一、青霉素溶液对大鼠臀肌纤维化影响的实验观察（论文文献综述）
赵淋淋[1]（2021）在《有氧运动调节AMPK相关信号通路减缓TAC诱导病理性心肌肥厚的机制研究》文中研究表明研究目的心力衰竭作为许多心血管疾病终端末期心脏功能失代偿的临床综合征,已经成为世界范围内的主要死亡原因。虽然心力衰竭的诊断和治疗已经取得了一些进展,但死亡率仍旧居高不下,因此寻找改善心血管功能的有效治疗靶点和干预手段至关重要。适度的有氧运动训练对心血管系统有许多益处。适当的运动训练可以减低多种心血管疾病的发病率,并同时改善心室功能。先前研究表明,适度运动训练可以增强心力衰竭病人的运动耐量、改善其血管内皮功能、并有效抑制病人的交感神经兴奋性,从而提高病人心输出量,改善左室功能和神经激素水平,因此认为运动训练对心衰有一定减缓作用,但有氧运动减缓心力衰竭的分子机制尚不清楚。因此,本研究通过四周有氧运动（在体实验）结合血管紧张素干预心肌细胞系（离体实验）,探究有氧运动通过AMPK（AMP-activated protein kinase）相关信号通路减缓病理性心肌肥厚的作用以及分子机制,为减缓心力衰竭提供坚实的理论依据。研究方法1、在体实验,本课题分别采用C57BL/6J小鼠以及AMPKα2基因敲除小鼠通过主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）建立病理性心肌肥厚模型,术后一周进行运动预适应一周,有氧运动干预四周,通过小鼠超声仪评价小鼠心功能。通过马松染色分析、天狼星红染色,偏振光观察评价小鼠心肌纤维化状况。通过麦胚凝集素（wheat germ agglutinin,WGA）免疫荧光染色评价小鼠心肌细胞面积。使用Western blot检测小鼠心力衰竭标志性蛋白（ANP）,心肌纤维化相关蛋白（collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、MMP-9）,促纤维化信号通路（TGF-β/Smad、NLRP3/IL-1β）,AMPK介导的自噬关键蛋白（p-AMPKα/AMPKα、p-mTOR/T-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和 p62）,硫化氢合成酶（CBS、CSE）。采用ZnAc捕捉法进行H2S提取,并使用酶标仪检测内源性H2S含量。2、离体实验,本课题组采用H9C2心肌细胞系,进行传代后采用血管紧张素（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）干预建立心肌细胞肥大模型,采用NaHS干预肥大心肌细胞,并进行AMPK抑制剂（CompoundC dihydrochloride,CC）,自噬抑制剂（3-Methyladenine,3-MA）干预实验,干预实验结束后,采用WGA免疫荧光实验评价心肌细胞大小,通过Western blot检测促纤维化信号通路（NLRP3/IL-1β）,AMPK 介导的自噬关键蛋白（p-AMPKα/AMPKα、p-mTOR/T-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1 和 p62）。研究结果第一部分、有氧运动对TAC诱导C57BL/6J小鼠病理性心肌肥厚的影响1、与Sham组相比,TAC导致C57BL/6J小鼠心脏质量（HW）、左心室质量（LV MASS）、左心室重量/体重比（LV/BW）、左心室重量/胫骨长度比（LV/TL）、心脏重量/体重比（HW/BW）和心脏质量/胫骨长度比（HW/TL）明显增高。与TAC组相比,运动训练四周显着减轻了 TAC诱导的C57BL/6J小鼠的心脏质量（HW）、左心室质量（LVMASS）、左心室重量/体重比（LV/BW）、左心室重量/胫骨长度比（LV/TL）、心脏重量/体重比（HW/BW）和心脏质量/胫骨长度比（HW/TL）的增加。而四组C57BL/6J小鼠的质量以及胫骨长度无显着性差异。2、与Sham组小鼠相比,TAC组左室舒张末期直径（LVEDD）和左室收缩末期直径（LVESD）显着增加,缩短分数（FS）和射血分数（EF）明显降低。与Sham+Ex组比较,TAC+Ex组小鼠左室舒张末期直径（LVEDD）和收缩末期直径（LVESD）增加,缩短分数（FS）和射血分数（EF）显着下降。与TAC组比较,TAC+Ex组小鼠左室舒张末期直径（LVEDD）和左室收缩末期直径（LVESD）显着减小,缩短分数（FS）和射血分数（EF）显着增加。3、与Sham组小鼠心肌细胞横截面积相比,TAC组小鼠心肌细胞横截面积明显增大。TAC+Ex组小鼠心肌细胞横截面积比与Sham+Ex组较大。而TAC+Ex组小鼠心肌横截面积与TAC组相比,显着性减小。4、与Sham+Ex组相比,TAC+Ex组ANP蛋白也成显着增加,但是有氧运动五周后的TAC+Ex组与TAC组相比,TAC+Ex组ANP蛋白显着降低。5、与Sham组相比,TAC组C57BL/6J小鼠心肌胶原纤维显着性增加（p<0.01）。与Sham+Ex组相比,TAC+Ex组心肌胶原纤维也显着性增加（p<0.01）,但TAC+Ex组心肌胶原纤维与TAC组相比,显着性降低（p<0.01）。,与Sham组相比,TAC组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白水平显着性增加（p<0.01）,而TAC+Ex组Ⅰ型胶原蛋白水平显着性高于与Sham+Ex组（p<0.05）,两组的Ⅲ型胶原蛋白水平无显着性差异。但TAC+Ex组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白水平比TAC组显着性降低(p<0.01。与Sham组相比,TAC组MMP-9蛋白水平显着升高（p<0.01）。与TAC组相比,有氧运动训练四周后MMP-9蛋白水平显着降低（p<0.01）（图 1-6A,D）。6、与Sham组比较,TAC组TGF-β、Smad2/3磷酸化和Smad4蛋白表达显着升高（p<0.01）,而与TAC小鼠相比,四周有氧运动训练后TAC+Ex组TGF-β、Smad2/3磷酸化和Smad4蛋白表达显着降。7、与Sham组相比,TAC组NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β蛋白水平显着性增加（p<0.01）,而Pro.caspase-1也呈上升趋势,但没有显着性差异。与Sham+Ex组相比,TAC+Ex组中c1.caspase-1蛋白水平显着性增加（p<0.01）,而NLRP3,Pro.caspase-1,IL-1β蛋白水平也呈升高趋势,但没有显着性差异。与TAC组相比,TAC+Ex 组 NLRP3（p<0.01）,c1.caspase-1（p<0.01）,IL-1β（p<0.05）蛋白水平显着性降低,而Pro.caspase-1蛋白水平呈下降趋势,但没有显着性差异。8、与Sham组相比,TAC显着降低了 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值以及Beclin-1蛋白表达水平,增加了 p62蛋白表达水平,说明压力负荷过载抑制了自噬水平的升高。与TAC组相比,TAC+Ex组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值以及Beclin-1蛋白表达水平增加,p62的蛋白表达下降。与Sham组相比,TAC组的p-AMPKα/AMPKα以及p-mTOR/T-mTOR蛋白表达率显着加,与TAC组相比,TAC+Ex组p-AMPKα/AMPKα蛋白表达率显着性增加,而p-mTOR/T-mTOR蛋白表达率显着降低。9、与Sham组相比,TAC组左室组织中CBS（P<0.05）和CSE（P<0.01）蛋白表达均显着降低。运动训练四周后,TAC+Ex组CBS（P<0.05）和CSE（P<0.01）蛋白水平较TAC组明显升高。此外,与Sham组相比,TAC诱导的C57BL/6J小鼠心肌组织中内源性H2S含量显着性降低,而有氧运动显着增加了 TAC诱导的C57BL/6J小鼠心肌组织中内源性H2S含量。第二部分、AMPK α2基因敲除阻滞有氧运动减缓病理性心肌肥厚的作用1、与KO+Sham组相比,KO+TAC组小鼠心脏质量（HW）、左心室质量（LV MASS）、左心室重量/体重比（LV/BW）、左心室重量/胫骨长度比（LV/TL）、心脏重量/体重比（HW/BW）和心脏质量/胫骨长度比（HW/TL）明显升高而与KO+Sham+Ex相比,TAC诱导的AMPKα2-/-小鼠的心脏质量（HW）、左心室质量（LVMASS）、左心室重量/体重比（LV/BW）、左心室重量/胫骨长度比（LV/TL）、心脏重量/体重比（HW/BW）和心脏质量/胫骨长度比（HW/TL）显着增加。而与KO+TAC组相比,KO+TAC+Ex组AMPKα2-/-小鼠的心脏质量（HW）、左心室质量（LVMASS）、左心室重量/体重比（LV/BW）、左心室重量/胫骨长度比（LV/TL）、心脏重量/体重比（HW/BW）和心脏质量/胫骨长度比（HW/TL）未显着降低。四组AMPKα2-/-小鼠的质量以及胫骨长度无显着性差异。2、与KO+Sham组小鼠相比,KO+TAC组左室舒张末期直径（LVEDD）和缩末期直径（LVESD）显着增加,缩短分数（FS）和射血分数（EF）明显降低,与KO+Sham+Ex组比较,KO+TAC+Ex组小鼠左室舒张末期直径（LVEDD）和收缩末期直径（LVESD）增加,缩短分数（FS）和射血分数（EF）显着下降。与KO+TAC组比较,KO+TAC+Ex组小鼠左室舒张末期直径（LVEDD）和左室收缩末期直径（LVESD）未显着减小,缩短分数（FS）和射血分数（EF）未显着增加。3、与KO+Sham组小鼠心肌细胞横截面积相比,KO+TAC组小鼠心肌细胞横截面积明显增大。KO+TAC+Ex组小鼠心肌细胞横截面积比KO+Sham+Ex组较大。而KO+TAC+Ex组小鼠心肌横截面积与KO+TAC组相比,心肌细胞面积未显着性减小。4、KO+TAC组与KO+Sham组相比,ANP蛋白显着性升高,与KO+Sham+Ex组相比,KO+TAC+Ex组ANP蛋白也成显着增加,但是有氧运动五周后的KO+TAC+Ex组与KO+TAC组相比,ANP蛋白水平未显着降低。5、与KO+Sham组相比,KO+TAC组AMPKα2-/-小鼠心肌胶原纤维显着性增加。与KO+Sham+Ex组相比,KO+TAC+Ex组心肌胶原纤维也显着性增加,但KO+TAC+Ex组心肌胶原纤维与KO+TAC组相比,未显着性降低。与KO+Sham组相比,KO+TAC组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白水平显着性增加,而KO+TAC+Ex组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白水平显着性高于KO+Sham+Ex组,但KO+TAC+Ex组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白水平与KO+TAC组相比,未显着性降低。KO+TAC组MMP-9蛋白水平显着升高。与KO+TAC组相比,有氧运动训练四周后MMP-9蛋白水平未显着降低。6、与KO+Sham组比较,KO+TAC组TGF-β、Smad2/3磷酸化和Smad4蛋白表达显着升高,而与KO+TAC小鼠相比,四周有氧运动训练后KO+TAC+Ex组TGF-β、Smad2/3磷酸化和Smad4蛋白表达未显着降低。7、与 KO+Sham 组相比,KO+TAC 组 NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β 蛋白水平显着性增加,而Pro.caspase-1也呈上升趋势,但没有显着性差异。与KO+Sham+Ex 组相比,KO+TAC+Ex 组中 NLRP3,Pro.caspase-1,IL-1β 蛋白水平也显着性升高。与KO+TAC组相比,KO+TAC+Ex组NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β蛋白水平未显着性降低。8、与KO+Sham组相比,KO+TAC显着降低了 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值以及Beclin-1蛋白表达水平,增加了 p62蛋白表达水平。与KO+TAC组相比,KO+TAC+Ex组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值以及Beclin-1蛋白表达水平未显着增加,p62的蛋白表达未显示下降。与KO+Sham组相比,KO+TAC组的p-mTOR/T-mTOR蛋白表达率显着加,与KO+TAC组相比,KO+TAC+Ex组p-mTOR/T-mTOR蛋白表达率未显着降低。9、与KO+Sham组相比,KO+TAC组左室组织中CBS和CSE蛋白表达均显着降低。运动训练四周后,KO+TAC+Ex组CBS（P<0.01）和CSE（P<0.05）蛋白水平较,KO+TAC组明显升高。此外,与KO+Sham组相比,TAC诱导的AMPKα2小鼠心肌组织中内源性H2S含量显着性降低,而有氧运动显着增加了 TAC诱导的AMPK α2小鼠心肌组织中内源性H2S含量。第三部分、AMPK介导的H2S及细胞自噬在病理性心肌肥厚中的机制研究1、与control相比,AngⅡ诱导的心肌细胞面积显着性增大,而与AngⅡ组相比,NaHS干预显着减小心肌细胞的肥大面积。与control相比,降低了 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比例和Beclin-1蛋白表达,增加了 p62蛋白表达（P<0.01）,与AngⅡ组相比,外源H2S增加LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达率,增加Beclin-1蛋白质的表达,同时p62的蛋白表达下降。与control相比,AngⅡ组p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR蛋白表达率增加。与AngⅡ组相比,外源H2S干预进一步增加了 p-AMPK/AMPK蛋白表达率,而降低了 p-mTOR/mTOR蛋白表达率。与control 相比,AngⅡ 组,NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β 蛋白水平显着性增加（p<0.01）,而Pro.caspase-1没有显着性差异。与AngⅡ组相比,外源性H2S降低NLRP3（p<0.05）,c1.caspase-1,IL-1β 蛋白水平,而 Pro.caspase-1 蛋白水平呈下降趋势,但没有显着性差异。2、与control组相比,AngⅡ组,LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达比以及Beclin-1蛋白表达水平降低,p62的蛋白表达显着升高。与AngⅡ组相比,外源性NaHS溶液显着增加LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达比以及Beclin-1蛋白表达水平,降低p62的蛋白水平表达。3-MA作为自噬抑制剂能浓度依赖性的降低LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达比以及Beclin-1蛋白表达水平,同时升高P62蛋白水平,与NaHS+AngⅡ相比。与control相比,AngⅡ诱导的心肌细胞面积显着性增大,而与AngⅡ组相比,NaHS干预显着减小心肌细胞的肥大面积。与NaHS+AngⅡ组,自噬抑制剂干预后,外源性硫化氢对肥大心肌细胞的减少作用消除。与control相比,AngⅡ组,NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β 蛋白水平显着性增加,而 Pro.caspase-1 没有显着性差异。与AngⅡ组相比,外源性H2S降低NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β蛋白水平,而Pro.caspase-1但没有显着性差异。与NaHS+AngⅡ组相比,3-MA+NaHS+AngⅡ 组 NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β 蛋白水平显着性增加。3、与 control 相比,AngⅡ 组 p-AMPK/AMPK 和 p-mTOR/mTOR 蛋白表达率增加。与AngⅡ组相比,外源H2S干预进一步增加了 p-AMPK/AMPK蛋白表达率,而降低了 p-mTOR/mTOR蛋白表达率。CC作为AMPK抑制剂能浓度依赖性的降低p-AMPK/AMPK的蛋白表达比,同时p-mTOR/mTOR蛋白表达率增加,与NaHS+AngⅡ相比。提示,10uMCC可显着性抑制AMPK蛋白活性。与control相比,AngⅡ诱导的心肌细胞面积显着性增大,而与AngⅡ组相比,NaHS干预显着减小心肌细胞的肥大面积。与NaHS+AngⅡ组,AMPK抑制剂干预后,外源性H2S对肥大心肌细胞的减少作用消除。与control组相比,AngⅡ组,LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达比以及Beclin-1蛋白表达水平降低,p62的蛋白表达显着升高。与AngⅡ组相比,外源性H2S显着增加LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达比以及Beclin-1蛋白表达水平,降低p62的蛋白水平表达。与NaHS+AngⅡ相比,CC+3-MANaHS+AngⅡ组LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达比以及Beclin-1蛋白表达水平显着下降,同时升高P62蛋白水平提高。与control相比,AngⅡ组,NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β蛋白水平显着性增加,而Pro.caspase-1没有显着性差异。与 AngⅡ 组相比,外源性 H2S 降低 NLRP3,c1.caspase-1,IL-1 β（p<0.01）蛋白水平,而Pro.caspase-1没有显着性差异。与NaHS+AngⅡ组相比,CC+NaHS+AngⅡ 组 NLRP3,c1.caspase-1,IL-1β 蛋白水平显着性增加。研究结论1、本实验研究证实TAC手术诱导的压力超负荷可导致C57BL/6J小鼠心脏以及左心室重量增加、小鼠心肌细胞横截面积增大,并伴有心肌组织纤维化的发生,以及小鼠心脏的收缩和舒张功能下降。四周有氧运动干预可以提高压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚C57BL/6J小鼠的射血分数,改善心功能障碍,提高心肌组织内源性H2S产生,抑制心肌细胞肥大以及减轻心肌纤维化,激活AMPK介导的细胞自噬,抑制NLRP3/IL-1β蛋白信号通路的激活,在一定程度上减缓了C57BL/6J小鼠病理性心肌肥厚的发展,从而对C57BL/6J小鼠心脏组织起到一定的保护作用。2、AMPKα2基因敲除阻滞有氧运动训练干预减轻TAC诱导的心肌损伤,其可能机制是AMPKα2敲除阻滞有氧运动激活心肌细胞自噬,从而造成对NLRP3/IL-1β蛋白信号通路的抑制不起作用。AMPKα2基因敲除未阻滞有氧运动干预增加心肌组织内源性H2S产生。3、外源性H2S激活AMPK,降低mTOR活性表达,激活心肌细胞自噬,抑制NLRP3/IL-1β信号通路蛋白水平表达,抑制AngⅡ诱导的心肌肥大从而减缓心肌肥厚,提示我们,有氧运动通过增加心肌组织内源性H2S产生,激活细胞自噬,抑制NLRP3/IL-1β蛋白信号通路的激活,从而预防病理性肥厚是由AMPKα2介导的。
