一、阿仑磷酸钠对成骨细胞增殖、分泌和成骨功能的影响（论文文献综述）
赵亚[1]（2021）在《NiTi合金表面几种纳米结构涂层的构建及其腐蚀行为与生物学性能研究》文中进行了进一步梳理由于近等原子比的NiTi合金独特的形状记忆效应、超弹性和低弹性模量等特性而被广泛用于生物医学领域,但是一些与表面相关的性能,如耐腐蚀性、抗菌性能和生物功能性仍无法满足临床要求。表面改性是保持其优异的体特性而改变其表面性质以满足临床需求的理想方法。鉴于医用NiTi合金特别是用作植入材料时其形状和结构的复杂性,溶液基的表面改性技术尤其适合,因为其无视线性限制,可以处理形状复杂的材料表面。本论文采用阳极氧化、水热处理和碱蚀处理三种溶液基的表面改性技术,在NiTi合金表面制备出四种纳米结构涂层,表征了涂层的形貌、微结构和化学组成,评价了涂层的耐腐蚀性、Ni2+释放行为以及成骨、成血管和免疫调节等生物功能性,具体研究内容如下:（1）在丙三醇电解液（H2O和NaCl）体系中对NiTi合金进行阳极氧化,制备出表面有序、直径可调的Ni-Ti-O纳米孔涂层。通过调控电解液组成为丙三醇、10%（体积）H2O和0.6 M NaCl中,电压为20-80 V下进行阳极氧化,生长出孔径约为23-39 nm的纳米孔。在该电解液体系中,NiTi合金表面形成的不规则无序层可以在阳极氧化过程中通过化学溶解或机械应力剥落完全去除。另外,阳极氧化过程中电解液搅拌对纳米孔径几乎没有影响,但是缩短了纳米孔长度。（2）选取上述制备的Ni-Ti-O纳米孔进行水热处理,在NiTi合金表面生长出了由Ti O2和Ti4Ni2O组成的纳米纺锤体涂层。该涂层可显着改善NiTi合金表面的亲水性并减少Ni2+的释放,形成的纳米结构与水热持续时间无关。纳米纺锤体表面不仅能诱导成骨细胞的成骨分化和内皮细胞的成血管,还能促进巨噬细胞下调促炎M1型基因并上调促愈合M2型基因的表达,以营造良好的免疫微环境。此外,经巨噬细胞条件培养基中培养后,内皮细胞一氧化氮（NO）的合成和VEGF的分泌都呈现升高趋势,同时加快了细胞迁移,进而促进血管新生能力。（3）在低温（25-80℃）下,NiTi合金在1-15 M的NaOH溶液中浸泡进行碱蚀处理,可在其表面生长主要由Ti O2、Na4Ti O4和Ni（OH）2组成的纳米片涂层。纳米片随着碱蚀温度、NaOH浓度和碱蚀时间的增加而变大。由于生长纳米片后比表面积显着增大,与NiTi合金基体相比,耐蚀性略有降低,但是碱蚀后的NiTi合金表示出强效的抗菌能力。此外,在5 M的NaOH溶液中生长的纳米片涂层既能促进成骨和内皮细胞的功能,又能刺激巨噬细胞营造良好的免疫微环境,进而促进成骨和成血管。（4）在上述研究基础上,于室温下在2.5-15 M的KOH溶液中对NiTi合金进行碱处理,生长出主要成分为Ti O2、K2Ti O3和Ni（OH）2的纳米结构。在低浓度（2.5-5 M）下,NiTi合金表面为纳米片结构,且随着KOH浓度的增加,结构变大;在高浓度（15M）下,表面结构演变为纳米片/纳米球复合结构。经碱蚀处理的样品可显着诱导成骨分化、上调内皮细胞的增殖、迁移、NO产生、VEGF分泌和血管生成等功能。此外,在15 M的KOH中生长的纳米片/纳米球复合涂层可以将巨噬细胞极化为抗炎的M2表型,并上调VEGF的表达以促进内皮细胞功能。
赖蔚文[2]（2020）在《阿仑磷酸钠对大鼠成骨细胞的影响》文中进行了进一步梳理目的:1.探究阿仑膦酸钠在体外对成骨细胞增殖和细胞内碱性磷酸酶活性的影响。2.探究阿仑膦酸钠在体内对骨代谢的影响,为临床治疗提供参考。方法:1.阿仑膦酸钠对成骨细胞的增殖影响:采用噻唑蓝比色试验（MTT）,在培养板中诱导成骨细胞生成后,观察其生长情况,再使用不同浓度的阿仑膦酸钠作用于成骨细胞,酶联免疫检测仪测定其吸光度值。2.阿仑膦酸钠对成骨细胞合成碱性磷酸酶活性的影响:在培养瓶中诱导成骨细胞生成后,使用不同浓度的阿仑膦酸钠作用于成骨细胞,采用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞碱性磷酸酶活性。3.阿仑膦酸钠对去卵巢SD大鼠的骨代谢影响:将收集到6W龄SD大鼠做去卵巢处理后应用阿仑膦酸钠治疗处理,在去卵巢4W、8W、12W三个时间点,对处于快速骨丢失期的大鼠进行多次采集外周血,离心后对血清中的OPG和RANKL分别用ELISA法进行检测,再计算出比值。其次,采用双能X线吸收仪（DXA）,分别在阿仑膦酸钠治疗前、阿仑膦酸钠治疗26W和52W三个时间点,测量大鼠髋部、腰椎L2-4、股骨颈区、股骨大转子4个部位的骨密度值,并比较治疗前后的髋部、腰椎L2-4、股骨颈区、股骨大转子等部位骨密度的变化。结果:1.大部分的成骨细胞呈贴壁生长,24h后观察形状为长条、三角、多边及不规则形。随着实验时间的延长,成骨细胞的密度逐渐变大,成为融合成片的条索长梭形。在培养至72h,大鼠成骨细胞逐渐由之前的多边形、三角形以及长条形等形状变为卵圆形、鹅卵石形,且常出现边界不清。2.MTT检测结果显示:在24h、36h、48h时,1.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L浓度的阿仑膦酸钠抑制成骨细胞的增殖作用。1.0×10-8mol/L、1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L浓度的阿仑膦酸钠促进成骨细胞的增殖作用,且1.0×10-8mol/L浓度的阿仑膦酸钠对成骨细胞的增殖促进作用最强。1.0×10-9mol/L、1.0×10-10mol/L浓度的阿仑膦酸钠对成骨细胞增殖的促进效果不明显。3.使用不同浓度的阿仑膦酸钠作用于大鼠成骨细胞72小时后,分析其对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果表明,大鼠成骨细胞在1.0×10-5 mol/L和1.0×10-6 mol/L浓度下的阿仑膦酸钠中的碱性磷酸酶活性增高。4.应用阿仑膦酸钠治疗12W与治疗4W相比,阿仑膦酸钠治疗后能显着升高OPG和OPG/RANKL比值。5.阿仑膦酸钠作用于SD去卵巢大鼠后,能够显着增加SD大鼠的骨密度。结论:1.不同浓度的阿仑膦酸钠对成骨细胞增殖分化和细胞内碱性磷酸酶活性影响不同。2.阿仑膦酸钠能够促进大鼠成骨分化并提高大鼠的骨密度。
王振[3]（2020）在《乙酰基-11-酮基-β-乳香酸对钛颗粒诱导骨溶解成骨影响及机制研究》文中研究说明第一部分 乙酰基-1 1-酮基-β-乳香酸通过促进骨形成减轻钛颗粒引起的骨溶解目的:探讨乙酰基-11-酮基-β-乳香酸（AKBA）对钛（Ti）颗粒诱导骨溶解的治疗作用。方法:选取40只8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分成四组:（1）对照组（Sham组）,手术操作与模型组相同,骨膜下注入生理盐水;（2）模型组（Model组）,骨膜下注入20mg钛颗粒溶液（200mg/ml）;（3）低浓度AKBA治疗组（Low-AKBA组）,造模后小鼠使用5mg/kg/d AKBA治疗;（4）高浓度AKBA治疗组（High-AKBA组）,造模后小鼠使用20mg/kg/d AKBA治疗。治疗两周后处死小鼠,留取小鼠颅骨行微计算机断层（Micro-CT）扫描分析,苏木素-伊红（H&E）染色,抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,马松三色（Masson）染色,钙黄绿素双标法和免疫组化分析。结果:Micro-CT显示AKBA治疗后骨溶解减轻,骨密度（BMD）较模型组明显升高,分别为 Low-AKBA 组 118.8±4.293 mg/mm3 和 High-AKBA组122.1±5.684 mg/mm3,模型组为103.0±4.425mg/mm3,差异有统计学意义（p<0.05）。同时AKBA治疗组骨体积（BV）,骨体积分数（BV/TV）显着高于模型组,骨表面陷窝数低于模型组,差异均有统计学意义（p<0.05）。H&E染色结果显示模型组Ti颗粒植入部分炎症反应明显,可见大量炎症细胞浸润,Low-AKBA组和High-AKBA组可见骨膜内炎症细胞减少,炎症反应较轻。经过AKBA治疗后颅骨厚度（BT）明显增高分别为0.258±0.020 mm（Low-AKBA 组）和 0.281±0.031 mm（High-AKBA 组）,与模型组（0.173±0.029 mm）相比差异有统计学意义（p<0.05）。经AKBA治疗后骨表面侵蚀率（EBS/BS）较模型组明显降低,差异有显着性（p<0.05）。TRAP染色结果显示模型组可见大量染色阳性的破骨细胞,AKBA治疗组阳性细胞数减少。Low-AKBA组和 High-AKBA 组 Oc.S/BS 分别为 8.06%±0.37%和 6.49%±0.93%,与模型组（20.63%±2.74%）相比较,差异具有显着性（p<0.05）。在 Low-AKBA 组和 High-AKBA组破骨细胞/骨表面积比值（Oc.S/BS）和平均破骨细胞数与骨表面积比值（N.Oc/BS）较模型组均明显降低,均有统计学意义（p<0.05）。钙黄绿素双标实验的矿化沉积率（MAR）在Low-AKBA组和High-AKBA组明显升高,与模型组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）。马松三染色显示,模型组未见明显蓝色骨胶原纤维染色,而AKBA治疗后可见蓝色骨胶原纤维形成,呈分散或连续存在,骨形成增加。