一、大泡性角膜病变动物模型的建立（论文文献综述）
卜敬华[1]（2019）在《高脂血症对小鼠睑板腺和角膜内皮的影响及其作用机制的研究》文中提出第一部分:高脂饮食诱导的肥胖和高脂血症通过调节PPAR-γ通路促进小鼠睑板腺炎症目的:探讨高脂饮食诱导的肥胖和高脂血症与睑板腺慢性炎症之间的关系,并探究PPAR-γ在其中的作用。方法:将雄性C57BL/6J小鼠置于四种不同的喂养方案:a)正常饮食（SD）;b)高脂饮食（HFD）;c)高脂饮食+罗格列酮（PPAR-γ激动剂）（HFD-rosi）;d)高脂饮食喂养4周,然后替换为正常饮食喂养4周（HFD-rev）。定期监测体重、眼表和眼睑变化。对睑板腺组织切片进行H&E染色,油红O染色和CD45、IL-1β、IL-6、TNF-α和F4/80的免疫荧光染色。通过qRT-PCR评估睑板腺中PPAR-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MMP-3 和 MMP-9 的基因表达。进行蛋白印迹以检测 PPAR-γ、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK的蛋白表达情况。结果:高脂饮食诱导小鼠体重和血液胆固醇水平显着增加。油红O染色显示高脂饮食小鼠睑板腺腺泡中脂质的积累。H&E染色显示高脂饮食小鼠中睑板腺腺泡之间细胞浸润增加。与正常饮食小鼠相比,高脂饮食小鼠的睑板腺中观察到CD45和F4/80阳性细胞的浸润增加。高脂饮食小鼠的睑板腺PPAR-γ表达显着下调,炎症相关细胞因子显着上调以及MAPKs和NF-κBp65磷酸化激活。给与罗格列酮治疗（HFD-rosi）以及高脂饮食后再改为正常饮食（HFD-rev）的小鼠睑板腺炎症状态可出现明显逆转。结论:高脂饮食诱导的肥胖和高脂血症通过抑制小鼠睑板腺PPAR-γ表达,激活MAPK和NF-κB信号通路,促进睑板腺炎症。第二部分:载脂蛋白E缺乏导致小鼠睑板腺功能障碍目的:研究载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠睑板腺和眼表组织的病理变化,探讨睑板腺功能障碍（MGD）与高脂血症的关系。方法:在裂隙灯显微镜下观察3、5、7个月龄雄性ApoE-/-小鼠以及年龄和性别匹配的野生型（WT）小鼠的眼表和睑缘情况,用立体显微镜对睑板腺结构进行观察。睑板腺组织切片进行H&E染色,油红O染色,TUNEL染色和K10、Fabp5、Ki67、p63、PPAR-γ、IL-6、TNF-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、AC-caspase 8 的免疫荧光染色。免疫组织化学染色方法检测CD45、4-HNE、NOX-4、3-NT。实时定量PCR和蛋白印迹检测睑板腺组织中相应基因表达。通过灌胃的方法给5个月的ApoE-/-小鼠分别服用罗格列酮和GW9662+罗格列酮2个月。结果:ApoE-/-小鼠眼睑出现显着异常,睑板腺缺失,腺泡形态异常,导管扩张,睑板腺开口堵塞。ApoE-/-小鼠中的睑板腺腺泡呈现出过度的脂质沉积。睑板腺导管和腺泡细胞异常角化增加,睑板腺腺泡细胞增殖减少,细胞凋亡增加。炎症细胞浸润到睑板腺腺泡的周围微环境中,NF-κB信号通路在睑板腺中被激活。ApoE-/-小鼠的睑板腺腺泡细胞中的氧化应激明显增加。进一步研究显示ApoE-/-小鼠睑板腺腺泡细胞中PPAR-γ的表达下调。PPAR-γ激动剂罗格列酮治疗2个月可降低ApoE-/-小鼠眼睑、角膜病变发病率,同时可以减轻睑板腺炎症。结论:MGD和高脂血症密切相关,ApoE-/-小鼠可作为模型研究脂代谢紊乱相关性MGD的病理生理和治疗。第三部分:高脂血症影响角膜内皮的紧密连接和泵功能目的:探讨不同高脂血症小鼠模型中角膜内皮的病理变化及相关机制。方法:采用喂养4周龄雄性野生型（WT）小鼠高脂饮食（HFD）和喂养载脂蛋白E敲除（ApoE-/-）小鼠正常饮食（SD）或高脂饮食的方法,建立三种不同程度的高脂血症小鼠模型。对照组饲喂WT小鼠正常饮食。16周后检测不同组小鼠体重,胆固醇水平和空腹血糖浓度。通过活体共聚焦显微镜评估角膜内皮细胞密度、角膜内皮细胞形态。对角膜内皮组织进行扫描电镜、透射电镜检测和ZO-1、N-cadherin、Na+-K+-ATPase、4-羟基壬烯醛（4-HNE）、8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OHdG）和NADPH氧化酶4（NOX4）的免疫染色。通过qRT-PCR评估角膜内皮中ZO-1、N-cadherin和Na+-K+-ATPase的基因表达水平。对全角膜组织进行油红O染色以评估脂质沉积情况。通过角膜内皮损伤模型观察不同组小鼠角膜内皮损伤后的恢复功能。提取房水并进行质谱检测其中脂肪酸变化。用不同浓度的棕榈酸处理体外培养的兔角膜内皮细胞以模拟体内高脂血症。在棕榈酸处理24小时后,进行 CCK8 活力测定和 ZO-1、N-cadherin、Na+-K+-ATPase、TOM20 和 TIM23 的免疫荧光染色。通过 qRT-PCR 检测 ZO-1、N-cadherin、Na+-K+-ATPase、NOX4、NFE2L2（Nrf2）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）的基因表达水平。结果:我们发现喂养高脂饲料的WT小鼠和喂养正常饲料或高脂饲料的ApoE-/-小鼠均可诱导出不同程度的高脂血症。油红O激活,线粒体超微结构异常改变。在高脂血症小鼠的角膜内皮细胞中还可观察到染色显示高脂血症小鼠的角膜内皮细胞中出现脂滴的积聚。在高脂血症模型小鼠中观察到角膜内皮细胞密度降低,内皮细胞形态异常,六边形比例明显下降,内皮细胞紧密连接破坏,内皮细胞表面微绒毛减少,泵功能标记物Na+-K+-ATPase表达紊乱且表达量减少,氧化应激细胞凋亡增加。此外,高脂血症小鼠内皮在损伤后恢复能力下降。通过质谱的方法检测房水中脂肪酸含量,发现在高脂血症小鼠房水中棕榈酸水平显着增加。体外培养的兔角膜内皮细胞显示出对棕榈酸的剂量依赖性细胞毒性,棕榈酸还可导致体外培养的兔角膜内皮细胞形态改变,泵功能降低,线粒体破坏,氧化应激标志物表达升高。结论:高脂血症可诱导角膜内皮细胞氧化应激,最终导致角膜内皮的病理改变。高脂血症可能是角膜内皮功能障碍的重要危险因素。
