一、LRH-1/hBlF and HNFl synergistically up-regulate hepatitis B virus gene transcription and DNA replication（论文文献综述）
贺锐,刘实[1]（2019）在《宿主因子参与HBV cccDNA形成和转录》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是引起乙肝的病原体. HBV基因组是一个不完全双链环状DNA（relaxed circular DNA, RC-DNA）.当HBV在宿主细胞中复制时,首先RC-DNA需要转化为共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, ccc DNA）,后者作为HBV的转录模板,产生病毒的亚基因组和各种m RNA.其中,pg RNA作为逆转录模板逆转录负链DNA,继而合成正链DNA,最后组装成新的RC-DNA. ccc DNA的存在是干扰素（IFNs）、核苷类似物（NAs）等药物无法彻底消除乙肝抗原、治愈乙肝的重要原因. HBV ccc DNA的形成和转录过程受到许多宿主因子的调控,本文从乙肝病毒的感染和复制特征出发,总结了在各个过程中参与HBV ccc DNA形成和转录的宿主因子,对有关HBV ccc DNA形成的具体过程以及调控机制的研究具有一定指导意义.
何家琳[2]（2017）在《FXR上调miR-122的分子机制及在抗HCC中的作用研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内最普遍的恶性肿瘤之一。其诱发因素有多个,包括病毒感染、原癌基因激活、抑癌基因表达异常等。目前关于肝细胞癌的发病机制有待深入研究,而进一步阐明与肝细胞癌发病过程中密切相关的基因及其相互作用无疑将有助于加深对HCC发病机制的理解以及发现靶向治疗HCC的新靶点。近年来,与HCC密切相关的法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR）和microRNA日益受到重视。FXR属于核受体超家族成员,主要在肝脏、小肠、肾脏和肾上腺中表达,密切参与胆汁酸代谢、糖脂代谢,进而调节肝脏再生、肝纤维化等。大量的研究发现,FXR与HCC的发生发展密切相关。FXR作为一种多功能的转录因子,可调节多种肿瘤相关靶基因的表达和功能,进而发挥重要的抗HCC作用,但FXR的抗HCC机制尚不十分清楚,有待进一步的深入研究。mi R-122是一种在肝脏中特异性高表达的microRNA。在正常生理状态下,miR-122可以调控肝脏的细胞发育和细胞代谢,诱导细胞分化,并参与肝细胞应激应答等多种生命活动;而在病理状态下,mi R-122与HCC密切相关。研究发现,在HCC发生、发展过程中,mi R-122发挥着类似抑癌基因的作用,其主要通过抑制肿瘤相关基因的表达而发挥其抗肿瘤的功能。鉴于miR-122在抗HCC方面的重要作用,那么设法上调miR-122的表达,无疑将有助于肝癌的防治。目前的研究多集中在miR-122通过调节靶基因发挥抗肿瘤作用的机制方面,而关于miR-122自身的表达调控少有报道,最近的研究发现,一些转录因子（HNF4α、C/EBPα）可以促进miR-122的表达,但关于核受体FXR是否上调miR-122的表达,并通过此通路发挥抗HCC作用,目前未见报道。因此,结合相关文献和我们初步的研究结果,本课题率先鉴定了miR-122是FXR的一个新靶基因,揭示FXR促进mi R-122表达的具体分子机制;进而阐明“FXR-miR-122通路”在抗HCC作用中的新机制,为进一步深入而全面地揭示FXR的抗肝细胞癌机制以及miR-122自身的表达调控积累新的理论资料,为探索以“FXR-miR-122通路”为靶标的抗肿瘤治疗提供新的科学依据。目的:本研究从体内外探讨FXR上调miR-122的分子机制及“FXR-miR-122通路在抗HCC中的重要作用方法:1.收集20例hcc病人的肿瘤组织及癌旁组织,和7种hcc细胞系,经real-timepcr和westernblot实验,检测fxr与mir-122的表达,并通过相关性统计,分析fxr与mir-122表达的相关性。2.不同浓度fxr激动剂处理hcc细胞,以及采用rna干扰（rnainterference,rnai）,通过real-timepcr和westernblot实验检测mir-122以及mir-122靶基因igf-1r和cycling1的表达,研究fxr对mir-122表达的影响。3.应用生物信息学分析,预测人mir-122的5’调控区fxr的可能结合位点,构建含可能结合位点报告基因质粒,转染细胞经luc报告基因检测实验,初步确定fxr可能结合位点的所在区域。进一步采用凝胶迁移率实验（emsa）和染色质免疫沉淀实验（chip）,探讨fxr调节mir-122表达的具体分子机制。4.hcc细胞转染antagomir-122抑制mir-122功能后,采用cck-8法检测细胞的增殖情况。5.hcc细胞接种裸鼠成瘤后,以fxr的配体灌胃处理小鼠,一定时间后,在肝癌荷瘤鼠上观察肿瘤的生长情况,然后处死小鼠,切取肿瘤组织,real-timepcr和westernblot实验检测mir-122,igf-1r和cycling1的表达情况。免疫组化测定增殖标志物ki67的表达,在体内探讨“fxr-mir-122通路”的抗hcc作用。结果:1.fxr和mir-122在20例hcc病人肿瘤组织中的表达均显着低于癌旁组织,且相关性分析显示,fxr与mir-122的表达呈显着正相关;同样,相对于正常人肝细胞系l02,7种hcc细胞系中fxr和mir-122的表达也呈显着正相关。2.fxr激动剂处理hcc细胞活化fxr后,可显着增加mir-122的表达,并减弱其靶基因和igf-1r和cycling1的表达,同时,hcc细胞转染fxrsirna抑制fxr后,显着抑制了fxr激动剂诱导mir-122的表达。3.通过报告基因检测、emsa和chip实验证实了,fxr可通过直接结合于mir-122启动子区-338到-325的dr2反应元件,增强mir-122的启动子活性,进而促进mir-122的表达。4.细胞增殖检测实验显示,抑制mir-122后可显着减弱fxr对hcc细胞增殖的抑制作用。5.肝癌荷瘤鼠模型上,fxr可显着诱导mir-122的表达,并抑制其靶基igf-1r和cycling1的表达,进而抑制肿瘤生长。结论:FXR通过直接结合于miR-122启动子区的DR2（-338到-325）反应元件,促进mi R-122的表达,进而抑制肿瘤的生长,提示FXR/miR-122通路可能是防治HCC的新靶点。
李艳艳[3]（2016）在《胆汁酸受体FXR调节HBV的表达及分泌》文中研究指明背景乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）是部分双链的DNA病毒,目前全球约3.5亿人感染,长期慢性持续性感染可引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌。HBV感染具有组织特异性和种属特异性。HBV感染的嗜肝性与肝脏特异性受体及肝脏富集的转录因子有关。我国科学家李文辉在HBV的研究方面取得了重大突破,他发现了HBV感染肝细胞的功能性受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide,NTCP）。NTCP是由SLC10A1基因编码的,是分布在肝细胞表面的受体蛋白,它既是胆汁酸肝肠循环中胆汁酸进入肝细胞的重要受体,又是HBV进入肝细胞的受体。HBV感染可以抑制NTCP的功能,从而导致胆固醇代谢和胆汁酸代谢发生一系列改变。法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）属于核受体超家族中的一员,胆汁酸是FXR的内源性配体。FXR作为胆汁酸激活的核受体,通过调控一系列基因的表达,在脂代谢、糖代谢、胆汁酸代谢、肝脏保护、动脉粥样硬化、肠道菌群的生长和固有免疫中发挥重要的作用。然而,胆汁酸在HBV感染中的作用还不太清楚。HBV感染的患者,体内胆汁酸的合成增加,血清中总胆汁酸水平升高,这与转氨酶升高的趋势基本一致,并且使用熊脱氧胆酸治疗HBV感染也没有明显效果,所以,人们对胆汁酸在HBV感染中的作用一直不被重视,仅仅把它作为一个诊断指标而已。随着HBV受体的发现,人们对胆汁酸与HBV感染之间的关系也开始产生了浓厚的兴趣。目前,胆汁酸对HBV复制表达分泌过程及慢性持续性感染中的作用机制尚不清楚,为此,本文将初步研究胆汁酸受体FXR对HBV表达及分泌的影响。目的探讨胆汁酸及受体FXR对HBV转录表达及分泌的影响。方法（1）构建HBV增强子/启动子荧光素酶报告质粒pGL3-EN2/Cp,PCR扩增EN2/Cp片段,SacI和SmaI双酶切、纯化、连接、转化、测序。（2）在HepG2细胞中,共转染pAAV/HBV1.2,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,荧光显微镜观察转染效率,然后加CDCA刺激24小时和48小时,收集胞内蛋白及胞外上清液,ELISA检测HBsAg和HBeAg表达及分泌。（3）在HepG2细胞中,共转染pHY106+wta,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,CDCA刺激48小时,收集胞内蛋白及胞外上清液,ELISA检测HBsAg和HBeAg表达及分泌。（4）在HEK-293T细胞中,共转染pAAV/HBV1.2,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,CDCA刺激48小时,收集胞内蛋白及胞外上清液,ELISA检测HBsAg和HBeAg的表达及分泌。（5）在HepG2细胞中,共转染pAAV/HBV1.2,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,CDCA刺激48小时,提取细胞内总RNA,RT-PCR检测preC/pgRNA水平。