免疫组化结果显示,碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和锌指结构转录因子（Osterix）阳性细胞数,经AKBA治疗后可见阳性细胞数明显增加,与模型组相比,差异具有显着性（p<0.05）。AKBA治疗组骨形成标志物表达增加,增加了骨形成。同时免疫组化结果显示,模型组pSer9-GSK-3β和β-catenin染色阳性细胞数明显减少,而AKBA组可见大量染色阳性细胞,治疗组与模型组相比,差异均具有显着性（p<0.05）。说明AKBA可通过激活GSK-3β/β-catenin信号通路,促进Ti颗粒诱导的骨溶解中新骨形成。结论:AKBA可激活GSK-3β/β-catenin信号通路,促进骨形成,减弱Ti颗粒的炎症反应,抑制破骨细胞的骨吸收,减弱骨溶解。AKBA有望作为治疗假体周围骨溶解的新型药物治疗方法。第二部分 乙酰基-11-酮基-β-乳香酸对钛颗粒干预下成骨细胞功能的影响目的:观察AKBA对体外Ti颗粒干预成骨细胞的分化成熟和成骨功能的影响。方法:以小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,分别用Ti颗粒和AKBA处理。实验分组:对照组（Control组）,仅加入培养基;模型组（Ti颗粒组）,5μg/cm2钛颗粒;低浓度AKBA组（Low-AKBA组）,5μg/cm2钛颗粒+100nMAKBA;高浓度 AKBA 组（High-AKBA 组）,5μg/cm2 钛颗粒+1000nM AKBA。CCK-8 法检测MC3T3-E1细胞增殖率;碱性磷酸酶染色检测ALP性细胞数,茜素红染色观察成骨细胞矿化情况,qRT-PCR 检测 Runx-2,Osterix,OCN,ALP,OPN,β-catenin 和Axin-2 的 mRNA 表达,Western blot 检测 Runx-2,OCN,Osterix,ALP,pSer9-GSK-3β,总GSK-3β,β-catenin和Axin-2的蛋白表达水平。结果:CCK-8细胞活力测定当AKBA治疗浓度低于10μM,钛颗粒小于10μg/cm2时细胞活性均未受影响。ALP染色结果表明:Ti颗粒组未见明显染色阳性成骨细胞,Low-AKBA组和High-AKBA组可见较多的ALP染色阳性成骨细胞,具有浓度依赖性,定量分析表明AKBA治疗组染色阳性细胞数和Ti颗粒组相比明显增多,具有统计学差异（p<0.05）。ALP染色分析表明,AKBA可促进成骨细胞的体外成骨分化。茜素红染色结果显示:Ti颗粒组未见明显橘红色钙结节,Low-AKBA组和High-AKBA组可见较多钙结节形成,散在或成片分布。定量分析表明,Low-AKBA组和High-AKBA组成骨细胞矿化率较Ti颗粒组明显增多,与Ti颗粒组相比分别提高了约224.3%和324.3%,差异具有显着性（p<0.05）。qRT-PCR结果显示,Ti颗粒组成骨标志物Runx-2,Osterix,OCN,ALP 和 OPN 的表达明显降低,Low-AKBA 组和 High-AKBA组可见成骨标志物的表达明显升高,与Ti颗粒组相比差异具有显着性（p<0.05）。Western blot结果和qRT-PCR结果基本一致。Western blot分析和qRT-PCR分析表明Ti颗粒可抑制β-catenin和Axin-2的表达,然而,AKBA治疗后明显增加（p<0.05）。Western blot分析pSer9-GSK-3β和GSK-3β表明,AKBA治疗后增加了 Ti颗粒诱导的 pSer9-GSK-3β/GSK-3β 比值（p<0.05）。这些结果表明,AKBA 可通过 GSK-3β/β-catenin信号通路调节成骨细胞,促进Ti颗粒干预下成骨细胞的分化和成骨功能。结论:AKBA在体外可促进Ti颗粒干预下成骨细胞的分化成熟,促进骨形成。AKBA对成骨细胞的作用可能是激活了GSK-3β/β-catenin信号通路来实现的。第三部分 阻断GSK-3β/β-catenin信号通路可抑制AKBA的作用目的:通过靶向干预GSK-3β/β-catenin信号通路观察AKBA对体外Ti颗粒干预成骨细胞的分化成熟和功能的影响,探讨其在AKBA促进成骨中的作用。方法:以小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,CCK-8法检测ICG-001对MC3T3-E1细胞增殖的影响;检测ICG-001可通过β-catenin信号通路抑制成骨细胞分化和矿化,实验分为4组:对照组,仅加入成骨诱导培养基;ICG-001组,20μM ICG-001;Ti 颗粒组,5μg/cm2 钛颗粒;Ti 颗粒+ICG-001 组,5μg/cm2 钛颗粒+20μM ICG-001。其次,研究ICG-001阻断GSK-3β/β-catenin信号通路对AKBA促进成骨细胞分化的影响。实验分为4组:对照组,仅加入成骨诱导培养基;Ti颗粒组:5μg/cm2钛颗粒,AKBA 组:5μg/cm2 钛颗粒+1000nMAKBA,AKBA+ICG-001 组:5μg/cm2钛颗粒+1000nMAKBA+20μMICG-001。碱性磷酸酶染色检测ALP阳性细胞数,茜素红染色观察成骨细胞矿化,免疫荧光检测β-catenin,qRT-PCR和Western blot分别检测Runx-2,Osterix,OCN,ALP,β-catenin 和 Axin-2 的 mRNA 和蛋白表达水平。结果:CCK-8检测结果表明,当ICG-001浓度小于50μM时细胞生存能力均未受到影响。ICG-001抑制信号通路实验结果中,对照组的ALP染色可见大量染色阳性的成骨细胞,ICG-001组和Ti颗粒组阳性细胞数则较对照组减少,Ti+ICG-001组最少,差异均有显着性（p<0.05）。茜素红染色对照组可见大量红色钙结节形成,而Ti颗粒组和ICG-001组钙结节形成较少,Ti+ICG-001组最少。Western blot和qRT-PCR结果显示:ICG-001组,Ti颗粒组和Ti颗粒+ICG-001组成骨标志物的表达明显降低,和对照组相比差异具有显着性,同时GSK-3β/β-catenin信号通路中Axin-2和β-catenin的表达也明显降低,差异具有显着性（p<0.05）。结果证实ICG-001可通过阻断GSK-3β/β-catenin信号通路抑制成骨细胞的分化和矿化。ICG-001和AKBA处理Ti颗粒干预成骨细胞后细胞免疫荧光检测表明AKBA治疗促进了 β-catenin的激活增加了核转运,这些效应在ICG-001存在时被抑制。qRT-PCR和Western blot检测AKBA+ICG-001组β-catenin和Axin-2 mRNA和蛋白表达较AKBA组明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）,同时成骨标志物Runx-2,Osterix,OCN和ALP的表达较AKBA组明显降低,具有统计学差异（p<0.05）。AKBA+ICG-001组中碱性磷酸酶染色阳性细胞数与茜素红染色检测到的钙结节数一致,均比AKBA组明显减少,差异具有显着性（p<0.05）。上述结果均表明,AKBA可促进Ti颗粒干预成骨细胞的分化成熟和矿化,但这些作用可被ICG-001所阻断。结论:AKBA治疗可通过GSK-3β/β-catenin信号通路的激活来促进钛颗粒干预下成骨细胞的分化和矿化,并可被ICG-001所阻断。
蒋宁宁[4]（2020）在《氟对骨细胞调控成骨作用的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:氟元素对人体健康不可或缺,但摄入过量的氟可引起人体生理及病理的变化,从而对身体造成损害。地方性氟中毒是我国流行最为广泛、病情最为严重的地方病之一。氟主要侵犯骨组织,氟斑牙和氟骨症是地方性氟中毒的特征性损害。成年人体内99%的氟化物都存在于钙化组织（主要是骨骼）中,过量氟暴露引起的氟骨症与代谢性骨转换密切相关。研究者已经证明了氟骨症病变在不同条件下也会有活跃进展时期或相对静止时期;就其进展时期而言,无疑是处于高骨转换状态骨代谢的主要形式或骨重建循环,即破骨细胞通过分泌酸性物质溶解旧骨,从而发挥骨吸收功能;成骨细胞通过分泌、合成以及矿化骨基质来形成新骨,从而发挥骨形成功能。大量研究表明骨细胞直接参与骨形成和骨重建过程,其通过影响破骨细胞和成骨细胞的分化成熟来影响骨重建过程。近年来,有关氟骨症的基础研究热点多在于氟化物对成骨、破骨的调控机制上,对骨细胞的研究相对较少,而氟化物对骨细胞如何调控成骨作用的研究更是少见。甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）是由甲状旁腺细胞所分泌的能够调控机体内钙稳态的一种活性多肽类激素。大量研究证实,PTH能够通过影响成骨细胞和骨细胞来参与骨转换过程。因此本实验利用骨组织的三种主要类型细胞进行染氟实验研究,旨在探究氟化物在骨细胞调控成骨机制中的作用,并进一步分析PTH在其中的地位,从而为进一步深入研究氟骨症的发病机制提供理论基础。