缪雅悠[2]（2019）在《两种遗传性角膜病小鼠模型的建立及其角膜病变特征分析》文中研究指明乙烷基亚硝基脲（ENU）是一种人工合成的高效烷化剂,能够以较高的效率诱导DNA突变,从而获得大量的人类疾病小鼠模型,用于人类相关疾病的发生、发展机制以及基因功能的研究。本研究利用ENU诱变方法,目前获得7种可遗传的突变小鼠模型,并对其中2种角膜病小鼠模型的角膜组织病变特征进行研究:1 ENU诱变获得两种遗传性角膜病小鼠模型本研究利用ENU腹腔注射15只8-10周龄雄性野生型C57BL/6J（B6）小鼠,待其恢复生殖能力后与野生型B6雌鼠配种繁育。经过初步筛选,共获得36只异常表型小鼠（白斑、瞳孔异位、无眼、角膜混浊等）。通过遗传验证实验,目前确定了7种可遗传的突变小鼠模型。本研究将其中2种角膜病小鼠分别命名为Cod1（Corneal disease 1）、Cod2（Corneal disease 2）,并展开后续工作。2Cod1、Cod2小鼠角膜HE染色分析采用HE染色法分析角膜组织发现:（1）正常小鼠角膜整体结构层次分明,上皮细胞排列整齐,上皮基部平整;角膜基质层中可见平行排列的胶原纤维,不含血管;内皮细胞明显。（2）2周龄Cod1小鼠角膜基质层底部局部胶原纤维松散,部分内皮细胞层缺失;8周龄Cod1小鼠角膜上皮表层局部出现空泡,基质层出现新生血管,部分内皮细胞层缺失。（3）2周龄Cod2小鼠角膜基质层底部胶原纤维松散;8周龄Cod2小鼠角膜上皮明显变薄,基质层底部局部胶原纤维松散,基质层出现明显新生血管。3Cod1、Cod2小鼠角膜免疫组织化学分析首先以抗CD31抗体对8周龄Cod1、Cod2小鼠角膜进行免疫组织化学分析,结果显示CD31均于Cod1、Cod2小鼠角膜基质层中表达,进一步证实了新生血管的存在。新生血管的生成往往也与角膜分化异常有关,故利用抗角蛋白Keratin 12（K12）、Keratin 14（K14）及Keratin 10（K10）对Cod1、Cod2小鼠角膜进行免疫组织化学分析,了解角膜上皮细胞分化情况。与野生型小鼠相比:（1）2周龄Cod1小鼠角膜上皮细胞K12表达较弱且局部为阴性,8周龄Cod1小鼠角膜K12表达增强;2周龄Cod2小鼠局部角膜上皮细胞K12为阴性,8周龄Cod2小鼠角膜K12阳性细胞明显减少且表达变弱。（2）2周龄及8周龄Cod1、Cod2小鼠所有角膜上皮层均表达K14且明显增强。（3）Cod1、Cod2小鼠角膜K10组化结果均为阴性,与野生型小鼠一致。结论:本研究首先采用ENU诱变获得2种遗传性角膜病小鼠模型（Cod1、Cod2）,并通过HE及免疫组织化学染色方法对其角膜组织进行研究,从而分析角膜混浊发生的原因,为这2种小鼠模型的应用奠定基础,并为人类遗传性角膜病发生的原因提供参考。
申琳[3]（2018）在《人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究》文中提出角膜是一层透明无血管的纤维膜,在组织学结构上角膜共分为5层,从外向内依次为:上皮细胞层,前弹力层,基质层,后弹力层和内皮细胞层。角膜内皮细胞为多边形单细胞层,是维持角膜相对脱水状态,保持角膜透明性和维持角膜厚度的重要因素。在人体内角膜内皮细胞难以再生,若被损伤只能依赖残存细胞形态的改变和移行来进行修复。当损伤超过一定限度造成内皮细胞的密度低于约500-800/mm2时,残存的内皮细胞便不能完全代偿损伤,会导致角膜内皮失代偿,表现为角膜水肿或大泡性角膜病变,严重时甚至失明。角膜移植是目前角膜内皮失代偿最常用也是最有效的治疗方法,然而每年我国角膜捐献的材料极为有限,得到有效救助的病人少之又少。若采取体外培养的方法获得更多的角膜内皮细胞,用于单纯内皮移植或组织工程角膜的构建,可为角膜内皮失代偿病人等多种角膜病变提供新的治疗方案。但是人角膜内皮细胞体外培养增殖传代能力相对有限,而且供体角膜材料仍然是不可缺少的一部分。因此,探求新的具有良好功能的角膜内皮细胞来源,成为急需解决的难题。干细胞诱导分化为角膜内皮细胞成为近年来研究的热点,例如利用胚胎干细胞、骨髓来源的内皮祖细胞、人角膜基质干细胞等。虽然多种干细胞可诱导为角膜内皮样细胞,然而这些研究均存在一定问题,如干细胞取材较困难、动物实验免疫排斥严重、缺乏高等动物实验验证等。皮肤是人体最大的器官,需要更新和修复来维持稳定,而皮肤干细胞则是主要的参与者,研究发现皮肤中包括多种多样的的成体干细胞群,例如表皮干细胞,毛囊干细胞,真皮干细胞等。不管在皮肤领域还是在非皮肤领域的应用中,皮肤中的各种干细胞几乎都具有较高的可塑性。Toma等人从人和啮齿动物的真皮中发现皮肤前体细胞（skin derived precursors,SKPs）,在不同诱导条件下这种细胞能向神经元、神经胶质细胞,骨、软骨细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞转化,是具有多向分化潜能的细胞。更重要的是SKPs被证明与胚胎时期的神经嵴细胞相关,且具有神经嵴细胞的特性,这与角膜内皮细胞的胚胎发育来源相一致。另外,皮肤来源广泛、取材方便,细胞提取方法也不复杂。因此,SKPs是角膜内皮细胞理想的种子细胞来源。角膜移植术是角膜内皮失代偿等多种严重角膜病变的主要治疗方法,主要包括穿透性角膜移植术和角膜内皮移植术。在临床上,穿透性角膜移植术（PKP）是一种重要的手术方式,然而并发症居多,而且免疫排斥率较高。角膜内皮移植术经过角膜瓣下后板层角膜移植术（PLK）,深板层角膜内皮移植术（DLEK）,后弹力层撕除角膜内皮移植术（DSEK）和后弹力层撕除自动刀内皮移植术（DSAEK）,角膜后弹力层内皮移植术（DMEK）几个发展阶段,这项技术已取得的飞速发展。近年来,有学者将体外培养的内皮细胞结合促进角膜贴附性的ROCK抑制剂用注射针注射到受体前房进行内皮移植,动物实验取得了成功,与DSAEK相比效果更好,应用于临床试验也取得令人满意的效果。前房注射法方法简单、易于操作,保留了自身正常的角膜上皮和基质结构,手术创伤小,并发症相对较少,恢复效果好,免疫排斥率也较低,经过研究者的不断努力,将来或可成为临床上治疗角膜内皮功能失代偿的新的手术方法。组织工程角膜（Tissue-engineered cornea,TEC）是在体外模拟天然角膜的组成结构构建出的具有良好的生物学活性的角膜供体替代品,主要由支架与种子细胞构成。支架材料主要分合成材料和天然材料两种,是构建组织工程角膜的重要组成部分。合成材料主要是以有机成分做为原材料的合成物,如胶原、丝蛋白等。天然材料主要是脱细胞的生物组织,是目前组织工程角膜主要的材料来源。脱细胞人角膜基质是TEC最理想的材料,然而由于仍需要捐献的角膜供体,其制备收到限制。近几年来脱细胞猪角膜基质（Acellular porcine cornea matrix,APCM）成为研究的热点,经过学者们不断的研究探索,发现APCM具有良好的组织相容性,且免疫原性较低、生物力学特性与人角膜相似,将其作为组织工程角膜的支架材料最为理想。在APCM的应用上,它可支持多种细胞的生长,可用于构建组织工程角膜前板层、后板层、全层等,动物实验也取得不错的效果,在中国已有用于板层角膜移植的成熟产品。因此,将干细胞诱导获得的角膜细胞与支架材料相结合,构建的出不依赖于供体角膜材料的组织工程角膜应用于角膜移植,可充分缓解角膜材料匮乏的压力,为角膜内皮失代偿和其他多种角膜病变的治疗提供不同的选择方案。因此,本研究中我们首先提取了皮肤来源的前体细胞（SKPs）,在体外对其诱导分化并筛选最佳的诱导方案,成功将SKPs分化为角膜内皮样细胞（CEC-like cells）,体外检测证明其具备正常角膜内皮细胞的形态与表面标志;通过初步探索诱导分化的机制,证实SKPs可能通过Wnt通路分化为角膜内皮样细胞。其次,为验证角膜内皮样细胞在体内的功能,我们将诱导的细胞用前房注射的方法治疗兔角膜内皮失代偿模型,取得了良好的效果;我们进一步进行了恒河猴的移植实验,长期观察发现角膜内皮样细胞功能极佳,与正常内皮细胞相似,能够使角膜恢复透明并能长期保持稳定。