孙敬辉[2]（2021）在《miR-489调控心肌纤维化的机制及人参皂苷Re的干预作用研究》文中认为心肌纤维化（myocardial fibrosis,MF）是众多心血管疾病发展至后期常见的病理改变,常常引起心肌收缩和舒张功能障碍,是心室重构不断进展和不可逆的主要原因。MF的发病机制十分复杂,涉及到神经体液、生长因子、促炎性细胞因子和基因转录之间复杂的相互作用。心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）是MF最主要的效应细胞,可在缺血、炎性因子等促纤维化因素的刺激下分化为肌成纤维细胞。激活的肌成纤维细胞会分泌大量的细胞外基质蛋白,导致心室硬度增加,顺应性降低和心肌电信号传导异常,诱发难治性心力衰竭、恶性心律失常,严重影响心血管疾病的预后。目前MF的治疗尚缺乏特效药物,因此探寻MF发病机制的关键因子及安全可靠的治疗药物,对于MF的治疗刻不容缓。MircoRNAs（miRNAs）是一类在真核细胞中广泛表达的短链非编码RNA。它们可以直接与靶基因的3’UTR区域结合,诱导靶基因mRNAs分解或阻碍其翻译,从而调节多种生理功能和病理过程。miR-489在心肌细胞和CFs中广泛表达。在心肌细胞中miR-489过表达能够下调下游髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,myd88）的水平,减轻血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）诱导的心肌肥厚。重要的是,miR-489转基因小鼠体内AngⅡ诱导的MF明显减轻,说明miR-489能够抑制AngⅡ诱导的MF,miR-489可能是治疗MF的一个潜在靶点。然而,miR-489在MF中的调控机制尚不清楚,尤其是在心肌梗死诱导的MF中miR-489是否也具有同样作用值得进一步研究。中医学中没有MF的直接论述,但MF是众多心血管疾病发展至后期的病理改变,是一种相对慢性渐进性病变。中医传统理论认为“久病多虚”、“久病多瘀”,因此治疗当以补气活血为法。人参是传统医学中补气的要药,具有补益元气,健脾补肺,安神益智等功效,以及抗心肌缺血、抗心律失常、抗动脉粥样硬化和抗纤维化等药理作用。人参皂苷Re是人参的主要活性成分之一,课题组前期研究发现,人参皂苷Re具有抗心肌梗死后MF的作用,并且可以调控Smad2/3的表达。既往研究证实,Smad3是miR-489的直接下游靶点,那么人参皂苷Re是否可以通过调节miR-489来发挥抗MF的作用,值得进行深入研究。本研究通过体外构建miR-489过表达和抑制的CFs模型,证实miR-489对MF和myd88/核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路具有调控作用。在此基础上,以人参皂苷Re为干预手段,通过结扎左冠状动脉前降支构建心肌梗死小鼠模型和AngⅡ干预的乳鼠原代CFs模型,观察人参皂苷Re的抗MF作用,并探讨人参皂苷Re对miR-489及其下游myd88/NF-κB通路的调控作用,为中医药抗MF,改善心血管疾病患者的预后提供科学依据。研究一 miR-489调节心肌纤维化的机制研究目的:在正常培养的CFs和AngⅡ干预的CFs中转染miR-489 mimic和inhibitor观察miR-489模拟物和抑制物对CFs表型分化、迁移和分泌等细胞生物学行为的影响,并探讨其作用机制。方法:提取乳鼠原代CFs,经波形蛋白免疫荧光鉴定纯度后,按照如下分组:（1）在正常培养条件下的CFs中转染miR-489 mimic,构建miR-489过表达模型。CFs分为3组:正常组（Normal）、miR-489过表达组（mimic）、miR-489阴性对照组（mimic-NC）。（2）在AngⅡ干预的CFs中转染miR-489 mimic,构建miR-489过表达模型。CFs 分为 3 组:AngⅡ组（AngⅡ）、AngⅡ+miR-489 过表达组（AngⅡ+mimic）、AngⅡ+miR-489 阴性对照组（AngⅡ+mimic-NC）。（3）在正常培养条件下的CFs中转染miR-489 inhibitor,构建miR-489抑制模型。CFs 分为 3 组:正常组（Normal）、miR-489 抑制组（inhibitor）、miR-489阴性对照组（inhibitor-NC）。（4）在AngⅡ干预的CFs中转染miR-489 inhibitor,构建miR-489抑制模型。CFs 分为 3 组:AngⅡ组（AngⅡ）、AngⅡ+miR-489 抑制组（AngⅡ+inhibitor）、AngⅡ+miR-489 阴性对照组（AngⅡ+inhibitor-NC）。采用qPCR技术检测miR-489 mimic转染的CFs中miR-489的表达水平,验证转染效果。采用Western blot技术检测各组中α-SMA的表达情况,观察CFs的分化情况;检测Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达,观察CFs胶原蛋白的分泌情况;检测CFs中myd88、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表达情况,观察miR-489的调控作用。结果:（1）经波形蛋白免疫荧光检测证实提取的CFs纯度在95%以上,符合实验要求。（2）与Normal组和mimic-NC组比较,mimic组miR-489的表达水平显着升高（P<0.01）,Normal组和mimic-NC组之间无显着性差异（P>0.05）,说明 miR-489 mimic 转染成功。与 Normal 组和 inhibitor-NC 组相比,inhibitor 组myd88表达显着上调（P<0.01）,Normal组和inhibitor-NC组之间无统计学差异（P>0.05）,说明miR-489 inhibitor转染成功。（3）在正常条件下培养的CFs和AngⅡ干预的CFs中,miR-489过表达均能够显着抑制myd88、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表达,降低p-NF-κB p65/p65的比值;抑制miR-489能够促进myd88、α-SMA、Collagen Ⅰ和 Collagen Ⅲ的表达,上调 p-NF-κBp65/p65 的比值。结论:在正常培养的CFs和AngⅡ干预的CFs中miR-489过表达均能够抑制下游myd88/NF-κB通路的活化,减轻CFs的纤维化反应;抑制miR-489能够激活下游myd88/NF-κB信号通路,促进CFs的纤维化反应。这表明在生理和病理情况下CFs中miR-489均可调节myd88/NF-κB信号通路,改善心肌纤维化反应。研究二人参皂苷Re调节心肌梗死后心肌纤维化的机制研究目的:观察人参皂苷Re对急性心肌梗死后小鼠心功能、血清学标志物、组织病理学改变和相关基因蛋白表达的影响,探讨人参皂苷Re改善梗死后MF的分子机制。方法:通过结扎左冠状动脉前降支构建C57BL/6小鼠心肌梗死后MF模型。小鼠被随机分为4组:假手术组（Sham）、模型组（Model）、低剂量人参皂苷Re组（L,19.5mg/kg/d）和高剂量人参皂苷Re组（H,39mg/kg/d）,每组10只。术后第二天开始灌胃给药,1次/天,连续灌胃四周。心脏超声检测各组小鼠左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）,观察心功能情况;通过心重指数（HWI）、心胫比（HW/TL）以及心肌中ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达,观察心梗后心肌代偿性肥厚情况;通过ELISA方法检测血清中心肌损伤（CK-MB）、心力衰竭（BNP）、肝肾功能（ALT、S-Cr）和 RAAS（AngⅡ）等标记物的含量;通过HE和Masson染色,观察心梗后心肌组织及纤维化的病变情况;Western blot 检测 myd88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ等相关蛋白表达;qPCR技术检测miR-489和myd88的表达形况。结果:（1）与Sham组相比,Model组LVEF和LVFS显着减低（P<0.01）;与Model组比较,低高剂量人参皂苷Re组LVEF和LVFS明显升高（P<0.01）。（2）与Sham组比较,Model组CK-MB、BNP和AngⅡ水平显着升高（P<0.01）;与Model组比较,低高剂量人参皂苷Re组CK-MB、BNP和AngⅡ水平显着下降（P<0.05）,ALT 和 S-Cr 无明显变化（P>0.05）。（3）与 Sham 组比较,Model组HWI、HW/TL以及心肌中ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达显着升高（P<0.01）,给以低高剂量人参皂苷Re干预后,这些指标明显下降（P<0.05）。（4）与Sham组比较,Model组心肌结构排列紊乱,肌丝较粗,呈波状变化,伴有大量炎症细胞浸润和胶原蛋白沉积。给予人参皂苷Re干预后组织病理改变明显减轻。（5）与 Sham 组比较,Model 组 myd88、p-NF-κB p65、α-SMA、Collagen Ⅰ和CollagenⅢ的表达明显升高,miR-489的表达显着下调（P<0.01）;与Model组比较,低高剂量人参皂苷Re组myd88、p-NF-κB p65、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达明显降低,miR-489的表达显着上调（P<0.05）。以上检测中低高剂量人参皂苷Re组之间无统计学差异（P>0.05）。结论:人参皂苷Re能够改善心肌梗死后小鼠的心脏功能,抑制心肌代偿性肥厚,减轻心肌缺血损伤和胶原蛋白沉积,改善组织病理学病变,且未发现明显肝肾毒性。其机制可能与调节心肌梗死后小鼠心肌中miR-489/myd88/NF-κB信号通路有关。研究三 人参皂苷Re干预AngⅡ诱导CFs生物学行为改变的机制研究目的:采用AngⅡ诱导C57BL/6乳鼠原代CFs,观察人参皂苷Re对CFs分化、迁移和分泌等生物学行为的影响,并探讨其相关机制。方法:提取乳鼠原代CFs后,通过CCK-8法筛选人参皂苷Re的安全浓度范围。CFs被随机分为5组:正常组（Normal）、模型组（Model）和人参皂苷Re低、中、高剂量组。给以相应药物处理后,收集细胞进行相关检测。采用Transwell实验和划痕实验检测各组CFs的迁移情况;采用免疫荧光和Western blot技术检测α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达情况,观察CFs分化为肌成纤维细胞和胶原蛋白的分泌情况;通过qPCR技术和Western blot技术检测miR-489、myd88、NF-κB p65 和 p-NF-κBp65 的表达情况。结果:（1）经 CCK-8 法选定 50μmol/L、100μmol/L 和 200μmol/L 为人参皂苷Re的干预浓度。（2）与Normal组比较,Model组穿过Transwell小室的CFs数量显着增多,迁移距离明显增长（P<0.01）;与Model组相比,低中高剂量人参皂苷Re均能减少穿过Transwell小室的CFs数量,缩短迁移距离（P<0.01）。（3）与 Normal 组比较,Model 组α-SMA、Collagen Ⅰ和 Collagen Ⅲ的荧光强度和蛋白表达量均明显升高（P<0.01）;与Model组相比,低中高剂量人参皂苷Re均能降低α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的荧光强度和蛋白表达量（P<0.01）。（4）与Normal组比较,Model组miR-489水平显着降低,myd88的表达和p-NF-κB p65/p65比值显着升高（P<0.01）,低中高剂量人参皂苷Re均能抑制这种趋势（P<0.05）。以上检测中低中高剂量人参皂苷Re组之间未发现统计学差异（P>0.05）。结论:人参皂苷Re能够抑制AngⅡ诱导的CFs迁移、表型分化和分泌等生物学行为的改变;其机制可能与调节AngⅡ诱导的CFs中miR-489/myd88/NF-κB信号通路有关。
王惠[3]（2021）在《基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响》文中认为研究背景:受饮食习惯、生活方式和社会压力等因素影响,心肌缺血和心肌梗死及其导致的心衰仍严重影响居民的身体健康和生活质量,其中涉及的中青年患者也在不断增多。研究发现,当心肌受损后可导致内质网、线粒体功能障碍,触发包括细胞焦亡在内的多种细胞死亡途径,导致心脏功能受损。临床使用益气活血中药治疗,可有效改善患者症状和心脏功能。而益气活血药主要包括黄芪50g,生晒参10g,当归15g,川芎15g,三七6g,是以中医气血理论（气虚血瘀、气滞血瘀）为理论基础而创立,为导师临床治疗心肌缺血缺氧、心肌损伤以及心肌梗死后各种遗留症状的经验效方,其作用主要是有益心气,促进血液运行和疏通脉络,本课题组在前期研究中已经证明益气活血药能够改善心肌梗死患者疼痛、胸闷、气短等的症状,明显改善心脏射血功能和心脏形态,可以改善大鼠心肌梗死后炎症反应对心肌的损伤,减轻血清中炎症细胞因子分泌水平。研究目的和意义:探究心肌梗死后内质网应激与细胞焦亡的相互作用和调控机制,详细研究心肌梗死的病理生理过程,揭示益气活血药防治心肌缺血、心肌梗死的作用机制和靶点,对于心梗的临床治疗和新药的研发有重要理论意义和实际应用价值。研究方法:本课题内容分为动物实验和细胞实验两部分。动物实验:购买雄性SD大鼠（200±20g）,适应性喂养三天后,结扎左冠状动脉前降支构建急性心梗动物模型。术后根据心电图情况,选取符合要求（5个及5个以上病理Q波）的成模大鼠并随机分为4组:模型组（Model,M）,益气活血组（YQHX,Y）,培哚普利组（Perindopril,P）和只穿线不结扎的假手术组（Sham,S）,于术后第二天给予相应药物和蒸馏水灌胃。前期研究结果表明益气活血药改善心肌缺血、减轻心肌梗死的作用以益气药和活血药2:1时作用最为显着,且服用28天疗效更佳显着。28天时间点还是心梗后心衰的时间窗,模拟临床急性心梗导致心衰的病理情况。因此本实验观察灌胃28天后,各组大鼠的心脏超声情况,HE染色观察各组大鼠心肌细胞状态,评价各组大鼠心脏功能;透射电镜观察心肌组织超微结构,免疫荧光染色观察TXNIP、GSDMD分布及表达情况;免疫蛋白印记法观察各组大鼠梗死边缘区心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况,揭示心肌梗死后梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡变化情况及益气活血药的调节作用。细胞实验:采用H9c2心肌细胞系复制缺糖缺氧模型,根据课题组前期研究结果,并考虑益气活血药冻干粉的存放时间,选用冻干粉200μg/ml、300μg/ml和400μg/ml浓度进行观察。将心肌细胞分为:对照组（C）;缺糖缺氧模型组（M）;200μg/ml益气活血药组（Y2）;30μg/ml益气活血药组（Y3）;400μg/ml益气活血药组（Y4）。根据课题组的前期研究成果,选用造模12h时的时间点观察益气活血药对中轻度心肌细胞损伤的保护作用。采用CCK-8试剂盒观察各组心肌细胞的活力,测定各组细胞中LDH和ROS水平,筛选出益气活血药调节氧化应激水平的最佳浓度为300μg/ml。为进一步观察内质网应激和细胞焦亡间的关系,使用内质网应激抑制剂4-PBA,并将心肌细胞以40×104密度随机分为5组:对照组（C）,缺糖缺氧模型组（M）,益气活血药组（Y）,4-PBA抑制剂组（4-PBA）,益气活血药组+4-PBA抑制剂组（Y+4-PBA）。通过Hoechst 33342/PI双染检测各组心肌细胞细胞焦亡率,免疫蛋白印记法观察各组心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况。实验结果:1.超声结果评价各组大鼠左室心功能情况。各组大鼠相应干预28天后,与假手术组相比,M组大鼠的左室射血分数（EF）和左室短轴率（FS）显着降低（p<0.01）,LVAWd、LVIDd、LVIDs 也都显着升高（p<0.01）,LVPWs 也有升高（p<0.05）,而、LVAWs降低（p<0.01）。益气活血药干预后可显着改善各组大鼠心功能,促进各组超声相应指标向正常范围恢复。2.各组大鼠梗死边缘区组织HE染色的心肌细胞情况。可见S组心肌细胞排列整齐,结构完整,细胞核位于细胞中央,无炎性细胞浸润;M组心肌细胞形态受损,细胞肿胀,细胞核散乱,形态位置都发生变化,心肌纤维断裂,结构破坏,胞浆着色不均,排列紊乱,细胞间隙显着增大,有大量炎性细胞浸润;Y组和P组边缘区组织可见心肌细胞肿胀,但整体结构完整,炎性细胞较M组减少,可见少量心肌纤维断裂,心肌细胞间隙略有增宽。3.透射电镜观察各组超微结构的变化。S组大鼠心肌Z线、M线清晰,粗细肌丝清晰排列整齐,线粒体结构完整,双层膜清晰可见,线粒体内基质颗粒和线粒体嵴排列清楚,内质网结构正常。心梗28天后,M组心肌细胞内超微结构紊乱,线粒体肿胀破裂,线粒体嵴模糊甚至消失,细肌丝断裂,粗肌丝堆积,肌原纤维断裂,内质网肿胀,多处可见空泡样结构。而药物干预组粗细肌丝融合分界不清,内质网、线粒体肿胀,线粒体嵴模糊,结构尚完整。5.免疫组化染色TXNIP、GSDMD的情况。TXNIP在假手术组少有表达,模型组显着增加,阳性细胞率大幅度提高。益气活血药和培哚普利组可减少TXNIP的阳性率表达。GSDMD在模型组广泛表达,强阳性染色细胞率较假手术组显着增多,用药组干预后GSDMD的蛋白阳性率可明显降低6.各组大鼠梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡相关蛋白表达情况。蛋白免疫印迹法结果显示:与 S 组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11 蛋白表达水平都显着增高（p<0.01）,而益气活血药和培哚普利可不同程度的降低各组蛋白表达,发挥相应调节作用（p<0.05）。7.益气活血药对缺糖缺氧H9c2心肌细胞的保护作用。与C组相比,缺糖缺氧12h后心肌细胞活力显着降低（p<0.01）,而Y2、Y3、Y4可不同程度的提高心肌细胞活力,保护其免受或少受缺糖缺氧的损伤,其中Y3的效果最佳。又继续探索了不同浓度益气活血药对各组细胞LDH和ROS的影响,结果显示益气活血药可降低缺糖缺氧心肌细胞LDH、ROS水平,其中Y3显示出更好的效果,故在本课题接下来的实验中,选用300μg/ml的益气活血药浓度进行机制探究。我们继续观察了 C、M、Y（300μg/ml）、4-PBA和Y（300μg/ml）+4-PBA五组心肌细胞的细胞存活率和LDH表达水平。结果显示,与C组相比,M组细胞存活率显着降低（p<0.01）,平均降至40%左右。在药物和抑制剂的干预下细胞存活率都明显增加（p<0.05）。虽然Y、4-PBA和Y+4-PBA三个组的细胞存活率程增加趋势,但三者没有统计学差异（p>0.05）。模型组细胞上清中LDH量显着增高（p<0.01）,平均可达400U/L左右。Y、4-PBA和Y+4-PBA干预后都可明显减少LDH的释放（p<0.01）,Y组与Y+4-PBA组相比,差异具有统计学差异（p<0.01）,Y+4-PBA组LDH的减少程度更佳显着。8.心肌细胞细胞焦亡率的情况。采用Hoechst 33342/PI双染后可见C组细胞淡蓝染,细胞密度高,细胞大小正常,基本没有红染细胞。M组细胞核蓝染高亮,细胞密度降低,细胞体积增大,大量红染细胞。而使用抑制剂和中药干预后,都可以降低焦亡细胞比率,细胞密度也较M组增加。9.益气活血药对缺糖缺氧心肌细胞内质网应激和细胞焦亡相关蛋白的影响。与S组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达水平都显着增高（p<0.01）,益气活血药和抑制剂干预都可降低相关指标的表达,而抑制剂作用更佳显着。当益气活血药与抑制剂联用时,可进一步降低其表达水平（p<001）。研究结论:1.益气活血药可通过改善缺血心肌细胞超微结构损伤而提高心梗后心功能,改善心梗后的收缩功能,减小梗死面积。2.益气活血药通过调节内质网应激和细胞焦亡相关蛋白,减少心肌细胞死亡,挽救缺血心肌。3.内质网应激抑制剂4-PBA可显着抑制心肌细胞焦亡相关指标表达,表明细胞焦亡可以由内质网应激途径触发并加重细胞焦亡的损伤作用,该作用可能与TXNIP/NLRP3途径有关。而益气活血药可通过抑制内质网应激TXNIP/NLRP3途径,缓解内质网应激抑制细胞焦亡,减轻心肌细胞损伤,且从研究结果显示,益气活血药的作用机制与IRE1 α诱导的相关途径密切相关,这将是进一步研究该课题的重点方向。4.益气活血药减轻内质网损伤,改善了“气虚”的状态,提高了受损心脏功能运行的动力,为从现代科学角度阐释中医“气血”理论提供了研究基础。
