失、轴突减少和胶质增生,周围神经中可见神经纤维内微管破坏增多。第三部分SMEK1缺失诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎加重的机制研究研究背景实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是一种主要由CD4+辅助T细胞介导的、累及中枢神经系统的炎性脱髓鞘性疾病,是目前公认的研究人类多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）的理想动物模型。通过免疫同种抗原可以在易感动物中成功地诱导发生。小胶质细胞作为中枢神经系统的炎性细胞在EAE和MS中发挥重要作用。小胶质细胞激活后分泌炎症因子如IL-1β可引起颅内病变,同时星形胶质细胞活化后一方面可以参与到炎症反应中,另一方面,星形胶质细胞的异常可引起血脑屏障通透性增加,进一步加重神经炎症。干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ）作为Th1分泌的主要细胞因子在EAE/MS的发病过程中扮演着多重角色。研究表明在EAE动物模型及多发性硬化患者中注射干扰素γ和抗干扰素γ的抗体均可加重疾病表型。此外,将干扰素γ修饰的树突状细胞（dendritic cell,DC）注射入EAE动物模型体内后可通过调节吲哚胺-2,3-加双氧酶1（Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1,IDO1）降低疾病评分。在EAE的发病过程中,DC可通过参与抗原递呈而发挥免疫调节作用。芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）在激活后可以诱导DC免疫耐受从而抑制EAE的致病性。已有文章表明PP4参与消化系统免疫调控过程,而SMEK1作为PP4的调节亚基在自身免疫病中的作用尚无报道,目前已知Smek1广泛表达于外周血中多种免疫细胞,同时,Smek1参与了胚胎时期神经发生等重要过程。因此本研究通过中枢神经系统自身免疫动物模型以探究SMEK1在中枢神经免疫和炎症中的作用和机制。研究目的1、探究Smek1敲除对EAE临床表现及组织病理改变。2、研究Smek1在小鼠免疫系统及中枢神经系统炎症中的作用机制。研究方法1、利用GEO数据库分析Smek1在多发性硬化患者外周血及脑组织的表达情况。取6-8周龄Smek1杂合敲除鼠及同窝野生型雌鼠皮下注射MOG35-55乳化液诱导EAE模型,同时腹腔注射200 ng-300 ng PTX,免疫当日计为第0天,48小时后再次腹腔注射等量PTX。每日记录免疫小鼠的体重并进行临床评分。2、在EAE小鼠发病达到最高峰时将小鼠处死,取小鼠脊髓颈膨大节段并保存于组织固定液,石蜡包埋,连续切片,行H&E、免疫组化染色显示小鼠炎性细胞浸润情况。3、取EAE小鼠脾脏及腹股沟、腋窝淋巴结制备成单细胞悬液,根据检测目的,加入CD11c、CD80、CD86、MHC-II检测DC,或将细胞种至培养皿中刺激阻断后分别加入CD4、IFN-y抗体检测Th1细胞,加入CD4、IL-4、IL-10检测Th2,加入F4/80、IL-1β检测巨噬细胞。4、取6-8周雌鼠的脾脏,在1640培养基中分别加入anti-CD3、anti-CD28、anti-IFN-γ及LPS体外诱导分化,实时荧光PCR及Western blot检测细胞因子转录水平的改变及相关通路的变化。5、对EAE小鼠脊髓切片行免疫荧光及免疫组化染色,显示中枢神经系统内胶质细胞的激活及MMP9的沉积,向小鼠注射荧光素钠检测EAE免疫小鼠血脑屏障通透性。利用小胶质细胞系及EAE小鼠脊髓切片行AhR免疫荧光染色。6、取疾病高峰期小鼠的脑组织提取mRNA及蛋白。将mRNA逆转录为cDNA后行实时荧光PCR。蛋白提取后定量、Western blot检测相应指标。同时,取EAE小鼠血清及脑组织,用ELISA法测定外周血中IL-1β水平。7、单细胞测序结果分析敲除Smek1后小鼠脑组织内小胶质细胞的转录表达模式。研究结果1、Smek1缺失可导致多发性硬化及EAE小鼠临床症状加重在多发性硬化患者的外周血及脑组织中SMEK1表达水平降低,Smek1杂合敲除小鼠在EAE中临床表现更为严重。2、敲除Smek1抑制IFN-γ而促进巨噬细胞的活化在EAE小鼠中,Smek1杂合敲除鼠的脊髓炎性细胞浸润增多,然而CD4阳性细胞较少,IBA1阳性细胞占浸润细胞的主要部分。流式细胞术检测实验性自身免疫性脑炎小鼠脾脏和淋巴结中的单个核细胞发现IFN-y减少而IL-1β增多。3、Smek1杂合敲除鼠中枢神经系统中胶质细胞激活在Smek1杂合敲除的EAE小鼠中,星形胶质细胞和小胶质细胞激活,并分泌大量IL-1β。同时中枢神经系统内NF-kappaB通路激活,血脑屏障通透性增高。4、单细胞测序发现Smek1敲除鼠存在新的小胶质细胞亚群我们在小鼠皮质、海马的单细胞测序结果中发现Smek1敲除鼠存在两群表达模式完全不同的小胶质细胞,其中一群小胶质细胞高表达炎性分子,进一步分析发现该群小胶质细胞是由异常分化形成的。5、Smek1杂合敲除鼠通过减少IFN-γ的分泌抑制了小胶质细胞及淋巴细胞内的犬尿酸-芳香烃受体通路在Smek1杂合敲除鼠的脾脏中的免疫细胞和中枢神经系统内的小胶质细胞中芳香烃受体及其上游的吲哚胺-2,3-加双氧酶的处于抑制状态,同时在转录水平下调抑炎因子IL-10,从而加重敲除鼠中的临床表型。体外分离小鼠脾脏细胞并加入anti-CD3、anti-CD28刺激培养,Smek1杂合敲除小鼠脾脏细胞IFN-y及IL-10 mRNA水平降低。结论1、SMEK1敲除后小鼠髓系巨噬细胞IL-1β表达增多,免疫后巨噬细胞激活增多。2、SMEK1敲除小鼠脑内存在一群新分化小胶质细胞发挥促炎作用。3、SMEK1敲除EAE小鼠中,IFN-γ分泌减少,导致免疫抑制通路IDO1-AhR受损。
鹿凯利[6]（2019）在《重组ADAMTS13对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经保护作用》文中提出研究背景和目的血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13）是一种金属蛋白酶,在预防微血管血栓形成方面发挥重要作用。近些年来重组ADAMTS13抑制炎症反应的作用,逐渐开始得到重视。研究发现重组ADAMTS13可以抑制动脉粥样硬化和卒中模型的炎症反应。此外,临床和基础研究均证实炎症反应在多发性硬化的病理过程中发挥至关重要作用。近期研究发现多发性硬化患者血浆中ADAMTS13水平降低。因此,本研究采用多发性硬化（MS）的经典动物模型--实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型,旨在观察重组ADAMTS13药物在EAE小鼠中是否能够发挥保护作用。研究方法以C57BL/6雌性小鼠为研究对象,采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)多肽构建EAE模型。分别在EAE病程7-21天或者15-29天,每日侧脑室注射重组ADAMTS13。首先,通过EAE小鼠的临床评分、最高评分和起病时间点,评估重组ADAMTS13对EAE小鼠神经功能的保护作用。然后,运用组织化学染色（HE、LFB）检测EAE小鼠脊髓冰冻切片的炎症细胞浸润和髓鞘脱失等病理改变;采用免疫荧光染色方法（CD3、Iba1、Ly6g）和流式细胞术检测脊髓组织中T淋巴细胞、小胶质细胞和中性粒细胞的浸润。最后,通过伊文思蓝染色检测血脊髓屏障通透性,采用Western blot方法检测EAE小鼠脊髓组织紧密连接蛋白occludin的水平;通过PCR方法检测EAE小鼠脊髓组织趋化因子CXCL1和CCL2的表达;采用ELISA方法检测脊髓组织中IL-1β、IL-17、IFN-γ细胞因子水平;运用流式细胞术检测重组ADAMTS13治疗对小鼠外周血和脾脏中细胞亚群的影响。研究结果与vehicle相比,重组ADAMTS13治疗性给药可以改善EAE小鼠临床症状、减少脊髓组织炎性细胞的浸润和髓鞘脱失。同样,重组ADAMTS13预防性给药也可以显着性地改善EAE小鼠的临床症状、减轻脊髓组织炎性细胞的浸润和髓鞘脱失。免疫荧光及流式细胞术结果均发现重组ADAMTS13降低脊髓组织中T淋巴细胞、中性粒细胞的数量。EAE小鼠血脊髓屏障通透性降低,脊髓中CXCL1和CCL2趋化因子的表达水平降低,以及IL-1β和IL-17细胞因子水平降低,共同参与了重组ADAMTS13在EAE小鼠模型中的炎性抑制及髓鞘保护作用。EAE小鼠外周血和脾脏中的白细胞不受重组ADAMTS13侧脑室给药的影响。研究结论本研究结果显示,重组ADAMTS13治疗可以减轻EAE小鼠血脊髓屏障损伤、抑制脊髓内炎症反应而发挥髓鞘保护作用,可能为MS治疗提供新的策略。