最后,我们又探索了以脱细胞猪角膜为支架,以诱导的角膜内皮样细胞为种子细胞构建组织工程角膜植片并用于动物实验的可行性;结果显示角膜内皮样细胞在脱细胞猪角膜基质上生长良好,经过动物穿透性角膜移植后,构建的植片可在短期发挥一定的内皮泵功能。总之,丰富的细胞来源、全新的诱导方法、良好的动物移植实验效果,为角膜内皮失代偿和其他多种角膜病变的治疗提供了新的不同的选择方案,为未来应用于临床展示了美好的前景,为再生医学再填枝叶。[目的]将提取的SKPs作为种子细胞体外诱导其分化为角膜内皮样细胞,寻求获得角膜内皮细胞来源的新方法。初步探索SKPs细胞分化为角膜内皮样细胞的分子机制。[方法]1.皮肤来源前体细胞SKPs的培养:收集重睑术后剩余的皮肤组织,将表皮真皮分离得到真皮,胶原酶消化后细胞筛网过滤,将细胞按一定密度接种在培养瓶中,用SKPs培养液培养。2.人角膜内皮细胞系B4G12细胞的培养及条件培养基的提取:从液氮中取出B4G12细胞复苏,无血清培养基常规培养,胰酶常规消化传代。细胞生长到70%-90%融合时,每12小时收集培养基,滤器过滤除菌,保存在-80℃冰箱备用。3.角膜内皮样细胞的诱导:层粘连蛋白、硫酸软骨素按一定比例包被培养板。将SKPs胰酶消化后枪头吹打成单个细胞,按1×105、5×105、1×106密度接种在包被好的培养板中。（1）条件培养基法:将B4G12细胞条件培养基加入接种好SKPs细胞的培养板中,隔日换液,每天观察细胞形态变化。（2）共培养法:将B4G12与SKPs细胞用transwell小室非接触式共培养,隔日换液,每天观察细胞形态变化。筛选最佳诱导方案。4.角膜内皮样细胞的鉴定:RT-PCR检测角膜内皮样细胞较SKPs在Na+/K+ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Co14a2、Col8a2、Pitx2、FoxC1的表达变化;免疫荧光及Western blotting检测标记物Na+/K+ATPase、ZO-1表达。将诱导的角膜内皮样细胞传代,RT-PCR、免疫荧光及Western blotting评估各标记物的表达。5.SKPs细胞分化为角膜内皮样细胞的分子机制研究:Western blot法检测角膜内皮样细胞与SKPs细胞t-LRP6、p-LRP6、β-Catenin、Gapdh的表达情况。[结果]1.经过筛选可得,以5×105密度接种SKPs用transwell小室与B4G12细胞共培养的方法得到的角膜内皮样细胞在形态和标记物的表达上最佳。诱导4天开始出现多边形细胞,8天时大部分转变成多边形细胞,呈单层镶嵌样排列,为角膜内皮样细胞,与人内皮细胞形态相似,且能稳定传3代。2.RT-PCR示诱导的细胞较SKPs在多种角膜内皮相关标记物如Na+/K+ ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Col4a2、Col8a2表达上随时间变化均有不同程度的增高,在分化相关转录因子Pitx2、FoxC1表达上也不同程度的改变;免疫荧光示诱导的细胞表达Na+/K+ATPase、ZO-1标记物;Western blotting示诱导的细胞Na+/K+ ATPase、ZO-1较SKPs细胞表达量增高。角膜内皮样细胞传代后仍能保持其形态及各标记物的表达。3.Western blot 显示角膜内皮样细胞较 SKPs 细胞在 β-Catenin、t-LRP6、p-LRP6表达上明显增高,说明经过诱导后细胞通过上调LRP6受体和其磷酸化水平激活下游分子,即通过Wnt通路的经典途径诱导分化为角膜内皮样细胞。[结论]SKPs经过与B4G12细胞共培养可诱导分化为角膜内皮样细胞,为角膜内皮细胞提供了新的丰富的来源。SKPs可能通过Wnt通路诱导分化为角膜内皮样细胞。[目的]利用诱导来的角膜内皮样细胞进行角膜内皮失代偿动物模型的角膜内皮移植实验,检测角膜内皮样细胞的体内功能,评估角膜内皮样细胞用于治疗角膜内皮细胞失代偿的可行性。[方法]1.兔角膜内皮失代偿动物模型制作:选取新西兰大白兔,右眼为术眼,利用我们自己制作的装置机械法刮除新西兰大白兔的角膜内皮细胞。HE染色和茜素红染色验证后弹力层的完整性和是否有内皮残留。2.兔角膜内皮移植:将角膜内皮样细胞用Dil标记,调整到一定密度混入100μl培养基中。抽取术眼100μl房水后,实验组将角膜内皮样细胞注射入兔前房,对照组只注射培养基,定期进行裂隙灯、眼压、眼前节OCT、激光共聚焦显微镜等检查。处死动物取角膜行茜素红染色、组织免疫荧光、HE染色等检测。3.恒河猴角膜内皮失代偿动物模型制作:右眼为术眼,机械法刮除角膜内皮细胞。4.恒河猴角膜内皮移植:将角膜内皮样细胞用Dil标记,调整到一定密度混入50μl培养基中,抽取术眼50μl房水后,实验组将角膜内皮样细胞注射入猴前房,对照组只注射培养基,定期进行裂隙灯、眼压、眼前节OCT、角膜内皮镜、B超、房角镜、眼底照相等眼科检查,处死动物取角膜行组织免疫荧光、HE染色等检测。[结果]1.兔角膜内皮移植术后,实验组角膜混浊程度逐渐减轻,可见瞳孔及虹膜纹理,角膜由厚变薄,术后7天角膜几乎完全恢复透明,共聚焦显微镜检查示角膜内皮呈紧密连接多边形,细胞数接近正常;对照组角膜混浊严重,厚度增加,窥不见内皮层。两组眼压均未见明显异常。取角膜行茜素红染色,结果示实验组角膜后弹力层上单层紧密排列的多边形角膜内皮样细胞,对照组后弹力层几乎无细胞。免疫荧光示,实验组角膜内皮面可见Dil红色荧光细胞,表达Na+/K+ATPase,对照组后弹力层裸露。HE染色,实验组角膜厚度基本恢复正常,后表面单层细胞覆盖,对照组角膜水肿增厚,后弹力层几乎无细胞结构。2.猴角膜内皮移植术后,实验组角膜混浊程度逐渐减轻,角膜由厚变薄,术后1个月角膜几乎完全透明,角膜厚度恢复正常;角膜内皮镜检测示角膜内皮样细胞呈多边形,单层紧密贴附在后弹力层上,内皮计数接近正常;前房出现少量渗出和角膜后沉积物,炎症反应较轻且逐渐消失。持续观察1年猴角膜继续保持透明,角膜厚度无明显变化,角膜内皮细胞计数略微减少,未见明显的角膜新生血管,眼压、B超、房角镜、眼底检查均正常。对照组角膜混浊逐渐加重,窥不见内皮层,1月时变成乳白色,随着观察时间延长角膜继续保持混浊。取实验组角膜进行免疫荧光检测示角膜内皮层可见Dil红色荧光,表达Na+/K+ATPase;HE染色示角膜后表面单层细胞覆盖,内皮细胞贴附良好,其他结构未见明显异常。[结论]皮肤来源的角膜内皮样细胞在体内具有与人角膜内皮细胞相似的功能,不仅能在兔角膜内皮移植上取得良好的效果,还能使猴角膜内皮失代偿模型恢复正常并能保持长期稳定,为角膜内皮细胞失代偿的治疗提供了新的选择方案。[目的]探索以诱导来的角膜内皮样细胞为种子细胞,以脱细胞猪角膜为支架构建组织工程角膜植片的可行性,初步评估其进行动物移植的效果。[方法]1.脱细胞猪角膜基质（APCM）及脱细胞猪角膜支架（APCM scaffold,AS）的制作:环钻钻取全层猪角膜,用氯化钠、DNA/RNA酶、PBS进行处理,去除猪角膜的细胞成分制成脱细胞猪角膜基质APCM,切割猪角膜基质前板层至厚度400μm左右,作为脱细胞猪角膜支架AS,置于-20℃保存备用。