实验方法:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验研究:我们选取骨组织的三种类型细胞,即成骨细胞选择其祖细胞（BMSCs）和前体细胞系（MC3T3-E1）、破骨细胞前体（RAW264.7）和骨细胞（IDG-SW3）作为实验对象,进行以下实验:（1）利用小鼠的股骨来分离成骨细胞祖细胞,经流式细胞仪鉴定其表面受体,得到确认其为BMSCs细胞;利用核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）诱导破骨细胞前体7天后,进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）染色,确认其分化为TRACP阳性、多核的破骨细胞样细胞;利用矿化诱导液培养IDG-SW3细胞1442天后,采用Western Blot法检测到SOST蛋白表达阳性,确认其骨细胞特征;利用矿化诱导液培养成骨前体细胞728天,使其分化为成熟的成骨细胞;（2）利用浓度为0.00132 mg/L的氟离子处理成骨细胞、破骨细胞前体和骨细胞7天后,采用噻唑蓝（MTT）法检测骨组织中三种类型细胞的增殖活性。（3）利用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子联合其他条件处理三种细胞7天后,进行细胞的凋亡率分析。用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH（1-34）处理骨细胞7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 ng/mL转化生长因子β1（TGF-β1）处理破骨细胞前体7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L PTH或相同氟浓度联合10 ng/mL TGF-β1处理成骨细胞祖细胞7天。各个实验结束后,采用美国BD公司的Annexin V-FITC凋亡试剂盒进行检测,观察骨组织三种细胞的凋亡情况。（4）利用明显影响细胞活性的,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理成骨细胞7天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,成骨细胞中Wnt10b、β连环蛋白（β-catenin）、Smad3、磷酸化Smad3、甲状旁腺素1受体（PTH1R）、核心结合因子2（Runx2）蛋白的表达变化;（5）利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10nmol/L的PTH处理骨细胞12天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,骨细胞中Smad3、磷酸化Smad3、硬化蛋白（SOST）、Dickkopf相关蛋白1（DKK1）、Wnt10b、β-catenin蛋白的表达变化。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验研究:利用孔径为3.0μm Polyester Membrance Transwell小室组成共培养系统,进行以下共培养实验:（1）将成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响破骨细胞活性,浓度为4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。采用实时定量PCR法,检测两种共培养系统中骨细胞所分泌的SOST、DKK1、RANKL、骨保护素（OPG）基因的表达变化。（2）将成骨细胞祖细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体（比例为2:1）混合培养在下层。利用明显影响成骨细胞活性,浓度为0.5 mg/L的氟离子处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h后。采用Diff-Quick Stain试剂盒进行染色,观察上层成骨细胞祖细胞增殖数量的变化。（3）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体（比例为2:1）混合培养在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。上层成骨细胞通过碱性磷酸酶（ALP）染色检测其分化情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理7天后,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。（4）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞28天。上层成骨细胞通过茜素红染色检测其矿化结节形成情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理28天,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。（5）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h。采用实时定量PCR法,检测上层成骨细胞和下层骨细胞内相关基因的表达变化。实验结果:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验结果:（1）流式细胞仪鉴定成骨细胞祖细胞（BMSCs）表现为CD34/CD44双阳性信号,证明成骨细胞祖细胞具有成骨分化的潜能;破骨细胞前体（RAW264.7）经RANKL诱导7天后进行TRACP染色,破骨细胞前体表现为三核或多核的TRACP阳性细胞,表明其已诱导成为破骨细胞样细胞;IDG-SW3细胞经矿化培养液诱导1442天,采用Western Blot法检测骨细胞标志物SOST蛋白的表达情况。实验结果表明,IDG-SW3细胞从21天开始表达骨细胞标志物硬化蛋白,直至42天仍表达硬化蛋白,证明其分化成为骨细胞。后续均选取矿化28天的IDG-SW3细胞进行实验研究。（2）细胞活性实验表明:氟对成骨细胞祖细胞作用范围窄,抑制作用较显着;破骨细胞前体对氟化物的作用比较敏感;成骨细胞活性整体呈现“倒U型”趋势,即随着氟浓度增加,成骨细胞活性逐渐增加,达到峰值后又逐渐下降;与其他骨组织细胞类型比较,骨细胞对氟离子的耐受性较强。（3）细胞凋亡实验表明:高剂量的氟显着促进骨组织中三种主要类型细胞的凋亡,氟联合PTH显着促进骨细胞的凋亡,TGF-β1轻度提高了破骨细胞前体的凋亡率,但PTH和TGF-β1对成骨细胞祖细胞的促凋亡作用不明显。（4）染氟或染氟联合PTH处理成骨细胞7天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH不同程度的抑制了Wnt10b、β-catenin以及Runx2蛋白的表达,氟联合PTH处理与单独氟处理相比较,上面各因子的变化相类似。另外,染氟能够促进成骨细胞的Smad3蛋白的磷酸化。（5）染氟或染氟联合PTH处理骨细胞12天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH处理,不同程度的下调SOST蛋白的表达,而上调DKK1蛋白表达。低剂量氟可以不同程度的促进Wnt10b、β-catenin、Smad3和P-Smad3蛋白的表达。氟联合PTH作用与单独氟处理相比较,Wnt10b和β-catenin蛋白的变化相类似。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验结果:（1）成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别与骨细胞进行共培养,染氟或染氟联合PTH处理下层成骨细胞7天,基因表达水平分析的结果显示:成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显着下降,而DKK1基因的表达量正好与之相反,由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显着上升。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显着上升。而DKK1基因显着下降。另一方面,成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值在单独染氟或染氟联合PTH处理条件下均显着下降。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显着上升。（2）利用氟处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h,上层成骨细胞祖细胞的迪夫染色结果显示:Transwell小室上层的成骨细胞祖细胞的个数,在氟处理骨细胞与破骨细胞混合培养组最低。其余各阳性激活SOST组,包括染氟的骨细胞或骨细胞与破骨细胞前体混合培养组,成骨细胞祖细胞的细胞数量也呈下降趋势。（3）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体混合培养在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天或28天,上层成骨细胞的碱性磷酸酶、茜素红染色结果显示:单独氟化物处理,刺激骨细胞诱导成骨细胞分化和成熟;而氟联合PTH处理,显着降低了成骨细胞的ALP活性,但刺激骨细胞诱导成骨细胞成熟。骨细胞与破骨细胞前体混合培养,单独染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞,上层成骨细胞分化趋势不明显。