李波[7]（2019）在《基于可溶性CD83-吲哚胺-2,3-双加氧酶-色氨酸犬尿氨酸途径的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病机制及治疗研究》文中研究指明多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种累及中枢神经系统（central nervous system,CNS）的自身免疫性疾病,临床表现以多病灶症状体征及病程反复为特点,是导致中青年人永久性神经功能障碍的常见原因,给患者及其家庭和社会带来沉重负担。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）可以从发病表现及病理改变等多方面模拟MS,被广泛用于MS发病机制及治疗的研究。尽管目前研究认为其涉及自身免疫失衡,炎症,细胞凋亡和氧化应激等多发面,MS中神经变性的确切机制仍有待阐明。尽管目前疾病修饰药物治疗可在一定程度上减缓疾病的进展和改善患者主观不适,但神经功能缺陷往往伴随患者整个病程甚至终生。因此,加强对多发性硬化新的发病机制及治疗方法的探索成为重要课题。神经系统正常功能依赖于免疫功能的稳定,免疫稳态破坏与多发性硬化等多种神经系统自身免疫性疾病相关,免疫调节治疗也是多发性硬化治疗的重要方法。神经系统免疫功能的调节有多种分子或反应途径参与,基于我们近期研究及文献查询结果,我们提出一条新的免疫调节通路概念:可溶性 CD83（soluble CD83,sCD83）-吲哚胺-2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）-色氨酸犬尿氨酸途径,sCD83是免疫调节相关分子,吲哚胺2,3-双加氧酶及色氨酸犬尿氨酸途径产物参与神经免疫调节作用,CD83+T细胞具有免疫调节功能。该通路各环节对MS治疗均具有重要意义。基于上述免疫调节通路,本研究中,我们分别应用吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂（曲尼司特）、拮抗剂（NLG919）以及抗氧化剂（硫辛酸）为干预剂,诱导建立实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,并给予干预,从髓鞘轴突病理变化、色氨酸犬尿氨酸代谢改变、炎性因子谱改变、细胞凋亡及氧化应激损伤、免疫调节细胞变化等多方面进行研究,探讨多发性硬化发病机制及干预剂对治疗的提示意义。第一部分 吲哚胺-2,3-双加氧酶拮抗剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究目的:以C57BL/6雌性小鼠建立多发性硬化的小鼠模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,利用吲哚胺-2,3-双加氧酶拮抗剂NLG919进行干预,观察实验小鼠发病情况,药物的干预作用,应用HE染色、电镜、Western Blot、ELISA、流式细胞术等方法,从炎性病理改变、凋亡、氧化应激、免疫调节等多方面研究探讨NLG919对EAE小鼠的影响。方法:1.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立。应用周龄为8-10周的C57BL/6雌性小鼠,体重约为18-20g,使用MOG35-55作为免疫抗原,在其中加入等体积的完全弗氏佐剂（CFA）并与一定含量的结核菌素充分混匀,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部多点皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）,即建立完成EAE小鼠模型。2.实验动物的分组及干预。将实验小鼠随机分为正常对照组、EAE组溶媒组及NLG919干预组。将NLG919用1.5%羧甲基纤维素钠制备悬浊液,每天现配现用,自发病第1天开始连续7天,按50mg/kg体重给予NLG919治疗组每天灌胃给药。正常对照组及EAE+溶媒组小鼠自发病后第1天开始连续7天,每日给予等量的生理盐水及1.5%羧甲基纤维素钠每日灌胃给药。3.神经功能评分。自免疫后的第1天起,分别由两名实验员在两个时间点采用双盲法于每天早晚（8:00和16:00）两次对小鼠进行神经功能评分并称重。神经功能评分使用的是Knoz 5分评分法。4.病理组织学观察。用HE染色观察实验小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况。用透射电镜观察实验小鼠脊髓腰膨大髓鞘、轴突及线粒体的变化情况。5.用Western Blot的方法,检测各组实验小鼠脊髓腰膨大淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）表达水平的变化和髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）表达水平的变化。6.ELISA评估炎性细胞因子IFN-丫,IL-10,IL-17A,TGF-β1表达水平的变化,评估氧化应激因子8-OHdG表达水平的变化,评估外周细胞凋亡因子Caspase-8表达水平的变化7.流式细胞术评估外周免疫调节细胞Tregs表达水平的变化。8.统计学分析。采用SPSS21.0统计软件（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”（x±s）表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。应用Student’s t检验进行两组之间差异的统计学分析,三组或更多组之间的统计学差异通过单因素方差分析及Newman-Keuls多重比较检验来分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.NLG919对EAE小鼠的干预使EAE小鼠的临床症状恶化,增加EAE小鼠神经功能学评分;2.NLG919药物对EAE小鼠的干预可以加重中枢神经系统（脊髓腰膨大）的炎性细胞的浸润病变;3.NLG919药物对EAE小鼠干预后,通过透射电镜观察,发现NLG919可以加重脊髓腰膨大髓鞘、轴突及线粒体的破坏程度;4.NLG919药物对EAE小鼠的干预使细胞因子TGF-β1表达减少,IL-10增加,显着增加IFN-γ表达,IL-17A表达显示出与IFN-γ相似的趋势;5.NLG919药物对EAE小鼠的干预使8-OHdG产生明显增加;6.NLG919药物对EAE小鼠的干预使Caspase-8表达降低;7.NLG919 药物对EAE小鼠的干预使Tregs水平明显降低。第二部分 吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究目的:以C57BL/6雌性小鼠建立多发性硬化的小鼠模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,利用吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂曲尼司特进行干预,观察实验小鼠发病情况,药物的干预作用,应用HE染色、电镜、Western Blot、ELISA、RT-PCR、流式细胞术等方法,从炎性病理改变、代谢、凋亡、氧化应激、免疫调节等多方面研究探讨曲尼司特对EAE小鼠的影响。方法：1.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立。应用周龄为8-10周的C57BL/6雌性小鼠,体重约为18-20g,使用MOG35-55作为免疫抗原,在其中加入等体积的完全弗氏佐剂（CFA）并与一定含量的结核菌素充分混匀,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部多点皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）,即建立完成EAE小鼠模型。2.实验动物的分组及干预。将曲尼司特用1.5%羧甲基纤维素钠制备悬浊液,每天现配现用,自发病第1天开始连续7天,按200mg/kg体重给予曲尼司特治疗组每天灌胃。正常对照组及EAE+溶媒组小鼠自发病后第1天开始连续7天,每日给予等量的生理盐水及1.5%羧甲基纤维素钠每日灌胃给药。3.神经功能评分。自免疫后的第1天起分别由两名实验员在两个时间点采用双盲法于每天早晚（8:00和16:00）两次对小鼠进行神经功能评分并称重。神经功能评分使用的是Knoz 5分评分法。4.病理组织学观察。用HE染色观察实验小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况。用透射电镜观察实验小鼠脊髓腰膨大髓鞘、轴突及线粒体的变化情况。5.Western Blot评估血清中sCD83表达水平变化。6.RT-PCR评估吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、EISA检测KYN表达水平变化。7.通过ELISA检测评估炎性相关细胞因子IFN-γ,IL-10,IL-17A,TGF-β1的水平变化。8.ELISA评估氧化应激因子8-OHdG表达水平的变化。9.ELISA评估细胞凋亡因子Caspase-8表达水平的变化。10.流式细胞术评估免疫调节细胞Tregs表达水平的变化。11.统计学分析。采用SPSS21.0统计软件（SPSS Inc.,Chicag,,IL,USA）进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”（x ±s）表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。应用Student’s t检验进行两组之间差异的统计学分析,三组或更多组之间的统计学差异通过单因素方差分析及Newman-Keuls多重比较检验来分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.曲尼司特治疗显着降低了 EAE小鼠平均最大神经学评分,曲尼司特治疗组小鼠的病程缩短并且恢复加快。2.EAE溶媒组实验小鼠病理组织切片HE染色呈现出弥漫性的炎性细胞浸润,EAE+曲尼司特组炎性细胞明显减少。在EAE-曲尼司特组小鼠中观察到较轻的髓鞘破坏、轴突退化变性及轻度损伤的线粒体。3.用Westernblot在血液中检测各组sCD83水平,结果显示,EAE-曲尼司特组sCD83水平升高,但与EAE-Veh组相比,差异无统计学意义。4.用RT-PCR评估吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、ELISA检测KYN表达水平变化,评估色氨酸犬尿氨酸代谢途径活化活性。结果显示,与EAE-Veh组相比,曲尼司特处理组小鼠的IDO mRNA和KYN表达显着增加。