（6）双荧光素酶报告基因分析,pGL3-EN2/Cp和pRL-TK或pFXR共转染于HepG2细胞中,CDCA处理48小时,通过双荧光素酶报告基因检测,分析FXR调控HBV转录的作用机制。（7）统计分析及作图。实验结果采用SPSS17.0软件进行独立样本t检验分析,P<0.05具有统计学意义。采用GraphPad Prism 5软件作图。结果（1）经测序和序列比对,成功构建pGL3-EN2/Cp质粒。（2）在转染pAAV/HBV1.2质粒的HepG2细胞中,CDCA处理24小时和48小时FXR显着促进HBeAg表达分泌（P<0.05）;FXR虽然促进胞内HBsAg表达（P<0.05）,但是细胞上清液中HBsAg含量无差异（P>0.05）。（3）在转染pAAV/HBV1.2质粒的HEK-293T细胞中,CDCA处理48小时,FXR显着促进HBeAg和HBsAg表达和分泌（P<0.05）。（4）在转染pHY106+wta质粒的HepG2细胞中,CDCA处理48小时,FXR显着促进HBeAg表达（P<0.05）。（5）在转染pAAV/HBV1.2质粒的HepG2细胞中,RT-PCR检测结果显示FXR促进preC/pgRNA基因表达（P<0.05）。（6）双荧光素酶报告分析显示,FXR与HBV核心启动子EN2/Cp结合,荧光素酶活性是对照组的5倍,显着促进萤火虫荧光素酶表达（P<0.05）。结论HBV感染导致胆汁酸水平的升高,胆汁酸受体FXR活化后调控HBV转录表达及分泌过程,本研究初步得出以下结论:（1）在HepG2细胞中,FXR促进了HBeAg的表达和分泌。（2）在HepG2细胞中,FXR促进胞内HBsAg表达,而胞外HBsAg的分泌水平没有差异。FXR相对的抑制了HBsAg的分泌。（3）荧光素酶报告基因分析和RT-PCR实验证明FXR在转录水平促进HBV表达。
王博[4]（2016）在《肝细胞CUL4B调控HBV复制和肝脏免疫微环境的作用研究》文中研究指明研究背景：乙肝病毒（HBV）感染是一个全球性的公共安全问题,慢性乙肝病毒感染导致严重的肝脏疾病,包括失代偿的肝硬化和肝癌等,严重威胁人类健康。我国处于乙肝病毒感染的高发区,因此阐明HBV的复制机制、发现清除病毒感染、控制疾病进程的潜在靶点是目前亟待解决的一个重要科学问题。CUL4B是CUL4B-RING-E3泛素连接酶复合体（CRL4B）的骨架蛋白,能够介导不同的底物蛋白泛素化修饰,参与调控多种生命活动过程,如：DNA复制和损伤修复,染色质重塑,细胞周期调控,胚胎发育,造血与生精等。本实验室的前期结果已证明,CUL4B能够促进HBV的复制,而对于乙肝病毒蛋白是否参与了CUL4B对HBV复制的调控以及确切机制仍不是很清楚。同时,肝脏作为乙肝病毒感染的主要靶器官,含有大量免疫细胞,因此也被认为是一个重要的免疫器官。在HBV感染的过程中,肝细胞本身除直接参与HBV复制过程外,尚可通过调控肝脏中多种免疫细胞的功能,影响机体清除病毒的免疫应答水平,与乙肝病毒感染的预后密切相关。因此本课题也对HBV感染模型中肝细胞CUL4B对局部免疫细胞功能的调节进行了初步探究。研究目的：1.研究HBV编码的病毒蛋白在CUL4B对HBV复制调控中的作用及机制。2.探索肝细胞CUL4B对肝脏免疫功能的调节作用。研究方法：1.肝细胞CUL4B调控HBV复制的机制研究1.1病毒蛋白Polymerase在CUL4B调控HBV复制中的作用1.1.1验证Polymerase蛋白在HBV复制中的作用构建Polymerase表达缺失质粒pcDNA3-HBV1.1 （ΔPol）。分别将pcDNA3-HBV1.1 （Polymerase蛋白野生型组）、pcDNA3-HBV1.1 （ΔPol） （Polymerase表达缺失组）、pcDNA3-HBV1.l（ΔPol）联合pcDNA3-Polymerase （Polymerase拯救组）转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA、收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,验证Polymerase在HBV复制中的作用。1.1.2分析Polymerase在CUL4B调控对HBV复制中的作用将CUL4B过表达质粒或其对照质粒与pcDNA3-HBV1.1、pcDNA3-HBV1.1（Δ Pol）、pcDNA3-HBV1.1 （ΔPol）联合pcDNA-Polymerase共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA、收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,分析Polymerase在CUL4B调控HBV复制中的作用。1.2病毒蛋白HBc在CUL4B调控HBV复制中的作用1.2.1验证HBc蛋白在HBV复制中的作用构建HBc表达缺失质粒pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBc）,将pcDNA3-HBV1.1 （HBc蛋白野生型组）、pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBc） （HBc表达缺失组）、HBV1.1（ΔHBc）联合pcDNA3-HBc （HBc拯救组）共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA,收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,验证HBc蛋白在HBV复制中的作用。1.2.2分析HBc蛋白在CUL4B调控HBV复制中的作用将CUL4B过表达质粒或对照质粒分别与pcDNA3-HBV1.1,pcDNA3-HBV1.1（Δ HBc）、pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBc）联合pcDNA3-HBc共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA,收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,分析HBc蛋白在CUL4B调控HBV复制中的作用。1.3HB3x蛋白在CUL4B调控HBV复制的作用研究1.3.1分析HBx蛋白对CUL4B表达的影响首先,课题检测了HBx蛋白对CUL4B表达本身的影响。将HBV全基因组、HBx、HBc、preS2等不同片段的过表达质粒及对照质粒转染入HepG2田胞,提取RNA进行RT-PCR,检测CUL4B mRNA表达水平；提取细胞蛋白进行Western blot,检测CUL4B的蛋白表达水平,分析HBx蛋白对CUL4B表达的影响。1.3.2体外研究HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用将CUL4B siRNA及对照siRNA分别与pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx） （HBx蛋白表达缺失组）或pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）联合pcDNA3-HBx （HBx拯救组）共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA,收取培养上清ELISA检测HBsAg, HBeAg等病毒复制指标,分析HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用。1.3.3体内研究HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用选取周龄为6～8周龄、雄性肝脏特异性Cul4b基因敲除小鼠（C57BL/6品系,Alb-Cre+/-;Cul4bflox/y）及其相应野生型小鼠（Cul4bflox/y）,尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1（ΔHBx）或pcDNA3-HBV1.1 （ΕHBx）联合pcDNA3-HBx,取外周血,用ELISA方法检测其血清HBsAg水平,采用real time-PCR方法检测血清HBV DNA水平,体内分析HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用1.4 CUL4B对HBV cccDNA微染色质组蛋白修饰的影响已有文献显示,CUL4B通过调控组蛋白甲基化和泛素化修饰,进而调节宿主基因的表达,参与肿瘤发生。同时,有研究报道,HBV cccDNA通过与组蛋白结合,以微染色质的形式存在细胞核中,而组蛋白修饰状态与HBV复制水平密切相关。因此,本课题研究了CUL4B是否能与HBV cccDNA结合,以及是否能够影响HBV cccDNA微染色质组蛋白修饰状态?1.4.1 CUL4B与HBV cccDNA的结合状态采取文献中的方法,将prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HuH-7细胞,构建重组HBV cccDNA模型。提取HBV cccDNA,采用染色质免疫共沉淀（ChIP）的方法验证CUL4B是否能够与cccDNA相结合。1.4.2 CUL4B对HBV cccDNA微染色质中组蛋白修饰状态的影响将CUL4B siRNA或对照siRNA分别与prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HuH-7细胞,提取HBV cccDNA,采用ChIP-qPCR方法检测CUL4B表达对HBV cccDNA组蛋白乙酰化、甲基化修饰水平的影响。2.肝细胞CUL4B寸肝脏免疫微环境的影响2.1建立小鼠急性HBV感染模型选取周龄为6～8周的雄性肝脏特异性Cul4b基因敲除小鼠（C57BL/6品系,Alb-Cre;Cul4bflox/y）及其相应野生型小鼠（Cul4bflox/y）,尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1全基因组表达质粒,构建HBV急性感染模型。