（4）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天和28天,下层骨细胞在蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟处理7天和28天,均显着促进骨细胞中β-catenin蛋白表达的以及Smad3蛋白的磷酸化,均抑制了骨细胞标志物SOST蛋白的表达。单独染氟或染氟联合PTH处理7天,不同程度促进骨细胞内Wnt10b和DKK1蛋白的表达。对比之下,单独染氟或染氟联合PTH处理28天,对骨细胞DKK1蛋白的表达影响不大。单独染氟28天,骨细胞中Wnt10b蛋白的表达量下降,而染氟联合PTH作用进一步抑制了Wnt10b蛋白的表达。（5）染氟和染氟联合PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA技术降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h,基因表达水平分析的结果显示:Transwell小室下层骨细胞SOST表达干扰成功,表现为各处理组骨细胞的SOST基因水平明显下降。单独氟化物处理,以及氟联合PTH处理骨细胞内DKK1基因的表达量上升,也不同程度促进RANKL和OPG基因的表达。与空白对照组比较,Tranwell上层成骨细胞在单独染氟处理组成骨细胞的标志物Runx2基因成轻度下降趋势,而成骨细胞中Smad3和Wnt10b基因的表达量上升,并且β-catenin基因的表达增加较为显着。低剂量氟联合PTH处理骨细胞,成骨细胞内成骨标志物ALP和Runx2基因的表达量显着增加,同时成骨细胞中的Smad3、wnt10b基因的表达量也是升高的。结论:本研究表明氟虽然不能直接刺激成骨细胞内Wnt10b/β-catenin以及Runx2的蛋白表达,但可以介导骨细胞内SOST和Wnt10b蛋白来发挥作用。SOST在氟化物影响骨细胞调控成骨细胞分化方面扮演着重要角色,其中Smad3蛋白磷酸化、Wnt10b/β-catenin等因子参与了氟对骨细胞调控成骨细胞分化的机制。PTH不仅影响SOST,而且可以调节骨细胞内其他因子来发挥刺激成骨的作用。
刘青柏[5]（2020）在《Sufu基因敲除对破骨细胞分化及钛颗粒诱导骨溶解的作用和机制研究》文中研究说明第一部分 Sufu基因条件性敲除小鼠的构建及验证[目的]构建LysM-Cre+/+;Sufufx/fx小鼠,验证该Cre在髓系细胞中敲除Sufu基因的效率,并探讨敲除Sufu基因对Hedgehog（Hh）通路的影响。[方法]我们将由Lysozyme启动子控制表达Cre重组酶的雄性LysM-Cre+/+,Sufufx/+小鼠与雌性LysM-Cre+/+;Sufufx/+小鼠交配获得髓系细胞特异性的Sufu条件性敲除小鼠（LysM-Cre+/+;Sufufx/fx）;通过PCR鉴定小鼠的基因型;通过RT-PCR检测Sufu条件性敲除鼠和对照鼠脾脏中Sufu基因的表达水平;从上述小鼠骨髓中分离原代单核巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages,BMMs）,通过 RT-PCR检测Sufu及Hh通路靶基因的mRNA水平。[结果]（1）将Sufufx/fx小鼠和LysM-Cre+/+小鼠之间进行交配,获得LysM-Cre+/+.;Sufufx/+小鼠;再将雄性LysM-Cre+/+;Sufufx/+小鼠与雌性LysM-Cre+/+;Sufufx/+小鼠进行交配,获得LysM-Cre+/+;Sufufx/fx小鼠;（2）在脾脏中Sufu基因的mRNA的表达在SufuCKO组和Ctrl组中的值分别为（0.19±0.10）和（1.00±0.35）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;（3）在BMMs中Sufu基因的mRNA的表达在SufuCKO组和Ctrl组中的值分别为（0.18±0.01）和（1.00±0.02）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;（4）在BMMs中Gli1基因的mRNA的表达在SufuCKO组和Ctrl组中的值分别为（8.40±1.51）和（1.00±0.49）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;（5）在BMMs中Ptch1基因的mRNA的表达在SufuCKO组和Ctrl组中的值分别为（1.75±0.20）和（1.00±0.03）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）。[结论]Sufu作为Hh信号通路负向调控基因,起着抑制Hh信号通路的作用。当条件性敲除Sufu基因后,脾脏和BMMs中Sufu的表达明显降低,Hh信号通路激活,该信号通路中靶基因Gli1和Ptch1的表达增强。第二部分 在体外BMMs中条件性敲除Sufu基因抑制破骨细胞的形成及机制研究[目的]探讨在体外BMMs中条件性敲除Sufu基因对破骨细胞形成的抑制作用及其相关的机制研究。[方法]通过将LysM-Cre+/+;Sufufx/fx小鼠（SufuCKO组）和对照小鼠（Ctrl组）的BMMs在体外进行诱导培养,使用TRAP染色、鬼笔环肽染色和DAPI染色来检测破骨细胞的形成情况,使用RT-PCR检测破骨细胞相关基因的表达,使用Western-Blot方法对RANKL诱导小鼠BMMs细胞向破骨细胞分化过程中特异性的核蛋白NFATcl和C-fos进行检测。[结果]TRAP染色显示在体外BMMs中条件性敲除Sufu基因抑制了破骨细胞的形成,小鼠原代BMMs经RANKL诱导分化为破骨细胞的数目值在Ctrl组和SufuCKO组分别为（259.00±21.74）个和（72.33±9.98）个,相比较差异有统计学意义（P<0.01）;诱导分化为破骨细胞所占的面积百分比值在Ctrl组和SufuCKO分别为（0.64±0.09）%和（0.12±0.06）%,相比较差异有统计学意义（P<0.01）。鬼笔环肽染色和DAPI染色显示在体外BMMs中条件性敲除Sufu抑制了破骨细胞膜和核的形成,小鼠原代BMMs经过完整培养基的诱导分化为破骨细胞的数目值在SufuCKO组和Ctrl组分别为（54.00±3.74）个和（183.67±7.41）个,相比较差异有统计学意义（P<0.01）;诱导分化为破骨细胞所占的面积百分比值在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.12±0.02）%和（0.71±0.05）%,相比较差异有统计学意义（P<0.01）。在体外BMMs中条件性敲除Sufu抑制破骨细胞发育相关基因mRNA的表达,RT-PCR显示破骨细胞内的NFATc1 mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.29±0.02）和（1.00±0.05）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;C-fos mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.23±0.02）和（1.00±0.06）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;Oscar mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.22±0.01）和（1.00±0.03）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;Acp5 mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.25±0.02）和（1.00±0.04）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;Ctsk mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.27±0.01）和（1.00±0.08）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;Dcstamp mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.21±0.02）和（1.00±0.04）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;Atp6v0a3 mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.26±0.02）和（1.00±0.02）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;Atp6v0d2 mRNA表达情况在SufuCKO组和Ctrl组分别为（0.28±0.02）和（1.00±0.05）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）。条件性敲除Sufu抑制了体外破骨细胞特异性NFATc1和C-fos蛋白的表达。