行HE及DAPI染色进行组织学检测。2.组织工程角膜植片（Tissue-engineered cornea,TEC）的构建:将角膜内皮样细胞一定密度接种在AS上构建组织工程角膜植片TEC,行HE及DAPI染色进行组织学检测,行茜素红染色进行细胞计数。3.兔穿透性角膜移植术:实验组移植组织工程角膜植片TEC,对照组移植脱细胞猪角膜支架AS。术后进行裂隙灯照相、眼压检查,处死后取角膜行免疫荧光染色检测。[结果]1.脱细胞猪角膜基质APCM无细胞残留,胶原排列规则无明显断裂,前弹力层完整;构建的组织工程角膜内皮植片TEC基质面可见贴附良好的CEC-like cells,茜素红染色可见细胞呈单层多边形镶嵌分布,细胞计数与正常兔角膜内皮计数相似。2.兔穿透性角膜移植术后,实验组3周之内角膜逐渐透明,角膜逐渐变薄;对照组角膜逐渐混浊,角膜逐渐增厚水肿。两组术后角膜上皮均逐渐修复,3周后上皮完全覆盖,荧光素染色阴性。观察期间两组术后眼压均未见明显异常,均未见明显的角膜新生血管。取角膜行免疫荧光示,实验组植片基质面覆盖有单层细胞,抗人核抗体和Na+/K+ATPase抗体免疫荧光染色阳性,对照组植片基质面无内皮细胞。[结论]角膜内皮样细胞在脱细胞猪角膜基质上生长良好,可用于构建组织工程角膜植片,进行动物移植实验后组织工程角膜植片可发挥一定的内皮泵功能。
吴敏[4]（2018）在《角膜内皮失代偿动物模型建立及水通道蛋白、Smac/DIABLO的表达变化研究》文中进行了进一步梳理[目的]1.利用恒河猴和SD大鼠探索建立角膜内皮失代偿动物模型,对比分析各自的优缺点和应用前景,为研究角膜内皮失代偿疾病动物模型建立提供新思路。2.研究水通道蛋白AQP-1、AQP-3、AQP-5、Na+-K+-ATP酶和第2个线粒体衍生的半胱天冬酶激活因子/低等电点的IAP直接结合蛋白（Smac/DIABLO）在聚维酮碘诱导的大鼠角膜内皮失代偿动物模型中的表达变化,初步探讨其作用机制。[方法]1.通过超声损伤诱导建立恒河猴角膜内皮失代偿动物模型,并进行临床和病理观察。2.通过前房灌注0.5%和0.25%浓度的聚维酮碘（PVP-I）诱导建立SD大鼠角膜内皮细胞失代偿动物模型,并进行临床和病理观察。3.对两种不同方法建立角膜内皮失代偿动物模型的优缺点进行比较分析。4.应用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot观察水通道蛋白AQP-1、AQP-3、AQP-5、Na+-K+-ATP 和 Smac/DIABLO 在大鼠角膜内皮失代偿动物模型中的mRNA和蛋白表达变化。[结果]1.改良超声法诱导建立恒河猴角膜内皮失代偿模型成功率为100.0%。在超声损伤角膜内皮后,角膜改变逐渐出现在内皮层、基质层、前弹力层和基底上皮层,术后4w出现角膜严重混浊,明显的上皮下大泡改变。共聚焦显微镜检查显示超声损伤后早期主要改变是角膜内皮细胞间隙增宽、细胞轻度水肿,基质层出现活化的基质细胞和细胞形态改变,基质厚度增加,术后2周开始出现前弹力层上皮状神经纤维减少,同时伴有基质层和内皮水肿加重,术后3周基底上皮细胞间隙增宽,少量朗格汉斯细胞浸润,基质层和内皮水肿加重,术后4周基底上皮层大量朗格汉斯细胞浸润,前弹力层仅见少量上皮状神经纤维,基质层大量活化的基质细胞,内皮层严重水肿。随着造模时间延长,实验组角膜厚度不断增厚,与术前相比,差异具有统计学意义,造模后不同时间点与对照组相比差异具有统计学意义。造模后4周HE染色几乎看不到角膜内皮层,Descemet’s膜暴露,基质层厚度显着增加;扫描电镜下显示大片的Descemet’s膜裸露,仅有极少数内皮细胞附着,残留的角膜内皮细胞明显水肿。2.0.5%（实验1组）和0.25%（实验2组）PVP-I前房灌注诱导建立SD大鼠角膜内皮功能失代偿模型的成功率均为100.0%,0.5%浓度组在术后14d即出现明显的角膜内皮功能失代偿改变,而0,25%浓度组则在30d才出现明显的角膜内皮功能失代偿改变。术后并发症主要是前房积血和眼球萎缩,5眼（5.0%）眼发生前房积血,包括1组2眼（4.0%）和2组3眼（6.0%）。有4眼（4.0%）发生眼球萎缩,包括1组3眼（6.0%）和2组1眼（2.0%）。总的并发症发生率在实验1组和2组分别为10.0%和8.0%,两组间并发症发生率没有统计学意义（X2=2.7616,p>0.05）。实验1组、2组随着观察时间的延长,角膜厚度出现不断增加的趋势,1组术后14d、30d中央角膜厚度与术前和空白对照组中央角膜厚度相比均有显着性差异（p<0.05）;2组在30d时CCT与术前和空白对照组中央角膜厚度相比均有显着性差异（p<0.05）。HE染色显示1组和2组均出现不同程度角膜内皮细胞消失,角膜基质增厚可见丰富血管,胶原纤维组织消失。扫描电镜显示两组不同程度的内皮细胞脱落、水肿,透射电镜显示内皮细胞线粒体嵴内水肿,轴突水肿。实验1组的病理、扫描和透射电镜改变均较2组严重。3.在大鼠角膜内皮失代偿动物模型中,RT-PCR结果显示AQP1 mRNA在造模后出现表达显着变化,呈现先降低后升高趋势,到14d达到峰值,表达量约为正常角膜的4.7倍。AQP3 mRNA和AQP5 mRNA在造模后出现表达显着降低趋势,到7d达到谷值,分别为正常角膜表达量的8%和1%。Na+-K+-ATP酶mRNA在在造模后早期出现下降晚期升高的趋势,7d达到谷值,约为正常角膜的1/4,到30d达到峰值,为正常角膜的1.9倍。Smac/DIABLOmRNA表达出现先下降后升高再下降的趋势,3d达到峰值,约为正常角膜的1.5倍,至30d约下降到正常角膜的1/4。Western-blot结果显示,与正常角膜组织相比,AQP1蛋白出现先升高后下降趋势,造模后7d达到峰值,约为正常角膜的7倍,在造模后30d低于正常角膜组织的AQP1蛋白表达。Na+-K+-ATP酶蛋白表达显着升高,7d达到峰值,在14d开始降至接近正常角膜。Smac/DIABLO蛋白表达造模后不断升高,7d达到峰值,30d仍然显着升高。[结论]1.改良超声法能成功诱导建立恒河猴角膜内皮失代偿模型,共聚焦显微镜对于动态观察恒河猴角膜变化情况是有用的工具。2.0.5%和0.25%PVP-I前房灌注均能成功诱导建立SD大鼠角膜内皮失代偿模型,PVP-I造模存在引发眼球萎缩的可能性,0.5%浓度的PVP-I可以更加快速诱发模型,临床表现也更为典型。3.SD大鼠角膜内皮失代偿发生发展过程中,水通道蛋白在蛋白表达和mRNA表达均发生了显着变化,其中AQP1先降低后显着升高,AQP3和AQP5出现显着下降;AQP1的蛋白表达也出现显着升高然后下降。Na+-K+-ATP酶出现mRNA表达先下降后升高,蛋白表达出现先升高后降低的改变。Smac/DIABLO mRNA表达现先下降后升高再下降,蛋白表达水平则持续升高。4.SD大鼠角膜内皮失代偿模型角膜组织中发生了 AQPs、Na+-K+-ATP酶和Smac/DIABLO的表达显着变化,说明在CED的病理生理过程中,AQPs和Na+-K+-ATP 酶、Smac/DIABLO 起到了重要作用。AQP1 和 Na+-K+-ATP 酶可能是CED病情变化的敏感指标,Smac/DIABLO可能通过线粒体凋亡途径调节角膜组织的细胞凋亡,参与到CED发生发展的的病理生理过程,但具体的作用机制待进一步研究证实。