pcDNA3质粒注射小鼠作为对照组。注射24h后收取外周血,realtime PCR检测血清HBV DNA的表达水平,比色法检测血清ALT水平。2.2肝细胞CUL4B表达对肝NK细胞和NKT细胞比例的影响取上述小鼠模型肝脏,研磨,用percoll法提取肝单个核细胞,流式细胞术检测NK细胞和NKT细胞在肝单个核细胞中所占的比例,统计在HBV急性感染模型及对照组中,肝细胞Cul4B敲除对肝NK细胞和NKT细胞的影响。2.3肝细胞CUL4B表达对肝脏NK细胞和NKT细胞IFN-γ分泌的影响取上述小鼠模型肝单个核细胞,胞内染色、流式细胞术检测NK细胞和NKT细胞IFN-γ的分泌情况。2.4肝细胞CUL4B表达对肝脏NK细胞表面活化受体表达的影响取上述小鼠模型肝单个核细胞,表面标记、流式细胞术检测NK细胞表面活化受体CD69、NKG2D的表达情况。研究结果1. CUL4B调控HBV复制的机制研究1.1病毒蛋白Polymerase不参与在CUL4B对HBV复制的调控作用1.1.1验证Polymerase蛋白在HBV复制中的作用成功构建了Polymerase蛋白表达缺失的HBV表达载体,并将其转染入HepG2细胞,检测HBV复制指标,结果显示Polymerase蛋白表达缺失可显着抑制HBV复制。1.1.2分析Polymerase在CUL4B调控对HBV复制中的作用将野生型或Polymerase蛋白表达缺失的HBV表达载体与CUL4B表达质粒共转染入HepG2细胞。结果显示,CUL4B过表达可显着提高野生型、Polymerase蛋白表达缺失型HBV病毒pgRNA水平和细胞培养上清中HBsAg水平,提示Polymerase并不参与CUL4B对HBV复制的调控过程。1.2病毒蛋白HBc不参与CUL4B对HBV复制的调控作用1.2.1验证HBc蛋白在HBV复制中的作用成功构建了HBc蛋白表达缺失的HBV表达载体,并将其转染入HepG2细胞,检测HBV复制指标,结果显示HBc蛋白表达缺失均可显着抑制HBV复制。1.2.2分析HBc蛋白在CUL4B调控HBV复制中的作用将野生型或HBc蛋白表达缺失的HBV表达载体与CUL4B表达质粒共转染入HepG2细胞。结果显示,CUL4B过表达可显着提高野生型、HBc蛋白表达缺失型HBV病毒pgRNA水平和细胞培养上清中HBsAg水平,提示HBc并不参与CUL4B对HBV复制的调控过程。1.3 HBx蛋白在CUL4B调控HBV复制的作用研究1.3.1 HBx蛋白上调肝细胞中CUL4B表达分别将HBV全基因组以及HBx、HBc、preS2等不同病毒蛋白过表达质粒或其对照质粒转染入HepG2细胞后,PCR及Western blot结果显示,HBx能够显着提高肝癌细胞中CUL4B mRNA和蛋白水平的表达。1.3.2体外实验证明HBx蛋白在CUL4B促进HBV复制中发挥重要作用将CUL4B siRNA及对照siRNA分别与pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）质粒或pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）联合pcDNA3-HBx质粒共同转染入HepG2细胞,PCR及ELISA结果显示,干扰CUL4B对于pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）转染组pgRNA和HBsAg水平无显着影响,但却可显着抑制pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）联合pcDNA3-HBx质粒共转染组中的pgRNA和HBsAg水平,提示HBx在CUL4B促进HBV复制中发挥重要作用。1.3.3体内实验进一步验证HBx参与CUL4B4进HBV复制的作用选取周龄为6～8周的雄性、肝脏特异性Cul4b基因敲除小鼠（C57BL/6品系,Alb-Cre;Cul4bflox/y）及其相应野生型小鼠（Cul4bflox/y）,分别尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）质粒和pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）联合pcDNA3-HBx质粒,ELISA及real time-PCR分别检测血清中HBV DNA和HBsAg水平。结果显示,肝细胞Cul4b基因敲除对于pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）注射组血清HBV DNA和HBsAg水平无明显影响,却可显着抑制pcDNA3-HBV1.1 （ΔHBx）联合pcDNA3-HBx注射后血清HBV DNA和HBsAg的水平,在体内进一步证实HBx参与了CUL4B促进HBV复制的过程。1.4 CUL4B可以影响HBV cccDNA为染色质组蛋白修饰1.4.1 CUL4B可以与HBV cccDNA相结合采取文献中的方法将prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HepG2或HuH-7细胞,构建重组cccDNA模型。染色质免疫共沉淀（ChIP）结果显示,CUL4B可以与HBV cccDNA相结合。1.4.2 CUL4B可提高HBV cccDNA结合的组蛋白H3乙酰化水平将CUL4B siRNA或对照siRNA分别与prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HepG2细胞或HuH-7细胞。ChIP-qPCR结果显示,在CUL4B干扰组细胞中,HBVcccDNA结合的组蛋白H3水平无显着变化,但结合的乙酰化,H3 （Ac-H3）水平显着下降,并且其中H3K27Ac水平的降低尤为明显。同时乙酰转移酶CBP、P300与cccDNA的结合也显着下降。以上结果初步提示,CUL4B可以提高HBV cccDNA结合的组蛋白H3乙酰化水平。1.4.3 CUL4B可影响HBV cccDNA结合的组蛋白甲基化水平将CUL4B siRNA及对照siRNA分别与prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HepG2细胞后。ChIP-qPCR结果显示,CUL4B干扰后,HBV cccDNA结合的H3K27Me3水平显着降低,而H3K4Me3水平有所升高。2.肝细胞CUL4B对肝脏免疫微环境的影响2.1应用Alb-Cre Cu14bfl0x/y肝特异性Cul4b基因敲除小鼠构建急性HBV感染模型采用周龄为6～8周的雄性肝特异性Cul4b基因敲除鼠及相应野生型小鼠,尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1全基因组表达质粒,构建急性HBV感染模型。pcDNA3质粒注射小鼠作为对照组。注射24h后收取外周血,realtime PCR检测血清HBV DNA的表达水平,证实急性肝炎模型构建成功。2.2肝细胞CUL4B对肝脏NK细胞和NKT细胞比例无明显影响取肝脏,研磨,用percoll法提取肝单个核细胞,进行流式细胞术检测NK细胞和NKT细胞在肝单个核中所占比例。结果显示,无论是pcDNA3注射组还是HBV质粒注射组,肝NK细胞和NKT细胞比例在肝特异性Cul4b基因敲除鼠及相应野生型小鼠无明显差异。2.3肝细胞CUL4B上调HBV感染模型中肝NK细胞IFN-γ的分泌流式细胞术检测上述小鼠模型中肝NK细胞和NKT细胞IFN-γ的情况。结果显示,pcDNA3或HBV质粒注射后,肝NKT细胞IFN-γ的产生在两组小鼠间无明显差异。而在HBV感染模型中,肝特异性敲除CUL4B能够导致小鼠肝脏内NK细胞IFN-γ的分泌显着高于野生型小鼠,但在pcDNA3注射组,两组小鼠NK细胞IFN-γ的分泌无显着性差异。2.4肝细胞CUL4B上调HBV感染模型中肝NK细胞活化受体表达流式细胞术检测肝NK细胞表面CD69、NKG2D受体的表达,结果发现,HBV质粒注射组中,肝特异性敲除Cul4b基因小鼠肝脏NK细胞活化性受体CD69和NKG2D表达比例的显着高于野生型小鼠,而pcDNA3注射小鼠,两组小鼠NK受体表达无明显差异。以上结果提示,肝细胞CUL4B可能通过调控肝脏免疫微环境进而调控HBV复制。研究结论与意义1.在前期工作的基础上,利用体内外实验进一步证实病毒蛋白HBx在CUL4B调控HBV复制中发挥重要作用,而polymerase口HBc蛋白未见明显作用。2.首次证实CUL4B可以结合HBV cccDNA,且可以通过影响结合的组蛋白甲基化/乙酰化水平调控HBV的复制3.首次发现肝细胞CUL4B可以调控肝脏NK细胞的活化和细胞因子分泌,进而影响HBV感染后的病毒清除机制。