5.ELISA评估炎性细胞因子表达水平的变化,结果显示,EAE-Veh相比,曲尼司特治疗显着降低IFN-γ表达,不同组中的IL-17A表达显示出与IFN-γ相似的趋势。曲尼司特组TGF-β1的表达略低于EAE-Veh组。曲尼司特组中IL-10的水平升高最显着,各组间差异具有统计学意义。6.ELISA评估氧化应激因子表达水平的变化,结果显示,EAE-Veh组的8-OHdG水平显着高于对照组及曲尼司特处理组。7.ELISA评估细胞凋亡因子表达水平的变化,结果显示,EAE-曲尼司特组中的Caspase-8表达与EAE-Veh组及对照组相比显着增加。8.流式细胞术评估免疫调节细胞表达水平的变化,结果显示,曲尼司特组Tregs数量显着高于对照组及EAE-Veh组。第三部分 硫辛酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究目的:以C57BL/6雌性小鼠建立多发性硬化的小鼠模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,以可溶性CD83-吲哚胺-2,3-双加氧酶-色氨酸犬尿氨酸途径为基础,用抗氧化剂硫辛酸进行干预,观察实验小鼠发病情况以及药物的干预作用,应用Western Blot、ELISA、RT-PCR、流式细胞术等方法,从炎性改变、代谢、免疫调节等多方面研究探讨硫辛酸对EAE小鼠的影响。方法:1.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立。应用周龄为8-10周的C57BL/6雌性小鼠,体重约为18-20g,使用MOG35-55作为免疫抗原,在其中加入等体积的完全弗氏佐剂（CFA）并与一定含量的结核菌素充分混匀,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部多点皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）,即建立完成EAE小鼠模型。2.实验动物的分组及干预。硫辛酸溶解于l00mM pH7.4的Tris缓冲液中,每天现配现用,自发病第1天开始连续7天,按100mg/kg体重给予硫辛酸治疗组每天腹腔注射。正常对照组及EAE+溶媒组小鼠自发病后第1天开始连续7天,每日给予等量的生理盐水及Tris缓冲液每日腹腔注射给药。3.用R-PCR评估吲哚胺2,3-双加氧酶（1DO）、ELISA检测KYN表达水平变化。4.通过ELISA检测评估炎性相关细胞因子TNF-α、IL-10,TGF-β1的水平变化。5.应用Westem-blot检测EAE小鼠疾病不同状态的血清sCD83 水平。6.应用流式细胞术检测各组实验小鼠全血中Tregs细胞的数量及CD4+CD83+T细胞的数量。7.统计学分析。采用SPSS21.0统计软件（SPSSInc.,Chicago,IL,USA）进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”（x±s）表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。应用Student’s t检验进行两组之间差异的统计学分析,三组或更多组之间的统计学差异通过单因素方差分析及Newman-Keuls多重比较检验来分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.RT-PCR评估吲味胺2,3-双加氧酶（IDO）、ELISA检测KYN表达,结果分析显示,急性期EAE溶媒组小鼠的IDO mRNA和KYN表达较硫辛酸处理组显着增加。2.应用ELISA检测评估炎性相夫细胞因于TNF-α、IL-10,TGF-β1的水平,结果分析显示,硫辛酸治疗组与同期EAE溶媒组相比,TNF-α表达显着减少,TGF-β的表达量增加,IL-10水平明显升高。3.应用western-blot检测EAE小鼠疾病不同状态的血清sCD83水平,分析结果显示,与急性期溶媒组EAE组相比,硫辛酸处理组sCD83水平稍降低。4.用流式细胞术检测实验小鼠全血中Tregs细胞的数量、及CD4+CD83+T细胞的数量,结果分析显示,与急性期EAE溶媒组相比,硫辛酸处理组EAE的Tregs细胞数量显着增加;与急性期EAE溶媒组相比,硫辛酸处理组CD4+CD83+T细胞的数量减少。结论:1.吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂NLG919恶化EE病情,加重病理损伤,可能机制为:促进炎症反应及氧化应激,抑制外周细胞凋亡,减少免疫调节细胞的产生。2.吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂曲尼司特改善EAE病情,减轻病理损伤,可能机制为:抑制炎症反应及氧化应激,促进外周细胞凋亡,增加免疫调节细胞及分子的产生。3.硫辛酸使色氨酸犬尿氨酸代谢活性相对降低,抑制炎症反应,促进免疫调节分子SCD83相对表达增多,使外周Tregs细胞及CD4+CD83+T细胞数量增加。
时鹏[8]（2018）在《基于婴儿双歧杆菌通过对CD4+T细胞亚群影响治疗吉兰-巴雷综合征作用机制研究》文中研究说明目的:探讨CD4+T细胞亚群及相关因子如Th1（CD4+IFN-γ+）、Th2（CD4+ IL-4+）、Th17（CD4+IL-17+）和 Treg（CD4+CD25+Foxp3+）等平衡对 GBS 影响机制,并给予婴儿双歧杆菌药物干预,摸索合理肠菌无创治疗GBS的方法,为GBS的临床治疗开辟新途径并提供理论和实验依据。材料和方法:本研究首先收集一组GBS患者并予以临床神经功能缺损（GDSS）评分,并采用ELISA方法检测其和对照组外周血和脑脊液IL-17A、IFN-γ和IL-4水平,RT-PCR检测其肠道婴儿双歧杆菌水平,观察其之间相关性;同时建立GBS实验性自身免疫性周围神经炎大鼠（EAN）模型,予以GDSS评分,并分别予以胃肠注射生理盐水、低浓度婴儿双歧杆菌和高浓度婴儿双歧杆菌,观测其大鼠坐骨神经脱髓鞘和炎性浸润水平的病理变化,并予以肌电图检测坐骨神经传导速度、波幅和潜伏期变化,同时ELISA法检测外周血IL-17A、IFN-γ和IL-4水平,以观察婴儿双歧杆菌对EAN大鼠IFN-γ、IL-17A和IL-4平衡、临床瘫痪症状、周围神经和神经根脱髓鞘和炎性细胞浸润的影响。同时收集另一组GBS患者予以临床神经功能缺损（GDSS）评分,采用流式细胞术检测其和正常对照组外周血淋巴细胞 Th1（CD4+IFN-γ+）、Th2（CD4+IL-4+）、Th17（CD4+IL-17+）和 Treg（CD4+CD25+Foxp3+）细胞水平,同时检测RT-PCR检测其肠道婴儿双歧杆菌水平和Th1、Th2、Th17和Treg细胞相关转录因子T-bet、GATA-3、RORγτ、Foxp3+水平,观察其相关性;并且建立EAN大鼠模型,予以胃肠注射低浓度婴儿双歧杆菌、高浓度婴儿双歧杆菌和生理盐水,同时观测其GDSS评分和体重变化及电子显微镜观察其对坐骨神经髓鞘及轴索损害程度影响,以及流式细胞学检测其对EAN大鼠外周血Th1（CD4+IFN-γ+）、Th2（CD4+IL-4+）、Th17（CD4+IL-17+）和 Treg（CD4+CD25+Foxp3+）细胞水平变化影响。综合应用婴儿双歧杆菌胃肠注射为干预手段,结合ELISA法、流式细胞术、RT-PCR等方法,GBS患者新鲜大便、外周血液单核淋巴细胞和脑脊液、婴儿双歧杆菌及EAN大鼠模型为研究对象,探讨CD4+T亚群细胞及相关因子平衡对床治疗开辟新途径并提供理论和实验依据。结果:1.ELISA法分别检测30例GBS患者和20例对照组外周血浆及脑脊液IL-17A、IFN-γ和IL-4水平,我们发现GBS组外周血浆IL-17A、IFN-γ水平明显高于对照组（p<0.01和p<0.05）,但是IL-4水平差别无明显统计学意义（p>0.05）;而脑脊液中仅IL-17A水平明显高于对照组（p<0.01）,而IFN-γ和IL-4水平差异无明显统计学意义（p>0.05）;但是GBS患者肠道婴儿双歧杆菌水平明显低于健康对照组,差异有统计学意义（p<0.01）。接着我们分析GBS患者外周血浆和脑脊液IL-17A水平和肠道婴儿双歧杆菌浓度及GDSS评分可能的相关性发现,其外周血浆和脑脊液IL-17A水平与GDSS评分有明显正相关性（r= 0.5169,p=0.013;r=0.5388,p=0.005）;相反发现肠道婴儿双歧杆菌水平和GDSS评分呈明显负相关性（r=-0.4796,p=0.0258）;进一步分析发现其外周血浆和脑脊液IL-17A水平与肠道双歧杆菌浓度也呈负相关性（r=-0.4366,p=0.0279;r=-0.4259,p=0.0341）;经过2周的生理盐水、低浓度双歧杆菌及高浓度双歧杆菌胃肠注射,EAN大鼠外周血浆IL-17A、IFN-γ水平明显低于模型组（p<0.05和p<0.01）,但是IL-4水平差异无明显统计学意义（p>0.05）;其坐骨神经传导速度及波幅得到明显提高,其潜伏期也得到相应缩短（p<0.05）,因此推测,IL-17A、IFN-γ参与了GBS/EAN的发生、发展,婴儿双歧杆菌给药可以降低Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）的水平,婴儿双歧杆菌可以改善EAN大鼠临床症状和降低炎症因子水平。2.为了研究GBS患者CD4+T细胞的分化,我们用流式细胞术检测30例GBS患者和20名健康对照组外周血淋巴细胞 Th1（CD4+IFN-γ+）、Th2（CD4+IL-4+）、Th17（CD4+IL-17+）和 Treg（CD4+CD25+Foxp3+）细胞水平,我们发现 GBS 患者 Th2 和 Th17细胞明显高于健康对照组,但是Treg细胞大量减少（p<0.05）。