在诱导第1天后,Ctrl组和SufuCKO组C-fos蛋白的值分别为（1.88±0.07）和（1.38±0.12）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.01）;Ctrl组和SufuCKO组NFATc1蛋白的值分别为（2.90±0.35）和（1.99±0.10）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.05）。在诱导第3天后,Ctrl组和SufuCKO组C-fos蛋白的值分别为（2.38±0.26）和（1.52±0.17）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.05）;Ctrl组和SufuCKO组NFATc1蛋白的值分别为（3.74±0.42）和（2.56±0.34）,两者相比较差异有统计学意义（P<0.05）。[结论]在体外M-CSF和RANKL能够诱导破骨细胞形成及其相关基因表达、特异性蛋白的形成;在体外BMMs中条件性敲除Sufu基因抑制了 M-CSF和RANKL所诱导的破骨细胞的形成及其相关基因表达、特异性蛋白的形成。第三部分 在体内BMMs中敲除Sufu基因抑制了钛颗粒诱导的颅骨骨溶解[目的]构建小鼠颅骨骨溶解模型,探讨在体内BMMs中条件性敲除Sufu基因对磨损钛颗粒所诱导的骨溶解发生是否具有抑制作用。[方法]通过Micro-CT及三维重建观察小鼠颅骨溶解缺损状况,使用软件分析各组中颅骨BV/TV和ROI内的孔隙数目和空隙面积值。对骨组织切片进行HE染色,观察小鼠颅骨骨组织孔洞形成情况,使用Image Pro-Plus 6.0软件分析各组中小鼠颅骨孔洞形成的侵蚀面积值。通过TRAP染色观察颅骨中破骨细胞的形成情况,使用Image Pro-Plus 6.0分析各组中破骨细胞数目值。[结果]Micro-CT重建的图像显示,在Ctrl组中我们清楚地观察到在颅骨的矢状线处出现了钛颗粒诱导形成的骨丢失现象;在Sham组中,BV/TV和ROI内的孔隙数目和空隙面积分别为[（79.15±1.28）%、（20.67±3.40）个、（3.68±0.58）%];而Ctrl组中BV/TV、ROI内的孔隙数目和空隙面积分别为[（31.30±3.61）%、（94.33±6.55）个、（36.10±3.18）%],与Sham组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。SufuCKO组小鼠颅盖骨中BV/TV和ROI内的孔隙数目和空隙面积分别为[（70.91±1.77）%、（36.33±3.68）个、（10.29±0.93）%],与 Ctrl 组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。HE染色显示Ctrl组中小鼠颅骨表面可见明显较多的骨侵蚀孔洞形成,孔洞形态、大小不一;与Ctrl组相比,Sham组小鼠和SufuCKO组小鼠颅骨表面可见骨侵蚀孔洞形成明显减少,孔洞的数量减少及形态较小;小鼠颅骨孔洞形成的侵蚀面积值在Sham组和Ctrl组分别为（0.90±0.27）%和（43.48±4.93）%,差异有统计学意义（P<0.01）;颅骨孔洞形成的侵蚀面积值在SufuCKO和Ctrl组分别为（4.81±1.28）%和（43.48±4.93）%,差异有统计学意义（P<0.01）。TRAP 染色可见,Ctrl组中骨侵蚀区域出现了较多的TRAP阳性细胞,细胞的大小不一,形态不规则,此即为破骨细胞;SufuCKO组中TRAP阳性细胞数量较Ctrl组减少,细胞的形态也较Ctrl组的小;Ctrl组和Sham组中破骨细胞数目值分别为（44.17±4.37）和（4.00±1.41）,差异有统计学意义（P<0.01）;Ctrl组和SufuCKO组中破骨细胞数目值分别为（44.17±4.37）个和（9.50±1.98）个,差异有统计学意义（P<0.01）。[结论]在体内BMMs中条件性敲除Sufu基因可降低钛颗粒所诱导的孔洞的形成及骨溶解发生,起到了预防骨侵蚀的作用;小鼠颅骨骨溶解模型之中,在体内BMMs中条件性敲除Sufu基因能够抑制破骨细胞的形成,达到抑制钛颗粒诱导的颅骨骨溶解作用。
闵愈[6]（2020）在《二至丸对绝经后骨质疏松症的干预作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:明确二至丸对绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）大鼠骨形成与骨吸收的干预作用。从成骨细胞（osteoblast,OB）与破骨细胞（osteoclast,OC）角度证实二至丸药效,同时从体内与体外探究趋化素（chemerin）对PMOP的作用机制。方法:1.体内实验研究:70只SPF级SD雌性大鼠,随机分为假手术组、模型组、阿仑磷酸钠组、氟化钠组、二至丸组、女贞子组、墨旱莲组,每组均10只。采用大鼠卵巢切除术制备PMOP动物模型。8周后各组灌胃给药,剂量分别为阿仑磷酸钠组（1 mg/kg）、氟化钠组（5 mg/kg）、二至丸组（2 g/kg）、女贞子组（1 g/kg）、墨旱莲组（1 g/kg）,假手术组与模型组均给予等量生理盐水（5 mL/kg）,连续给药8周。采用Micro-CT扫描各组大鼠股骨的骨微结构,用双能X线吸收法（简称DXA）、椎体压缩法检测各组大鼠的骨质量。采用酶联免疫吸附（简称ELISA）检测给药后各组血清中BALP、TRACP-5b、β-catenin、RANKL、OPG、IL-1、IL-6及chemerin的分泌水平。采用实时荧光定量PCR（简称qPCR）检测给药后各组骨组织中RANKL、OPG、β-catenin及chemerin的基因表达水平。2.体外实验研究:用MTT比色法筛选二至丸、女贞子及墨旱莲对MC3T3-E1及RAW 264.7生长的最适宜浓度。建立成骨分化培养基进行诱导MC3T3-E1细胞向OB分化模型。用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导RAW 264.7细胞建立向OC分化模型。分组为对照组、模型组、二至丸组、女贞子组、墨旱莲组。分化培养结束后,用qPCR检测成骨分化标志指标OCN、RUNX2、ALP基因表达水平,及破骨分化标志指标CTSK、NFATc1、TRACP基因表达水平。提取BMSCs后置于IL-1β环境下培养,用ELISA检测炎性环境中chemerin分泌水平及二至丸对炎性环境中chemerin水平的影响;用qPCR检测chemerin mRNA表达水平。结果:体内实验部分:1.PMOP大鼠模型造模结果显示:DXA结果显示模型组大鼠BMD显着低于假手术组（P<0.05）,Micro-CT股骨二维图与DXA结果一致,证明PMOP大鼠模型造模成功。2.骨强度实验结果显示:骨微结构方面,Micro-CT股骨二维图示,与模型组相比,各给药组骨小梁数量增多,排列较致密有序,骨微结构修复明显。骨量方面,BMD与L5椎体压缩实验结果均显示,与假手术组相比,模型组大显着降低（P<0.01）;而各给药组与模型组比均明显升高（P<0.05,P<0.01）。3.ELISA检测血清中骨代谢标志物结果显示:与假手术组相比,模型组血清BALP、OPG、β-catenin分泌水平显着降低（P<0.01）,TRACP-5b、RANKL分泌水平明显升高（P<0.05）;与模型组相比,二至丸组、女贞子组与墨旱莲组血清BALP、OPG、β-catenin分泌水平明显升高（P<0.05,P<0.01）,TRACP-5b、RANKL分泌水平显着降低（P<0.01）。4.ELISA检测血清中炎症相关因子结果显示:与假手术组相比,模型组血清IL-1、IL-6分泌水平显着升高（P<0.05）;与模型组相比,二至丸组、女贞子组与墨旱莲组血清IL-1、IL-6分泌水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。5.qPCR检测骨组织中骨代谢标志物结果显示:与假手术组相比,模型组OPG mRNA、β-catenin mRNA表达明显减少（P<0.05）,RANKL mRNA表达显着上升（P<0.01）;与模型组相比,二至丸组、女贞子组与墨旱莲组OPG mRNA、β-catenin mRNA表达明显上升（P<0.05,P<0.01）,RANKL mRNA表达明显减少（P<0.05,P<0.01）。6.体内chemerin实验研究结果显示:模型组chemerin分泌及表达水平均较假手术组显着升高（P<0.01）。与模型组比较,二至丸组、女贞子组与墨旱莲组中chemerin分泌及表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。体外实验部分:7.MTT检测细胞活力结果显示:筛选出女贞子50μg/mL,墨旱莲50μg/mL,二至丸100μg/mL为MC3T3-E1、RAW 264.7后续给药浓度。8.qPCR检测MC3T3-E1成骨分化相关指标结果显示:与对照组相比,二至丸组、女贞子组、墨旱莲组的OCN、RUNX2、ALP mRNA表达显着上升（P<0.01,P<0.05）。9.破骨分化指标结果显示:与对照组相比,模型组破骨分化指标CTSK、NFATc1、TRACP mRNA表达显着上升（P<0.01）。与模型组相比,二至丸组、女贞子组、墨旱莲组的CTSK、NFATc1、TRACP mRNA表达均显着减少（P<0.01）。10.二至丸对炎性环境中chemerin水平影响结果显示:模型组chemerin分泌及表达水平均较对照组显着上升（P<0.01）。与模型组比较,二至丸组及墨旱莲组中chemerin分泌水平显着降低（P<0.01）。chemerin mRNA表达下降在二至丸组最为显着（P<0.01）。结论:二至丸及其单味药可有效提升骨形成并抑制骨吸收,从而改善PMOP的骨代谢异常状态,其作用机制可能与chemerin调控炎性因子影响骨重建相关。