张添甜[4]（2021）在《Nur77转录调控GSK-3β影响老年心肌纤维化的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:年龄是心力衰竭（HF）的主要危险因素。50岁以上的人群中大约有1%会受到HF的影响,而在75岁以上的人群中HF的患病率达8.4%。因此,HF已成为老年人死亡的主要原因。心肌衰老具有独特的组织学和生化特征,表现为左室心肌肥厚,心肌细胞数量的减少,心肌线粒体功能异常,心肌细胞的体积增加,脂质积累和纤维化区域的增加。纤维化是各种慢性疾病和衰老相关器官功能衰竭的发病机制,是心肌病理重塑的最后标志。组织纤维化的发生与衰老密切相关,而衰老是组织纤维化进展的触发和诱发因素。衰老心肌细胞通过凋亡和/或坏死途径丢失,导致剩余的心肌细胞肥大和纤维化。纤维化使心肌组织变硬且顺应性较差,随后导致心脏收缩功能障碍,增加了HF的风险。研究表明,高龄会激活Wnt/β-catenin信号,促进不同组织中产生衰老相关的表型,并诱导心肌纤维化基因的表达。GSK-3β破坏了β-catenin的稳定性在Wnt/β-catenin信号通路的调节中起着关键作用。因此,减少心肌纤维化的发生是治疗心力衰竭的靶点,负调控心肌纤维化所涉及的内源性途径对于抑制心脏衰老至关重要。Nur77（也称为NR4A1,NGFI-B）是一种转录因子,属于孤儿核受体Nr4A家族,受NGF刺激而表达上调。Nur77已被证明在多种组织中广泛表达,并参与调节不同的生物学及生理学进程,如能量代谢,细胞周期,细胞凋亡,炎症等。研究表明,Nur77敲减会导致新生大鼠心肌细胞肥大,此外,Nur77可以抑制慢性β-肾上腺素刺激,慢性ISO刺激引起的不良心脏重塑,而在小鼠心肌内注射Nur77腺病毒可减少慢性ISO输注引起的心肌肥大,纤维化并改善射血分数。并且,Nur77可以调节心肌中多种细胞的功能,例如:Nur77通过抑制炎性单核细胞的侵袭以及限制促炎因子的表达,在急性心肌梗死后的心肌纤维化中具有保护作用,Nur77抑制肾上腺嗜铬细胞中交感共递质NPY的表达和释放,导致Nur77-KO小鼠心肌肥大和纤维化。这些结果表明Nur77在多种病理生理过程中参与调节心肌功能和重塑,然而,Nur77在衰老相关心肌纤维化中的作用机制仍不清楚。本研究旨在通过建立Nur77敲除的自然衰老小鼠模型和Nur77过表达和低表达的心肌细胞模型,在体内实验观察Nur77对衰老小鼠心肌功能及结构、心肌病理组织学及纤维化相关指标的影响。在体外实验观察Nur77对心肌细胞纤维化的影响,并试图阐明Nur77影响心肌纤维化的机制。方法:第一部分:Nur77调控自然衰老小鼠心肌纤维化的作用研究1.将雄性Nur77基因敲除（Nur77-KO）小鼠及其野生对照（WT）同窝鼠饲养24个月,对6月龄（年轻）和15月龄（老年）,24月龄（超老年）WT和Nur77-KO小鼠进行超声心动图检测。2.处死小鼠,称量体重及心脏重量,HE,Masson,TUNEL染色检测小鼠心肌病理组织学改变,Western blot和q RT-PCR方法检测心肌肥大及纤维化相关指标的变化。第二部分:Nur77调控心肌细胞纤维化的作用研究1.体外培养大鼠心肌细胞系（H9c2）,用不同浓度TGF-β1刺激细胞24h,Western blot方法检测心肌细胞纤维化指标的变化,筛选合适的药物浓度。2.体外培养大鼠心肌细胞系（H9c2）,转染sh RNA对照慢病毒和Nur77 sh RNA慢病毒,转染完成后进行嘌呤霉素筛选构建低表达对照（Control）和Nur77低表达（sh-Nur77）稳转细胞系并应用Western blot和q RT-PCR方法验证细胞模型。3.体外培养大鼠心肌细胞系（H9c2）,转染对照慢病毒和Nur77过表达慢病毒,转染后进行嘌呤霉素筛选,构建过表达对照（Control）和Nur77过表达（Nur77）的稳转细胞系并应用Western blot和q RT-PCR方法验证细胞模型。4.PBS对照和TGF-β1（8ng/ml）处理过表达对照（Control）、Nur77过表达（Nur77）H9c2细胞及低表达对照（Control）、Nur77低表达（sh-Nur77）H9c2细胞24小时,应用Western blot和q RT-PCR方法检测各组细胞中纤维化标志物Col-1,α-SMA的蛋白和m RNA表达水平。第三部分:Nur77调控GSK-3β/β-catenin通路抑制心肌纤维化的机制研究1.通过Western bolt检测不同月龄WT及Nur77-KO小鼠心肌中GSK-3β/β-catenin信号通路的变化。2.在PBS对照和TGF-β1（8ng/ml）条件下处理低表达对照（Control）和Nur77低表达（sh-Nur77）H9c2细胞24小时,应用q RT-PCR和western bolt检测GSK-3β/β-catenin信号m RNA和蛋白表达水平的变化。3.在PBS对照和TGF-β1（8ng/ml）条件下处理过表达对照（Control）和Nur77过表达（Nur77）的稳转H9c2细胞24h,q RT-PCR和western bolt检测GSK-3β/β-catenin信号m RNA和蛋白表达水平的变化。4.H9c2细胞中,通过转染对照（Control）和GSK-3β小干扰RNA（si GSK-3β）构建GSK-3β低表达细胞模型,应用Western blot方法验证细胞模型。5.Nur77过表达的稳转细胞H9c2转染GSK-3βsi RNA48h,后TGF-β1（8ng/ml）处理细胞24小时,实验分组:CON;CON+TGF-β;Nur77+TGF-β;Nur77+GSK-3βsi+TGF-β。Western blot检测不同组中Col-1,α-SMA的蛋白表达,GSK-3β/β-catenin信号的变化。6.应用JASPAR网站预测Nur77结合序列元件在GSK-3β启动子区域的结合位点。7.应用Ch IP和荧光素酶报告实验检测Nur77对GSK-3β转录活性的调控作用。结果:第一部分:Nur77调控自然衰老小鼠心肌纤维化的作用研究1.与6m WT组相比,24m WT组小鼠左室舒张/收缩末期内径增大、舒张末期左心室后壁增厚,左室射血分数、缩短分数下降,舒张功能E/A比值降低。与6m WT组相比,15m WT组小鼠左室舒张末期内径增大、收缩末期左心室后壁增厚。与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO左室收缩/舒张末期内径增大、舒张/收缩末期左心室后壁增厚,左室射血分数、缩短分数及E/A比值显着降低。2.与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠的HW/BW比率显着增加。q RT-PCR结果显示,与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠心肌中脑利钠肽（BNP）、β-肌球蛋白重链（MHC）表达增加。3.与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠心肌TUNEL染色阳性细胞数量比率和Masson染色心肌纤维比例增加。4.与6m组WT小鼠相比,15m WT小鼠的心肌组织Col-1蛋白的表达明显增多。与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠心肌中Col-1,α-SMA蛋白的表达进一步增多。第二部分:Nur77调控心肌细胞纤维化的作用研究1.用不同浓度TGF-β1（0、2、8、40、80 ng/ml）刺激H9c2细胞24h,TGF-β1以浓度依赖的方式,使H9c2心肌细胞纤维化标志物Col-1表达增高。2.TGF-β1刺激降低Nur77在H9c2细胞中的表达,并可以增加H9c2细胞中α-SMA蛋白表达。无论是否存在TGF-β1刺激,Nur77敲减均可以显着增加H9c2细胞中Col-1的蛋白表达。3.TGF-β1刺激显着增加了H9c2细胞中纤维化标志物了Col-1,α-SMA的蛋白表达。PBS对照条件下,Nur77的过表达显着抑制H9c2细胞中Col-1表达,且降低TGF-β1刺激的H9c2细胞中纤维化标志物α-SMA的蛋白水平。第三部分:Nur77调控GSK-3β/β-catenin通路抑制心肌纤维化的机制研究1.与6m WT心肌相比,15m WT心肌中的β-catenin表达增加,GSK-3β表达减少;与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO进一步减少心肌中GSK-3β表达,增加β-catenin表达。2.在有或者没有TGF-β1刺激下,Nur77敲低均显着降低H9c2心肌细胞中GSK-3β的蛋白表达,并增加β-catenin的表达。3.无论是否存在TGF-β1刺激,Nur77过表达均导致H9c2中内源性GSK-3β表达增加,并在TGF-β1（8ng/ml）刺激条件下降低H9c2中β-catenin的蛋白表达。q RT-PCR结果显示,慢病毒介导的Nur77的过表达显着增加了心肌细胞H9c2中GSK-3βm RNA的表达,而对β-catenin m RNA水平几乎没有影响。4.TGF-β1刺激使心肌细胞中Col-1和α-SMA蛋白表达增加,Nur77过表达有效的抑制TGF-β1诱导的心肌细胞中Col-1和α-SMA蛋白表达增加,而GSK-3βsi RNA组Col-1和α-SMA蛋白表达的升高。同时,TGF-β1刺激使心肌细胞中β-catenin蛋白表达增加,Nur77的过度表达增加心肌细胞中GSK-3β的表达,使β-catenin蛋白表达减少,而si RNA介导GSK-3β的敲减导致β-catenin的表达增加。5.JASPAR网站预测在GSK-3β的转录起始位点前有3个能和Nur77结合的作用位点,分别是-1441,-144,-26。6.Ch IP和荧光素酶报告实验结果提示Nur77能够和GSK-3β转录起始位点前的DNA序列结合,增加GSK-3β转录。结论:第一部分:Nur77调控自然衰老小鼠心肌纤维化的作用研究1.敲除Nur77加重衰老小鼠心肌结构异常及舒缩功能障碍;2.敲除Nur77加速衰老小鼠心肌细胞肥大和心肌纤维化发病进程。第二部分:Nur77部分抑制TGF-β诱发的H9c2细胞纤维化。第三部分:Nur77调控GSK-3β/β-catenin通路抑制心肌纤维化的机制研究1.Nur77通过激活GSK-3β,抑制β-catenin介导的心肌纤维化。2.Nur77是GSK-3β上游核转录因子,通过转录调控GSK-3β抑制心肌纤维化。
胡艳红[5]（2020）在《益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究》文中研究指明国际糖尿病联盟数据显示,2019年全球20-79岁成人死亡人数中,因患糖尿病而致死的约占11.3%;65-99岁年龄段人群中,糖尿病患病率约占19.3%（约1.356亿）,预计到2030年,65岁以上（65-99岁）的糖尿病患者人数将达到1.952亿,2045年约2.762亿。这些数据表明糖尿病是全球人口老龄化社会的慢性疾病负担,预防糖尿病及其并发症对延缓衰老与衰老相关性疾病的研究,应对人口老龄化意义重大。流行病学调查研究显示,糖尿病血管病变是糖尿病患者主要常见并发症,与糖尿病血糖波动密切相关,是其他多种并发症发生的病理基础。血管是人体多种器官的重要组成部分,血管衰老是引起人体多器官系统衰老的重要病理生理基础,是血管相关性疾病发生的高危因素,故研究糖尿病血管衰老及其并发症对延缓糖尿病血管病变,提高老年人身体健康刻不容缓。糖尿病血管衰老分糖尿病大血管衰老和糖尿病微血管衰老,其中胸主动脉和颈总动脉是大血管衰老主要损伤部位,胸主动脉和颈总动脉作为心脑的主要供血部位,两血管衰老可进一步加重心肌纤维化、脑认知功能障碍等心脑血管损伤,导致心脑老化。血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC）作为血管壁中膜的主要构成成分,其异常增殖、迁移、细胞周期改变和表型转化,是导致VSMC衰老,加速血管衰老,最终诱导糖尿病血管衰老的重要病理因素。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）通路是影响衰老的主要信号通路,现大量研究发现,AMPK/mTOR通路在糖尿病大血管损伤、糖尿病心脏病、糖尿病脑病、糖尿病肾病及糖尿病视网膜损伤等糖尿病血管病变方面具有重要预防和保护作用,也是影响VSMC增殖、迁移和表型转化的重要途径,可减少VSMC衰老,参与血管衰老进程,并与糖代谢关系密切。因此基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的作用机制意义重大。人参三七川芎提取物（Ginseng Radix et Rhizoma,Notoginseng Radixet Rhizomaand Chuanxiong Rhizomaextracts,GSC）是益气活血药人参、三七、川芎的醇提取物,前期药理学研究显示,GSC具有较好的抗衰老功效,在一定程度上可以从整体、血管组织、细胞和分子水平延缓大鼠生理性血管衰老和复制性血管内皮细胞和VSMC衰老。但对于疾病造成的病理性血管衰老的机制及GSC对此类血管衰老及并发症的干预研究仍处于初步阶段。因此本研究通过构建体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型和体外高糖诱导人主动脉血管平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle Cell,HASMC）衰老模型,观察益气活血药GSC对糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导HASMC衰老的保护作用,并以AMPK抑制剂和基因转染技术抑制HASMC中AMPK表达为切入点,探讨基于AMPK/mTOR通路GSC对高糖诱导HASMC衰老的调节作用和机制。第一部分益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症的体内实验研究实验一益气活血药延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的机制研究目的:探讨GSC对糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的作用机制。方法:腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）联合高脂饲料长期喂养诱导糖尿病小鼠模型,造模7个月后,随机分为空白对照（Control）组、糖尿病（HG）组、GSC-L组、GSC-H组和二甲双胍（Met）组,连续给药9周。取材前购进新一批4周龄雄性C57BL/6小鼠正常适应性喂养7天,作为青年（Young）组。观察各组小鼠一般状态,检测小鼠随机血糖,使用苏木精-伊红（HE）染色、胶原纤维（Masson）染色结合透射电镜（TEM）检测小鼠颈总动脉病理形态学变化,采用冯库萨（Von Kossa）染色检测小鼠颈总动脉、胸主动脉钙盐沉积程度,免疫组化（IHC-P）和蛋白免疫印迹法（WB）检测小鼠颈总动脉和胸主动脉中基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinases 2,MMP-2）、周期蛋白依赖激酶抑制因子2A（p16）、周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A（p21）、runt 相关转录因子-2（Runt-related transcriptionfactor-2,Runx2）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin,α-SMA）与平滑肌 22α 蛋白（Smooth Muscle 22α,SM22α）蛋白表达。结果:Young组和Control组小鼠体型适中、反应灵敏、活泼好动、毛发黑亮有光泽,血糖较低,颈总动脉、胸主动脉病理形态学改变较轻,各衰老蛋白表达较正常;与Control组相比较,HG组小鼠体型瘦弱、反应迟钝、弓背卷体、精神萎靡、毛竖无光泽间杂黄白色毛发,血糖升高显着（P<0.01）。颈总动脉血管纤维化,血管壁内皮细胞和VSMC损伤严重,胞质裂解、突起,胞内空泡和溶酶体等大量增多,中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管病理形态学改变加重（P<0.01）。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达增加,SM22α蛋白表达减少（P<0.01）。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达,α-SMA低表达（P<0.01）;与HG相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠外在衰老状态明显好转,血糖下降显着（P<0.05）,颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度、颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度明显减轻（P<0.01）。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达减少,SM22α蛋白表达增强（P<0.05）。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达被抑制,α-SMA表达增强（P<0.05）。结论:高糖可以通过改变小鼠一般状态,刺激颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管衰老病理形态学变化改变,调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α相关衰老蛋白表达,诱导小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老。GSC可以降低糖尿病小鼠血糖水平,改善小鼠外在衰老状态和体内血管衰老病理性变化,延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老,其作用机制可能是通过调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α蛋白表达来发挥作用。实验二基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠心脏老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠心脏老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显着衰老病理变化,故在检测糖尿病心肌纤维化时只分Control组、HG组、GSC-L组、GSC-H组和Met组五组。其余分组同体内实验一。分别使用HE、Masson、Von Kossa结合TEM检测小鼠心脏组织病理形态学改变,采用IHC-P和WB检测心脏组织中胶原蛋白Ⅰ型（Collagen types I,Collagen I）、胶原蛋白Ⅲ型（Collagen types Ⅲ,Collagen Ⅲ）、转化生长因子 β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）蛋白表达,WB 检测 MMP-2、抑癌基因 p53（Tumor suppressor p53,p53）、磷酸化抑癌基因 p-p53（Phospho-tumor suppressor p53,p-p53）蛋白和 AMPK/mTOR 通路表达。结果:Young和Control组小鼠心肌纤维、心肌细胞排列均匀致密、有规则,结构清晰完整。心脏微血管染色均匀,未见明显钙盐沉积。MMP2、p53、p-p53及AMPK/mTOR通路表达不显着;与Control组相比较,HG组心肌细胞体积增大,核皱缩,线粒体肿胀、变性、线粒体嵴空泡化,甚至断裂。细胞间隙增宽,排列紊乱,多见炎细胞浸润,并可见灶性坏死。心脏微血管正常结构被破坏,血管弹性纤维间有大量棕色钙盐颗粒沉积,心肌间质尤其是在微血管周围有蓝染胶原纤维大量沉积（P<0.01）。心肌中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白高表达,p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK蛋白比值显着降低,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K蛋白比值升高显着（P<0.05）。与HG组相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠心脏组织病理形态学显着改善（P<0.05）,CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白表达水平下降,可有效上调 p-LKB1/LKB1 和 p-AMPK/AMPK 蛋白比值,下调 p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K 蛋白比值（P<0.05）。结论:高糖通过刺激小鼠心脏发生心肌纤维化、心脏超微结构改变、心脏微血管纤维化和钙化等病理形态学改变,增加心肌纤维化标志物Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1和衰老蛋白MMP2、p53和p-p53表达,促进AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,从而诱导心脏老化。GSC能够改善糖尿病小鼠心脏病理形态学变化,延缓心脏老化,其作用机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路表达,抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53和p-p53蛋白表达来发挥作用。实验三基于AMPK-mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠脑老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠脑老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一和实验二显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显着衰老病理变化,故在检测糖尿病小鼠海马区尼氏体数量变化和神经元损伤时,没有检测Young组病理变化。其余分组同体内实验一。使用旷场实验检测小鼠行为学变化,分别使用HE、Nissl、Von Kossa结合TEM检测小鼠脑组织海马区组织病理形态学改变,采用IHC-P检测海马组织晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end-product,AGE）和β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）蛋白表达,WB检测海马组织AGE、糖基化终末产物受体（Receptor of advanced glycation end-products,RAGE）、Aβ、MMP2、p53、p-p53 和AMPK/mTOR通路表达。