为了进一步验证GBS患者CD4+T细胞的分化,同时采用RT-PCR检测Th1、Th2、Th17和Treg细胞相关转录因子 T-bet、GATA-3、RORγτ、Foxp3 水平,发现 GBS 患者 GATA-3 的 mRNA表达水平和RORγτmRNA显着高于健康对照组（p<0.05）,但是T-bet、Foxp3mRNA表达水平两者差异不明显,无统计学意义（p>0.05）。接下来,我们采用RT-PCR检测粪便样本中婴儿双歧杆菌的水平,结果显示,GBS患者肠道的婴儿双歧杆菌水平明显低于健康对照组（p<0.01）。进一步分析表明,GBS患者GATA-3的mRNA表达水平和RORγτmRNA表达水平与患者肠道的婴儿双歧杆菌水平呈负相关（分别为r=-0.5866,p=0.0279;r=-0.4259,p=0.0341）。另一方面,GBS 患者 Foxp3mRNA 表达=-0.5866,p=0.02 79;r=-0.4259,p=0.0341)。另一方面,GBS 患者 Foxp3mRNA 表达水平与婴儿双歧杆菌的浓度无相关性（r=0.234,p=0.057）,因此,表明Th2和Th17的水平增加和婴儿双歧杆菌的浓度降低,同时可能与GBS的发生发展有关;胃肠注射EAN大鼠婴儿双歧杆菌两周后,我们通过透射电子显微镜检查发现,坐骨神经的超微结构发生了改变,包括髓鞘的肿胀、组织结构紊乱和脱髓鞘症状均有所改善。此外,婴儿双歧杆菌明显改善了 EAN大鼠坐骨神经传导速度和波幅,并且婴儿双歧杆菌低浓度和高浓度之间这种作用没有区别。因此,我们因此推测双歧杆菌可以改善EAN大鼠临床症状和降低炎症因子水平。同时发现胃肠注射EAN大鼠婴儿双歧杆菌两周后,流式细胞学检测EAN大鼠外周血Th1（CD4+IFN-γ+）、Th2（CD4+IL-4+）、Th17（CD4+IL-17+）和 Treg（CD4+CD25+Foxp3+）细胞水平变化,我们发现 Th2 和 Th17细胞水平比模型组显着降低（p<0.01）,而Th1细胞的水平相比较,无明显变化（p>0.05）,但是Treg细胞显着高于模型组（p<0.01）,并且进一步研究发现,低和高浓度的婴儿双歧杆菌对这些改变无明显差别（p>0.05）。因此,在动物模型中,婴儿双歧杆菌给药可以降低Th2和Th17的水平,促进Treg细胞的水平升高,可以改善EAN大鼠临床症状。结论:1.CD4+T亚群细胞及相关因子Th1、Th2、Th17和Tregs与GBS/EAN发病机制及临床症状有一定的相关性,主要是Th17细胞促进GBS/EAN的发生发展,而Tregs细胞具有抑制其发生发展,对促进GBS临床症状改善有一定的作用。2.GBS/EAN患者肠道婴儿双歧杆菌水平较正常对照组明显下降,且肠道婴儿双歧杆菌越低和GDSS评分越高,提示婴儿双歧杆菌具有抑制GBS/EAN发生、发展,促进其临床症状改善的作用;3.而应用婴儿双歧杆菌后,EAN大鼠特别Th17细胞水平明显降低,而Tregs水平明显增加,同时GBS患者和EAN大鼠周围神经病理改变和临床症状均改善明显,通过应用婴儿双歧杆菌调节CD4+T亚群细胞及相关因子水平特别Th17/Tregs平衡是可以改善GBS/EAN患者临床症状。4.CD4+T亚群细胞及相关因子平衡对GBS具有一定的影响,给予婴儿双歧杆菌药物干预,可为GBS的临床治疗开辟新途径并提供理论和实验依据
杨茜[9]（2016）在《亚精胺对自身免疫疾病的调控及其机制》文中研究表明自身免疫疾病是由于自身的免疫系统错误地攻击、破坏健康的机体组织所导致的,目前已经发现80余种自身免疫疾病。其中,多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是以中枢神经系统（central nervous system,CNS）白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫病,因T细胞介导的免疫耐受紊乱而导致的神经髓鞘和轴索发生了炎性损害。在对MS的经典动物模型--实验性自身反应性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的研究中发现,多种转录因子、免疫分子、免疫细胞相互联系,相互作用,影响着疾病的病理进程,其中Th1、Th17细胞、巨噬细胞等对于EAE的发病均起着重要的作用。对此,机体高度进化的负反馈免疫调节机制参与了调整炎症反应和固有免疫从而影响疾病的进程。其中,机体的多种代谢产物也具有复杂的免疫调节作用。已有研究发现,广泛分布于组织细胞内的天然多胺,包括腐胺（putrescine,Pu）,亚精胺（spermidine,Sd）及精胺（spermine,Sm）,不但具有广泛的生物学调控作用,如促进细胞分化、增殖、生长、稳定细胞膜和亚细胞器结构,调控体内核酸、蛋白质的生物合成、修饰蛋白激酶等,并且具有一定的免疫调控作用。其中,亚精胺在多种疾病条件下发挥了调节炎症的作用。本研究论文深入而全面的探究了亚精胺在EAE发病过程中的调节作用及机制,进一步来分析亚精胺在干预自身免疫疾病中的潜在意义。研究中,我们发现亚精胺在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（EAE）中具有显着的预防及治疗效果。经过亚精胺干预后,患病小鼠体内的炎症反应受到抑制,炎性细胞浸润减少,促炎性的细胞因子水平得到下调。我们经过研究发现,亚精胺通过抑制免疫反应改善EAE的作用机制主要是调控巨噬细胞的功能,而并非直接作用于致病性T细胞,该结论有一系列实验证据支撑。首先,我们利用被动诱导EAE的模型,给受体小鼠输注未处理的或者经过亚精胺处理过的致病性T细胞,两组受体小鼠能够被动诱导出相同临床分数的EAE,该结果提示了亚精胺对T细胞的直接作用不能缓解EAE。第二,如果去除EAE小鼠体内的巨噬细胞,在此基础上亚精胺治疗并不能缓解EAE,所以巨噬细胞在其中发挥了重要作用。第三,我们分选出亚精胺治疗的EAE小鼠的巨噬细胞,将其与致病性T细胞共培养,能够显着抑制自身抗原介导的T细胞激活和增殖。因此,在EAE病理条件下,亚精胺能够通过调控促炎型巨噬细胞的功能间接抑制了具有自身免疫反应的致病性T细胞的活化和增殖,进而缓解了疾病的发展。我们进一步挖掘亚精胺对巨噬细胞免疫调节的具体机制,通过研究发现,亚精胺对巨噬细胞的调控作用是通过两种方式进行的。一方面是通过抑制NF-κB信号通路:亚精胺影响IκB的磷酸化和降解,同时亚精胺还抑制转录激活所需的p65的磷酸化（ser536）。NF-κB介导了众多炎症因子和共刺激分子的基因转录,这些炎症因子和共刺激分子是T细胞激活所需的“第二信号”,因此亚精胺通过下调NF-κB信号通路的活性来调控巨噬细胞的功能,抑制致病性T细胞的激活。另一方面,通过基因表达谱芯片分析和验证,我们发现了亚精胺能够上调巨噬细胞精氨酸酶1（arginase 1）的表达。据报道,巨噬细胞的精氨酸酶1能削弱T细胞的CD3ξ链,影响T细胞共刺激信号;同时高表达的精氨酸酶1可耗竭微环境里精氨酸,阻碍T细胞的激活和增殖。因此,我们从亚精胺处理的EAE小鼠中分离获得巨噬细胞,发现其具有免疫抑制功能,对EAE具有显着的治疗作用。当arginase 1抑制剂存在时,这些从亚精胺处理的EAE小鼠中分离获得的巨噬细胞不再具有免疫抑制和治疗EAE的作用,因此,亚精胺对巨噬细胞的调节是依赖于精氨酸酶1的。这些发现有助于我们加深对亚精胺是如何参与塑造机体免疫微环境的认识,尤其是调控炎症状态下巨噬细胞的活化状态。此外,亚精胺这种新的免疫调节机制的发现将为其将来在临床应用提供新的理论依据和参考。
胡景霞[10]（2013）在《实验性自身反应性脑脊髓炎中小胶质细胞通过PD-L1途径发挥免疫抑制作用》文中指出多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种常见的以中枢神经系统（central nervous system, CNS）炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是生命科学界公认的MS动物模型。MS患者和EAE动物共同的特点是发病后存在自我缓解的现象,这是大脑限制过强免疫应答的一种自我保护作用,提示CNS中存在对脑内自身抗原进行负向免疫调控的效应。但是,负向免疫调控的关键启动细胞是什么?负向免疫调控的作用机制是什么?中枢神经系统存在特化的组织吞噬细胞称为小胶质细胞（microglia）,被认为是CNS潜在的抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）。PD-L1/PD-1 （programmed cell death ligand-1/programmed death-1, PD-L1/PD-1）属于B7/CD28共刺激分子超家族的重要成员,是免疫反应效应阶段的负向调节信号通路,可通过调控T细胞的活性来诱导并维持的外周免疫耐受。研究表明,EAE发病动物CNS中PD-L1的表达逐渐增加,阻断PD-L1/PD-1信号通路造成EAE发病时间缩短并加重临床症状。由于小胶质细胞在脑组织中数量众多,且参与生理条件下的免疫赦免,那么疾病条件下它们是否表达PD-L1并通过PD-L1途径发挥免疫调节作用尚无人深入研究。为此本课题将观察小胶质细胞在MOG35-55 （myelin oligodendrocyte glycolprotein,MOG）诱导的EAE小鼠模型中数量及PD-L1表达的动态改变；明确小胶质细胞是否对T细胞具有抑制作用；探讨PD-L1分子是否具有调控小胶质细胞抑制作用的功能。本研究试图阐明小胶质细胞与EAE疾病进展和转归的关系,明确其在CNS负向免疫调控中所扮演的角色,为寻找CNS免疫性疾病的治疗靶点提供理论基础和实验依据。本研究主要包括五部分的内容：（1） MOG35-55诱发C57BL/6小鼠EAE模型的构建我们成功建立了人MS的C57BL/6小鼠EAE模型。用MOG35-55肽段并辅以结核杆菌及百日咳毒素免疫EAE敏感动物品系C57BL/6小鼠,免疫后第10天开始陆续发病,出现EAE典型的神经系统临床症状,病程为慢性单时相进展型,约在第20天达到发病高峰,同时伴随CNS组织的病理改变,HE染色检测结果发现,在脊髓白质区血管周围有大量淋巴细胞浸润,即呈“袖套样”炎性结构改变。