任吉华[5]（2016）在《沉默信息调节因子1（SIRT1）在HBV复制调控中的作用及机制研究》文中指出背景:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是导致急慢性肝炎的关键因素,并可逐步发展为肝硬化和肝癌,每年约有100万人死于HBV相关的各种终末期疾病,HBV感染已成为威胁人类健康的重要病因。因此,防治HBV感染的工作显得尤为重要。目前,HBV疫苗已得到广泛使用,干扰素和核苷酸类似物已用于临床治疗乙型肝炎,但分别存在疫苗接种失败、副反应严重和耐药等缺点,所以阐明HBV复制调控的分子机制,鉴定HBV感染过程中的关键宿主因子,寻求新的药物治疗靶点具有非常重要的意义。SIRT1是依赖于烟碱胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,也是HBV cccDNA微染色体的组成成分之一,SIRT1与多种细胞功能密切相关,越来越多的报道显示其可调节病毒在体内的感染过程,但是SIRT1可否直接调控HBV的生活周期尚不十分明确。目的:1.研究SIRT1对HBV复制和转录的影响。2.阐明SIRT1调控HBV感染的分子机制。3.在体内外研究SIRT1抑制剂对HBV复制的影响。1.qrt-pcr和westernblot检测hbv稳定复制细胞系（hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1）与对照细胞（phh和hepg2）中sirt1的mrna和蛋白水平,进一步检测hbv瞬时表达对sirt1的mrna和蛋白表达水平的影响。2.在hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞中转染慢病毒介导的靶向沉默sirt1表达的shrna（shcont、shsirt1-1、shsirt1-2）或sirt1过表达质粒,real-timepcr和southernblot检测sirt1沉默或过表达对hbvdna复制中间体表达水平的影响,qrt-pcr分析sirt1沉默或过表达对hbv3.5kbmrna转录的影响,westernblot和elisa分别检测sirt1沉默或过表达对hbvcoreprotein（hbc）和hbsag、hbeag分泌的影响。3.real-timepcr和southernblot检测sirt1沉默对转染pgem-hbv1.3或环化hbv的huh-7细胞中hbv复制的影响。4.hepg2细胞中共转染hbv启动子和过表达sirt1质粒,双荧光素酶报告系统分析过表达sirt1对hbv启动子活性的影响,并检测sirt1沉默对hbvcp启动子活性的影响5.hepg2.2.15细胞中沉默sirt1的表达,qrt-pcr筛选受sirt1调控的与hbv转录有关的转录因子,westernblot进一步检测sirt1对目标转录因子ap-1亚基c-jun蛋白水平表达的影响。6.染色质免疫共沉淀技术（chip）分析c-jun与hbvcp有无结合。7.突变c-jun与pgem-hbv1.3中hbvcp的结合位点,real-timepcr和southernblot检测sirt1对突变型hbvdna复制中间体表达方法:的影响。8.在hepg2细胞中通过双荧光素酶报告系统分析c-jun沉默对sirt1促进hbvcp启动子活性的影响,real-timepcr和southernblot检测c-jun沉默对sirt1增加hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞中hbvdna复制中间体表达水平的影响。9.mts实验分析sirt1抑制剂nicotinamide在hepad38和hepg2.2.15细胞中的cc50。10.在hepad38和hepg2.2.15细胞中加入不同浓度的nicotinamide,real-timepcr和southernblot检测nicotinamide对hbvdna复制中间体表达水平的影响,qrt-pcr分析nicotinamide对hbv3.5kbmrna转录的影响,westernblot和elisa分别检测nicotinamide对hbvcoreprotein（hbc）表达和hbsag、hbeag分泌的影响。11.在hbv转基因小鼠（c57bl/6j）中,通过尾静脉注射不同浓度的nicotinamide溶液,微板法检测小鼠血清中ast和alt水平,real-timepcr分析小鼠血清和肝组织中hbvdna水平,elisa检测小鼠血清中hbsag、hbeag水平。结果:1.sirt1的mrna水平（p<0.05）和蛋白水平在hbv稳定复制细胞系中明显高于对照细胞,hbv瞬时表达后sirt1的mrna水平（p<0.05）和蛋白水平也显着增加。2.sirt1沉默可显着抑制hbv复制细胞（hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞）中hbvdna复制中间体（p<0.01）、hbv3.5kbmrna（p<0.01）、hbc的表达水平,hbsag和hbeag的分泌水平（p<0.05）;过表达sirt1则明显促进了hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞中hbvdna复制中间体（p<0.01）、hbv3.5kbmrna（p<0.01）的表达水平、及hbsag和hbeag的分泌（p<0.05）。3.在转染pgem-hbv1.3或环化hbv的huh-7细胞中sirt1沉默显着抑制了hbvdna复制中间体的表达水平（p<0.05）。4.sirt1过表达可明显促进hbvcp的启动子活性（p<0.001）,而对hbvspi、spii、xp的启动子活性无显着影响;sirt1沉默可显着抑制hbvcp的启动子活性（p<0.001）。5.hepg2.2.15细胞中sirt1沉默明显下调了转录因子ap-1亚基c-jun的mrna水平（p<0.01）和蛋白水平,sirt1过表达明显促进了c-jun的蛋白表达水平。6.c-jun可结合于hbvcp区域。7.pgem-hbv1.3中ap-1位点突变后,sirt1不能发挥增强hbv复制的作用。8.c-jun沉默减弱了sirt1对hbvcp启动子活性和hbv复制中间体表达的促进作用。9.nicotinamide在hepad38和hepg2.2.15细胞中的cc50分别是36.38mm和44.44mm。10.nicotinamide处理显着抑制了hepad38和hepg2.2.15细胞中hbvdna复制中间体（p<0.05）、hbv3.5kbmrna（p<0.01）、hbc的表达水平,及hbsag和hbeag的分泌水平（p<0.05）。11.Nicotinamide处理对小鼠血清中AST和ALT的水平无明显影响;不同浓度的nicotinamide处理可以浓度梯度依赖的方式下调小鼠血清中HBV DNA拷贝数（P<0.05）及HBsAg和HBeAg水平（P<0.05）;nicotinamide处理组小鼠肝组织中HBV DNA拷贝数显着低于未处理组（P<0.05）。结论:在本研究中,我们阐明了SIRT1在HBV复制中的作用。研究数据显示SIRT1表达水平在HBV复制细胞中显着上调;SIRT1沉默或过表达能调控HBV复制。此外,SIRT1可通过转录因子AP-1增强HBVCp启动子活性。上调SIRT1的表达;SIRT1增加转录因子AP-1的表达,增强HBV Cp的活性,从而促进HBV的转录和复制;SIRT1抑制剂nicotinamide在不导致细胞毒性或肝损伤的情况下抑制了HBV稳定表达细胞系和HBV转基因小鼠中HBV的复制。
郝瑞栋[6]（2015）在《肝细胞核因子6抑制乙型肝炎病毒基因表达和复制及其机制的研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（HBV）是一种小的包膜病毒,其慢性感染会导致多种肝脏疾病包括肝炎、肝纤维化、乃至肝细胞癌。当前全球范围内有3.5亿人左右的慢性HBV携带者,其中约有1亿人位于中国。尽管当前已经有有效的HBV疫苗,慢性HBV感染依然是全球卫生医疗体系的重要负担。当前治疗HBV的主要药物为干扰素以及核苷类似物,但是这些方法有较强的副作用或者易产生耐药性,并且都不能够治愈慢性HBV感染或者说不能够从病人肝脏中清除HBV。所以,当前应该更加深入的研究HBV的复制以及病毒-宿主互作以促进开发新的抗HBV的治疗方法。HBV属于嗜肝病毒科（Hepadnaviridae）,正嗜肝病毒属（orthorHepadnavirus）,能够特异性的在人类的肝脏中复制,其复制受到多种宿主普遍存在的转录因子以及肝脏富集性转录因子的调控。肝脏富集的转录因子包括肝细胞核因子（HNFs）, CCAAT/原件结合蛋白（C/EBPs）,D位点结合蛋白（DBPs）等。其中,HNF1、 HNF3、 HNF4和C/EBPalpha已经被证明可以在转录或者转录后水平影响病毒的基因表达以及复制。在本研究中,我们证明了肝细胞核因子6（HNF6）能够抑制病毒的基因表达和DNA复制。在肝癌细胞系中过表达HNF6可以抑制HBV的分泌性抗原HBsAg、 HBeAg、以及病毒RNA的表达水平,同时HNF6还可以降低HBV复制中间体DNA的水平。通过shRNA下调HNF6的表达可以促进HBV的基因表达和复制。进一步的机制研究发现,HNF6可以抑制病毒SP2启动子活性从而导致HBsAg表达的下调。SP2启动子上的顺式元件（nt 3009-3019）对于HNF6抑制SP2启动子的作用是关键的。另一方面,我们还证明了HNF6可以在转录后水平影响病毒RNA的水平。深入研究发现,HNF6可以加速HBV前基因组RNA的降解,使其半衰期减少近3个小时,但是这种促进降解的作用并不依赖于La蛋白。另外HNF6抑制HBV RNA的作用主要发生在细胞核内。通过截短突变体实验证明了HNF6蛋白的N端是主要起到抗HBV作用的区域。最后,我们通过小鼠尾静脉高压注射模型证明了HNF6可以在体内抑制HBV的基因表达以及DNA复制。综上所述,本研究发现了HNF6可以通过转录以及转录后的机制来抑制HBV的复制。这一结果加深了我们对于HBV与宿主细胞相互作用以及HBV复制转录调控机制的理解。