结果:Young和Control组小鼠行为学、脑微血管病理形态学及超微结构无显着改变,衰老蛋白及AMPK/mTOR通路表达无显着差异;与Control组相比较,HG组小鼠中央活动总时间和总行径路程均显着下降（P<0.01）,脑微血管内细胞数量减少、排列紊乱,可见血管腔狭窄,血管壁有棕色颗粒沉积。神经元核膜皱缩,染色质分布不均匀,电子密度低,胞浆内细胞器部分溶解消失,脑微血管壁结构欠清晰。尼氏体、神经元和锥体细胞数量减少（P<0.01）。海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53的蛋白表达水平显着增加,AMPK/mTOR通路表达存在显着差异（P<0.01）;与HG组相比较,各药物干预组小鼠行为学、脑微血管病理形态学均显着改善,海马CA1、CA3和DG区神经元变性减轻,尼氏体、神经元和锥体细胞数量增加（P<0.01）,海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白活性显着下降,AMPK/mTOR通路表达被改善（P<0.05）。结论:高糖可以诱导小鼠海马区尼氏体数目减少,导致神经元受损及超微结构改变,加速脑微血管钙化等病理改变,增加AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达,促使AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,改变小鼠行为学变化,致使脑老化。GSC可以从行为学方面改善糖尿病小鼠的衰老状态,并通过抑制小鼠海马区尼氏体缺失和神经元损伤,缓解脑微血管钙化和海马区超微结构改变,充分发挥脑保护作用。其保护机制可能是通过调节AMPK/mTOR通路,抑制AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达有关。第二部分益气活血药延缓高糖诱导血管平滑肌细胞衰老的体外实验研究实验一建立高糖诱导的HASMC衰老模型目的:探索一种稳定的高糖诱导的病理性HASMC衰老模型,为研究GSC延缓血管衰老提供一种新的细胞实验模型。方法:取第6或7代HASMC接种贴壁后,用无血清DMEM低糖基础培养基饥饿24h,然后选择5.5、11、22、33、44、66、88和110 mmol/L浓度的高糖培养基分别干预24h、48h、72h、96h,用MTT筛选诱导HASMC衰老的最佳高糖浓度和干预时间。继而依次使用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测细胞衰老程度,划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,流式检测细胞周期,WB检测衰老相关蛋白MMP2、p53、p-p53和表型转化标志蛋白SM22α、α-SMA、Runx2、OPN和重组人骨形态发生蛋白-2（Recombinant Human Bone Morphogenetic protein-2,BMP-2）表达,进一步验证最佳高糖造模浓度和干预时间。结果:MTT结果显示:33 mmol/LD-Glucose干预HASMC 72h时,HG组细胞增殖活力显着下降,D-M组细胞增殖活力变化不明显,确立为诱导HASMC衰老模型最佳高糖浓度和干预时间。与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升（P<0.05）。结论:33 mmol/LD-Glucose培养基作用HASMC72h时,细胞衰老较为明显,为诱导HASMC衰老模型的最佳高糖浓度和最佳作用时间。HASMC衰老机制可能与改变细胞增殖迁移能力、SA-β-gal表达、细胞周期、表型转化,调节p53、p-53、MMP2、SM22α、α-SMA、Runx2、OPN、BMP-2 蛋白表达有关。实验二益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC对高糖诱导的HASMC衰老的影响。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,分别筛选GSC和Met最佳干预浓度,然后分为Control组、HG组、GSC-L组、GSC-M组、GSC-L组和Met组。在体内实验一检测方法的基础上,再使用免疫荧光检测α-SMA和OPN荧光表达。结果:与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比、α-SMA荧光表达及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比、OPN荧光表达及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升（P<0.05）;与HG组相比较,GSC和Met干预组细胞增殖活力和迁移能力增加,细胞SA-β-gal蓝染比率和G0/G1期细胞所占百分比下降,S期上升,衰老蛋白MMP2、p53、p-p53及合成型标志物Runx2、OPN、BMP-2表达受到抑制,收缩型标志物SM22α、α-SMA蛋白表达水平增加（P<0.05）。结论:GSC通过改善HASMC增殖迁移能力、细胞周期、表型转化和β-半乳糖苷酶表达可延缓高糖诱导的HASMC衰老,其干预机制可能与降低MMP2、p53、p-p53、OPN、Runx2、BMP-2表达水平,增加SM22α、α-SMA表达水平密切相关。实验三基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC在HASMC衰老中对AMPK/mTOR信号通路的影响。通过AMPK抑制剂和基因转染技术干扰AMPK活性与表达,进一步探讨GSC延缓HASMC衰老的作用机制。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,基因转染技术干扰AMPK活性分为Control组、HG组、GSC组和Met组,其余分组同体内实验二。WB检测AMPK/mTOR通路活化,AMPK抑制剂Compound C和AMPKα1慢病毒颗粒干扰AMPK活化后,采用体内实验一检测方法进行具体指标检测。结果:1)与Control组相比较,HG组HASMC p-AMPK/AMPK比值下调,p-mTOR/mTOR比值上调（P<0.01）;与HG组相比较,药物干预组p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR比值趋于正常（P<0.05）。2)Compound C抑制AMPK活性后,与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、细胞周期改变、SA-β-gal蓝染比率、表型转化及 MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN 和 BMP-2 蛋白表达和 AMPK/mTOR 通路表达方面尚未有显着差异。3)AMPKα1沉默后,与SCR shRNA阴性对照组比较,AMPKα1 shRNA转染后HASMC中AMPK磷酸化与未磷酸化表达水平下调（P<0.01）,mTOR磷酸化与未磷酸化表达水平上调显着（P<0.01）,HASMC增殖迁移能力及SM22α、α-SMA蛋白表达均下降,MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN和BMP-2蛋白表达上调,部分具有统计学差异（P<0.05,P<0.01）;与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、表型转化及衰老相关蛋白和AMPK/mTOR通路表达尚未有显着差异。结论:AMPK/mTOR通路参与高糖诱导HASMC衰老这一过程,GSC可以调控AMPK/mTOR通路,保护HASMC衰老。通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰AMPK表达后,GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用显着减弱。提示GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用机制,部分可能来源于对AMPK/mTOR通路的调控。综上所述,本研究利用体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型及体外高糖诱导的HASMC衰老模型,证明益气活血药GSC可以延缓糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导的HASMC衰老。并通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰HASMC AMPK表达后,观察GSC对HASMC衰老的作用,进一步证实GSC延缓糖尿病血管衰老及并发症的机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路及其上下游通路来发挥作用的,以往未从此角度探索益气活血药对血管衰老及血管衰老并发症的保护作用,为中医药防治糖尿病心脑血管疾病提供了新思路。
郑荣华[6]（2020）在《胰高血糖素样肽1对心肌重塑和心功能的保护作用及机制研究》文中认为动物实验和临床观察结果证实,各种药理学手段干预抑制心脏肥大和纤维化,可以延缓心脏功能的恶化。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要生物活性肽产物,通过与其血管紧张素II 1型受体（AT1R）的结合,对心血管系统的变化、起着重要的病理生理调节作用。尽管AngII转换酶抑制剂或受体阻断剂,已常规用于临床并取得了良好的治疗效果,但病人观察的结果表明,此类药物的使用可产生一系列的副作用。因此,寻求通过调节AngⅡ系统的变化,进而减少心脏重塑并促进心脏功能恢复的辅助疗法,仍值得进一步研究。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是一种肠降血糖激素,体内半衰期较短,使用外源性GLP-1协同剂利拉鲁肽已广泛用于糖尿病人的治疗。近年来的研究结果表明,不依赖降血糖调节机制的利拉鲁肽疗法,也可用于高血压,心肌梗塞,心肌病和其它多种心血管疾病的治疗。但有关GLP-1疗法对压力性负荷所致心力衰竭的疗效和作用机理,尚缺少足够的系统性评价和探索。因此,本研究选择了大鼠腹主动脉缩窄在体心脏模型,观察了利拉鲁肽对由压力负荷增加所致AngII系统活化的干预特征（研究第一部分）,包括:1)心肌氧化应激和抗氧化酶的作用;2)AngII AT1/AT2受体平衡的调节;3)纤维细胞的迁移和增生的影响;4)心肌细胞肥大和心脏收缩和舒张功能的调节。为了解调节的可能机制,实验进一步分析了利拉鲁肽疗效的作用环节（研究第二部分）,包括:1)观察血液中GLP-1水平的变化;2)心脏形态和重量的作用;3)纤维化反应调节蛋白表达如mTOR/p70S6K的影响;4)自噬调节蛋白表达如LC3,Beclin-1,p62的影响;5)心肌纤维化和心功能改变的调节。在培养的H9C2心肌细胞,观察了利拉鲁肽对AngⅡ诱导下心肌细胞反应特征的直接作用（研究第三部分）,包括:1)细胞增殖和肥大的作用;2)AngII受体表达的调节;细胞氧化反应水平如ROS和纤维化介导蛋白TGFβ1和α-SMA的调定;3)纤维化调节蛋白如mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响;4)胶原蛋白表达变化的作用。在上述研究中,为澄清利拉鲁肽调定AngII受体和纤维化的传导机制,实验采用AngII AT1受体阻断剂替米沙坦和mTOR特异性抑制剂雷帕霉素进行了对比性观察,证实了利拉鲁肽受体通路和氧化应激的直接细胞效应。本研究的结果表明,GLP-1疗法对压力负荷增加所致的心肌纤维化和功能紊乱,有显着的抑制作用;这种保护效应是通过调定AngII受体和纤维化反应过程来实现的。这些研究结果也为GLP-1疗法在心衰病人的治疗,提供了新的实验基础和应用前景。第一部分胰高血糖素样肽1通过阻断大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体减轻腹主动脉缩窄后的心脏重塑并改善心脏功能目的:血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）通过引起心脏重塑和功能障碍而导致心力衰竭的发生,在心力衰竭的发病机制中具有重要的作用。已证明胰高血糖素样肽1（GLP-1）对动物和患者具有心脏保护作用。本研究想证实GLP-1受体激动剂利拉鲁肽是否通过改变AngⅡ1型受体（AT1R）受体表达来抑制腹主动脉缩窄（AAC）引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）替米沙坦治疗组（Telmi组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以10mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠替米沙坦。2.定期测量大鼠体重和血糖值。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.酶标仪检测:通过丙二醛（MDA）、超氧化物歧化物（SOD）和人N端前脑钠素（NT-pro BNP）试剂盒检测大鼠心脏MDA和NT-pro BNP的含量以及SOD的活性。5.免疫组化法:定位及评估心脏组织的ACE2、巨噬细胞、肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。6.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。7.Western-blot法:测定心肌组织中AT1R、AT2R、TGF-β1、p-smad2、smad2、p-smad3、smad3、smad4、smad7、collagenI和collagenⅢ的蛋白定量表达。8.采用2D Vivid7超声仪测定大鼠的心功能。9.采用BL-410生物信号采集与处理系统:检测大鼠心率、血压及左心室血流动力学指标。结果:1.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠血糖、体重的影响:从术后第2周开始定期测量大鼠体重和血糖值,随着时间的推移,虽然两种数据均出现上升趋势,但各组同一时间的数值之间并无显着的统计学差异。2.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌肥大和HW/BW的比值的影响:腹主动脉缩窄术16周后,相对于Sham组大鼠HW/BW比值（3.38±0.17vs.2.46±0.05,p<0.05）和MSA（1512±99 vs.586±98μm2,p<0.05）明显升高,利拉鲁肽和替米沙坦可分别减少HW/BW比值（2.63±0.09和2.77±0.05vs.AAC组,所有p<0.05）和MSA降至766±61μm2或871±51μm2（与AAC组相比,p<0.05）。3.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏衰竭的影响:相对于Sham组,AAC组在实验16周后检测发现NT-pro BNP（48.4±8.6pg/ml）表达水平显着提高,给予利拉鲁肽和替米沙坦治疗后,NT-pro BNP的表达水平分别为（10.3±0.8pg/ml和14.8±1.3pg/ml vs.AAC组,所有p<0.05）。4.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏氧化应激和抗氧化酶的影响:与Sham组相比,AAC组心肌组织中的MDA表达显着提高（23.4±1.3vs.16.3±0.6nmol/mg,p<0.05）,SOD表达水平却降低（8.1±0.8 vs.10.4±0.4U/mg,p<0.05）。相对于AAC组,给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后可使MDA水平分别降低至15.9±1.6和17.2±1.4nmol/mg（相对于AAC组,p<0.05）,且SOD酶活性分别提高至11.9±1.2和11.6±1.1U/mg（与AAC组相比,p<0.05）,结果提示给药后心脏抗氧化能力增强。5.利拉鲁肽和替米沙坦降低术后大鼠AT1R、AT2R、AT1R/AT2R比值及ACE2的影响:实验结束时,相对于Sham组,AT1R的蛋白表达水平显着提高10.55±2.5%,而AT2R的蛋白表达则降低了36.43±5.6%,p<0.05。在手术后给予利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AAC组呈现相反的表达水平。在抑制AT1R表达的同时刺激AT2R的表达,体现为AT1R/AT2R比例的降低。免疫组织化学染色显示,相对于Sham组,AAC组中血管周围和心肌间质中ACE2的表达显着减弱。相对于AAC组,在术后给予利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗可逆转ACE2的表达下降。6.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠巨噬细胞浸润和TGF-β1的影响:免疫组织化学法检测AAC组心脏切片结果表明,在血管周围区域和心肌间质中聚集了大量巨噬细胞,而利拉鲁肽或替米沙坦治疗可减轻这些巨噬细胞的聚集数量,Sham组则很少见巨噬细胞在心肌组织间隙中聚集。与AAC组巨噬细胞浸润增强相一致,心肌中TGF-β1的表达也显着增加。WB检测TGF-β1的蛋白质水平,进一步证实了TGF-β1表达的变化。与AAC组相比,在腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦可使心脏中巨噬细胞浸润和TGF-β1的表达均降低。7.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠肌成纤维细胞增殖和Smads蛋白的影响相对于Sham组,AAC组在心肌血管周围出现大量的α-SMA阳性肌成肌纤维细胞。而在Sham组,在心肌细胞间隙中仅有很少的α-SMA阳性细胞表达。在进行腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦的药物治疗,α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目明显减少。在Sham组中,Smad2和Smad3几乎没有被磷酸化。然而AAC组,Smad2/3的磷酸化显着增强,与Smad2/3的总蛋白水平增加相一致。相对于Sham组,AAC组中Smad4的总蛋白水平显着上调,而Smad7的总蛋白表达下调。然而,通过利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗后明显逆转了所测Smad家族成员蛋白质表达的变化趋势。8.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌组织胶原蛋白合成和纤维化的影响:与Sham组相比,AAC组中胶原蛋白I和Ⅲ的蛋白水平显着增加。利拉鲁肽或替米沙坦的给药组I型和Ⅲ型胶原蛋白的产生相对AAC组显着减少。AAC组Masson结果显示由胶原蛋白面积百分比来表示的沉积胶原蛋白区域在血管周围和间质心肌中显着扩展。在整个实验中,在假手术对照中均未检测到新合成的胶原蛋白。腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙药物组,心脏中血管周区域和心内膜均显示胶原沉积显着减少。9.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏功能的影响:超声结果显示相对于Sham组,AAC组在实验的16周时导致LVIDd显着增加,LVEF和LVFS降低。与AAC组的结果相比,利拉鲁肽或替米沙坦治疗可增强心脏功能。BL-410生物信号采集和处理系统结果显示:相对于Sham组,AAC组中大鼠的MAP,HR和LVEDP各项指标都显着增加,LVSP降低。此外,左室压力的最大增加速率(+dp/dtmax)和左室压力的减小速率(-dp/dtmax)明显降低。利拉鲁肽和替米沙坦治疗16周可有效预防心脏功能减退,与抑制心脏肥大和纤维化的结果相一致。结论:1.利拉鲁肽对心肌重塑和心功能具有保护作用;2.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用主要通过下调AT1R,AT1R/AT2R,上调AT2R和ACE2的表达,进而减少自由基产生有关;3.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用是通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/Smads表达,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第二部分胰高血糖素样肽1通过抑制mTOR/p70S6K信号通路对压力超负荷引起心肌纤维化和功能障碍的保护作用目的:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）介导组织纤维化并负面调节自噬。