而对照组动物始终未出现任何的神经系统症状,CNS中也未见任何病理学改变的征象。（2）动态监测EAE小鼠模型中小胶质细胞的数量、表型和活化状态采用流式细胞仪检测结果显示未处理组小鼠CNS的小胶质细胞（CD45lowCD11b+）占CD45+细胞的92.9%,EAE组小胶质细胞所占比例持续下降,高峰期比例下降至46.2%,恢复期逐渐回升。小胶质细胞绝对计数显示细胞数量呈现持续上升的趋势,与未处理小鼠比较,发病前期小胶质细胞的数量上升,但是并不明显（P>0.05）,发病初期、发病中期及高峰期与未处理组对比具有统计学意义（p<0.05）。小胶质细胞的数量与疾病进展具有明显的相关性。本研究动态检测了小胶质细胞表面与抗原提呈相关的膜表面分子的表达情况,结果显示,小胶质细胞表面MHC-Ⅱ分子的表达呈进行性增加,刺激性协同刺激分子CD86表达在发病初期明显增加（p<0.05）,但是在疾病中期表达恢复正常。抑制性协同刺激分子PD-L1的表达与MHC-Ⅱ分子基本一致,呈进行性增加,在发病初期、中期和高峰期均明显增加（p<0.05）。PD-L2和B7-DC变化无明显。发病初期,小胶质细胞的MHC-Ⅱ分子和CD86共表达,提示此时期的小胶质细胞具有免疫激活作用,而发病中期和高发期,MHC-Ⅱ分子和PD-L1共表达,表明此时期的小胶质细胞可发挥免疫调控作用。本研究通过免疫荧光检测技术检测EAE模型小鼠腰髓组织中Iba-1的表达来确定小胶质细胞的分布和活化情况。正常组小胶质细胞表达低量的Iba-1,主要表现为分枝状,且细胞分布分散。EAE高峰期腰髓组织各个部位表达Iba-1均增加,其中外侧索、后正中裂和前正中沟区的白质内小胶质细胞胞体变大,分支回缩消失,形态粗壮,表现为树突状及阿米巴样,胞体相互有重叠。灰质区也可见Iba-1表达增高,胞体增大,细胞密度增加,但灰质区细胞密度较白质区低,细胞分支较白质区明显。（3）动态监测EAE模型小鼠CNS中CD4+T细胞的数量、PD-1的表达及其细胞亚群本研究检测EAE模型中CNS浸润的CD4+T细胞的比例,结果显示,CD4+T细胞在临床症状出现前已进入CNS,CD4+T细胞所占CD45+细胞的比例逐步上升,高峰期比例最高,达到20.8%,随后比例下降,表明发病高峰期某种因素触发了大量T细胞凋亡,从而促进了疾病的恢复。同时流式细胞术结果显示CNS浸润的CD4+T细胞表达PD-1进行性增加,高峰期表达量最高,有统计学意义（p<0.05）。本研究同时采用了免疫组织荧光标记技术标记CD4分子和PD-1分子,结果显示,EAE高峰期的脊髓切片中可见大量CD4+/pD-1+的细胞,且细胞分布与活化小胶质细胞聚集部位相吻合,为确定小胶质细胞与CD4+T细胞存在相互作用的可能性提供了形态学依据。本实验动态监测了EAE不同时期脑和脊髓中Thl和Th17细胞的变化,结果表明,随着EAE病程的进展,IFN-7和IL-17的表达呈现逐渐升高趋势,发病中期比例达到最高,随后比例下降,提示此时效应性CD4+T细胞可能发生了凋亡。本实验同时检测了CD4+ Foxp3+调节性T的动态变化,结果显示,CD4+ Foxp3+调节性T细胞在脑中持续上升,高峰期达到最高,为34.6%,缓解期下降。本实验的数据表明EAE高峰期IL-17和IFN-y表达呈下降趋势,而Treg继续呈现聚集和扩增,说明效应性T细胞的下降和Treg细胞的上调是限制CNS过强炎症反应的基本因素。（4）利用小胶质细胞与OVA323-339抗原特异性CD4+T细胞体外共培养系统验证小胶质细胞具有免疫抑制作用小胶质细胞与OT II特异的初始CD4+T细胞共培养观察小胶质细胞对初始T细胞的抗原提呈能力,结果显示,小胶质细胞具有一定的刺激T细胞增殖的能力即具有抗原提呈功能,但是该能力显着低于脾脏DC （spleen Dendrtitic cell, spDC）的作用。同时实验数据显示小胶质细胞可诱导Thl细胞的产生,但是Th17不受影响。将小胶质细胞体外加入到spDC/CD4+T细胞共培养体系中,观察它是否能够抑制由DC刺激所引起的CD4+T细胞的增殖。在spDC/CD4+T细胞共培养体系中加入小胶质细胞后,CD4+T细胞绝对计数显着降低,表明EAE小胶质细胞能显着抑制由DC刺激引起的CD4+T细胞的增殖。同时观察该培养体系中T细胞亚群情况发现加入小胶质细胞组与单纯spDC/CD4+T细胞组比较,CD4+IFN-γ+细胞明显减少,均具有统计学意义（p<0.05）,Thl7无明显变化。结果说明,EAE小胶质细胞可抑制spDC诱导的Thl细胞分化,但是不影响Th17的分化。（5）探讨小胶质细胞发挥免疫抑制作用的机制为了探讨小胶质细胞发挥免疫抑制作用的机制,我们检测了共培养体系中Treg细胞的变化,结果显示,EAE-microglia/T组的Treg细胞的比例明显高于单纯CD4+T组,具有统计学差异（p<0.05）; spDC/T组加入EAE高峰期小胶质细胞后,Treg的比例明显增高（p<0.05）。结果说明小胶质细胞可通过诱导Treg细胞发挥免疫抑制作用。为了验证一氧化氮（nitric oxide, NO）是否参与了小胶质细胞的抑制作用,本课题采用实时定量PCR检测小胶质细胞一氧化氮合酶的表达情况,结果发现EAE发病高峰期小胶质细胞表达一氧化氮合酶明显高于未处理组（p<0.05）,表明小胶质细胞可能通过释放NO来抑制T细胞的增殖。于是,本实验在共培养体系中加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME,以观察去除NO后,小胶质细胞的抑制作用是否得到逆转?结果发现,加入NO合酶抑制剂的确可以使CD4+T细胞的增殖得到显着恢复,提示小胶质细胞分泌的NO参与了对CD4+T细胞的抑制功能。然后,我们检测了不同处理组上清中NO的OD值,结果显示,与spDC/T组比较,在包含EAE高峰期小胶质细胞的实验组均产生大量NO（p<0.05）。因此,结果显示小胶质细胞可通过释放NO来抑制抗原特异性T细胞反应。（6）体外阻断PD-L1/PD-1途径观察小胶质细胞的免疫抑制功能在microglia/T培养体系中,加入阻断性anti-PD-L1抗体后CD4+T细胞的数量显着增加（p<0.05）,同样的结果出现在microglia/spDC/T共培养体系中。但是与spDC/T比较,CD4+T细胞增殖恢复并不完全,说明PD-L1部分参与了由小胶质细胞介导的抑制作用,但是并不是全部作用都由其引起,肯定还有其他因素起作用,有待于进一步研究。为明确PD-L1是否能够影响小胶质细胞对T细胞的分化作用,本课题同样检测了阻断PD-L1后CD4+T细胞亚群的变化。实验显示,在microglia/T和microglia/spDC/T两种共培养体系中阻断PD-L1均可使Thl细胞数量显着性增加（p<0.05）,表明PD-L1具有抑制Thl细胞分化的作用。无论是在microglia/T还是在microglia/spDC/T培养体系,Treg细胞的比例均无明显差异（P>0.05）,表明PD-L1并不参与小胶质细胞诱导Treg细胞产生的过程。本研究检测了共培养体系上清中NO的分泌,结果显示阻断PD-L1组上清中NO检测液的OD值明显低于同型对照抗体组,提示PD-L1可通过影响小胶质细胞分泌NO而调控T细胞的增殖。综上所述,本课题研究表明EAE高峰期的小胶质细胞是一群具有免疫抑制表型和功能的免疫细胞,通过诱导Treg、分泌NO发挥免疫抑制作用。EAE高峰期小胶质细胞高表达PD-L1分子,该分子通过影响小胶质细胞分泌NO发挥免疫调控作用。本课题明确证实小胶质细胞具有免疫抑制作用,为进一步开展CNS负向免疫调控机制的研究提供了理论依据,而且为临床工作中MS的诊断和治疗提供新的思路和潜在药物作用靶点,具有重要的临床应用价值。
二、Peripheral clonal deletion of MBP-specific T cells by intravenous au-toantigen: rapid reversal of ongoing, progressive experimental autoimmune encephalomyelitis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Peripheral clonal deletion of MBP-specific T cells by intravenous au-toantigen: rapid reversal of ongoing, progressive experimental autoimmune encephalomyelitis（论文提纲范文）
（1）中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 视神经脊髓炎相关性视神经炎实验模型的建立及应用研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 动物实验模型 |
| 3 离体组织实验模型 |
| 4 细胞实验模型 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 视神经脊髓炎谱系疾病发病相关抗体的研究进展 |
| 1 NMO概述 |
| 2 AQP4-IgG |
| 3 MOG-IgG |
| 4 GFAP抗体 |
| 5 AQP1-IgG |
| 6 其他相关性抗体 |
| 7 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 细胞因子与视神经脊髓炎谱系疾病 |
| 1 前言 |
| 2 Th17细胞相关的细胞因子 |
| 3 Th2细胞相关细胞因子 |
| 4 Treg细胞相关细胞因子 |
| 5 其他细胞因子 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 综述四 非侵入性电刺激在眼科应用的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 经角膜电刺激 |