刘海,李妍,杨忠昆,张文佳,王莹婷[5]（2015）在《角膜基质内羊膜移植治疗兔大泡性角膜病变的实验研究》文中提出目的探讨角膜基质内羊膜（amniotic membrane,AM）移植治疗兔大泡性角膜病变（bullous keratopathy,BK）的疗效。方法 40只新西兰健康成年白兔,建立BK模型,然后随机分为角膜基质内AM移植组（A组,12只）、角膜表面AM移植组（B组,12只）、切开角膜板层组（C组,12只）、对照组（D组,4只）,比较四组兔移植后不同时间的中央角膜厚度和角膜中央混浊情况。结果 AM移植前四组兔的中央角膜厚度差异无统计学意义（F=0.184,P=0.90）,而在移植后第1、2、4、8、12周四组兔中央角膜厚度组间差异均有显着统计学意义（均为P<0.01）。AM移植后4周时,A组兔的角膜中央混浊情况为+者7眼、++者1眼,B、C组均为+者2眼、++者6眼,D组为+者3眼、++者5眼,组间差异有统计学意义（χ2=13.21,P<0.01）,而其他时间点差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论角膜基质内AM移植可以有效修复BK兔角膜内皮细胞。
荣蓓,白静,晏晓明[6]（2013）在《兔大泡性角膜病变疼痛状态客观评价的方法学研究》文中研究表明背景建立一种眼科疾病模型动物疼痛和痛苦的客观评价标准对于眼科基础和临床研究以及对实验动物的人文关怀都是非常必要的,目前国内尚缺乏这方面的研究。目的探讨定量评分法结合模型动物行为判断法评价大泡性角膜病变兔疼痛状态的有效方法。方法选取健康成年新西兰白兔12只,其中9只兔为实验组,均取左眼为实验眼,应用角膜内皮刮除术制作大泡性角膜病变模型,3只作为正常对照。于术前,术后1、3、7、14 d应用手持裂隙灯显微镜观察实验组模型兔角膜病变区的变化,应用超声生物显微镜（UBM）测量其中央角膜厚度（CCT）,同时参考国际动物关怀与使用委员会（IACUC）起草的美国实验动物疼痛指南,通过建立"体质量+疼痛状态20项评分"法对疼痛指标进行量化评分,以评估实验动物的疼痛状态。结果术后1 d裂隙灯显微镜下观察可见9只大泡性角膜病变模型眼角膜明显水肿,呈灰白色混浊;术后3 d角膜表面出现明显大泡,大泡破裂后角膜上皮糜烂,并持续到术后14 d。术后1、3、7、14 d模型眼CCT分别为（1468±100）、（2313±588）、（2391±271）、（2362±151）μm,与术前的（390±6）μm相比,差异均有统计学意义（均P=0.000）,而术后3、7、14 d间CCT比较差异无统计学意义（P>0.05）。术后1、3、7、14 d实验动物体质量分别为（3.29±0.20）、（3.20±0.17）、（2.77±0.25）、（3.10±0.30）kg,与术前的（3.52±0.18）kg相比差异均有统计学意义（P=0.008、0.007、0.003、0.004）。实验组术前和对照组所有实验兔在观察期内疼痛评分均为0分,实验组术后1、3、7、14 d疼痛状态评分分别为7（7,7）、11（10,12）、9（8,10）、9（9,9）分,其中术后3 d评分最高,与术后1、7、14 d相比差异均有统计学意义（P=0.007、0.005、0.007）,与角膜出现大泡及角膜上皮糜烂时间基本吻合。20项指标中以进食减少、自我隔离/躲避、磨牙、进行抓持/点眼等操作时可观察到攻击性增加、活动性减少、姿势异常（头低位、弓背等）、发出低沉的叫声7项在所有9只实验动物术后均为阳性。结论应用"体质量+疼痛状态20项评分"法可以对大泡性角膜病变兔模型的疼痛状态进行有效、客观、量化的评价
肖中男,胡竹林[7]（2012）在《大泡性角膜病变的临床治疗及研究进展》文中研究指明各种原因引起的角膜内皮细胞损害,致角膜内皮失代偿,产生角膜基质水肿、上皮下水肿,最终形成的大泡性角膜病变（bullous keratopathy,BK）已成为常见的致盲性角膜病。而BK并非一种独立的疾病,往往与其他多种眼病同时存在,使其更加不易治疗。近年来,除了临床常用的药物及传统的手术方式外,学者们还积极开发新的角膜层间术式,拓展羊膜在手术中的应用及其复合术式;对角膜内皮细胞移植术及体外培养角膜内皮细胞移植的不断探索和发展,在临床和研究上都取得了一定的进展。本文就BK的临床治疗和研究进展作一综述。
肖中男[8]（2012）在《恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞的实验研究》文中研究说明目的：探讨超声乳化破坏恒河猴角膜内皮细胞后角膜内表面的变化；通过观察移植到无内皮层的角膜内表面的恒河猴血管内皮细胞的位置、形态和功能改变,探索血管内皮细胞移植治疗角膜内皮细胞损伤的方法和前房注射法的可行性。方法：体外培养增殖恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞株（RF6A）并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记。将恒河猴9只随机分为三组：实验组（A组,3只）、实验对照组（B组,2只）,空白对照组（C组,4只）。A组：超声乳化角膜内表面后立即将体外培养增殖经Brdu标记的RF6A通过角巩膜缘注射至前房,全麻下保持实验动物俯卧位3-4小时；B组：超声乳化术后一个月后用与A组相同的方法移植经Brdu标记的RF6A；C组：行超声乳化术后不行细胞移植,其中一只术后立即摘眼行各项检测。术后观察各组角膜透明情况；术前、术后1、2、3、4、8、12周分别抽取房水,用ELISA法测定房水中血管内皮细胞生长因子（VEGF）浓度；使用全自动生化分析仪测定房水中Ca2+、Mg2+、P、Na+、K+、C1-六项离子的浓度,并行统计学分析。术后4、8、12周分别摘取术眼,行病理切片、抗Brdu单克隆抗体免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜观察角膜内表面RF6A分布和形态结构,虹膜及小梁网的形态结构。结果：角膜透明度：在观察期内（3个月）,A组、B组角膜比C组有较好的透明度,未出现新生血管及大泡性角膜病变。术眼前房深度均正常。病理切片：A组和B组的角膜内表面可见细胞层,抗Brdu单克隆抗体免疫组化染色阳性,示该细胞为体外培养经Brdu标记的RF6A；后弹力层均基本完整。虹膜仅有轻度水肿；小梁网结构清晰,未见细胞碎片堵塞网孔。C组角膜内表面仅见周边残留角膜内皮细胞,免疫组化染色阴性；除术后立即摘眼的角膜后弹力层完整外,其他各时期后弹力层逐渐溶解消失。虹膜及小梁网结构清晰。扫描电镜：A组和B组角膜内表面可见RF6A分布均匀,生长良好。虹膜上见散在RF6A生长,但虹膜表面结构无明显改变；小梁网未见细胞碎片堵塞。C组角膜内表面仅见结构形态已破坏的CECs,术后后弹力层逐渐溶解,未见新的CECs生长。透射电镜：培养的RF6A以及角膜内表面的RF6A呈不规则扁圆形,其丰富的细胞器和特征性WP小体提示具备一定的活体血管内皮细胞的特征与活性。C组角膜内表面残存的CECs,胞质水肿,细胞器稀少。房水VEGF浓度：仅A组不同观察时间点的VEGF浓度差异有统计学意义。A、B和C组三组间Ca2+、Mg2+、P、Na+、K+、Cl-浓度无明显差异。术后3月时A组Na+浓度略低于C组。实验组内各时期Mg2+、P离子浓度有一定改变。结论：前房注射法能够将恒河猴血管内皮细胞移植到角膜内表面,且细胞能在超声乳化破坏角膜内皮层的后弹力层上生长,并在一定程度上发挥屏障作用维持角膜的脱水状态和透明性。移植术后,对虹膜、前房角的组织结构形态在短期内不产生病理性的影响；对房水VEGF浓度和Ca2+、Mg2+、P、Na+、K+、Cl-的浓度有一定程度的影响。