本部分旨在研究胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物利拉鲁肽是否通过抑制mTOR/p70S6K信号传导并促进自噬活性来保护心脏免受腹主动脉缩窄引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）雷帕霉素治疗组（Rapa组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以0.2mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠雷帕霉素。2.检测大鼠血糖和血浆中GLP-1含量,利用GLP-1试剂盒酶标仪检测。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织进行固定、包埋后,HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.免疫组化法:定位及评估心脏组织的肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。5.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。6.Western-blot法:测定心肌组织中GLP-1R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、LC3、Beclin-1、p62、collagen I和collagenⅢ的蛋白定量表达。7.无创评估大鼠心脏整体功能。8.有创大鼠血流动力学测定。结果:1.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠基本状态的影响各组血糖和体重均有增高趋势,但是在四个实验组之间没有发现统计学差异。2.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏形态和HW/BW比值的影响相对于Sham组,AAC组在实验结束后发现心脏重量显着增加,并引起结构性扩张,利拉鲁肽和雷帕霉素给予治疗后明显减轻。相对于Sham组,AAC组HW/BW比显着增加（4.07±0.22 vs.2.68±0.21,p<0.05）。利拉鲁肽或雷帕霉素治疗显着降低了HW/BW比（与AAC组相比,分别为2.98±0.20和2.85±0.18,所有p<0.05）。相对于Sham组,AAC组的MSA明显增加（553±23 vs.232±25μm2,p<0.05）。利拉鲁肽或雷帕霉素治疗可将MSA相对降低至294±24μm2或322±23μm2,与AAC组相比,所有p<0.05。3.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠血浆GLP-1水平和GLP-1受体表达的影响与Sham组相比,AAC组导致血浆GLP-1水平显着降低（0.10±0.01vs.0.15±0.01ng/ml,p<0.05）,GLP-1受体的表达下调了26.1±5.6%。相对于AAC组,利拉鲁肽或雷帕霉素的给药使血浆GLP-1水平显着升高（相对于AAC组分别为0.15±0.01和0.14±0.01ng/ml,所有p<0.05）,在这些组中与GLP-1水平升高相一致,GLP-1受体的表达水平升高。4.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠肌成纤维细胞增殖的影响相对于Sham组,AAC组心肌间质含有丰富的α-SMA阳性肌成纤维细胞。然而与AAC组相比,利拉鲁肽或雷帕霉素的给药抑制了α-SMA阳性的肌成纤维细胞的出现数量。5.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响相对于Sham组,AAC组没有改变mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但是明显提高了其磷酸化水平。利拉鲁肽或雷帕霉素的给药并不影响mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但在两种蛋白的磷酸化中均具有相一致性的抑制作用。6.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠LC3,Beclin-1和p62表达的影响相对于Sham组,腹主动脉缩窄后LC3-I稳定增加（p<0.05）,而自噬抑制的标志物LC3-Ⅱ/LC3-I比率降低。与Sham组相比,AAC组心肌Beclin-1的表达下降（p<0.05）。与Sham组的大鼠相比,AAC组p62的蛋白水平显着升高（p<0.05）。利拉鲁肽作用后逆转AAC组的LC3,Beclin-1和p62蛋白表达,和雷帕霉素的表达调节相一致。7.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠胶原合成和组织纤维化的影响相对于Sham组,AAC组胶原I和Ⅲ的蛋白质水平增加。Masson三色染色法结果显示,AAC组心肌中纤维化区域在心肌间质和血管周围区域明显增加。在整个实验中,在Sham组心肌间质和血管周围区域均未检测到新合成的胶原蛋白。用利拉鲁肽或雷帕霉素治疗等效地抑制了胶原的表达,并减少了心肌间质和血管周围区域的纤维化沉积。8.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏整体功能的影响相对于Sham组,AAC组LVSs,LVIDd,LVIDs,LVPWd明显增加,EF和FS降低,利拉鲁肽或雷帕霉素治疗增强心脏功能逆转了AAC组的心脏功能指标变化。9.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏收缩和舒张功能的影响与Sham组相比,AAC组HR和MAP显着增加,LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax分别降低了24±3%、32±2%和27±3%（p<0.05）,LVEDP增加了230±12%（p<0.05）。利拉鲁肽和雷帕霉素改变了AAC组代表心脏功能变化的趋势,从而保护心脏功能。结论:1.利拉鲁肽通过增加血浆GLP-1水平和GLP-1R表达对长期压力超负荷大鼠的心脏具有保护作用;2.利拉鲁肽对大鼠的心脏保护作用主要通过下调mTOR/p70S6K信号激活自噬,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第三部分胰高血糖素样肽1对血管紧张素Ⅱ诱导H9C2心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用及机制研究目的:选用AngⅡ诱导H9C2心肌细胞为研究对象,观察利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2细胞肥大和纤维化的影响作用。以血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦作对照,进一步验证利拉鲁肽对心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用是通过影响AT1R信号传导的激活而进行,以mTOR的特异抑制剂雷帕霉素和mTOR的特异兴奋剂MHY1485作对照,进一步验证利拉鲁肽可通过抑制mTOR/p70S6K通路抑制心肌细胞肥大和纤维化的形成。方法:1.AngⅡ诱导H9C2心肌细胞模型建立2.分组:第一部分:（1）空白对照组（Control）:加入等体积培养基;（2）模型对照组（AngⅡ）:含10-6mol/L AngⅡ的培养基;（3）利拉鲁肽组（AngⅡ+Lira）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-7mol/L的Lira;（4）替米沙坦组（AngⅡ+Telmi）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-5mol/L的Telmi;第二部分:（1）空白对照组（Control）:加入等体积培养基;（2）模型对照组（AngⅡ）:含10-6mol/L AngⅡ的培养基;（3）利拉鲁肽组（AngⅡ+Lira）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-7mol/L的Lira;（4）雷帕霉素组（AngⅡ+Rapa）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-6mol/L的Rapa;（5）MHY1485组（AngⅡ+MHY1485）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-5mol/L的MHY1485;（6）AngⅡ+Lira+Rapa组（AngⅡ+Lira+Rapa）:含10-6mol/L的AngⅡ,10-7mol/L的Lira和10-6mol/L的Rapa;（7）AngⅡ+Lira+MHY1485组（AngⅡ+Lira+MHY1485）:含10-6mol/L的AngⅡ,10-7mol/L的Lira和10-5mol/L的MHY1485。3.实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测H9C2心肌细胞中ANP和BNP的m RNA含量。4.鬼笔环肽染色心肌细胞面积。5.Western-blot法:测定心肌细胞中AT1R、AT2R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、TGF-β1、collagen I的蛋白定量表达。6.流式检测心肌细胞中ROS水平表达。7.细胞免疫荧光染色:定位及评估心肌细胞中TGF-β1、α-SMA、collagen I的表达。结果:1.AngⅡ诱导H9C2模型建立10-6 mol/L AngⅡ作用心肌细胞24h后,不论是增殖率还是细胞表面积都相对最大。因此根据实验结果选取10-6 mol/L AngⅡ作用24h用于后续实验。2.不同浓度利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2心肌细胞增殖的影响在降低AngⅡ引起的H9C2心肌细胞增殖率实验中选取10-7 mol/L liraglutide进行实验。3.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞肥大的影响利用鬼笔环肽对细胞进行染色测量细胞表面积。结果显示与Control组细胞表面积811.8±64.1μm2相比,AngⅡ组心肌细胞表面积为1191.8±69.1μm2,明显增大。而加入利拉鲁肽和替米沙坦后,面积分别减少到1007.8±62.3μm2和902.3±64.3μm2（所有数据,p<0.05）。心肌细胞ANP和BNP含量可反映心肌细胞的肥大程度,利拉鲁肽和替米沙坦均可降低AngⅡ引起心肌细胞的ANP和BNP的m RNA含量的增高。4.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞AT1R和AT2R蛋白表达的影响使用蛋白印迹法检测AngⅡ受体的表达程度。在AngⅡ组AT1R表达增高,AT2R降低,在AngⅡ给药的基础上分别加入利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AngⅡ组呈现相反的表达水平。5.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内ROS表达水平的影响镜下拍照结果显示与Control组细胞相比较,AngⅡ组的ROS荧光亮度明显增高,加入利拉鲁肽和替米沙坦的细胞组,ROS荧光亮度下降（见图3-8）。流式结果显示与镜下观察结果相一致,AngⅡ组心肌细胞的ROS免疫荧光值为5546±202,相对于control组3264±205明显增高（p<0.05）。加入利拉鲁肽和替米沙坦后,ROS荧光平均免疫荧光值降为4804±203和3781±218（见图3-9）。6.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内TGF-β1水平的影响AngⅡ组TGF-β1免疫荧光平均光密度（AOD）为0.08±0.007,明显高于Control组细胞TGF-β1的AOD为0.02±0.008。加入利拉鲁肽和替米沙坦的细胞组,TGF-β1的AOD为0.05±0.010和0.03±0.011。相对于AngⅡ组明显降低,具有统计学意义。通过蛋白质印迹测定法检测各组细胞水平的TGF-β1的蛋白水平,和荧光结果一致,进一步证实了TGF-β1表达的变化趋势。7.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内α-SMA水平的影响免疫荧光结果定位显示α-SMA在心肌细胞中的表达主要位于心肌细胞质中。进行平均光密度值结果统计,结果显示AngⅡ组心肌细胞中α-SMA的表达显着增加（AOD为0.11±0.01 vs.0.05±0.01 Control,p<0.05,见图3-10A）。在给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后心肌细胞中α-SMA的表达平均光密度值为0.08±0.01和0.06±0.01,与AngⅡ组相比均降低（见图3-10B）。8.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内Collagen I表达水平的影响免疫荧光法检测细胞内胶原蛋白I主要表达在心肌细胞质中,在给予AngⅡ后collagen I的表达增多。在AngⅡ给药的基础上加入利拉鲁肽或替米沙坦治疗有效地抑制了胶原I的平均光密度值,并减少了心肌细胞质中荧光亮度。使用蛋白质印迹法进一步确定了各组细胞胶原蛋白I的蛋白表达。和荧光结果相一致,如图3-12C典型条带及平均灰度值结果分析显示,AngⅡ组的胶原I的蛋白质水平表达增加,加入利拉鲁肽或替米沙坦治疗均有效地抑制了胶原I的蛋白表达水平。9.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞面积的影响鬼笔环肽染色心肌细胞表面积和前面的结果相一致。在此组实验中,在AngⅡ给药基础上加入雷帕霉素也明显减少了由于AngⅡ造成心肌细胞表面积增大,结果为884.2±84.5μm2,在AngⅡ给药基础上混合给予利拉鲁肽和雷帕霉素,进一步减少了雷帕霉素组的细胞表面积。相反在加入MHY1485（mTOR的特异兴奋剂）后,增加了AngⅡ造成的心肌肥大表面积为1318.0±80.1μm2。在加入利拉鲁肽和MHY1485药物后,逆转MHY1485增加AngⅡ造成的心肌肥大的程度。10.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞mTOR和p70S6K蛋白表达的影响相对于Control组,AngⅡ组没有改变mTOR的总蛋白水平,但是明显提高了磷酸化的mTOR的水平（Ser2448处的磷酸化）。另外,心肌细胞中p70S6K的总蛋白水平在AngⅡ刺激后没有改变,但是检测到了明显的磷酸化的p70S6K（在Thr389磷酸化）（p<0.05,图3-14B）。利拉鲁肽或雷帕霉素的给药并不影响mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但在两种蛋白的磷酸化中均具有相一致性的抑制作用（p-mTOR和p-p70S6K）。利拉鲁肽或雷帕霉素混合给药后加强了这一现象的发生,但在AngⅡ基础上加入MHY1485再加入利拉鲁肽后,可以逆转MHY1485的结果,降低mTOR和p70S6K的磷酸化水平（p<0.05,图3-14）。11.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞内Collagen I水平的影响蛋白质印迹法确定了胶原蛋白I的表达,在AngⅡ组相对于Control组增加。免疫荧光结果显示,AngⅡ组中心肌细胞质中荧光亮度明显增加,在Control组心肌细胞质中collagen I表达较少。在AngⅡ给药的基础上加入利拉鲁肽或雷帕霉素治疗有效地抑制了collagen I的表达,并减少了心肌细胞质中荧光亮度,在MHY1485组加入利拉鲁肽后,可以逆转MHY1485组collagen I的表达水平。结论:1.利拉鲁肽通过降低AT1R,上调AT2R的表达,进而减少自由基,抑制心肌细胞肥大;2.利拉鲁肽通过抑制TGF-β1的表达,减少肌成纤维细胞的表达,进而减少心肌细胞纤维化的形成;3.利拉鲁肽通过抑制mTOR/p70S6K通路降低心肌细胞肥大和纤维化的形成。
孔繁达[7]（2020）在《补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究》文中研究说明目的:本研究通过建立心梗后心衰模型,在“心肾相关”理论指导下应用补肾活血方治疗心衰大鼠,观察补肾活血方对大鼠实验疗效,明确其改善大鼠心室重构作用,并以Wnt/β-catenin信号通路为契合点,从在体及离体两个层面进一步探讨补肾活血方改善心室重构的具体分子机制。材料与方法:1.心梗后心衰大鼠模型建立及评价。购买130只SPF级雄性SD大鼠（体重250±20g）,随机选出30只用于心梗后心衰大鼠模型建立及评价,剩余100只用于后续其他实验。将选出的30只大鼠随机分为假手术组与模型组,每组15只。通过结扎大鼠冠脉左前降支（left anterior descending artery,LAD）造成大鼠大面积心肌梗死,随机选取术后存活大鼠3只,于术后第三天行2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2、3、5-Triphenytetrazoliumchlor ide,TTC）染色测量大鼠心肌梗死面积,其余术后存活大鼠进行力竭式游泳,1次/日,并减半喂食（按体重计算标准饲料量/2）,持续4周,造成慢性心衰大鼠模型,假手术组大鼠冠脉LAD只挂线,不结扎,术后正常饮食。造模过程中,观察大鼠存活状况,造模结束后计算大鼠存活率,观察两组大鼠体征（包括心率、呼吸频率、尿量等）,采用超声法测量大鼠射血分数（ejection fraction,EF）,称取大鼠体重及心脏重量计算心重指数（heart weight index,HWI）,酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法检测大鼠血清脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）含量。通过上述方法综合评价心梗后心衰模型制备的可靠性。2.补肾活血方对慢性心衰大鼠心功能及“心肾相关”指标的影响。购买的130只SPF级雄性SD大鼠,上述实验使用30只,剩余100只。在剩余的100只SPF级雄性SD大鼠中随机挑选20只作为假手术组,其余80只大鼠通过结扎大鼠冠脉LAD造成心肌梗死,术后进行力竭式游泳及饥饿,造成慢性心衰大鼠模型（造模操作手法同上述实验）。将造模后存活大鼠随机分为模型组、补肾活血组、赖诺普利组。赖诺普利组大鼠给予赖诺普利片配置成的混悬液2.0mg/kg·d（按人鼠剂量换算）灌胃,每天1次,每次3ml;补肾活血组大鼠给予补肾活血方熬制汤剂灌胃,剂量为18.0g/kg·d（按人鼠剂量换算）,每天1次,每次3ml;假手术组和模型组大鼠每日给予常规等容积蒸馏水灌胃,每天1次,每次3ml。各组均给药4周。药物治疗4周后超声检测各组大鼠舒张末期左心室内径（LVEDD）,收缩末左心室内径（LVESD）并计算EF值及左心室短轴缩短分数（FS）,处死大鼠取材,制作心肌病理切片并采用HE染色法（纵切）观察各组大鼠心肌形态改变,Elisa法测定各组大鼠血清BNP表达水平,免疫蛋白印记（Western blotting,WB）法检测大鼠肾组织中Klotho蛋白表达水平,反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测大鼠肾组织骨桥蛋白（osteopontin,OPN）信使核糖核酸（messenger ribonucleic cid,m RNA）表达情况。3.观察补肾活血方对心梗后心衰大鼠模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大改善心室重构机制。动物造模及药物治疗同上。药物治疗4周后,采用HE染色法（横切）观察心肌横截面面积,Elisa法测定各组大鼠血清Wnt3a表达水平,WB法检测各组大鼠心肌β-连环蛋白（β-catenin）、散乱蛋白1（dishevelled 1,Dvl1）、磷酸化糖原合酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK3β）水平,RT-PCR法检测大鼠心肌组织Myc m RNA表达情况。4.观察补肾活血方对H9C2心肌细胞肥大模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大机制,明确补肾活血方调控Wnt/β-catenin信号通路的主要靶点。含药血清制备:购买20只大鼠,随机选出10只给予补肾活血方熬制汤剂18.0g/kg·d灌胃,每天1次,每次3ml,灌胃1周后取材收集大鼠血清,离心制备补肾活血方含药血清;另外10只大鼠给予等量蒸馏水灌胃,1周后取材收集大鼠血清,离心制备正常大鼠血清。