| 3 经眼眶电刺激 |
| 4 经眼睑电刺激 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究视神经脊髓炎相关性视神经炎患者临床特点及疗效分析 |
| 研究背景 |
| (一) 视神经脊髓炎相关性视神经炎患者的临床特点分析 |
| 1 研究方案 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 临床评估 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 临床特点 |
| 2.3 实验室检查 |
| 2.4 影像学特点 |
| (二) 针刺联合中药治疗NMO所致视神经萎缩的临床疗效 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 视神经萎缩诊断标准 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 2 治疗方案 |
| 3 疗效指标 |
| 3.1 最佳矫正视力 |
| 3.2 动态视野 |
| 3.3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 NMO视神经萎缩患者一般资料 |
| 4.2 临床表现 |
| 4.3 治疗前后最佳矫正视力比较 |
| 4.4 针刺治疗前后动态视野变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 视神经脊髓炎相关视神经炎大鼠模型的构建与评价 |
| 研究背景 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用动物及患者血清 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方案 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 模型诱导后视神经内AQP4-IgG的沉积 |
| 2.2 大鼠视神经功能学变化 |
| 2.3 视神经光镜观察结果 |
| 2.4 视神经LFB染色结果 |
| 2.5 脊髓光镜观察结果 |
| 2.6 脊髓组织形态LFB染色结果 |
| 2.7 大脑光镜及HE染色观察结果 |
| 2.8 视网膜的光镜观察结果 |
| 2.9 视神经电镜超微结构观察 |
| 2.10 视神经NFL免疫荧光结果 |
| 2.11 视神经内CD68免疫荧光结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NMO-ON动物模型构建国内外进展 |
| 3.2 本研究的主要结果与未来展望 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 实验研究 调肝活络法治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的疗效及机制探究 |
| 研究背景 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用动物及血清 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠视神经F-VEP变化 |
| 2.2 大鼠视神经PLR变化 |
| 2.3 大鼠视网膜Brn3a变化 |
| 2.4 大鼠视神经形态学变化(HE染色) |
| 2.5 大鼠视神经超微结构变化(电镜) |
| 2.6 大鼠视神经组织免疫荧光染色结果 |
| 2.7 Western Blotting法检测视神经内目标蛋白阳性表达结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NMO-ON的中西医防治现状 |
| 3.2 NMO-ON发病机制研究进展 |
| 3.3 调肝活络防治NMO-ON的疗效及潜在机制 |
| 4 结论 |
| 5 本研究主要创新、局限及未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要研究成果 |
（2）细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 非经典NF-κB信号通路的组成与调控 |
| 1.2 非经典NF-κB信号在树突状细胞中的功能 |
| 1.3 树突状细胞在自身免疫病中的作用 |
| 1.4 细胞周期的调控机制 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DCAF2的表达在树突状细胞激活后下调 |
| 3.2 树突状细胞中DCAF2 的缺失破坏免疫稳态并导致自身免疫反应 |
| 3.3 树突状细胞中DCAF2 的缺失促进实验性自身免疫病的发展 |
| 3.4 DCAF2在DC中特异性抑制IL-23 表达 |
| 3.5 DCAF2 负调控非经典NF-κB信号的活化 |
| 3.6 DCAF2 的缺失通过非经典NF-κB信号引发过度的炎症反应 |
| 3.7 DCAF2 负调控NIK的蛋白质稳定及下游信号通路 |
| 3.8 DCAF2 诱导NIK的泛素化修饰和降解 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 细胞周期蛋白参与调控免疫反应的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议 |
（3）以小胶质细胞自身免疫炎症调节为切入点探讨DHA在EAE模型小鼠中的药效及分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 DHA治疗EAE模型小鼠的药效学研究 |
| 第一节 DHA在EAE模型中具有机能改善和神经保护的作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 DHA对EAE小鼠中枢神经系统炎症进展的影响及药效评价 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二章 DHA在EAE模型中对中枢神经系统自身免疫炎症反应的系统性药理学研究 |
| 第一节 基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二节 基于免疫共刺激分子探索DHA对“巨噬细胞-T细胞”相互作用单元所产生的影响的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三节 DHA能够通过抑制CCL5来抑制炎症细胞趋化募集 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第四节 DHA能够增强小胶质细胞的吞噬能力 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三章 聚焦“小胶质细胞功能调节”开展DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究 |
| 第一节 基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二节 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三节 DHA对炎症“促-抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 结语与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 查新报告 |
（4）应用诱导性少突胶质细胞祖细胞治疗小鼠自身免疫性脑脊髓炎的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1 MS的研究进展 |
| 1.1 MS的病因 |
| 1.1.1 遗传基因 |
| 1.1.2 环境因素 |
| 1.1.3 生活方式 |
| 1.2 MS的发病机制 |
| 1.2.1 预损伤 |
| 1.2.2 早期阶段 |
| 1.3 MS的治疗措施 |
| 1.3.1 DMDs |
| 1.3.2 细胞疗法 |
| 2 OLs的分化成熟 |
| 2.1 OLs的分布、特征及功能 |
| 2.2 OLs分化成熟的调控机制 |
| 2.2.1 信号通路 |
| 2.2.1.1 音猬因子(Sonic Hedgehog,SHH)信号通路 |
| 2.2.1.2 Wnt信号通路 |
| 2.2.1.3 Notch信号通路 |
| 2.2.1.4 其他 |
| 2.2.2 micro RNAs(miRNAs) |
| 2.2.3 Sox基因家族 |
| 3 细胞重编程技术 |
| 3.1 间接谱系转化技术的研究进展 |
| 3.2 iOL系的生成策略研究进展 |
| 4 总结和展望 |
| 第2章 试验部分 |
| 引言 |
| 试验一 小鼠EAE模型的构建及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品和试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 EAE模型的诱导 |
| 2.2 石蜡切片的制作 |
| 2.3 石蜡切片的化学染色 |
| 2.3.1 苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色 |
| 2.3.2 劳克坚牢蓝(Luxol fast blue,FLB)染色 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 EAE小鼠的鉴定 |
| 3.1.1 临床表现 |