宋梅[7]（2014）在《维甲类X受体alpha调控乙型肝炎病毒感染机制研究》文中指出乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的重大公共卫生问题,全球约有两亿四千万慢性乙肝感染者,这些人都有发展为肝衰竭、肝硬化以及肝癌的高风险。我们先前的研究发现钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）是HBV及其卫星病毒丁型肝炎病毒（HDV）的功能性受体。NTCP是肝脏中重要的胆酸转运蛋白,其表达主要在肝脏中,并受到由多种转录因子组成的复杂网络的调节。已知维甲类X受体alpha（RXRα）和法尼醇X受体（FXR）是肝细胞富集型的核受体蛋白,在胆酸代谢中发挥重要作用。RXRα在众多核受体中非常独特,是其它二型核受体,如维甲酸受体（RAR）和FXR等,共同的专性异源二聚体伴侣蛋白。RXRa缺失的小鼠胚胎致死,在成人肝脏中RXRα是三个亚型中表达最高的,表明其可能发挥重要作用。我们发现在树鼩原代肝细胞（PTH）及稳定转染了人NTCP的HepG2细胞（HepG2-hNTCP）中,用siRNA降低RXRα的表达能显着促进HBV的感染,而用RXRα的激动剂贝莎罗汀（Bexarotene）处理细胞,能浓度依赖地抑制HBV感染,但HBV接种后降低RXRα的表达或用贝莎罗汀激活RXRα对病毒感染影响甚微。在RXRα众多肝细胞富集型的伴侣蛋白中（包括FXR、RARα、LXRα等）,仅肝X受体alpha（LXRα）具有与RXRα相同的效应---负调控HBV早期感染,RXRα可能通过与LXRα的相互作用调节HBV感染。进一步的实验表明,贝莎罗汀处理能抑制HepG2-hNTCP细胞中[3H]-牛磺胆酸的摄取,而降低RXRa的表达能促进[3H]-牛磺胆酸的摄取,同时增强NTCP的蛋白表达。RXRα是肝脂质代谢的主要调控因子,RNA-seq和质谱分析结果表明在缺失RXRα时,细胞内花生四烯酸代谢途径整体下调。前列腺素是由花生四烯酸产生的一系列脂类介质,参与调节多种感染性疾病。我们发现抑制前列腺素合成途径中两个关键合酶PTGES和PTGDS,能增强HBV早期感染。这些工作能为我们研究HBV感染的调节机制提供新的认识和思路,同时表明调节RXRα的活性可能帮助治疗HBV感染。
秦骏[8]（2005）在《核受体LRH-1辅因子Prox1的生物学功能研究》文中研究指明核受体hLRH-1（hB1F/NR5A2）是本实验室在乙肝病毒增强子II的研究中克隆的一个转录因子,属于核受体FTZ-F1亚家族的成员。近年来LRH-1功能的研究迅速进展,目前已知LRH-1在胆汁酸合成代谢途径、肝脏特异性基因表达的调控网络以及乙肝病毒基因表达和复制中发挥着关键作用。其中在胆汁酸代谢平衡中LRH-1扮演重要角色,它调控着催化胆汁酸合成（胆固醇分解）经典途径的限速酶—CYP7A1的表达。为了深入了解LRH-1转录激活的分子机制,我们对LRH-1的辅因子进行了研究。 第一部分:Prox1 作为LRH-1 的辅抑制子抑制胆固醇7-α-羟化酶的表达利用酵母双杂交的方法我们筛选得到hLRH-1相互作用蛋白Prox1（prospero-related homeobox transcription factor）。在细胞水平上,证明过表达Prox1能够通过蛋白间相互作用的机制抑制CYP7A1的表达,由此得出了Prox1是hLRH-1特异性辅抑制子的结论。并通过生化实验精确地定位了两者之间的相互作用的区段。报告基因分析的结果表明Prox1 可以分别通过与hLRH-1 的DBD 或LBD 结构域的相互作用而单独行使抑制功能。电泳迁移率改变实验显示Prox1 能够在体外抑制hLRH-1 结合靶基因的能力。上述研究不仅对深入了解LRH-1 转录激活的分子机制以及其体内的生物学功能有重要意义,也为Prox1 体内参与胆汁酸合成代谢途径提供了理论基础。 第二部分:Prox1 通过多个调控元件抑制乙型肝炎病毒HBV 的表达和复制Prox1属于同源异型蛋白家族中的一员,体内具有重要的生物学功能,国际上的研究表明它在淋巴血管建立和眼睛晶状体形成中发挥重要的作用。由于hLRH-1是在研究乙型肝炎病毒（HBV）基因表达调控时首先被克隆,它能够调控HBV ENII/Cp（Enhancer II/Core Promoter of HBV）启动子的活性。本部分的工作对hLRH-1辅抑制子Prox1在HBV基因表达和DNA复制中的作用进行了研究。首先,Prox1通过与hLRH-1相互作用显着抑制HBV ENII/Cp启动子的活性;其次,Prox1可以通过与肝细胞富集的转录因子HNF-1直接相互作用,抑制HNF-1对
杨艳杰[9]（2004）在《乙型肝炎病毒EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ结合蛋白的研究》文中研究指明目的：研究与HBV的调控基因EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ结合的肝细胞特异性蛋白质因子，以进一步了解HBV嗜肝性的分子生物学机制，为探索特异性更强的基因治疗技术奠定基础及进一步的治疗应用创造条件。 方法：（1）应用噬菌体表面展示技术分别以生物素化的HBV增强子Ⅰ（EnhⅠ）、HBV表面抗原启动子Ⅰ（SPⅠ）、HBV表面抗原启动子Ⅱ（SPⅡ）PCR产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”过程，经噬斑的PCR扩增后，构建T-A克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索，确定EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ DNA结合蛋白。（2）将筛选到的HBV SPⅡ结合蛋白之一的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基4（NADHDH4），根据其全基因编码序列，设计引物，以人肝癌细胞基因组为模板，经PCR得到NADHDH4的全基因编码序列，将其构建到真核表达载体pcDNA3.1（-）中。将HBV SPⅡ启动子构建到氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因载体中，二者共转染人肝癌细胞系HepG2，用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达。 结果：（1）噬菌体经富集后，从随机筛选的12个克隆中得到6个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了和HBV EnhⅠ结合的肝细胞蛋白，共编码3种蛋白。分别为3-磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶、人类血清白蛋白、核膜孔复合体相互作用蛋白。（2）经4轮生物筛选后，随机挑选的14个克隆中得到8个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了和HBV SPⅠ特异结合的肝细胞蛋白，共编码7种蛋白。其中3个克隆编码未知功能蛋白；其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白。（3）通过生物筛选结合生物信息学分析，确定了和HBV SPⅡ特异结合的肝细胞蛋白，11个阳性克隆共编码7种蛋白。其中2个克隆编码未知功能蛋白；其余的克隆分别编码PCTARIE蛋白激酶2、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基4、人血清白蛋白、α1微球蛋白、复制蛋白等蛋白。（4）成功构建了HBV SPⅡ的报告基因载体和NADHDH4的真核表达载体。用CAT ELISA法测量结果：pCAT3-SPⅡ实验组CAT酶的表达是pCAT3 basic的1.4倍，而pcDNA3.1（-）-NADHDH4+pCAT3-SPⅡ实验组酶的表达是pCAT3-SPⅡ的近2.8倍。第三军医大学硕士学位论文 结论:1、利用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到了与HBV Enhl结合的蛋白，分析了该蛋白的编码基因，可能是作用于Enhl的反式作用因子，但它们对HBV增强子I是否有转录调控作用还需进行进一步的研究证实;2、用噬菌体表面展示技术筛选得到了7种HBv SPI的结合蛋白，分别为3个未知功能蛋白和4一氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白。结合蛋白与HBV SPI之间的相互作用，还需体外结合和共转染实验进一步证实;3、筛选得到了与HBV SPn特异结合的7种蛋白质，利用生物信息学分析分别为2个未知功能蛋白和PCTARIE蛋白激酶2、尼克酞胺腺嗓吟二核营酸脱氢酶亚基4、人血清白蛋白、al微球蛋白、复制蛋白等蛋白，并推测其可能是作用于SPn的反式作用因子，为今后更好地了解HBV的转录调控机制及生活史提供了线索;4、通过共转染实验证实NADHDH4对HBV SPn有明显上调作用。
王水良[10]（2003）在《人核受体nr5a2（hblf）转基因小鼠的建立及其分析》文中研究指明核受体（nuclear receptor）是与类固醇激素受体同源的一类配体依赖性转录因子超家族；机体的生长发育、细胞分化以及体内许多生理、代谢过程都可归因于核受体与相应配体及众多辅调节因子相互作用所调控的基因网络的协调表达。人核受体hB1F（human B1 binding factor）是中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所在研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）基因的转录调控中克隆到的一个肝脏富集的转录因子，它能够特异结合HBV增强子Ⅱ（enhancerⅡ，ENⅡ）的B1区段并激活ENⅡ的功能。氨基酸序列分析发现，hB1F是核受体超家族Ftz-F1（fush tarazu factor Ⅰ）亚家族的新成员，为一孤儿受体，根据1999年提出的命名原则被正式命名为NR5A2。 对hB1F（NR5A2）以及其他生物中的同源基因的功能研究发现，它对多种肝脏特异基因如α-甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）和α1-抗胰蛋白酶（alphal-antitrypsin）基因的表达具有重要的调控作用；此外，NR5A2还参与调控肝富集转录因子基因hnfl α、hnf3 β和hnf4 α的表达。近年的实验则表明，NR5A2可激活胆汁酸生物合成途径中两个重要酶即胆固醇7-α羟化酶（cholesterol 7-αhydroxylase,CYP7A1）和甾醇12-α羟化酶（sterol 12-α hydroxylase,CYP8B1）基因表达，因而在生物体的胆固醇代谢平衡调节中发挥重要作用。鉴于NR5A2基因敲除小鼠为早期胚胎致死，提示该基因可能在生物体的早期发育中也具有极其重要的作用。