购买H9C2细胞株,根据实验设计分为四组。应用96孔板培养细胞。正常组心肌细胞共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;模型组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;中药组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液;中药实验组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及持续活化型β-catenin质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液。为消除误差,实验另设对照,将上述分组中Top-flash换为Fop-flash。将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中48h,应用Dual-Glo?Luciferase Assay System双荧光报告系统检测细胞荧光值。另取24孔板,孔中铺圆形玻片,按上述分组方法培养细胞并转染,转染后取出玻片用显微镜观察心肌细胞面积,鬼笔环肽法观察心肌细胞F-actin荧光强度及细胞形态。结果:1.造模完成时,模型组大鼠死亡4只,LAD结扎后大鼠心电图显示ST段明显抬高,幅度超过0.1m V;TTC染色显示术后大鼠心肌梗死面积为39.46%。造模结束时模型组大鼠心率、呼吸频率高于假手术组,尿量少于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠EF均值低于45%,低于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠心重指数高于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠血清BNP、Ang Ⅱ水平明显高于假手术组（P﹤0.01）。2.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD升高,EF、FS值降低,血清BNP水平明显升高,心肌结构紊乱,部分胞核溶解,肾组织Klotho蛋白表达降低,OPN m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组大鼠比较,补肾活血组大鼠LVEDD、LVESD降低,EF、FS值升高,血清BNP水平明显降低,心肌结构改善,肾脏Klotho蛋白表达升高,OPN m RNA表达降低（P﹤0.01）;与赖诺普利组比较,补肾活血组大鼠超声指标、肾组织Klotho蛋白及OPN m RNA表达无差异（P﹥0.05）。3.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠心肌横截面面积增大,Wnt经典通路配体Wnt3a血清水平降低,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显升高,心肌组织Myc m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组比较,补肾活血组及赖诺普利组大鼠心肌横截面面积变小,血清Wnt3a水平升高,心肌组织Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显降低,心肌组织Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）,补肾活血组心肌组织β-catenin表达较高（P﹤0.01）,赖诺普利组心肌组织β-catenin蛋白表达变化不明显（P﹥0.05）;与赖诺普利组相比,补肾活血组大鼠心肌横截面面积无差异（P﹥0.05）,血清Wnt3a水平较高,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达较低,Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）。4.显微镜下观察正常组H9C2细胞,可见细胞多呈长梭形。模型组H9C2细胞面积增大,F-actin荧光强度明显高于正常组（P﹤0.01）,细胞内微丝增多增粗,细胞横向增宽,形态不规则,提示H9C2细胞肥大模型成功,双荧素酶报告系统显示模型组H9C2细胞荧光值明显高于正常组（P﹤0.01）;相比于模型组,中药组H9C2细胞面积缩小,细胞多呈梭形,F-actin荧光强度降低,细胞内微丝较细,双荧素酶报告系统的荧光值降低（P﹤0.01）;相比于中药组,中药实验组H9C2细胞面积增大,细胞形态不规则、粗大,细胞内F-actin荧光强度增强（P﹤0.01）,微丝增多增粗,双荧光系统荧光值明显升高（P﹤0.01）。结论:1.结扎LAD可见大鼠心电图ST段明显升高并有大面积心肌梗死,说明手术流程可靠;术后大鼠经力竭式游泳、饥饿造成慢性心衰模型,其体征符合临床表现,心脏重量增加,心功能（BNP、EF值）降低,心衰时RAAS系统主要指标Ang Ⅱ升高,贴近临床,是可靠的慢性心衰造模方法。2.补肾活血方可提高慢性心衰大鼠心功能（BNP、EF值）,改善心肌排列,改善心室结构（LVEDD、LVESD）,调节“心肾相关”因子Klotho、OPN的表达,明确“心肾相关”理论对于慢性心衰治疗的指导地位。3.补肾活血方可下调大鼠心肌组织中β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达,下调Myc m RNA表达,表明补肾活血方可调控Wnt/β-catenin信号通路中的多个信号分子靶点,并通过Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制心肌肥大作用。补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。4.实验显示,Ang Ⅱ可刺激H9C2细胞肥大,且其机制与激活Wnt/β-catenin信号通路有关,补肾活血方可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路达到抑制心肌肥大的作用,其作用靶点位于通路传导中β-catenin的上游,结合体内实验可推断补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。
王峰[8]（2020）在《微小RNA-122-5p和155-5p在芹菜素改善TGF-β1/Smads介导心肌纤维化中的作用研究》文中研究说明目的:观察微小RNA（micro RNA,miR）-122-5p和155-5p在转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β1诱导心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）增殖和分化中的作用,同时观察芹菜素对其的影响,并在小鼠心肌纤维化模型上进一步加以证实,以阐明miR-122-5p和155-5p与TGF-β1/Smads之间的关系,以及芹菜素影响CFs活化和改善心肌纤维化的作用机制,为芹菜素应用于防治心肌纤维化提供充分的药理学依据。方法:（1）在体外,采用TGF-β1刺激的CFs,观察不同浓度的芹菜素对CFs表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、collagenⅠ、collagenⅢ、缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）-1α、细胞内凯特-斯隆基因（cellular Sloan-Kettering Institute,c-Ski）、Smad2/3/4/7和p-Smad2/3的影响;同时也观察芹菜素对细胞中miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-133-5p、miR-27b-5p、miR-122-5p和miR-155-5p表达的影响,以选择合适的芹菜素浓度和确定受其影响的miR。（2）将转染miR-122-5p mimic或inhibitor的CFs联合TGF-β1刺激,并同时给予芹菜素处理,观察miR-122-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3/7和p-Smad2/3表达的变化,以探究miR-122-5p在TGF-β1诱导CFs表型转化和胶原合成中的作用,以及芹菜素对其的影响。另将miR-122-5p mimic与LV-HIF-1α共转染CFs,观察miR-122-5p对HIF-1α、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4和Smad7表达的影响,采用生物信息学方法预测miR-122-5p与HIF-1α之间的相互作用关系,并用荧光素酶实验确定它们的靶向结合。（3）将转染miR-155-5p mimic或inhibitor的CFs联合TGF-β1刺激,并同时给予芹菜素处理,观察miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、c-Ski、Smad2/3/7和p-Smad2/3表达的变化,以探究miR-155-5p在TGF-β1诱导CFs表型转化和胶原合成中的作用,以及芹菜素对其的作用。采用生物信息学的方法来预测miR-155-5p的作用靶基因,并进一步采用荧光素酶实验确定miR-155-5p与其靶基因的结合。（4）在体内实验中,将ICR雄性小鼠随机分为对照组、模型组、芹菜素75、150和300 mg/kg组、卡托普利25 mg/kg组。给药组于上午按0.2 m L/10 g体重灌胃给药,3 d后与模型组一起,于下午皮下注射异丙肾上腺素5 mg/kg 1次,次日将剂量调整为2.5 mg/kg/d,连续30 d,之后药物处理组再继续给药7 d。实验结束时,小鼠禁食12 h后取眼眶血和心脏,心脏称重后计算心重系数,部分心肌用冷生理盐水制成10%组织匀浆,用比色法测定血清和心肌组织中的丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）含量,部分心肌固定切片后进行Masson染色,观察胶原纤维沉积的程度,部分心肌置-80°C冰箱,用于检测miR-122-5p、miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、TGF-β1、核因子κB（nuclear factorκB,NF-κB）、HIF-1α、c-Ski、Smad2/3/4/7和p-Smad2/3 m RNA或蛋白表达。结果:（1）在TGF-β1刺激的CFs中,加入芹菜素6-24μM后,可剂量依赖性降低α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3的m RNA或蛋白表达（p<0.05或p<0.01）,增加c-Ski和Smad7的m RNA和蛋白表达（p<0.05或p<0.01）。芹菜素6-24μM也可剂量依赖性逆转TGF-β1对CFs中miR-122-5p和miR-155-5p表达的影响。（2）CFs转染miR-122-5p mimic后,细胞中miR-122-5p和Smad7 m RNA或蛋白表达显着增加（p<0.01）,而α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3m RNA或蛋白表达显着降低（p<0.05或p<0.01）。CFs转染miR-122-5p inhibitor后,则出现相反的结果。用TGF-β1刺激miR-122-5p mimic转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的效应降低（p<0.05或p<0.01）。MiR-122-5p mimic联合芹菜素后,抑制TGF-β1对CFs活化的作用进一步增强（p<0.01）。用TGF-β1刺激miR-122-5p inhibitor转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的作用则进一步增强（p<0.05或p<0.01）。芹菜素可拮抗miR-122-5p inhibitor增强TGF-β1活化CFs的效应（p<0.01）。在HIF-1α过表达的CFs中,HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达显着增加（p<0.01）,Smad7表达显着降低（p<0.01）。HIF-1α介导的这些效应能够被miR-122-5p mimic逆转（p<0.05或p<0.01）。荧光素酶实验结果显示,miR-122-5p mimic和HIF-1α3’-UTR野生型质粒共转的荧光素酶活性显着降低（p<0.01）,显示HIF-1α是miR-122-5p作用的靶基因。（3）CFs转染miR-155-5p mimic后,细胞中miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、Smad2/3和p-Smad2/3的m RNA或蛋白表达显着增加（p<0.01）,而c-Ski的m RNA和蛋白表达显着降低（p<0.01）。CFs转染miR-155-5p inhibitor后,则出现相反的结果。用TGF-β1刺激miR-155-5p mimic转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的效应进一步增强（p<0.05或p<0.01）。芹菜素可拮抗miR-155-5p mimic增强TGF-β1活化CFs的效应（p<0.01）。用TGF-β1刺激miR-155-5p inhibitor转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的作用则被抑制（p<0.05或p<0.01）。MiR-155-5p inhibitor联合芹菜素后,抑制TGF-β1对CFs活化的作用进一步增强（p<0.05或p<0.01）。荧光素酶实验结果显示,miR-155-5p mimic和c-Ski 3’-UTR野生型质粒共转的荧光素酶活性显着降低（p<0.01）,显示c-Ski是miR-155-5p作用的靶基因。（4）在动物实验中,芹菜素组的心重系数、心肌组织中的羟脯氨酸和MDA含量显着降低（p<0.05或p<0.01）,心肌组织中的SOD和GSH-PX活力则显着增加（p<0.05或p<0.01）。心肌组织的Masson染色结果显示,芹菜素组的胶原染色面积显着减少（p<0.01）。Real-time PCR和Western blot结果显示,芹菜素可显着增加miR-122-5p、c-Ski和Smad7的表达（p<0.01）,抑制miR-155-5p、NF-κB p65、HIF-1α、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的表达（p<0.01）。结论:MiR-122-5p和155-5p参与了TGF-β1/Smads信号通路介导的CFs活化,它们的作用靶基因分别为HIF-1α和c-Ski。芹菜素可通过增加miR-122-5p和降低miR-155-5p的表达调节各自的靶基因HIF-1α和c-Ski表达,从而逆转TGF-β1介导的Smad2/3上调和Smad7下调;芹菜素也可通过增加机体的抗氧化能力削弱NF-κB/TGF-β1途径的激活,抑制CFs的活化而发挥抗心肌纤维化作用。
刘培培[9]（2020）在《丹蛭降糖胶囊干预高糖诱导心肌纤维化的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的研究丹蛭降糖胶囊干预糖尿病模型大鼠心肌组织纤维化及调节高糖诱导心肌成纤维细胞增殖的作用,并通过TLR4-My D88-NF-κB信号通路探讨其作用机制。方法体内实验:清洁级SD大鼠给予高脂饲料联合链脲佐菌素制备2型糖尿病大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组（等容量蒸馏水）,丹蛭降糖胶囊低、中、高剂量组（270、540、1080 mg/kg）、阳性药组（150 mg/kg,二甲双胍）,并另设对照组普通饲料喂养（等容量蒸馏水）,药物干预8周,剖取心脏,通过HE和Masson染色,Collagen I和CollagenⅢ免疫组化检测,观察各组大鼠心肌组织形态学变化,研究丹蛭降糖胶囊干预糖尿病模型大鼠心肌纤维化的作用。体外实验:分离培养新生SD乳鼠心肌成纤维细胞,构建高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型,丹蛭降糖胶囊含药血清与TLR4特异性阻断剂干预后,通过MTT实验观察细胞活力,细胞划痕实验和免疫荧光法观察细胞增殖,Western blot和RT-q PCR检测TLR4-My D88-NF-κB信号通路和心肌纤维化相关蛋白和基因的变化,阐明TLR4-My D88-NF-κB信号通路调节高糖诱导心肌成纤维细胞增殖的分子机制,揭示丹蛭降糖胶囊干预高糖诱导心肌纤维化的作用及与TLR4-My D88-NF-κB信号通路的关系。结果一、丹蛭降糖胶囊对糖尿病模型大鼠心肌纤维化的影响研究通过对心肌组织形态学观察:与对照组相比,HE及Masson结果显示模型组大鼠心肌断裂,成纤维细胞增多并伴有炎性浸润,胶原沉积并伴有间质纤维化,免疫组化显示模型大鼠心肌组织可见大量Collagen I和Collagen III沉积;与模型组比较,丹蛭降糖胶囊各剂量组和二甲双胍组大鼠心肌组织HE及Masson结果显示,染色较均匀,肌纤维排列较整齐,方向趋于一致,心肌纤维断裂情况减轻,细胞排列整齐,胶原增生明显减少,有少量炎性细胞浸润,免疫组化染色显示Collagen I和CollagenⅢ表达明显减少。二、丹蛭降糖胶囊调节TLR4-My D88-NF-κB信号通路干预高糖诱导心肌成纤维细胞增殖的机制研究。（1）不同葡萄糖浓度（5.5、15、30、45、60mmol/L）以及高渗组（甘露醇）干预48h,对心肌成纤维细胞OD值观察结果显示:与正常组（5.5mmol/L）相比,高糖模型组（30mmol/L）干预48h OD值显着增加（P<0.01）,高糖诱导心肌成纤维细胞的增殖模型制备成功;丹蛭降糖胶囊含药血清不同浓度组（5%、10%、15%、20%、25%）干预48h,5%、10%、15%含药血清浓度组未出现细胞毒性作用;（2）与对照组比,高糖模型组心肌成纤维细胞划痕实验迁移抑制率明显降低（P<0.05）,TGF-β1、Vimentin、Collagen I和Collagen III蛋白表达,TLR4、My D88、NF-κB p65的蛋白和基因表达均显着增加（P<0.05）;（3）与高糖模型组比,TLR4特异性阻断剂TAK-242的干预组心肌成纤维细胞增殖降低,细胞迁移抑制率明显增加（P<0.05）,TGF-β1、Vimentin、Collagen I和Collagen III蛋白表达,TLR4、My D88、NF-κB p65的蛋白和基因表达均显着降低（P<0.05）;（4）与高糖模型组比,丹蛭降糖胶囊含药血清组心肌成纤维细胞增殖降低,细胞迁移抑制率明显增加（P<0.05）,TGF-β1、Vimentin、Collagen I和Collagen III蛋白表达,TLR4、My D88、NF-κB p65的蛋白和基因表达均显着降低（P<0.05）。结论丹蛭降糖胶囊可通过调节TLR4-My D88-NF-κB信号通路,抑制高糖诱导心肌成纤维细胞的增殖,抗心肌纤维化,改善糖尿病模型大鼠心肌组织形态学,有效干预糖尿病并发的心肌组织损伤,有显着防治糖尿病心肌病的作用。