| 3.1.2 HE染色观察 |
| 3.1.3 LFB染色观察 |
| 3.2 不同MOG35-55用量对小鼠EAE发病率的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验二 miRNA对 iOPCs体外分化成熟的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 miRNAs |
| 1.4 主要仪器与设备 |
| 1.5 主要药品和试剂 |
| 1.6 主要溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 NIH/3T3细胞的培养 |
| 2.1.1 NIH/3T3细胞的复苏 |
| 2.1.2 NIH/3T3细胞的传代培养 |
| 2.1.3 NIH/3T3细胞的冻存 |
| 2.2 质粒DNA的提取 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 G418筛选 |
| 2.5 iOPCs的鉴定 |
| 2.5.1 形态学观察 |
| 2.5.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.6 miRNA的细胞转染 |
| 2.7 iOLs的鉴定 |
| 2.7.1 形态学观察 |
| 2.7.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.7.3 RT-qPCR |
| 2.8 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重编程获得iOPCs的鉴定 |
| 3.1.1 形态学观察 |
| 3.1.2 iOPCs转化率 |
| 3.2 miRNA对 iOLs成熟的影响 |
| 3.2.1 形态学观察 |
| 3.2.2 iOLs的鉴定 |
| 3.2.3 MBP+iOLs |
| 3.2.4 MBP mRNA的相对表达量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 iOPCs的生成 |
| 4.2 iOPCs向成熟iOLs的分化 |
| 5 小结 |
| 试验三 芬戈莫德结合iOPCs移植治疗小鼠EAE的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 FTY720 治疗EAE小鼠 |
| 2.2 FTY720治疗效果的评定 |
| 2.2.1 临床观察及评分 |
| 2.2.2 流式细胞术 |
| 2.2.3 ELISA检测 |
| 2.3 iOPCs的侧脑室注射 |
| 2.4 FTY720 联合iOPCs移植治疗EAE小鼠的效果评定 |
| 2.4.1 临床观察及评分 |
| 2.4.2 MRI |
| 2.4.3 Western Blot检测 |
| 2.5 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FTY720对EAE小鼠的治疗效果评定 |
| 3.1.1 临床表现及评分 |
| 3.1.2 FTY720治疗对T淋巴细胞数量的影响 |
| 3.1.3 FTY720治疗对IL-17水平的影响 |
| 3.2 FTY720 联合iOPCs移植治疗EAE小鼠的效果评定 |
| 3.2.1 临床表现及评分 |
| 3.2.2 MRI |
| 3.2.3 MBP的蛋白含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 FTY720对EAE小鼠的治疗效果 |
| 4.2 iOPCs对 EAE小鼠的治疗效果 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 在读期间发表论文及课题参研情况一览表 |
| 致谢 |
（5）PADMAL变异型的致病基因验证以及SMEK1在中枢神经损伤中的病理机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 COL4A1突变导致遗传性脑小血管病PADMAL的研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 第二部分 SMEK1通过影响微管稳定性导致神经退行性病变的机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 第三部分 SMEK1缺失诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎加重的机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）重组ADAMTS13对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 1.多发性硬化及其动物模型概述 |
| 2.ADAMTS13及VWF概述 |
| 3.假设提出 |
| 第一部分 重组ADAMTS13 对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的保护作用研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 EAE动物模型构建及评估 |
| 2.4 侧脑室置管及药物治疗 |
| 2.5 样本处理 |
| 2.6 HE染色 |
| 2.7 快蓝髓鞘染色(Luxol fast blue,LFB) |
| 2.8 免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色 |
| 2.9 脊髓组织单细胞悬液制备及流式细胞分析(flow cytometry) |
| 3.统计分析 |
| 4.研究结果 |
| 4.1 重组ADAMTS13减轻EAE小鼠的临床评分 |
| 4.2 重组ADAMTS13减轻EAE小鼠脊髓脱髓鞘损伤 |
| 4.3 重组ADAMTS13减轻EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润 |
| 4.4 重组ADAMTS13对EAE小鼠脊髓浸润T淋巴细胞的影响 |
| 4.5 重组ADAMTS13对EAE小鼠脊髓浸润中性粒细胞的影响 |
| 4.6 重组ADAMTS13对EAE小鼠脊髓内小胶质细胞和单核细胞的影响 |
| 5.总结和讨论 |
| 第二部分 重组ADAMTS13 对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠保护作用的机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 伊文思蓝检测血脊髓屏障 |
| 2.4 免疫印迹(western blot)技术 |
| 2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.6 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.7 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.8 脾脏细胞流式染色 |
| 3.统计分析 |
| 4.研究结果 |
| 4.1 重组ADAMTS13对EAE小鼠血脊髓屏障的影响 |
| 4.2 重组ADAMTS13对EAE小鼠脊髓内趋化因子表达水平的影响 |
| 4.3 重组ADAMTS13对EAE小鼠脊髓内炎性因子水平的影响 |
| 4.4 重组ADAMTS13对EAE小鼠外周血和脾脏炎性细胞的影响 |
| 5.总结与讨论 |
| 第三部分 全文总结和展望 |
| 1.全文总结 |
| 2.课题创新点 |
| 3.今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表论文 |
（7）基于可溶性CD83-吲哚胺-2,3-双加氧酶-色氨酸犬尿氨酸途径的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病机制及治疗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 吲哚胺-2,3-双加氧酶拮抗剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 硫辛酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 FoxP3、Treg与中枢神经系统自身免疫性疾病 |
| 参考文献 |
| 综述二 sCD83、IDO、KP与四种神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）基于婴儿双歧杆菌通过对CD4+T细胞亚群影响治疗吉兰-巴雷综合征作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于双歧杆菌通过TH17细胞影响治疗吉兰-巴雷综合征作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于婴儿双歧杆菌通过对Th1、Th2、Thl7和Treg细胞影响治疗吉兰-巴雷综合征作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文、专利和科研项目 |
| 主要专业词汇中英文对照表 |
| 致谢 |
（9）亚精胺对自身免疫疾病的调控及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词对照表 |
| 引言 |
| 1.1 多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎 |
| 1.1.1 多发性硬化 |
| 1.1.2 实验性自身免疫性脑脊髓炎 |
| 1.2 MS的免疫学机理 |
| 1.3 巨噬细胞的调控 |
| 1.3.1 巨噬细胞的极化 |
| 1.3.2 巨噬细胞极化后的表型特点 |
| 1.3.3 巨噬细胞与EAE的关系 |
| 1.4 多胺的代谢和生理作用 |
| 1.5 研究的立论与目标 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验试剂及材料 |
| 2.耗材和仪器设备 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 EAE动物模型的建立 |
| 3.2 巨噬细胞过继转移EAE模型实验 |
| 3.3 T细胞过继转移建立EAE模型 |
| 3.4 巨噬细胞去除模型建立 |
| 3.5 细胞的分离纯化 |
| 3.6 EAE小鼠脾脏细胞体外增殖实验 |
| 3.7 EAE小鼠脾脏细胞培养及巨噬细胞培养上清中因子的检测 |
| 3.8 巨噬细胞和T细胞混合培养实验 |
| 3.9 荧光定量PCR检测基因表达水平 |
| 3.10 Western Blot |
| 3.11 流式细胞分析 |
| 3.12 数据处理及统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 亚精胺对EAE疾病的缓解作用 |
| 1.1 观察给予亚精胺干预后对EAE模型的疾病发展 |
| 1.2 观察给予亚精胺干预处理后EAE模型的病理特征 |
| 2 亚精胺治疗后EAE模型的免疫特性分析 |
| 2.1 亚精胺对EAE疾病中细胞亚型的影响分析 |
| 2.2 亚精胺对EAE小鼠体内辅助性T细胞亚群的影响 |
| 3 亚精胺对EAE小鼠缓解作用依赖于巨噬细胞 |
| 3.1 亚精胺的治疗效果不依赖于T细胞直接作用 |
| 3.2 亚精胺干预EAE小鼠中抗原递呈细胞的功能变化 |
| 3.3 亚精胺的治疗效果依赖于巨噬细胞的存在 |
| 3.4 亚精胺干预后EAE小鼠中巨噬细胞的免疫抑制功能 |
| 4 亚精胺对EAE小鼠中巨噬细胞功能的变化 |
| 4.1 亚精胺治疗后EAE小鼠体内巨噬细胞活化状态的改变 |
| 4.2 亚精胺干预后巨噬细胞对EAE小鼠的治疗作用 |
| 5 亚精胺对EAE小鼠体内巨噬细胞活化中信号通路的变化 |
| 5.1 亚精胺抑制EAE小鼠脾脏巨噬细胞中的NF-κB信号通路 |
| 5.2 亚精胺抑制骨髓巨噬细胞中的NF-κB信号通路及炎症因子的表达量 |
| 6 亚精胺可以通过Arginase-1 介导巨噬细胞的免疫抑制作用 |
| 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（10）实验性自身反应性脑脊髓炎中小胶质细胞通过PD-L1途径发挥免疫抑制作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 中枢神经系统是免疫赦免器官 |
| 1.2 CNS存在负向免疫调控作用 |
| 1.3 人MS及其动物EAE模型是具有自发缓解特点的CNS自身免疫性疾病 |
| 1.3.1 体内存在特异性识别自身髓鞘蛋白的T细胞 |
| 1.3.2 EAE相关的免疫反应的触发 |
| 1.3.3 MS的发病过程中CD4~+T细胞起着中枢性作用 |
| 1.3.4 MS及EAE模型具有自发缓解的特点 |
| 1.4 小胶质细胞是CNS中唯一定居的免疫细胞 |
| 1.4.1 CNS小胶质细胞的起源和维持 |
| 1.4.2 稳态下的小胶质细胞发挥重要的生理学作用 |
| 1.4.3 CNS发生炎症时小胶质细胞的功能复杂 |
| 1.5 PD-L1/PD-1作为负性共刺激信号通路参与调节CNS自身免疫性疾病 |
| 1.5.1 PD-Ls/PD-1信号通路的生物学功能 |
| 1.5.2 PD-L1/PD-1参与调节CNS自身免疫反应 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 试剂和试剂盒 |
| 2.1.2.1 一般试剂 |
| 2.1.2.2 抗体及免疫磁珠 |
| 2.1.2.3 试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 溶液及配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 EAE模型的诱导 |
| 2.2.1.1 C57BL/6小鼠的免疫和神经功能评分 |
| 2.2.1.2 组织和冰冻切片 |
| 2.2.1.3 HE染色 |
| 2.2.2 常规实验方法 |
| 2.2.2.1 小鼠脾脏的单细胞制备 |
| 2.2.2.2 MACS分选细胞步骤 |
| 2.2.2.3 e450荧光染料标记细胞方法 |
| 2.2.3 脑和脊髓的单细胞制备 |
| 2.2.4 脑和脊髓小胶质细胞数量的检测 |
| 2.2.5 脑和脊髓小胶质细胞表型的检测 |
| 2.2.6 脑和脊髓Foxp3的检测 |
| 2.2.7 脑和脊髓Th1和Th17细胞的检测 |
| 2.2.8 免疫组织荧光间标法(漂洗法)检测腰髓Iba-1的表达 |
| 2.2.9 免疫组织荧光直标法(漂洗法)检测腰髓CD4和PD-1的表达 |
| 2.2.10 小胶质细胞影响抗原肽特异性T细胞增殖的实验 |
| 2.2.11 小胶质细胞影响抗原肽特异性T细胞分化的实验 |
| 2.2.12 实时定量PCR检测小胶质细胞一氧化氮合酶的表达情况 |
| 2.2.13 培养上清NO的检测 |
| 2.2.14 数据处理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MOG_(35-55)诱发的C57BL/6小鼠EAE模型的构建 |
| 3.1.1 实验动物发病情况 |
| 3.1.2 EAE小鼠脊髓病理切片HE染色 |
| 3.2 EAE小鼠模型中小胶质细胞的动态监测 |
| 3.2.1 EAE小鼠模型中小胶质细胞数量的变化 |
| 3.2.2 EAE模型小鼠CNS中小胶质细胞的表型变化 |
| 3.2.3 免疫组织荧光检测小胶质细胞的形态改变 |
| 3.3 EAE模型小鼠CNS中CD4~+T细胞的动态监测 |
| 3.3.1 流式细胞仪检测EAE模型小鼠CNS中CD4~+T细胞表达PD-1的情况 |
| 3.3.2 免疫荧光检测EAE模型小鼠CD4~+T细胞PD-1的表达 |
| 3.3.3 流式细胞仪检测EAE模型CNS中CD4~+T细胞亚群的动态变化 |
| 3.4 体外共培养体系检测小胶质细胞的免疫抑制作用 |
| 3.4.1 小胶质细胞对初始CD4~+T细胞具有抗原提呈作用 |
| 3.4.1.1 小胶质细胞具有较弱的抗原提呈能力 |
| 3.4.1.2 小胶质细胞诱导初始T细胞分化为Th1 |
| 3.4.2 小胶质细胞可抑制脾脏DC诱导的T细胞增殖 |
| 3.4.2.1 小胶质细胞抑制DC诱导的T细胞增殖 |
| 3.4.2.2 EAE小胶质细胞可抑制DC诱导的Th1的分化 |
| 3.5 小胶质细胞通过诱导Treg,释放NO发挥抑制作用 |
| 3.5.1 小胶质细胞通过诱导Treg抑制T细胞的增殖 |
| 3.5.2 小胶质细胞通过NO抑制T细胞的增殖 |
| 3.6 PD-L1对小胶质细胞抑制功能的调控作用 |
| 3.6.1 阻断PD-L1使小胶质细胞的抑制作用部分得到逆转 |
| 3.6.2 阻断PD-L1可促进Th1细胞的分化 |
| 3.6.3 阻断PD-L1不影响Treg的分化 |
| 3.6.4 PD-L1通过促进小胶质细胞分泌NO来发挥免疫抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
四、Peripheral clonal deletion of MBP-specific T cells by intravenous au-toantigen: rapid reversal of ongoing, progressive experimental autoimmune encephalomyelitis（论文参考文献）
- [1]中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究[D]. 韩梦雨. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究[D]. 黄涛. 浙江大学, 2021(01)
- [3]以小胶质细胞自身免疫炎症调节为切入点探讨DHA在EAE模型小鼠中的药效及分子机制[D]. 冉庆森. 中国中医科学院, 2020(01)
- [4]应用诱导性少突胶质细胞祖细胞治疗小鼠自身免疫性脑脊髓炎的研究[D]. 谢登峰. 西南大学, 2020(01)
- [5]PADMAL变异型的致病基因验证以及SMEK1在中枢神经损伤中的病理机制研究[D]. 段若楠. 山东大学, 2020(11)
- [6]重组ADAMTS13对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经保护作用[D]. 鹿凯利. 上海交通大学, 2019(01)
- [7]基于可溶性CD83-吲哚胺-2,3-双加氧酶-色氨酸犬尿氨酸途径的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病机制及治疗研究[D]. 李波. 河北医科大学, 2019(01)
- [8]基于婴儿双歧杆菌通过对CD4+T细胞亚群影响治疗吉兰-巴雷综合征作用机制研究[D]. 时鹏. 苏州大学, 2018(04)
- [9]亚精胺对自身免疫疾病的调控及其机制[D]. 杨茜. 上海交通大学, 2016(05)
- [10]实验性自身反应性脑脊髓炎中小胶质细胞通过PD-L1途径发挥免疫抑制作用[D]. 胡景霞. 山东农业大学, 2013(12)