杨成香[9]（2012）在《光动力学角膜胶原交联对LASIK术后角膜瓣愈合影响的实验研究》文中研究说明目的在20世纪90年代,激光治疗在屈光手术界产生了巨大的影响。准分子激光角膜原位磨镶术（Laser in situ keratomileusis,LASIK）是在角膜瓣下对角膜基质层进行激光切削,同其他所有手术一样,LASIK同样存在手术风险以及潜在手术并发症,在角膜瓣与角膜基质床粘附的过程中也会出现一些问题。胶原交联是指交联诱导物在特定的条件下被激活,产生氧自由基或者单态氧,从而诱导胶原纤维之间共价键的形成,以此来增加胶原纤维之间共价键的密度,从而使组织的生物机械强度增加。交联诱导剂种类繁多,其中,核黄素-紫外线A诱导的角膜胶原交联在眼表疾病中的应用已经引起广泛关注,尤其在治疗圆锥角膜方面,国内外已经应用于临床。本实验研究试图将核黄素—紫外线A诱导角膜胶原交联的方法应用于准分子激光原位角膜磨镶术（LASIK）后,诱导LASIK术后角膜发生胶原交联,以此探讨核黄素—紫外线A诱导的角膜胶原交联是否能够促进LASIK术后角膜瓣与角膜基质床的黏着与愈合,减少LASIK术后角膜瓣移位及医源性圆锥角膜等相关并发症的发生。实验主要是通过建立新西兰白兔LASIK动物模型,诱导LASIK术后角膜发生胶原交联反应,并对动物模型角膜进行相关指标的测量,在安全性及有效性方面对实验方法的可行性及其应用价值进行初步研究,为进一步的应用提供理论依据。方法1.建立新西兰兔LASIK动物模型健康新西兰白兔22只,双眼行LASIK手术,建立实验动物模型,右眼给予核黄素-紫外线A诱导角膜胶原交联,左眼行LASIK手术后不做诱导角膜胶原交联处理,做为空白对照组。术毕,送回动物房,为后续实验指标的观察测量做好准备。术后双眼4次/天滴用0.5%左氧氟沙星滴眼液共三天,预防感染。2.实验动物眼前节裂隙灯观察术后1天、3天及1周,随机取实验动物4只,行眼前节裂隙灯检查,观察实验眼与对照眼的角膜水肿、炎症细胞浸润等。3.实验动物角膜共聚焦显微镜检查术后1周,1月及3月,随机取实验动物4只,行活体角膜共聚焦显微镜检查,观察实验眼与对照眼的角膜基质中角膜细胞的变化。4.角膜组织病理切片光学显微镜观察术后1周、1月及3月,各随机取实验动物4只,耳缘静脉给予过量空气处死实验动物,取角膜组织进行角膜组织病理切片,行HE（苏木精-伊红）染色,观察并比较实验眼与对照眼在角膜炎症细胞浸润方面的差别,并观察角膜基质层中切削区的变化。5.角膜组织病理切片电子显微镜观察术后1月,随机取实验动物5只,耳缘静脉给予过量空气处死实验动物,取角膜组织进行角膜组织病理切片,在电子显微镜下进行观察,观察角膜胶原纤维直径的变化。6.角膜瓣抗拉力实验检测术后1月,随机取实验动物5只,耳缘静脉给予过量空气处死实验动物,剥离眼球,利用电子单纤维强力仪进行角膜瓣抗拉力检测,比较角膜瓣与角膜基质床的黏附力。结果1.术后在裂隙灯下观察术眼,在未刮除角膜上皮细胞的情况下,核黄素可通过角膜瓣周边缝隙渗透进入前房,约20分钟后,裂隙灯下可见前房内黄绿色条带,表明核黄素能够到达角膜瓣下并穿透角膜基质层。2.术后1天、3天及1周,裂隙灯检查发现,实验组与对照组相比,两者均无明显的充血水肿。3.术后1周,1月及3月活体角膜共聚焦显微镜检查结果显示,实验组有更为明显的处于激活状态的角膜细胞。4.病理学结果显示实验组及对照组均无明显的炎症细胞浸润,并且在切削区域内均可见“无细胞区”的存在。5.角膜组织电镜检查结果显示,实验组角膜胶原纤维直径（36.51±3.29nm）明显大于对照组（29.55±1.74nm）,（t=7.94,P<0.01）,统计学差异有显着性。6.术后1个月,抗拉力实验结果显示,实验组角膜瓣与角膜基质床的黏附力较对照组明显增加,在不同的拉伸长度0.668mm,1.336mm,2.025mm,2.593mm,3.261mm及3.950mm时,对应的t值分别为456.08,289.18,451.55,476.94,371.37及151.24,P<0.01,统计学差异有显着性。结论核黄素-紫外线A诱导的角膜胶原交联对LASIK术后角膜瓣与角膜基质床的黏附与愈合有一定的促进作用,并且未见明显的炎症反应等毒副作用,但其作用机理仍需进一步研究。
高洪瑞,蒋华[10]（2010）在《大泡性角膜病变兔角膜内皮细胞密度、Na+-K+-ATP酶活性的变化及意义》文中进行了进一步梳理目的观察大泡性角膜病变兔角膜内皮细胞密度及Na+-K+-ATP酶活性变化,探讨大泡性角膜病变的发病机制。方法新西兰大白兔24只,以0.05%的新洁尔灭溶液单眼前房注射建立大泡性角膜病变模型（模型组）,另1只眼不作处理（对照组）。7 d后处死所有动物,分别检测两组角膜厚度、角膜内皮细胞密度及角膜内皮Na+-K+-ATP酶活性。结果模型组病变角膜水肿混浊,角膜厚度为（696.17±43.54）μm,角膜内皮细胞密度为（646.58±126.72）个/mm2,角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶活性为（1.03±0.28）U/mg prot,对照组分别为（367.51±23.13）μm、（2 876.00±164.65）个/mm2、（3.82±0.27）U/mg prot,两组相比,P均<0.01。结论大泡性角膜病变兔角膜内皮细胞密度及Na+-K+-ATP酶活性明显降低,这可能是本病的发病机制。
二、大泡性角膜病变动物模型的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大泡性角膜病变动物模型的建立（论文提纲范文）
（1）高脂血症对小鼠睑板腺和角膜内皮的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 睑板腺 |
| 1.1.1 睑板腺结构 |
| 1.1.2 睑板腺功能 |
| 1.1.3 睑板腺功能障碍 |
| 1.2 角膜内皮的结构和功能 |
| 1.3 高脂血症 |
| 1.4 高脂血症和眼部疾病 |
| 1.4.1 脂性角膜弓 |
| 1.4.2 脂质角膜病 |
| 1.4.3 糖尿病性视网膜病变 |
| 1.5 研究现状和本课题的研究意义 |
| 第二章 高脂饮食诱导的肥胖和高脂血症通过PPAR-γ通路促进小鼠睑板腺炎症 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 动物 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂与药品 |