为进一步深入研究NR5A2的生理功能，本研究通过原核显微注射法构建nr5a2转基因小鼠。 论文第一部分，将含人hb1fcDNA的质粒pcDNA3-hb1f显微注射入653颗小鼠受精卵的雄原核并回输至24只假孕受体母鼠输卵管，其中13只怀孕并产下97只仔鼠（雌性45，雄性52）。经PCR法鉴定，共获得11只阳性候选Founder鼠，PCR阳性率为11.3％。进一步对PCR阳性的小鼠基因组DNA作Southern blot杂交鉴定，其中7只呈阳性，阳性率为7.2％。以PCR和Southern blot双阳性的hb1f转基因小鼠为Founder鼠，分别将其与正常C57小鼠杂交以建立转基因小鼠品系（命名为TGM-1、TGM-2、TGM-3、TGM-4、TGM-5、TGM-6和TGM-7）。F1和F2代的PCR鉴定结果表明，7个Founder鼠的转基因都可稳定遗传给后代；第二军医大学博士学位论文中文摘要遗传学专业其中品系TGM一1的4只FZ（2乙2早）经测交实验证实为转基因纯合子，己完成建系任务。同时，经RT一PCR和Western blot分析，发现除TGM一2外其余6个hbZ厂转基因小鼠品系的肝脏都有NRSAZ的表达:对TGM一1的转基因多组织表达分析表明，在cMV启动子驱动下，hblf转基因可在肝脏、心、肺、胃和肾等部位表达。 论文第二部分，为了解外源转基因的表达是否会造成转基因小鼠各重要脏器的器质性改变，TGM一1的主要组织器官经10%甲醛固定后进行常规病理分析。所有送检组织均未见有明显的病理性改变，推测可能外源基因的过表达通过未知的机制抑制了内源同源基因的表达而起了保护性作用。作为一转录因子，本研究感兴趣的更在于hBIF在活体内能调控哪些下游基因的表达。通过基因芯片技术对TGM一1与正常C57小鼠肝脏基因表达谱的比较分析，我们共鉴定到28个差异表达基因，部分基因的差异表达经RT-PCR实验证实。其中包括与胆固醇生物合成相关的焦磷酸法呢酷合成酶基因等25个基因为下调，而皮质类固醇结合球蛋白（又名丝/苏氨酸蛋白酶抑制子）基因等3基因的表达表现为上调。 最后，由于NRSAZ在人肝组织有高表达，为在小鼠体内模拟这一现象，并避免外源转基因在肝外组织表达对结果分析带来的干扰，我们将hblfcDNA置于小鼠白蛋白启动子/增强子序列下游构建肝特异表达的pAlb一hblf载体;再通过原核显微注射将线性化的该载体导入631颗小鼠受精卵并回输至25只假孕母鼠输卵管以构建hblf肝特异表达转基因小鼠模型。18只怀孕母鼠共产下114只仔鼠，经PCR鉴定获得4只携有pAlb一hbjf转基因的候选Founder鼠，阳性率3 .5%;其中一只同时也为southem blot阳性，阳性率0.88%。考虑可能是二者敏感性差别造成检出率不一，所有4只均已作为候选Founder用于转基因小鼠品系的建立 （命名TGM.AI、TGM.AZ、TGMA3和TGM.A4）。 本论文已完成人核受体NRSAZ基因nr勿2(hb功的广谱和肝特异表达两个转基因小鼠模型建立，该模型的获得为在整体水平进一步深入揭示NRSAZ的生理功能奠定了基础。此外，对n心a2转基因小鼠的初步分析提示，NRSAZ可能通过直接或间接但目前尚未知的机制下调焦磷酸法呢酷合成酶基因的表达，从而在胆固醇代谢平衡等过程中起调控作用。
二、LRH-1/hBlF and HNFl synergistically up-regulate hepatitis B virus gene transcription and DNA replication（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、LRH-1/hBlF and HNFl synergistically up-regulate hepatitis B virus gene transcription and DNA replication（论文提纲范文）
（1）宿主因子参与HBV cccDNA形成和转录（论文提纲范文）
| 1 HBV感染和复制循环概述 |
| 2 宿主因子在cccDNA形成过程中的作用 |
| 3 宿主因子在cccDNA表观修饰中的作用 |
| 4 参与cccDNA转录过程的转录因子 |
| 5 讨论与总结 |
（2）FXR上调miR-122的分子机制及在抗HCC中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 附件 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 核受体FXR的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 microRNA-122的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）胆汁酸受体FXR调节HBV的表达及分泌（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(ABBREVIATION) |
| 前言 |
| 1 材料、试剂和仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器设备 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 2.1 构建pGL3-EN2/Cp重组质粒 |
| 2.2 HepG2和HEK-293T细胞的培养 |
| 2.3 转染 |
| 2.4 双荧光素酶报告基因的检测 |
| 2.5 提取细胞RNA |
| 2.6 Real-timePCR实验 |
| 2.7 ELISA检测HBsAg和HBeAg |
| 2.8 细胞内蛋白质的提取 |
| 2.9 统计学分析及作图 |
| 3 结果 |
| 3.1 成功构建pGL3-EN2/Cp质粒 |
| 3.2 pAAV/HBV1.2质粒鉴定 |
| 3.3 在HepG2细胞中,FXR促进HBeAg表达及分泌 |
| 3.4 在HepG2细胞中,FXR对HBsAg表达及分泌的影响 |
| 3.5 在HepG2细胞中转染pHY106+wta,FXR促进HBeAg表达 |
| 3.6 在HEK-293T细胞中,FXR促进HBeAg表达和分泌 |
| 3.7 在HEK-293T细胞中,FXR促进HBsAg表达和分泌 |
| 3.8 FXR在转录水平调控HBV表达 |
| 3.9 FXR与EN2/Cp结合促进萤火虫荧光素酶表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的文章及获得奖励 |
（4）肝细胞CUL4B调控HBV复制和肝脏免疫微环境的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 肝细胞CUL4B调控HBV复制的机制研究 |
| 第一章 前言(含文献综述) |
| 第二章 材料 |
| 第三章 方法 |
| 第四章 结果 |
| 第五章 讨论 |
| 第二部分 肝细胞CUL4B对肝脏免疫微环境的影响 |
| 第一章 前言(含文献综述) |
| 第二章 材料 |
| 第三章 方法 |
| 第四章 结果 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录和成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）沉默信息调节因子1（SIRT1）在HBV复制调控中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SIRT1对HBV转录和复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要细胞 |
| 1.1.2 质粒和抗体 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.1.5 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 质粒提取 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 Real time Quantitative PCR(qRT-PCR) 检测HBV对SIRT1mRNA表达的影响 |
| 1.2.4 Western blot检测HBV复制对SIRT1蛋白表达水平的影响，检测SIRT1的沉默水平和过表达水平并检测SIRT1沉默对HBc表达的影响 |
| 1.2.5 Real-time PCR分析SIRT1沉默和过表达对HBV复制的影响 |
| 1.2.6 Southern blot分析SIRT1沉默和过表达对HBV复制的影响 |
| 1.2.7 SIRT1 沉默对环化 HBV 复制的影响 |
| 1.2.8 ELISA分析SIRT1沉默和过表达对HBV表面抗原(HBsAg)分泌的影响 |
| 1.2.9 ELISA分析SIRT1沉默和过表达对HBV表面抗原(HBsAg)分泌的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV复制对SIRTI表达的影响 |
| 2.1.1 HBV复制对SIRT1 mRNA表达水平的影响 |
| 2.1.2 HBV复制对SIRT1蛋白水平表达的影响 |
| 2.1.3 HepAD38细胞中验证HBV复制对SIRT1表达的影响 |
| 2.2 SIRT1沉默对HBV复制和转录的影响 |
| 2.2.1 SIRT1沉默水平验证 |
| 2.2.2 SIRT1沉默对HBV稳定复制的细胞中HBV复制中间体表达的影响 |
| 2.2.3 SIRT1沉默对HBV稳定复制的细胞中HBV转录的影响 |
| 2.2.4 SIRT1沉默对HBV蛋白表达的影响 |
| 2.2.5 SIRT1沉默对瞬时表达HBV复制的影响 |
| 2.3 过表达SIRT1对HBV复制和转录的影响 |
| 2.3.1 SIRT1过表达水平验证 |
| 2.3.2 SIRT1过表达对HBV复制中间体表达的影响 |
| 2.3.3 SIRT1过表达对HBV转录的影响 |