王博伦[7]（2020）在《雷尼酸锶在磨损颗粒诱导小鼠假体周围骨溶解中的治疗作用及机制研究》文中研究说明第一部分雷尼酸锶抑制磨损颗粒引起的小鼠假体周围骨溶解目的探讨雷尼酸锶（Strontium ranelate,SR）,一种治疗绝经后骨质疏松的药物,对钛金属磨损颗粒诱导小鼠假体周围骨溶解的作用。方法选取雌性C57BL/6j小鼠42只,建立胫骨平台置入钛钉模型加关节腔内注射钛金属颗粒,采用随机数字表方法分为3组:对照组（Control）,雷尼酸锶低剂量治疗组（625SR组）和高剂量治疗组（1800SR组）,每组14只小鼠。Control组仅接受钛钉置入与钛颗粒注射,术后每天灌胃400μl等渗盐水;625SR和1800SR组,在模型建立术后,分别灌胃625或1800mg kg-1d-1SR。12周后,CO2箱处死各组小鼠进行取材,骨组织标本处理后行Micro-CT检测假体周围骨质溶解情况、骨小梁厚度和数量;苏木精与伊红染色观察组织病理学;免疫组织化学染色观察骨组织中RANKL与OPG蛋白的表达水平。结果扫描电镜观察显示钛金属颗粒呈多边形,形状及粒径大小不统一,Ti颗粒平均直径为3.13±1.65μm,其中93%的颗粒直径小于15μm,50%的颗粒直径小于2.6μm,20%的颗粒直径小于1.0μm;Micro-CT结果显示雷尼酸锶治疗组,钛钉假体周围的骨质溶解现象明显减轻,和对照组（0.731±0.057mm3）相比,SR625组假体周围骨量显着增加（0.808±0.035mm3,P<0.05）且SR1800组（0.936±0.034mm3,P<0.01）的骨量也显着增加。在骨体积分数方面,与对照组相比（33.71%±2.35%）,SR1800组BV/TV显着增加（43.06%±2.48%,P<0.01）而SR625组（37.49%±3.68%）骨体积分数增长与对照组相比无统计学差异。相反的,与对照组相比（41.12±2.18 1/mm）,在SR625组中观察到骨表面积密度显着下降（34.49±1.75 1/mm,P<0.01）且在SR1800组（31.83±0.77 1/mm,P<0.01）也有下降;在骨小梁生成上,与对照组相比（0.108±0.014 mm）,SR625组中骨小梁的厚度显着增加（0.190±0.033 mm,P<0.01）且SR1800组也显着增加（0.232±0.016mm,P<0.01）。此外,与对照组相比（1.761±0.097 1/mm）,SR625组中骨小梁的数量也显着增加（2.825±0.444 1/mm,P<0.01）并且SR1800组中（3.341±0.460 1/mm,P<0.01）也观察到骨小梁的数量显着增加。但在骨小梁分离距离上,雷尼酸锶治疗组与对照组相比无统计学差异;H&E染色与免疫组织化学染色则表明,雷尼酸锶可以缓解假体周围磨损颗粒引起的炎症反应,同时SR能增加OPG的表达,下调RANKL的表达,进而提高OPG/RANKL的比值,差异有统计学意义（p<0.05）。结论:雷尼酸锶可有效地促进新骨形成,抑制骨吸收,减轻磨损颗粒引起的炎症反应,抑制假体周围骨质溶解。另外,雷尼酸锶可下调RANKL/OPG的比率,揭示雷尼酸锶可能是一种潜在的防治人工关节无菌性松动的新药物。第二部分雷尼酸锶促进钛颗粒诱导的炎性成骨细胞增殖与分化目的建立体外无菌性松动细胞实验模型,观察钛颗粒刺激单核巨噬细胞系释放炎症细胞因子对成骨细胞增殖分化以及RANKL和OPG蛋白表达的影响,并探讨雷尼酸锶在磨损颗粒诱导的炎性成骨细胞中的作用。方法首先使用经高温高压消毒处理并去除内毒素的钛金属颗粒刺激小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7,收集含有炎症细胞因子的条件培养基。再以小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1为主要研究对象,分别以雷尼酸锶0.1、0.5、1.0m M和（或）含有炎症细胞因子的条件培养基处理,建立细胞水平无菌性松动实验模型。CCK-8法检测MC3T3-E1细胞增殖率;对硝基苯磷酸盐（p NPP）检测碱性磷酸酶ALP活性;使用成骨诱导培养基促进MC3T3-E1细胞分化,并用茜素红染色观察成骨细胞矿化能力;RT-PCR检测Rnux2、OCN、OPG、RANKL、SOST和GAPDH等基因m RNA表达含量;免疫荧光染色双染观察RANKL与OPG的亚细胞定位,以及雷尼酸锶与条件培养基对RANKL/OPG的影响;ELISA检测条件培养基中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症细胞因子的含量。结果Ti颗粒最适宜的刺激条件为1:100,24小时;将条件培养基与MC3T3-E1细胞共培养,经ALP活性检测,条件培养可使MC3T3-E1细胞ALP活性降低42.8%（p<0.01）;而应用了雷尼酸锶之后,雷尼酸锶可以恢复缓解由于条件培养基所造成的ALP活性降低,其中0.5m M SR作用最明显（75.5%,p<0.05）其次为1.0m M SR（60.9%,p<0.01）,而0.1m M SR对于ALP活性的恢复无作用,差异无统计学意义;成骨诱导培养基诱导MC3T3-E1细胞分化,在第2d使用RT-PCR检测Runx2与OCN的m RNA表达含量,对比Ti CM组可见雷尼酸锶治疗组（0.5m M）显着提高成骨成熟相关标志物的表达,并在第14d使用茜素红染色观察MC3T3-E1细胞的成骨矿化能力,结果表明Ti CM组红染区域明显较少,可观察到细胞密度较Cont CM对照组有所降低,而在雷尼酸锶治疗组,可见MC3T3-E1细胞矿化结节大量聚集红染,这表明雷尼酸锶可以促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的分化与矿化。RT-PCR检测RANKL与OPG基因m RNA的相对表达情况,另使用细胞免疫荧光技术对蛋白的表达情况进行亚细胞定位,可见雷尼酸锶在细胞水平同样可以调节RANKL与OPG蛋白的表达。结论:钛颗粒刺激RAW264.7细胞产生的条件培养基可以抑制小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的碱性磷酸酶活性与成骨矿化能力;0.5m M与1.0m M的雷尼酸锶可在短期与中长期缓解由于条件培养基所导致的成骨细胞活性降低,并促进成骨细胞增殖与分化,其可能作用机制为调控MC3T3-E1细胞中RANKL/OPG蛋白的表达。第三部分雷尼酸锶调控WNT/β-catenin信号通路治疗人工关节无菌性松动目的明确雷尼酸锶在无菌性松动细胞模型中对钛颗粒诱导的成骨细胞凋亡的作用,并探讨WNT/β-catenin信号通路在雷尼酸锶调控成骨细胞功能中的作用。方法无菌性松动细胞实验模型建立同第二部分。本部分以小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,通过转染含有TOPFlash与p-TK Green Renilla基因片段的质粒构建成骨细胞双荧光素酶报告基因系统,观察在雷尼酸锶与条件培养基干预下WNT/β-catenin信号通路的转录活性;在此基础上使用重组小鼠Wnt-3a蛋白和可与CBP蛋白结合特异性拮抗WNT信号通路的ICG-001,对WNT/β-catenin信号通路进行纵向激活与阻断;使用FITC标记的膜联蛋白V与PI双染再经流式细胞仪技术检测雷尼酸锶对成骨细胞凋亡的影响;Western blotting检测成骨细胞RANKL、OPG、SOST和β-actin等蛋白的表达水平。结果应用条件培养基与MC3T3-E1细胞共培养,可导致成骨细胞的凋亡,较对照组增加凋亡1.81倍,此作用在雷尼酸锶0.1m M与0.5m M的干预下有不同程度的恢复（0.1m M 1.65倍,0.5m M 1.27倍）,这表明条件培养基可诱导成骨细胞的凋亡,而雷尼酸锶可保护成骨细胞免受凋亡。另通过构建双荧光素报告基因系统我们得出,条件培养基可降低成骨细胞WNT/β-catenin信号通路的转录活性,但应用雷尼酸锶之后,被降低的WNT信号通路转录活性可被恢复,在阻断WNT信号转导通路后,此作用被减弱;Western blot实验则表明在应用雷尼酸锶之后,可见雷尼酸锶上调OPG,β-catenin蛋白表达水平,下调RANKL蛋白的表达,特别地我们发现雷尼酸锶可以降低成骨细胞中SOST蛋白的表达含量。结论:雷尼酸锶可以保护由于条件培养基所致的成骨细胞凋亡,且此过程很可能与其通过下调骨硬化蛋白,间接激活WNT/β-catenin信号转导通路有关。