| 2.2.4 抗体 |
| 2.2.5 主要耗材 |
| 2.2.6 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养与处理 |
| 2.3.2 裂隙灯检查 |
| 2.3.3 血液中总胆固醇含量检测 |
| 2.3.4 H&E染色 |
| 2.3.5 油红O染色 |
| 2.3.6 免疫荧光染色 |
| 2.3.7 RNA提取、反转录和qRT-PCR |
| 2.3.8 引物设计 |
| 2.3.9 Western Blot |
| 2.3.10 透射电镜 |
| 2.3.11 统计方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 高脂饮食可以诱导小鼠的肥胖和高脂血症以及睑板腺分泌物的异常 |
| 2.4.2 高脂饮食可以诱导小鼠睑板腺组织学改变 |
| 2.4.3 高脂饮食可以诱导小鼠睑板腺炎症细胞浸润 |
| 2.4.4 高脂饮食可以改变小鼠睑板腺PPAR-γ的表达水平 |
| 2.4.5 高脂饮食可以激活小鼠睑板腺MAPK和NF-κB信号通路 |
| 2.4.6 高脂饮食可以促进小鼠睑板腺腺泡细胞凋亡 |
| 2.4.7 高脂饮食可以破坏小鼠睑板腺线粒体结构 |
| 2.4.8 恢复饮食可以逆转小鼠睑板腺的表型 |
| 2.4.9 罗格列酮可以减轻高脂饮食诱导的睑板腺炎症 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 载脂蛋白E缺乏导致小鼠睑板腺功能障碍 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 动物 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 主要试剂与药品 |
| 3.2.4 抗体 |
| 3.2.5 主要耗材 |
| 3.2.6 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物饲养与处理 |
| 3.3.2 裂隙灯检查 |
| 3.3.3 血液总胆固醇含量检测 |
| 3.3.4 H&E染色 |
| 3.3.5 油红O染色 |
| 3.3.6 凋亡检测 |
| 3.3.7 免疫荧光染色 |
| 3.3.8 免疫组织化学染色 |
| 3.3.9 RNA提取、反转录和qRT-PCR |
| 3.3.10 引物设计 |
| 3.3.11 Western Blot |
| 3.3.12 统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 ApoE~(-/-)小鼠特征 |
| 3.4.2 ApoE~(-/-)小鼠睑板腺和眼表临床表现 |
| 3.4.3 ApoE~(-/-)小鼠睑板腺细胞的病理改变 |
| 3.4.4 ApoE~(-/-)小鼠眼睑组织的炎症 |
| 3.4.5 ApoE~(-/-)小鼠睑板腺细胞的氧化应激 |
| 3.4.6 ApoE~(-/-)小鼠睑板腺细胞分化的改变 |
| 3.4.7 PPAR-γ激动剂可显着改善ApoE~(-/-)小鼠睑板腺的病理改变 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 高脂血症影响角膜内皮的紧密连接和泵功能 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 动物 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 主要试剂与药品 |
| 4.2.4 抗体 |
| 4.2.5 主要耗材 |
| 4.2.6 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 动物 |
| 4.3.2 高脂血症动物的建立 |
| 4.3.3 血液胆固醇和空腹血糖检测 |
| 4.3.4 油红O染色 |
| 4.3.5 活体共聚焦显微镜 |
| 4.3.6 小鼠内皮损伤模型的建立 |
| 4.3.7 扫描电镜 |
| 4.3.8 透射电镜 |
| 4.3.9 房水的提取和检测 |
| 4.3.10 兔角膜内皮细胞原代培养 |
| 4.3.11 棕榈酸制备 |
| 4.3.12 CCK8实验 |
| 4.3.13 免疫荧光染色 |
| 4.3.14 免疫组织化学染色 |
| 4.3.15 RNA提取、反转录和qRT-PCR |
| 4.3.16 引物设计 |
| 4.3.17 统计方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ApoE基因缺陷和高脂饮食可以诱导小鼠高脂血症以及角膜内皮细胞的脂质沉积 |
| 4.4.2 高脂血症导致小鼠角膜内皮细胞表型改变 |
| 4.4.3 高脂血症导致小鼠角膜内皮细胞损伤后失代偿 |
| 4.4.4 高脂血症诱导小鼠角膜内皮细胞氧化应激 |
| 4.4.5 棕榈酸诱导体外培养的兔角膜内皮细胞表型改变 |
| 4.4.6 棕榈酸诱导体外培养的兔角膜内皮细胞氧化应激和线粒体功能障碍 |
| 4.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间相关科研成果和获奖 |
| 致谢 |
（2）两种遗传性角膜病小鼠模型的建立及其角膜病变特征分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 人类疾病动物模型的意义与应用 |
| 1 人类疾病动物模型的意义 |
| 2 人类疾病动物模型的分类 |
| 3 人类疾病动物模型的选择 |
| 第二章 ENU诱变技术的发展与应用 |
| 1 ENU诱变的机理 |
| 2 ENU剂量的选择及突变效率 |
| 3 ENU诱变筛查方法 |
| 第三章 国内外遗传性眼病小鼠模型的研究概况 |
| 1 国内遗传性眼病小鼠模型的研究概况 |
| 2 国外遗传性眼病小鼠模型的研究概况 |
| 3 本实验室已鉴定的遗传性眼病小鼠模型 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 ENU诱变获得两种遗传性角膜病小鼠模型 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ENU处理后雄鼠的生殖情况 |
| 2.2 突变小鼠筛选情况 |
| 2.3 突变小鼠遗传验证实验 |
| 2.4 Cod1、Cod2小鼠遗传稳定性研究 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Cod1、Cod2小鼠角膜HE染色分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 Cod1、Cod2小鼠角膜免疫组织化学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CD31在Cod1、Cod2小鼠角膜基质中的表达情况 |