| 2.3.4 SIRT1过表达对HBV蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SIRT1调控HBV转录和复制的分子机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要细胞 |
| 1.1.2 质粒和抗体 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.1.5 引物序列 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 双荧光素酶报告系统检测SIRT1对HBV启动子活性的影响 |
| 1.2.2 QRT-PCR分析SIRT1沉默对与HBV转录有关的转录因子表达的影响 |
| 1.2.3 Western blot检测SIRT1对c-Jun蛋白表达的影响 |
| 1.2.4 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, CHIP)分析c-Jun与HBV core promoter的结合 |
| 1.2.5 pGEM-HBV1.3 中HBV core promoter与c-Jun结合位点突变 |
| 1.2.6 Real-time PCR和southern blot检测SIRT1对突变型pGEM-HBV1.3 复制的影响及分析c-Jun沉默在SIRT1促进HBV复制中的作用 |
| 2 结果 |
| 2.1 SIRT1对HBV启动子活性的影响 |
| 2.2 SIRT1对与HBV转录相关的转录因子表达的影响 |
| 2.3 转录因子AP-1 与HBV core promoter相互结合 |
| 2.4 AP-1 结合位点突变减弱SIRT1对HBV复制的促进作用 |
| 2.5 AP-1 在SIRT1促进HBV复制中的作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SIRT1抑制剂尼克酰胺对HBV复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要细胞和动物 |
| 1.1.2 质粒和抗体 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MTS实验分析nicotinamide在HepAD38和HepG2.2.15细胞中的半数细胞毒性浓度(CC50) |
| 1.2.2 HepAD38和HepG2.2.15细胞中检测nicotinamide对HBV复制的影响 |
| 1.2.3 小鼠血清中HBV DNA提取 |
| 1.2.4 肝组织中基因组DNA的提取 |
| 1.2.5 HBV转基因小鼠(HBV-Tg C57BL/6)中验证nicotinamide对HBV复制的影响 |
| 1.2.6 检测nicotinamide处理后HBV转基因小鼠血清中AST(谷草转氨酶)/ALT(谷丙转氨酶)的水平 |
| 2 结果 |
| 2.1 体外验证SIRT1抑制剂nicotinamide对HBV复制的影响 |
| 2.1.1 MTS实验分析nicotinamide在HepAD38和HepG2.2.15细胞中的半数细胞毒性浓度(CC50) |
| 2.1.2 Nicotinamide对HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响 |
| 2.1.3 Nicotinamide对HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV 3.5kbmRNA表达水平的影响 |
| 2.1.4 Nicotinamide对HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV蛋白表达的影响 |
| 2.2 HBV转基因小鼠(HBV-Tg C57BL/6)体内验证nicotinamide对HBV复制的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
（6）肝细胞核因子6抑制乙型肝炎病毒基因表达和复制及其机制的研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 乙型肝炎病毒的发现 |
| 1.2 乙型肝炎病毒的基因组 |
| 1.2.1 乙型肝炎病毒的基因组结构 |
| 1.2.2 乙型肝炎病毒的基因组分型 |
| 1.3 乙型肝炎病毒编码的蛋白 |
| 1.3.1 乙型肝炎病毒表面抗原 |
| 1.3.2 乙型肝炎病毒核心抗原 |
| 1.3.3 乙型肝炎病毒的逆转录酶蛋白 |
| 1.3.4 乙型肝炎病毒的X蛋白 |
| 1.3.5 乙型肝炎病毒的e抗原 |
| 1.4 HBV的复制周期 |
| 1.4.1 吸附和进入细胞 |
| 1.4.2 转运病毒基因组进入细胞核 |
| 1.4.3 rcDNA转变为cccDNA |
| 1.4.4 病毒RNA的转录 |
| 1.4.5 逆转录 |
| 1.4.6 衣壳的成熟 |
| 1.4.7 包膜和出芽 |
| 1.5 乙型肝炎病毒的转录水平调控 |
| 1.5.1 普遍存在的转录因子对HBV转录的调控 |
| 1.5.2 肝脏富集的转录因子 |
| 1.6 乙型肝炎病毒的转录后水平调控 |
| 1.6.1 HBV RNA的加工 |
| 1.6.2 HBV RNA的出核 |
| 1.6.3 调控HBV RNA的稳定性 |
| 1.7 肝细胞核因子6 |
| 1.7.1 肝细胞核因子6的发现 |
| 1.7.2 HNF6调控细胞增殖 |
| 1.7.3 HNF6调控细胞分化和器官形成 |
| 1.7.4 HNF6参与细胞迁移和细胞基质粘附 |
| 1.7.5 HNF6参与肝脏代谢 |
| 1.7.6 HNF6调控性别依赖性基因的表达 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒 |
| 2.1.2 细胞系和菌株 |
| 2.1.3 工具酶 |
| 2.2 溶液配制 |
| 2.2.1 Northern Blot实验相关试剂 |
| 2.2.2 Southern Blot实验相关试剂 |
| 2.2.3 免疫印迹相关缓冲液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 克隆构建 |
| 2.3.2 哺乳动物细胞RNA提取 |
| 2.3.3 逆转录与qPCR |
| 2.3.4 免疫印迹 |
| 2.3.5 原核蛋白表达纯化 |
| 2.3.6 细胞的复苏/传代/转染/冻存 |
| 2.3.7 慢病毒介导的基因下调 |
| 2.3.8 双荧光报告系统实验 |
| 2.3.9 免疫荧光 |
| 2.3.10 HBV相关的病毒学实验 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 研究背景和立项依据 |
| 3.2 HNF6抑制HBV的基因表达和DNA复制 |
| 3.3 下调HNF6的表达促进HBV的基因表达和DNA复制 |
| 3.4 HNF6抑制HBV SP2启动子的活性 |
| 3.5 HNF6通过转录后的机制影响HBV前基因组RNA的水平 |
| 3.6 HNF6促进HBV前基因组RNA的降解 |
| 3.7 HNF6的N端介导了其抑制HBV的作用 |
| 3.8 HNF6在小鼠中抑制HBV基因表达和复制 |
| 3.9 讨论 |
| 第四章 研究总结和展望 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（7）维甲类X受体alpha调控乙型肝炎病毒感染机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV) |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒概况 |
| 1.1.2 乙型肝炎病毒结构和基因组 |
| 1.1.3 乙型肝炎病毒的生活史 |
| 1.1.4 乙型肝炎病毒的基因转录调控 |
| 1.1.5 丁型肝炎病毒(Hepatitis Delta virus)概况 |
| 1.2 维甲类X受体(Retinoid X receptor) |
| 1.2.1 核受体(Nuclear receptor)概况 |
| 1.2.2 维甲类X受体及其异源二聚体伴侣 |
| 1.2.3 维甲类X受体形成的异源二聚体在肝脏中的作用 |
| 1.2.4 维甲类X受体的激动剂 |
| 第二章 立题依据及研究思路 |
| 第三章 实验材料和实验方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.0 细胞与细胞系 |
| 3.1.1 细胞培养 |
| 3.1.2 分子克隆 |
| 3.1.3 蛋白电泳及Western Blot相关实验 |
| 3.1.4 免疫组化及免疫共沉淀 |
| 3.1.5 抗体 |
| 3.1.6 实时定量PCR (Real-time PCR) |
| 3.1.7 ELISA |
| 3.1.8 多肽 |
| 3.1.9 其它试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 分子生物学操作 |
| 3.2.2 细胞培养,转染以及稳定细胞株的建立 |
| 3.2.3 免疫印迹(Western Blot) |
| 3.2.4 蛋白表面生物素(Biotin)标记及免疫共沉淀 |
| 3.2.5 [~3H]牛磺胆酸盐([~3H]-taurocholate)摄取实验 |
| 3.2.6 从病人血清中超速离心纯化乙肝病毒 |
| 3.2.7 乙肝病毒(HBV)侵染PTH的实验方法 |
| 3.2.8 丁肝病毒(HDV)侵染PTH的实验方法 |
| 3.2.9 乙肝病毒的制备 |
| 3.2.10 HepG2-hNTCP细胞中HBV及HDV的感染 |
| 3.2.11 酶联免疫吸附检测(ELISA) |