王汉石[8]（2020）在《硫化氢对内毒素导致成骨细胞凋亡影响的研究》文中提出目的:慢性骨髓炎难治愈,给患者带来了巨大的痛苦和昂贵的经济负担。慢性骨髓炎的治疗周期需要多次手术而且较长的住院时间,很多病例难以完全根治,会影响患者的生活质量以及社会的经济发展。以往认为,金黄色葡萄球菌是骨髓炎中的主要致病菌。对慢性骨髓炎致病菌谱的研究总结可以发现,目前革兰阴性杆菌比例不断升高,所以对革兰阴性杆菌在慢性骨髓炎疾病发展过程中的具体机制应该进一步研究,为针对性的疗法提供新的思路。能够代谢有机硫化物的酶普遍存在于微生物中。微生物通过释放硫化氢使硫化氢参与到微生物的许多生理过程中,例如防御抗生素,信号传递和能量代谢。与微生物相似,人体内也有多种代谢产生硫化氢的酶。硫化氢被认为是继一氧化氮和一氧化碳以后的第三种内源性信号气体分子。然而,关于硫化氢在骨髓炎感染过程中的具体作用尚不清楚。第一部分研究拟探索几种慢性骨髓炎中常见的革兰阴性杆菌在体外及体内的硫化氢释放情况,确认其释放硫化氢的浓度,并为后续的研究提供理论及实验基础。在骨髓炎期间,由于骨基质合成减少和成骨细胞凋亡率增加,新骨沉积减少,导致骨质丢失。细胞外细菌成分可能会减少成骨细胞。细胞质炎性体激活可能与自分泌/旁分泌死亡受体配体信号协同作用以诱导细胞死亡。所以,控制感染骨细胞的凋亡途径可能是限制骨髓炎炎症损伤的一种有吸引力的新方法。革兰阴性菌的主要致病物为内毒素。内毒素可以通过直接或者间接作用促进成骨细胞凋亡。Caspase家族蛋白的高度表达是凋亡发生的重要标志。凋亡启动后,细胞内底物分裂、染色质浓缩、DNA断裂、以及最终细胞死亡。除了促凋亡作用的Caspase家族,细胞的凋亡过程还受到Bcl-2家族蛋白的抗凋亡作用。目前,针对细菌性骨破坏的有效治疗仅限于抗生素方案和外科手术策略来治疗感染性骨疾病。因此研究可能恢复成骨细胞功能下降的药物仍是预防感染性骨疾病骨质破坏的主要目标。第二部分研究通过探讨革兰阴性菌产生硫化氢对其引起成骨细胞凋亡的作用,试图为新的治疗方案提供新的思路。细胞的凋亡受其内在多种信号通路的调节。近年来,PI3K/AKT信号通路已被发现在细胞多项生理活动的调节过程中起到重要作用,研究发现AKT在多种细胞中起到抗凋亡作用。另外AKT通路还可以与其他信号通路互相作用,起到抑制凋亡的作用。AKT通路下游涉及到多个信号通路。NF-κB相关通路就是其中重要的一个信号通路。激活的AKT可以磷酸化的IKK,进而磷酸化与NF-κB相连的IκB。IκB作为转录因子可以调控一系列基因表达。对AKT通路的抑制会引起对NF-κB通路的抑制,进而使细胞中生存因子的表达降低,促进细胞凋亡。多个实验发现硫化氢可以抑制AKT的磷酸化,因此,第三部分实验要验证是否硫化氢通过抑制AKT磷酸化及下游NF-κB通路激活,促进了凋亡蛋白的表达,加剧了成骨细胞的凋亡。研究方法:在体外NB培养基中培养三种细菌大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌,分别用平板计数法制备106CFU/mL浓度的三种细菌悬液备用。将NaHS梯度稀释浓度,作为标准比较硫化氢在醋酸铅试纸上产生黑色沉淀的量。比较不同菌液和NaHS组37℃过夜后试纸上产生的黑色沉淀,估计三种细菌在培养基中产生硫化氢的量。取40只SD大鼠根据随机数法分出对照组和大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌三种细菌实验组,每组10只。腹腔麻醉后胫骨钻孔后根据分组注射入细菌悬液或无菌NB培养基。术后三周经腹腔过量麻醉处死。处死后取大鼠胫骨标本固定后进行HE染色。并取病灶周围组织进行组织硫化氢含量测定。培养MC3T3-E1和hFOB两种成骨细胞细胞系。将MC3T3-E1和hFOB分别用梯度浓度硫化氢供体单独处理或者与LPS共同处理,培养2天后进行MTT检测,比较硫化氢单独处理或者与LPS共同处理时对细胞增殖能力的影响。将成骨细胞分为三组:（1）对照组;（2）LPS单独处理组以及（3）LPS合并硫化氢共同处理组。对三组进行流式细胞学检测、Hoechst染色以及Western blot,观察不同情况成骨细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白表达情况。三组细胞处理后,更换成骨诱导培养基培养,进行ALP及qPCR检测,观察不同情况对成骨细胞成骨能力的影响。对三组进行免疫荧光及Western blot检测,观察不同情况下细胞中AKT/NF-κB通路相关蛋白的表达情况。应用AKT激活剂后,进行流式细胞学,qPCR,ALP及茜素红检测,进一步检验AKT通路在凋亡及成骨过程中的作用。结果:1、革兰阴性菌可以在体外释放硫化氢,本研究的三种革兰阴性菌:大肠杆菌、阴沟肠杆菌和克雷氏肺炎杆菌,在NB培养基中均可以产生硫化氢,而且产生硫化氢的浓度在50-100μM之间。大鼠骨髓炎模型HE染色后,在镜下可见三种细菌感染后的骨组织中可见炎症细胞浸润及骨小梁结构破坏,说明细菌感染造模成功。用硫化氢检测试剂盒检测。结果显示三种细菌感染后骨髓炎局部组织中的硫化氢浓度明显升高。上述实验结果表明,大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌三种慢性骨髓炎常见的革兰阴性菌在体内及体外均可以产生硫化氢。2、硫化氢促进LPS对成骨细胞的凋亡作用,而且加重LPS对成骨细胞增殖和成骨功能的抑制。用两种不同浓度的硫化氢供体分别处理两种成骨细胞,与对照组相比,两种成骨细胞的增值率在硫化氢0-100μM范围内均无明显降低。然而,硫化氢与LPS共同作用时,两组细胞系内的增值率均有所下降,而且呈剂量相关。说明硫化氢可以加重LPS对成骨细胞增殖的抑制效果。与LPS单独处理组相比,硫化氢与LPS共同处理组凋亡率降低而且的Hoechst染色结果显示凋亡细胞数增加,另外凋亡相关的蛋白表达也有所增加。这些结果都说明硫化氢可以促进LPS对成骨细胞凋亡作用。诱导成骨后的qPCR及ALP检验结果显示硫化氢及LPS组合组较LPS组中,成骨细胞成骨相关基因的表达以及产生ALP的量降低。这提示硫化氢能加强LPS对成骨功能的抑制。应用FAS特异性抑制剂后,成骨细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白表达降低,说明硫化氢过FAS凋亡通路影响成骨细胞的凋亡过程。3、硫化氢通过抑制AKT/NF-κB信号通路影响LPS对成骨细胞的作用。Western blot及免疫荧光结果显示,硫化氢抑制pAKT及p65蛋白表达。使用pAKT激活剂以后,pAKT表达明显升高。成骨细胞的凋亡率以及成骨能力都明显上升。另外硫化氢抑制COX-2的表达,这可能与硫化氢对成骨功能的抑制有关。结论:1、慢性骨髓炎中常见的革兰阴性菌在体外及体内都可以释放硫化氢,体外释放浓度在50-100μM之间;2、在硫化氢作用下,内毒素对成骨细胞的增殖与成骨作用起抑制作用;3、在硫化氢作用下,内毒素对成骨细胞的促凋亡水平提高;4、硫化氢与内毒素对成骨细胞的促凋亡机制与FAS凋亡通路有关;5、硫化氢通过抑制AKT/NF-κB通路引起对成骨细胞的促凋亡作用。
杨清毅[9]（2019）在《基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死实验研究》文中研究说明目的:基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对骨髓间充质干细胞增殖和成骨-成脂分化的影响,为临床治疗提供理论依据。方法:第一部分临床实验研究实验一:2015年5月至2016年4月从我院11例激素性股骨头坏死行人工关节置换术（实验组）和7例股骨颈骨折、股骨粗隆间骨折行人工关节置换或髓内固定术（对照组）患者术中从股骨近端抽取骨髓。实验经医院伦理委员会通过,术前每位患者均签署知情同意书。全骨髓培养法分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞,P3代用于实验研究。采用流式细胞仪进行表面抗原鉴定,CCK-8法、细胞周期检测两组细胞增殖情况,油红O染色鉴定其成脂能力,茜素红染色鉴定其成骨能力,RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、PPAR-γ的m RNA和蛋白表达差异,基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能发病机制。实验二:不同浓度梯度的骨碎补总黄酮干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞,分为0g/L骨碎补总黄酮组、10-1g/L骨碎补总黄酮组、10-2g/L骨碎补总黄酮组、10-3g/L骨碎补总黄酮组、10-4g/L骨碎补总黄酮组、10-5g/L骨碎补总黄酮组、10-6g/L骨碎补总黄酮组、10-7g/L骨碎补总黄酮组,干预7天,检测各组细胞增殖率,得到最佳干预浓度用于下序实验研究。再分别用最佳干预浓度骨碎补总黄酮及经典成骨诱导剂干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞,分为对照组、骨碎补总黄酮治疗组、经典成骨诱导剂组,干预21天后,检测各组ALP活性,茜素红染色及定量检定各组成骨能力,RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix的m RNA和蛋白表达差异,基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对激素性股骨头坏死患者BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。第二部分动物实验研究随机将160只雄性SD大鼠分为对照组、模型组和治疗I、II、III组,每组各32只。给予模型组地塞米松磷酸钠（30mg/Kg,T.w.）臀肌注射。治疗I、II、III组在模型组基础上同时给于骨碎补水煎剂正常浓度、浓缩5倍、浓缩10倍灌胃治疗,对照组采用生理盐水干预。12周后给予所有大鼠处死获取标本--股骨头组织和骨髓间充质干细胞用于检测。