辛博[10]（2019）在《Nur77对心肌成纤维细胞功能影响及野黄芩苷调控Nur77抑制心肌纤维化相关研究》文中研究说明心肌纤维化（myocardial fibrosis,MF）是以心肌间质或血管周围细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积为主要特征的一种病理反应。研究表明,心肌纤维化是大多数心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）发展到终末期的必然生理过程。因此,阻断或逆转心肌纤维化是治疗心血管疾病的重要目标之一。心肌成纤维细胞（Cardiac fibroblasts,CFs）是产生细胞外基质的中心细胞,其激活是心肌纤维化发生的中心环节,在心肌纤维化过程中发挥关键的作用。众多细胞因子、信号通路参与调控心肌成纤维细胞的激活,但其激活的确切机制仍在探索过程中。近年来,国内外学者开始关注核转录因子在心肌纤维化发生发展过程中的作用。最新研究表明,孤儿核受体Nur77可负反馈调控多种实验性纤维化疾病,这也提示Nur77可能成为抗心肌纤维化的潜在靶点。野黄芩苷是一种黄酮类单体,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理活性。有报道显示野黄芩苷可以通过ERK信号通路抑制心肌梗死所致的大鼠心肌纤维化,但其抗心肌纤维化相关的细胞及分子机制尚未完全明确。本课题组前期研究发现,金丝桃苷可通过ERK/CREB通路诱导Nur77的表达,抑制血管平滑肌细胞增殖,同时ERK信号通路也是调控Nur77表达的重要信号通路之一。我们的预实验结果显示:（1）小鼠心肌纤维化组织和体外激活的原代心肌成纤维细胞中Nur77表达增加。（2）野黄芩苷可诱导正常小鼠心肌组织和未激活的原代心肌成纤维细胞中Nur77表达增加。基于文献研究和预实验结果,我们提出假设:（1）孤儿核受体Nur77可能参与调控心肌成纤维细胞功能及心肌纤维化的发生发展。（2）野黄芩苷通过调控Nur77发挥抗心肌纤维化作用。并开展以下研究:目的:（1）探讨调控Nur77对心肌成纤维细胞功能的影响。（2）探究野黄芩苷调控Nur77对心肌成纤维细胞功能和心肌纤维化的作用及相关分子机制。为寻找抗心肌纤维化的新靶点和开发抗心肌纤维化药物提供新思路。方法:（1）ANG Ⅱ诱导小鼠心肌纤维化,同时ANG Ⅱ（1μM）刺激原代心肌成纤维细胞。Western bolt、RT-q PCR、免疫组化和免疫荧光法检测组织和细胞中α-smooth muscle actin（α-SMA）,Collagen Ⅰ（Col Ⅰ）和Collagen Ⅲ（Col Ⅲ）以及NR4A家族m RNA和蛋白表达。（2）构建Ad Nur77腺病毒和Nur77 siRNA,分别转染原代心肌成纤维细胞。CCK-8和细胞计数法、Transwell和划痕实验、Western blot、RT-qPCR以及流式细胞仪分别检测过表达或敲减Nur77对原代心肌成纤维细胞增殖、迁移、α-SMA表达和胶原合成以及细胞凋亡、细胞周期的影响。（3）ANG Ⅱ和不同浓度SCU分别刺激正常和敲减Nur77的原代心肌成纤维细胞。CCK-8法、Transwell小室实验、免疫荧光法、RT-qPCR法分别检测原代CFs增殖、迁移、表型转化及纤维化相关基因表达的变化。Western blot检测细胞中Nur77及p-Nur77蛋白水平。对细胞给予MAPK抑制剂刺激,Western blot检测细胞中Nur77及p-Nur77蛋白水平。ANG Ⅱ和不同浓度SCU分别刺激正常和敲减Nur77的原代心肌成纤维细胞,Western blot检测细胞中ERK1/2和p38 MAPK总蛋白和磷酸化蛋白水平。Western blot检测敲减Nur77后细胞中ERK1/2和p38 MAPK总蛋白和磷酸化蛋白水平。（4）（1）雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:空白对照组、ANG Ⅱ模型组、ANG Ⅱ+野黄芩苷组、野黄芩苷对照组。HE和Masson染色检测心肌组织病理变化和胶原沉积;Western blot、RT-q PCR和免疫组织化学法检测心肌组织中Col Ⅰ,Col Ⅲ,α-SMA和Nur77以及p-Nur77的蛋白或m RNA水平。（2）对小鼠心肌原位注射Nur77干扰慢病毒或NC对照慢病毒,同时建立ANG Ⅱ诱导的实验性小鼠心肌纤维化模型。Masson染色检测心肌组织胶原沉积;Western blot、RT-q PCR和免疫组织化学法检测心肌组织中Col Ⅰ,Col Ⅲ,α-SMA以及Nur77和p-Nur77的m RNA或蛋白水平。结果:（1）心肌纤维化组织和ANG Ⅱ激活的原代心肌成纤维细胞中Nur77表达增加。（2）原代心肌成纤维细胞过表达Nur77后,细胞增殖能力下降,同时迁移能力减弱;PCNA,Cyclin D1,Col Ⅰ,Col Ⅲ和α-SMA蛋白水平均降低;对细胞凋亡无显着影响。原代心肌成纤维细胞敲减Nur77后,增殖能力和迁移能力增强;纤维化相关基因Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA m RNA表达增加;细胞凋亡数减少,同时G0-G1期细胞数减少,S期和G2期细胞数增多。（3）（1）野黄芩苷抑制ANG Ⅱ诱导的原代心肌成纤维细胞增殖,迁移和表型转化,减少Col Ⅰ,Col Ⅲ和α-SMA m RNA表达。Nur77敲减后减弱了以上作用;（2）50μM的野黄芩苷刺激细胞12 hr时,Nur77水平最高;野黄芩苷对p-Nur77水平无影响;（3）野黄芩苷可抑制ANG Ⅱ诱导的Nur77磷酸化;（4）ERK1/2和p38 MAPK抑制剂能抑制ANG Ⅱ和野黄芩苷诱导的细胞中Nur77表达;（4）野黄芩苷可呈剂量依赖抑制ANG Ⅱ刺激的ERK1/2和p38 MAPK磷酸化;Nur77敲减后,野黄芩苷抑制ERK1/2和p38 MAPK磷酸化作用仍未减弱。（4）（1）野黄芩苷可缓解ANG Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化,并抑制Col Ⅰ,Col Ⅲ,α-SMA蛋白和m RNA表达;Nur77敲减后,上述作用减弱;（2）野黄芩苷降低了纤维化心肌组织中p-Nur77的水平。SCU抑制ANG Ⅱ刺激的纤维化心肌组织中ERK1/2和p38 MAPK磷酸化。结论:（1）ANG Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化组织和ANG Ⅱ激活的原代心肌成纤维细胞中Nur77高表达。（2）Nur77可负反馈调控原代心肌成纤维细胞的功能。（3）野黄芩苷可抑制原代心肌成纤维细胞的增殖、迁移、表型转化,减少ECM合成。（4）野黄芩苷可抑制ANG Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化。（5）野黄芩苷调控心肌成纤维细胞功能、抑制心肌纤维化作用的分子机制是通过ERK1/2/p38 MAPK通路改变Nur77表达量,抑制Nur77磷酸化来实现的。综上,本研究初步阐明了Nur77对心肌成纤维细胞功能的调控作用,同时部分阐明了野黄芩苷调控Nur77抑制心肌成纤维细胞激活和抗小鼠心肌纤维化作用的相关分子机制。这些结果为全面了解心肌纤维化发病机制和开发抗心肌纤维化药物提供新思路。
二、青霉素溶液对大鼠臀肌纤维化影响的实验观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、青霉素溶液对大鼠臀肌纤维化影响的实验观察（论文提纲范文）
（1）有氧运动调节AMPK相关信号通路减缓TAC诱导病理性心肌肥厚的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 心力衰竭 |
| 2 AMPK与心力衰竭 |
| 3 运动与心力衰竭 |
| 4 总结与展望 |
| 5 参考文献 |
| 第一部分 有氧运动对TAC诱导C57BL/6J小鼠病理性心肌肥厚的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物与实验设计 |
| 2.2 TAC模型制备 |
| 2.3 运动方案 |
| 2.4 超声检测小鼠心功能 |
| 2.5 小鼠心脏取材 |
| 2.6 小鼠心肌组织石蜡包埋、切片步骤 |
| 2.7 小鼠心肌组织马松染色 |
| 2.8 天狼星红染色 |
| 2.9 偏振光 |
| 2.10 WGA染色 |
| 2.11 W B |
| 2.12 内源性H_2S含量的检测 |
| 2.13 统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 有氧运动对C57BL6/J小鼠心肌肥厚的影响 |
| 3.2 有氧运动可减缓TAC引起的心功能障碍 |
| 3.3 有氧运动对TAC诱导左室纤维化和心肌细胞肥大的影响 |
| 3.4 有氧运动对C57BL6/J小鼠心肌TGF-β/Smad信号通路的影响 |
| 3.5 NLRP3/IL-1β蛋白在有氧运动预防TAC诱导C57BL6/J小鼠心肌肥厚中的表达变化 |
| 3.6 自噬相关蛋白在有氧运动预防TAC诱导C57BL6/J心肌肥厚中的表达变化 |
| 3.7 有氧运运动对TAC诱导C57BL6/J小鼠心肌肥厚中硫化氢合成酶蛋白表达水平以及内源性H_2S产生的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病理性心肌肥厚模型的建立 |
| 4.2 有氧运动训练减轻病理性心肌肥厚 |
| 4.3 有氧运动训练减轻心肌纤维化 |
| 4.4 有氧运动训练降低TAC诱导的心肌组织NLRP3/IL-1β蛋白信号通路表达 |
| 4.5 有氧运动激活AMPK介导的心肌自噬 |
| 4.6 有氧运动增加心肌内源性H_2S合成以及硫化氢合成酶蛋白水平 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 AMPKα2 基因敲除阻滞有氧运动预防病理性心肌肥厚的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 AMPKα2 基因敲除效率验证 |
| 3.2 有氧运动对AMPKα2~(-/-)小鼠心肌肥厚的影响 |
| 3.3 有氧运动未能改善AMPKα2~(-/-)小鼠的心功能障碍 |
| 3.4 有氧运动对AMPKα2~(-/-)小鼠左室纤维化和心肌细胞肥大的影响 |
| 3.5 有氧运动对AMPKα2~(-/-)小鼠心肌TGF-β/Smad信号通路的影响 |
| 3.6 NLRP3/IL-1β蛋白在有氧运动减缓TAC诱导AMPKα2~(-/-)小鼠心肌肥厚中的表达变化 |
| 3.7 自噬相关蛋白在有氧运动减缓TAC诱导AMPKα2~(-/-)小鼠心肌肥厚中的表达变化 |
| 3.8 有氧运运动对TAC诱导AMPKα2~(-/-)小鼠心肌肥厚中硫化氢合成酶蛋白表达水平以及内源性H_2S产生的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 AMPKα2 基因敲除阻滞有氧运动减缓小鼠心肌纤维化 |
| 4.2 AMPKα2 基因敲除阻滞有氧运动激活心肌自噬 |
| 4.3 AMPKα2 基因敲除小鼠心肌组织内源性H_2S增加未减缓病理性心肌肥厚 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第三部分 AMPK介导的H_2S及细胞自噬在病理性心肌肥厚中的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 研究设计 |
| 2.1 小鼠心肌细胞实验设计与技术路线图 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 主要实验仪器 |
| 3.2 主要实验试剂 |
| 3.3 试剂配制 |
| 3.4 细胞传代与培养 |
| 3.5 细胞复苏与冻存 |
| 3.6 抑制剂 |
| 3.7 WGA染色 |
| 3.8 WB |
| 3.9 数据统计 |
| 4 结果 |
| 4.1 不同浓度血管紧张素Ⅱ干预对小鼠心肌细胞的影响 |
| 4.2 不同NaHS浓度溶液对肥大心肌细胞中ANP蛋白表达的影响 |
| 4.3 NaHS(H_2S供体)对血管紧张素诱导心肌肥厚的影响 |
| 4.4 自噬介导硫化氢对心肌细胞炎症的抑制作用 |
| 4.5 硫化氢通过AMPK相关的信号通路促进自噬发挥抗炎作用 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 全文讨论 |
| 研究结论 |
| 论文创新点 |
| 研究不足 |
| 7 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 学习经历 |
| 读博期间发表论文情况 |
（2）miR-489调控心肌纤维化的机制及人参皂苷Re的干预作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 心肌纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 人参皂苷Re药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 研究一 miR-489调节心肌纤维化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 CFs形态学观察与纯度检测 |
| 2 过表达miR-489抑制CFs分化和分泌 |
| 3 过表达miR-489抑制myd88/NF-κB通路的活化 |
| 4 抑制miR-489促进CFs分化和分泌 |
| 5 抑制miR-489促进myd88/NF-κB通路活化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究二 人参皂苷Re调节心肌梗死后心肌纤维化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 人参皂苷Re改善AMI后心脏功能 |
| 2 人参皂苷Re抑制AMI后心肌代偿性肥厚 |
| 3 人参皂苷Re减轻AMI后心肌损伤 |
| 4 人参皂苷Re改善AMI后心脏组织病理学改变 |
| 5 人参皂苷Re抑制AMI后纤维化相关蛋白的表达 |
| 6 人参皂苷R调控AMI后miR-489和myd88 mRNA的表达 |
| 7 人参皂苷Re抑制AMI诱导的myd88/NF-κB通路活化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究三 人参皂苷Re干预AngⅡ诱导CFs生物学行为改变的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 人参皂苷Re干预CFs的浓度筛选 |
| 2 人参皂苷Re抑制AngⅡ诱导的CFs分化 |
| 3 人参皂苷Re抑制AngⅡ诱导的CFs迁移 |
| 4 人参皂苷R抑制AngⅡ诱导的CFs中胶原蛋白的表达 |
| 5 人参皂苷Re抑制AngⅡ诱导的CFs中myd88/NF-κB通路活化 |
| 6 人参皂苷Re调节CFs中miR-489和myd88 mRNA的表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究结语 |
| 创新点 |
| 基金项目 |
| 主要仪器设备 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（3）基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 益气活血类中药保护缺血性心肌病的作用机制及在内质网应激方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 心肌细胞死亡形式及其在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 益气活血药对心梗大鼠心脏功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 益气活血药对心肌梗死大鼠内质网应激和细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 益气活血药对缺血缺氧诱导的H9c2心肌细胞活力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 益气活血药对缺糖缺氧诱导的H9c2心肌细胞内质网应激和细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）Nur77转录调控GSK-3β影响老年心肌纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:Nur77 调控自然衰老小鼠心肌纤维化的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验常用试剂配制: |
| 2.3.2 小鼠心脏功能检测 |
| 2.3.3 左室质量指数计算及取材 |
| 2.3.4 HE染色 |
| 2.3.5 Masson染色 |
| 2.3.6 TUNEL染色 |
| 2.3.7 Western blot |
| 2.3.8 qRT-PCR |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nur77 敲除对衰老小鼠心功能及结构的影响 |
| 3.2 Nur77 敲除对衰老小鼠心肌肥大的影响 |
| 3.3 Nur77 对衰老小鼠心肌组织结构的影响 |
| 3.4 Nur77 敲除对衰老相关心肌纤维化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Nur77 调控心肌细胞纤维化的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏 |
| 2.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3 Nur77sh RNA及其对照慢病毒制备 |
| 2.3.4 细胞慢病毒转染 |
| 2.3.5 细胞冻存 |
| 2.3.6 Western blot |
| 2.3.7 qRT-PCR |
| 2.4 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGF-β1 诱导H9c2 心肌细胞纤维化 |
| 3.2 Nur77 特异性干扰序列的筛选 |
| 3.3 Nur77 低表达对H9c2 心肌细胞纤维化的影响 |
| 3.4 Nur77 过表达对大鼠H9c2 心肌细胞纤维化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:Nur77 调控GSK-3β/β-catenin通路抑制心肌纤维化的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏 |
| 2.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3 细胞慢病毒转染 |
| 2.3.4 细胞GSK-3βsi RNA转染 |
| 2.3.5 细胞冻存 |
| 2.3.6 qRT-PCR |
| 2.3.7 Western blot |
| 2.3.8 ChIP |
| 2.3.9 荧光素酶报告实验 |
| 2.3.10 质粒提取 |
| 2.3.11 转录因子预测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nur77 对自然衰老小鼠心肌组织中GSK-3β/β-catenin通路的影响 |
| 3.2 Nur77 敲减对H9c2 细胞中GSK-3β/β-catenin通路的影响 |
| 3.3 Nur77 过表达对H9c2 细胞中GSK-3β/β-catenin通路的影响 |
| 3.4 联合GSK-3βsi及 Nur77 过表达干预对H9c2 细胞纤维化及 GSK-3β/β-catenin通路的影响 |
| 3.5 明确Nur77是GSK-3β的上游核转录因子,转录调控GSK-3β |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 GSK-3β在衰老相关心力衰竭中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 AMPK/mTOR通路在糖尿病血管病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 益气活血药人参三七川芎对血管保护作用的药理研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症的体内实验研究 |
| 实验一 益气活血药延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠心脏老化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK-mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠脑老化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益气活血药延缓高糖诱导血管平滑肌细胞衰老的体外实验研究 |
| 实验一 建立高糖诱导的HASMC衰老模型 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）胰高血糖素样肽1对心肌重塑和心功能的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 胰高血糖素样肽1通过阻断大鼠血管紧张素II1型受体减轻腹主动脉缩窄后的心脏重塑及改善心脏功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及主要药品 |
| 1.4 实验方法及步骤 |
| 2 结果 |
| 2.1 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠血糖、体重的影响 |
| 2.2 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌肥大和HW/BW比值的影响 |
| 2.3 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏衰竭程度的影响 |
| 2.4 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏氧化应激和抗氧化酶的影响 |
| 2.5 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠AT1R、AT2R、AT1R/AT2R比值及ACE2表达的影响 |