| 2.2 角蛋白K12、K14、K10在Cod1、Cod2小鼠角膜中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（3）人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 体外诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 利用角膜内皮样细胞进行角膜内皮移植的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 利用角膜内皮样细胞构建组织工程角膜植片的初步实验研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 皮肤干细胞及其在组织工程角膜应用的相关进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（4）角膜内皮失代偿动物模型建立及水通道蛋白、Smac/DIABLO的表达变化研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| （一）CED动物模型建立 |
| （二）CED的临床治疗 |
| （三）水通道蛋白与角膜疾病 |
| （四）第2个线粒体衍生的半胱天冬酶激活因子/低等电点的IAP直接结合蛋白（Second mitochondria-derived activator of caspases/direct inhibitor ofapoptosis-binding protein with low pi, Smac/DIABLO) |
| 参考文献 |
| 第一部分 改良超声法诱导建立恒河猴CED模型 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 前房灌注聚维酮碘诱导建立SD大鼠CED模型 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 水通道蛋白、Smac/DIABLO在聚维酮碘诱导的大鼠CED模型中的表达变化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）角膜基质内羊膜移植治疗兔大泡性角膜病变的实验研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（7）大泡性角膜病变的临床治疗及研究进展（论文提纲范文）
| 0引言 |
| 1临床治疗 |
| 1.1药物治疗 |
| 1.2软性角膜接触镜 |
| 1.3手术治疗 |
| 1.3.1角膜层间术式 |
| 1.3.2羊膜移植的应用 |
| 1.3.3结膜瓣遮盖 |
| 1.3.4角膜移植术 |
| 1.3.4.1穿透性角膜移植 |
| 1.3.4.2自体板层角膜转位[28]及自体板层角膜转位联合其他层间术式[29] |
| 1.3.5角膜内皮移植术 |
| 1.3.5.1后板层角膜移植术 |
| 1.3.5.2深板层内皮角膜移植术 |
| 1.3.5.3后弹力层撕除角膜内皮移植术 |
| 1.3.5.4后弹力层角膜内皮移植术 |
| 1.3.5.5体外培养的角膜内皮细胞移植 |
| 2展望 |
（8）恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（9）光动力学角膜胶原交联对LASIK术后角膜瓣愈合影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1.1 实验对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验过程中用到的主要仪器设备及试剂 |
| 1.1.3 建立动物实验模型 |
| 1.2 相关指标的检测 |
| 1.2.1 眼前节裂隙灯检查 |
| 1.2.2 活体角膜共聚焦显微镜检查 |
| 1.2.3 术后角膜组织的取材与处理 |
| 1.2.4 生物力学检查 |
| 1.2.5 病理学检查 |
| 1.2.6 统计学方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 眼前节裂隙灯检查 |
| 1.3.2 活体角膜共聚焦显微镜检查 |
| 1.3.3 生物力学-角膜瓣抗拉力实验 |
| 1.3.4 角膜组织病理切片结果 |
| 1.3.5 角膜组织病理切片电子显微镜结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 实验动物模型的建立 |
| 1.4.2 病理学检查以及活体角膜共聚焦显微镜检查 |
| 1.4.3 角膜瓣生物力学检查 |
| 1.4.4 角膜组织电镜检查 |
| 1.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）大泡性角膜病变兔角膜内皮细胞密度、Na+-K+-ATP酶活性的变化及意义（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物分组与模型建立 |
| 1.2 角膜厚度、内皮细胞密度及Na+-K+-ATP酶活性检测 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
四、大泡性角膜病变动物模型的建立（论文参考文献）
- [1]高脂血症对小鼠睑板腺和角膜内皮的影响及其作用机制的研究[D]. 卜敬华. 厦门大学, 2019(08)
- [2]两种遗传性角膜病小鼠模型的建立及其角膜病变特征分析[D]. 缪雅悠. 扬州大学, 2019(02)
- [3]人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究[D]. 申琳. 山东大学, 2018(01)
- [4]角膜内皮失代偿动物模型建立及水通道蛋白、Smac/DIABLO的表达变化研究[D]. 吴敏. 昆明医科大学, 2018(01)
- [5]角膜基质内羊膜移植治疗兔大泡性角膜病变的实验研究[J]. 刘海,李妍,杨忠昆,张文佳,王莹婷. 眼科新进展, 2015(08)
- [6]兔大泡性角膜病变疼痛状态客观评价的方法学研究[J]. 荣蓓,白静,晏晓明. 中华实验眼科杂志, 2013(05)
- [7]大泡性角膜病变的临床治疗及研究进展[J]. 肖中男,胡竹林. 国际眼科杂志, 2012(07)
- [8]恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞的实验研究[D]. 肖中男. 昆明医科大学, 2012(11)
- [9]光动力学角膜胶原交联对LASIK术后角膜瓣愈合影响的实验研究[D]. 杨成香. 天津医科大学, 2012(03)
- [10]大泡性角膜病变兔角膜内皮细胞密度、Na+-K+-ATP酶活性的变化及意义[J]. 高洪瑞,蒋华. 山东医药, 2010(42)