| 3.2.12 免疫组化 |
| 3.2.13 RNA提取及反转录 |
| 3.2.14 实时定量PCR (RT-PCR)反应 |
| 3.2.15 RNA-seq |
| 3.2.16 细胞内总胆固醇测定 |
| 3.2.17 质谱分析 |
| 3.2.18 结果统计与分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 贝莎罗汀活化维甲类X受体(RXR)能抑制HBV的早期感染 |
| 4.1.1 在HepG2-hNTCP细胞中,贝莎罗汀活化RXR抑制HBV病毒感染 |
| 4.1.2 在HepG2-hNTCP细胞中,HBV接种后加入贝莎罗汀基本不影响HBV感染 |
| 4.1.3 在树鼩原代肝细胞(PTH)中,贝莎罗汀活化维甲类X受体(RXR)能抑制HBV的早期感染 |
| 4.1.4 贝莎罗汀活化维甲类X受体(RXR)能抑制HDV的早期感染 |
| 4.2 siRNA降低维甲类X受体alpha (RXRα)的表达能促进HBV的早期感染 |
| 4.2.1 在HepG2-hNTCP细胞中,siRNA降低维甲类X受体alpha(RXRα)表达后接种HBV能促进病毒感染 |
| 4.2.2 在HepG2-hNTCP细胞中,接种HBV后siRNA降低维甲类X受体alpha (RXRα)的表达基本不影响HBV感染 |
| 4.2.3 在树鼩原代肝细胞(PTH)中,siRNA降低维甲类X受体alpha (RXRα)的表达能促进HBV的早期感染 |
| 4.2.4 在HepG2-hNTCP细胞中,siRNA降低维甲类X受体alpha(RXRα)的表达能促进HDV的早期感染 |
| 4.2.5 在树鼩原代肝细胞(PTH)中,siRNA降低维甲类X受体alpha (RXRα)的表达能促进HDV的早期感染 |
| 4.3 在Talen特异性敲除维甲类X受体alpha (RXRα)的HepG2-hNTCP细胞中,HBV和HDV的感染较正常细胞明显增强 |
| 4.3.1 构建针对人维甲类X受体alpha (RXRα)的TALEN系统 |
| 4.3.2 筛选人维甲类X受体alpha (RXRα)稳定敲除的单克隆细胞 |
| 4.4 人维甲类X受体alpha(RXRα)的异源二聚体伴侣蛋白对HBV感染的影响 |
| 4.4.1 法尼醇X受体(FXR)对HBV感染的影响 |
| 4.4.2 肝X受体alpha (LXRα)对HBV感染的负调控 |
| 4.4.3 下调肝X受体beta(LXRβ)、过氧化物酶体增殖物激活受体alpha(PPARα)和维甲酸受体alpha (RARα)的表达不影响HBV的感染 |
| 4.5 人维甲类X受体alpha(RXRα)对HBV受体NTCP表达的调节 |
| 4.6 脂质代谢对HBV及HDV感染的影响 |
| 4.6.1 胆酸合成通路对HBV感染的影响 |
| 4.6.2 胆固醇合成通路对HBV感染的影响 |
| 4.6.3 前列腺素合成途径对HBV感染的影响 |
| 第五章: 实验讨论 |
| 5.1 贝莎罗汀抑制HBV早期感染 |
| 5.2 降低RXRa的表达促进HBV早期感染 |
| 5.3 维甲类X受体alpha对NTCP表达的调控 |
| 5.4 RXRa异源二聚体伴侣蛋白对HBV感染的影响分析 |
| 5.5 维甲类X受体通过调节细胞内脂质代谢影响HBV感染 |
| 第六章 参考文献 |
| 附录一 主要实验仪器 |
| 附录二 缩写注释 |
| 附录三 实验所用引物序列 |
| 文章发表 |
| 学术会议 |
| 致谢 |
（8）核受体LRH-1辅因子Prox1的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一部分 Prox1 作为LRH-1 的辅抑制子抑制胆固醇7-α-羟化酶的表达 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 结果 |
| 2.1 使用酵母双杂交的方法筛选得到hLRH-1 相互作用蛋白Prox1 |
| 2.2 Prox1 与hLRH-1 存在直接的相互作用 |
| 2.3 hLRH-1 的DBD 和LBD 结构域负责与Prox1 的相互作用 |
| 2.4 Prox1 中的LXXLL 结构域对于介导与hLRH-1 的LBD 区相互作用非常重要,但却和LRH-1 的DBD 区相互作用无关 |
| 2.5 Prox1 抑制hLRH-1 靶基因—cyp7a1 的表达 |
| 2.6 Prox1 可以分别通过hLRH-1 的DBD 或LBD 行使抑制功能 |
| 2.7 Prox1 影响了LRH-1 结合DNA 的能力 |
| 讨论 |
| 第二部分Prox1 通过多个调控元件抑制乙型肝炎病毒的基因表达和DNA 复制 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 结果 |
| 2.1 Prox1 通过多个病毒调控元件抑制HBV 的基因表达 |
| 2.2 Prox1 抑制HNF-1 转录激活能力 |
| 2.3 Prox1 和HNF-1 存在直接的相互作用 |
| 2.4 HNF-1 的POU 和Homeodomain 负责直接招募Prox1 |
| 2.5 Prox1 氨基端的1-120 个氨基酸负责与HNF-1 相互作用 |
| 2.6 Prox1 与HNF-1 的相互作用对于抑制Sp1 的转录活性非常重要,但与抑制ENI/Xp 活性无关 |
| 2.7 Prox1 抑制乙型肝炎病毒的基因表达和DNA 复制 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 缩略名词对照表 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
（9）乙型肝炎病毒EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ结合蛋白的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 乙型肝炎病毒EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ结合蛋白的研究 |
| 引言 |
| 第一部分 应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒EnhⅠ结合蛋白 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒SPⅠ结合蛋白基因 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒SPⅡ结合蛋白的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 NADHDH4调节乙型肝炎病毒SPⅡ表达的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 乙型肝炎病毒调节基因结合蛋白的研究 |
| 文献综述二 丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活作用研究 |
| 研究生学习期间发表的论文 |
（10）人核受体nr5a2（hblf）转基因小鼠的建立及其分析（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人核受体nr5a2(hb1f)广谱表达转基因小鼠的建立 |
| 摘要 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 人核受体nr5a2(hb1f)广谱表达转基因小鼠的表型及肝脏基因表达谱改变分析 |
| 摘要 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 人核受体nr5a2(hb1f)肝特异表达转基因小鼠的建立 |
| 摘要 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究工作小结 |
| 综述 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
四、LRH-1/hBlF and HNFl synergistically up-regulate hepatitis B virus gene transcription and DNA replication（论文参考文献）
- [1]宿主因子参与HBV cccDNA形成和转录[J]. 贺锐,刘实. 科学通报, 2019(30)
- [2]FXR上调miR-122的分子机制及在抗HCC中的作用研究[D]. 何家琳. 第三军医大学, 2017(12)
- [3]胆汁酸受体FXR调节HBV的表达及分泌[D]. 李艳艳. 河南大学, 2016(04)
- [4]肝细胞CUL4B调控HBV复制和肝脏免疫微环境的作用研究[D]. 王博. 山东大学, 2016(02)
- [5]沉默信息调节因子1（SIRT1）在HBV复制调控中的作用及机制研究[D]. 任吉华. 重庆医科大学, 2016(02)
- [6]肝细胞核因子6抑制乙型肝炎病毒基因表达和复制及其机制的研究[D]. 郝瑞栋. 武汉大学, 2015(06)
- [7]维甲类X受体alpha调控乙型肝炎病毒感染机制研究[D]. 宋梅. 北京协和医学院, 2014(06)
- [8]核受体LRH-1辅因子Prox1的生物学功能研究[D]. 秦骏. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）, 2005(06)
- [9]乙型肝炎病毒EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ结合蛋白的研究[D]. 杨艳杰. 第三军医大学, 2004(01)
- [10]人核受体nr5a2（hblf）转基因小鼠的建立及其分析[D]. 王水良. 第二军医大学, 2003(02)