| 2.6 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠巨噬细胞浸润和TGF-β1 表达的影响 |
| 2.7 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠肌成纤维细胞增殖和Smads蛋白表达的影响 |
| 2.8 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌组织胶原蛋白合成和纤维化的影响 |
| 2.9 利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利拉鲁肽对心脏功能具有保护作用 |
| 3.2 利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用主要通过下调AT1R,AT1R/AT2R,上调AT2R和 ACE2 的表达,进而减少自由基产生有关 |
| 3.3 利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用是通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/Smads表达,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关 |
| 4 小结 |
| 第二部分 胰高血糖素样肽1 通过抑制mTOR/ p70S6K信号通路对压力超负荷引起心肌纤维化和功能障碍的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及主要药品 |
| 1.4 实验方法及步骤 |
| 2 结果 |
| 2.1 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠基本状态的影响 |
| 2.2 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏形态和HW/BW比值的影响 |
| 2.3 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠血浆GLP-1 水平,GLP-1 受体表达的影响 |
| 2.4 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠肌成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.5 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响 |
| 2.6 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠LC3,Beclin-1和p62 表达的影响 |
| 2.7 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠胶原合成和组织纤维化的影响 |
| 2.8 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏整体功能的影响 |
| 2.9 利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏收缩和舒张功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利拉鲁肽通过增加GLP-1 水平和GLP-1R表达对长期压力超负荷大鼠的心脏具有保护作用 |
| 3.2 利拉鲁肽通过抑制mTOR/p70S6K信号通路,激活自噬,进而减少胶原沉积和纤维化起到心脏保护作用 |
| 4 小结 |
| 第三部分 胰高血糖素样肽1 对血管紧张素Ⅱ诱导的H9C2 心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂及主要药品 |
| 1.4 实验方法及步骤 |
| 2 结果 |
| 2.1 AngⅡ对H9C2 心肌细胞的增殖作用 |
| 2.2 不同浓度利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2 心肌细胞增殖的影响 |
| 2.3 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞肥大的影响 |
| 2.4 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞AT1R和 AT2R蛋白表达的影响 |
| 2.5 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内ROS水平的影响 |
| 2.6 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内TGF-β1 水平的影响 |
| 2.7 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内α-SMA水平的影响 |
| 2.8 利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内Collagen I水平的影响 |
| 2.9 利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞面积的影响 |
| 2.10 利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞mTOR和 p70S6K蛋白表达的影响 |
| 2.11 利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞内Collagen I水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利拉鲁肽通过降低AT1R,上调AT2R的表达,进而减少自由基,抑制心肌细胞肥大 |
| 3.2 利拉鲁肽通过抑制TGF-β1 的表达,减少成纤维细胞的表达,进而减少心肌细胞纤维化的形成 |
| 3.3 利拉鲁肽通过抑制mTOR/p70S6K通路降低心肌细胞肥大和纤维化的形成 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 心梗后心衰大鼠模型的建立与评价(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于“心肾相关”理论探讨补肾活血方对Klotho、OPN及心室重构的影响(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 基于Wnt/β-catenin通路补肾活血方抑制心梗后心衰大鼠心肌肥大机制研究(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制HC92 心肌细胞肥大机制研究(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述一 Wnt/β-catenin 信号通路与心室重构的关系 |
| 参考文献 |
| 综述二 “心肾相关”理论源流及研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（8）微小RNA-122-5p和155-5p在芹菜素改善TGF-β1/Smads介导心肌纤维化中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 芹菜素对TGF-β1刺激小鼠心肌成纤维细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第二部分 MiR-122-5p在芹菜素抑制TGF-β1诱导心肌成纤维细胞分化和胶原合成中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三部分 MiR-155-5p在芹菜素抑制TGF-β1诱导心肌成纤维细胞分化和胶原合成中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第四部分 芹菜素抑制异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌纤维化作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:微小RNA在心肌纤维化中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）丹蛭降糖胶囊干预高糖诱导心肌纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 一、丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病模型大鼠心肌纤维化的影响 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 2型糖尿病模型大鼠的制备 |
| 2.2 动物分组和给药 |
| 2.3 HE染色观察心肌组织形态学变化 |
| 2.4 Masson染色观察心肌组织形态学变化 |
| 2.5 免疫组化观察心肌组织CollagenⅠ和Ⅲ蛋白表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 丹蛭降糖胶囊对模型大鼠血糖的影响 |
| 3.2 丹蛭降糖胶囊对模型大鼠心肌组织形态学的影响 |
| 3.3 丹蛭降糖胶囊对模型大鼠心肌组织中CollagenⅠ和Ⅲ蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 糖尿病心肌病 |
| 4.2 糖尿病心肌病与心肌纤维化 |
| 4.3 实验结果分析 |
| 二、丹蛭降糖胶囊干预高糖诱导心肌成纤维细胞增殖的作用及机制研究 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 含药血清的制备 |
| 1.6 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 乳鼠原代心肌成纤维细胞的分离与培养 |
| 2.2 心肌成纤维细胞的传代 |
| 2.3 乳鼠心肌成纤维细胞的原代分离培养及鉴定 |
| 2.4 不同浓度葡萄糖对心肌成纤维细胞的影响 |
| 2.5 丹蛭降糖胶囊对心肌成纤维细胞的影响 |
| 2.6 实验分组 |
| 2.7 免疫荧光法检测心肌成纤维细胞增殖 |
| 2.8 划痕实验检测心肌成纤维细胞迁移 |
| 2.9 Western blot检测心肌成纤维细胞相关蛋白表达 |
| 2.10 RT-qPCR检测心肌成纤维细胞相关基因表达 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 原代心肌成纤维细胞的鉴定 |
| 3.2 不同浓度的葡萄糖对心肌成纤维细胞的影响 |
| 3.3 不同浓度的丹蛭降糖胶囊含药血清对心肌成纤维细胞的影响 |
| 3.4 丹蛭降糖胶囊对高糖诱导心肌成纤维细胞增殖的影响 |
| 3.5 丹蛭降糖胶囊对高糖诱导心肌成纤维细胞的迁移的影响 |
| 3.6 丹蛭降糖胶囊对高糖诱导心肌成纤维细胞胶原及纤维化蛋白表达的影响 |
| 3.7 丹蛭降糖胶囊对高糖诱导心肌成纤维细胞中TLR4-MyD88-NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.8 丹蛭降糖胶囊对高糖诱导心肌成纤维细胞中TLR4-MyD88-NF-κB信号通路相关基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 心肌纤维化病理机制及其中药防治的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简介 |
| 致谢 |
（10）Nur77对心肌成纤维细胞功能影响及野黄芩苷调控Nur77抑制心肌纤维化相关研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略语对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 Nur77在心肌纤维化组织及体外激活的原代心肌成纤维细胞中的表达情况 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 细胞来源 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 ANGⅡ诱导的小鼠心肌纤维化模型建立 |
| 1.2.2 原代心肌成纤维细胞分离培养及鉴定 |
| 1.2.3 组织石蜡包埋切片 |
| 1.2.4 Masson’s trichrome染色检测心肌组织胶原沉积 |
| 1.2.5 免疫组织化学检测蛋白表达 |
| 1.2.6 免疫荧光检测组织蛋白表达 |
| 1.2.7 组织总RNA提取 |
| 1.2.8 细胞总RNA提取 |
| 1.2.9 逆转录 |
| 1.2.10 RT-q PCR |
| 1.2.11 Western blot实验 |
| 1.2.12 免疫荧光 |
| 1.2.13 统计学处理 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Nur77在小鼠纤维化心肌组织中的表达 |
| 1.3.2 Nur77在体外原代心肌成纤维细胞中的表达情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 调控Nur77对心肌成纤维细胞功能的影响 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 细胞来源 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代心肌成纤维细胞分离培养 |
| 2.2.2 293T细胞培养 |
| 2.2.3 腺病毒Ad Nur77、Ad NC扩增 |
| 2.2.4 腺病毒感染原代心肌成纤维细胞 |
| 2.2.5 si Nur77 RNA转染原代心肌成纤维细胞 |
| 2.2.6 细胞总RNA提取、逆转录及RT-q PCR |
| 2.2.7 Western blot实验 |
| 2.2.8 细胞计数法检测过表达Nur77对原代心肌成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.2.9 CCK-8 法检测过表达和敲减Nur77 对原代心肌成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.2.10 划痕法检测过表达或敲减Nur77对原代心肌成纤维细胞迁移的影响 |
| 2.2.11 Transwell法检测过表达或敲减Nur77对原代心肌成纤维细胞迁移的影响 |
| 2.2.12 细胞周期测定 |
| 2.2.13 细胞凋亡测定 |
| 2.2.14 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 过表达Nur77抑制原代心肌成纤维细胞增殖 |
| 2.3.2 过表达Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的细胞周期相关蛋白表达 |
| 2.3.3 过表达Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的原代心肌成纤维细胞表型转化和胶原合成 |
| 2.3.4 过表达Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的原代心肌成纤维细胞的迁移 |
| 2.3.5 过表达Nur77对原代心肌成纤维细胞凋亡数无影响 |
| 2.3.6 敲减Nur77促进原代心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达 |
| 2.3.7 敲减Nur77促进原代心肌成纤维细胞的增殖 |
| 2.3.8 敲减Nur77促进原代心肌成纤维细胞的迁移 |
| 2.3.9 敲减Nur77改变原代心肌成纤维细胞周期 |
| 2.3.10 敲减Nur77抑制原代心肌成纤维细胞凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 野黄芩苷调控Nur77对心肌成纤维细胞功能影响及相关机制研究 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 细胞来源 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原代心肌成纤维细胞分离培养 |
| 3.2.2 siRNA转染原代心肌成纤维细胞 |
| 3.2.3 细胞总RNA提取、逆转录 |
| 3.2.4 RT-qPCR实验 |
| 3.2.5 Western blot实验 |
| 3.2.6 CCK-8细胞增殖实验 |
| 3.2.7 Transwell实验 |
| 3.2.8 细胞免疫荧光 |
| 3.2.9 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞的增殖 |
| 3.3.2 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞的迁移 |
| 3.3.3 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达 |
| 3.3.4 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞表型转化 |
| 3.3.5 野黄芩苷对原代心肌成纤维细胞中Nur77及其磷酸化蛋白表达的调控 |
| 3.3.6 野黄芩苷通过ERK1/2/p38 MAPK信号通路调控Nur77 及其磷酸化蛋白表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 野黄芩苷调控Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化 |
| 4.1 .实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 小鼠心肌纤维化动物模型的制备 |
| 4.2.2 Masson’s trichrome染色 |
| 4.2.3 HE染色 |
| 4.2.4 免疫组织化学检测蛋白表达 |
| 4.2.5 组织总RNA提取、逆转录和RT-q PCR |
| 4.2.6 胶原面积半定量分析 |
| 4.2.7 Western blot实验 |
| 4.2.8 统计学处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 野黄芩苷调控Nur77 抑制ANG Ⅱ诱导的小鼠心肌组织中胶原沉积 |
| 4.3.2 胶原染色面积测定 |
| 4.3.3 野黄芩苷调控Nur77 抑制ANG Ⅱ诱导的心肌纤维化相关基因表达 |
| 4.3.4 野黄芩苷调控Nur77 及其磷酸化蛋白抑制ANG Ⅱ诱导的心肌纤维化 |
| 4.3.5 野黄芩苷对ANGⅡ激活的纤维化心肌组织中相关信号通路的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 综述 心肌纤维化发病机制及中医药防治研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 在校期间发表文章 |
| 附件 |
四、青霉素溶液对大鼠臀肌纤维化影响的实验观察（论文参考文献）
- [1]有氧运动调节AMPK相关信号通路减缓TAC诱导病理性心肌肥厚的机制研究[D]. 赵淋淋. 上海体育学院, 2021(09)
- [2]miR-489调控心肌纤维化的机制及人参皂苷Re的干预作用研究[D]. 孙敬辉. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响[D]. 王惠. 北京中医药大学, 2021(02)
- [4]Nur77转录调控GSK-3β影响老年心肌纤维化的机制研究[D]. 张添甜. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究[D]. 胡艳红. 中国中医科学院, 2020(01)
- [6]胰高血糖素样肽1对心肌重塑和心功能的保护作用及机制研究[D]. 郑荣华. 山西医科大学, 2020
- [7]补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究[D]. 孔繁达. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [8]微小RNA-122-5p和155-5p在芹菜素改善TGF-β1/Smads介导心肌纤维化中的作用研究[D]. 王峰. 苏州大学, 2020(06)
- [9]丹蛭降糖胶囊干预高糖诱导心肌纤维化的作用及机制研究[D]. 刘培培. 安徽中医药大学, 2020(03)
- [10]Nur77对心肌成纤维细胞功能影响及野黄芩苷调控Nur77抑制心肌纤维化相关研究[D]. 辛博. 上海中医药大学, 2019(03)