通过HE染色观察及Image J软件检测各组股骨头骨小梁面积、脂肪空泡面积及软骨厚度;通过股骨头轴向压力测试测定各组股骨头力学改变;通过全骨髓培养法体外分离、培养以上五组骨髓间充质干细胞,传代纯化,P3代用于实验研究。通过CCK-8、成骨-成脂定向诱导后I型胶原SP染色、茜素红染色、油红O染色及定量、ALP定量检测五组大鼠P3代骨髓间充质干细胞增殖功能变化和成骨-成脂分化情况,并通过RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix、PPAR-γ的m RNA和蛋白表达水平,进一步探讨基于Wnt/β-Catenin信号通路的激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。结果:第一部分临床实验结果实验一结果:1.两组hBMSCs细胞表面抗原检测结果:实验组各表面抗原（CD29、CD44、CD45、CD54、CD90）较对照组有显着性差异（P<0.05）。2.两组hBMSCs细胞增殖、细胞周期检测结果:实验组较对照组增殖能力明显下调（P<0.05）。3.两组hBMSCs细胞成骨-成脂定向诱导及定量检测结果:实验组较对照组成骨分化能力明显减弱,成脂分化能力增强,定量检测差异有统计学意义（P<0.05）。4.RT-PCR结果:实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2 m RNA的表达明显下调,成脂分化因子PPAR-γm RNA的表达明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）,Osterix m RNA的表达差异无统计学意义（P>0.05）。5.Western Blot结果:实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2蛋白的表达显着下调,成脂分化因子PPAR-γ显着上调,差异有统计学意义（P<0.05）。实验二结果:1.不同浓度骨碎补总黄酮干预激素性股骨头坏死患者hBMSCs 7天细胞增殖结果显示10-5g/L骨碎补总黄酮组细胞增殖率最高,与其他各组均有显着性差异（P<0.05）,为最佳干预浓度。2.ALP检测结果:较对照组,骨碎补总黄酮组(10-5g/L)和经典成骨诱导剂组干预1周、2周ALP活性明显增高（P<0.05）;经典成骨诱导剂组ALP活性较骨碎补总黄酮组高,但两者无显着性差异（P>0.05）。3.三组SONFH患者hBMSCs干预3周茜素红染色及定量检测结果:对照组钙结节染色结果呈阴性,相较对照组,骨碎补总黄酮组和经典成骨诱导剂组茜素红染色可见大量阳性钙结节,定量检测有显着性差异（P<0.05）;经典成骨诱导剂组和骨碎补总黄酮组钙结节定量检测有显着性差异（P<0.05）。4.三组SONFH患者hBMSCs各基因m RNA相对表达量RT-PCR检测结果:相较对照组,骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCs Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix m RNA的表达有显着性差异（P<0.05）。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两者之间Wnt10、β-Catenin、Runx2、Osterix m RNA的表达有显着性差异（P<0.05）;LRP5、Cyclin D1m RNA的表达无显着性差异（P>0.05）。5.三组SONFH患者hBMSCs各蛋白相对表达量WB结果:相较对照组,骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCs Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix蛋白表达有显着性差异（P<0.05）。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两组之间β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix蛋白表达也有显着性差异（P<0.05）。第二部分动物实验研究结果1.五组SD大鼠股骨头组织HE染色结果:与对照组相比,模型组骨小梁面积、最大软骨厚度明显减小,脂肪空泡面积明显增大,差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,治疗I、II、III组骨小梁面积和最大软骨厚度明显增大、脂肪空泡面积明显减少,差异均有统计学意义,尤其是治疗II组效果最佳（P<0.05）。2.五组SD大鼠股骨头生物力学测试结果:相较对照组股骨头,模型组和治疗I、II、III组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变弱,股骨头软骨下骨的最大位移明显增加,有显着性差异（P<0.05）;相较模型组,治疗I、II、III组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变强,股骨头软骨下骨的最大位移明显减小,有显着性差异（P<0.05）,尤其以治疗II、III组效果明显,二者之间无显着性差异。3.五组SD大鼠r BMSCs增殖结果:五组SD大鼠r BMSCs增殖曲线均呈现“S”型。相较对照组,模型组细胞增殖曲线下调最明显,有显着性差异（P<0.05）;相较于模型组,治疗I、II、III组细胞增殖曲线均上调,差异有统计学意义（P<0.05）,尤其以治疗II、III组上调明显。4.五组SD大鼠r BMSCs成骨功能检测结果:I型胶原SP染色、茜素红染色及定量、ALP活性检测结果显示相较对照组,模型组各指标明显降低;相较于模型组,治疗I、II、III组各指标明显增高,定量检测分析差异有统计学意义（P<0.05）,尤其以治疗II、III组效果明显,但二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR和Western Blot结果显示相较对照组,模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子及促进成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、Runx2、Osterix m RNA及蛋白表达均有明显下调,差异有统计学意义（P<0.05）;相较模型组,治疗I、II、III组各因子m RNA及蛋白表达均有明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）,尤以治疗II、III组效果明显。5.五组SD大鼠r BMSCs成脂功能检测结果:相较对照组,模型组油红O染色明显增强;相较于模型组,治疗I、II、III组明显减弱,定量检测分析差异有统计学意义（P<0.05）,尤其以治疗II、III组效果明显,但二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR和Western blot结果显示相较对照组,模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子Wnt10、β-Catenin m RNA及蛋白表达均有明显下调,PPAR-γm RNA及蛋白表达明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）;相较模型组,治疗I、II、III组Wnt10、β-Catenin m RNA及蛋白表达均有明显上调,PPAR-γm RNA及蛋白表达明显下调,差异有统计学意义（P<0.05）,尤以治疗II、III组效果明显。结论:1.激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能明显降低,成脂分化功能增强,符合“髓枯骨痿”中医理论,其机制可能与Wnt/β-Catenin信号通路抑制,Wnt10、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2下调,PPAR-γ上调有关。2.骨碎补可以通过促进激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能,减弱成脂分化功能而发挥治疗作用,符合“肾主骨生髓,补肾壮骨”中医理论,其机制也可能与激活Wnt/β-Catenin信号通路,上调促增殖及成骨分化因子（Wnt10、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix）、抑制成脂分化因子（PPAR-γ）表达有关。
邓鹏[10]（2019）在《大鼠成骨细胞LncRNA差异表达在激素性股骨头坏死中的中医药防治机理研究》文中提出目的:1.建立大鼠正常成骨细胞和激素诱导后成骨细胞模型。2.探究激素诱导后成骨细胞中差异表达的LncRNA,分析差异表达LncRNA可能的作用机制。3.探究LncRNA MEG3在激素诱导后成骨细胞中的作用机制,分析中药袁氏生脉成骨片在激素性股骨头坏死治疗中的作用机制。方法:1.选用10只新生SD大鼠乳鼠（出生后24小时）,采用酶交替消化法分离新生大鼠颅骨的成骨细胞并进行传代培养。生物倒置显微镜下观察原代培养的成骨细胞形态;并采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Ⅰ型胶原免疫荧光染色对培养的细胞进行鉴定。并在正常成骨细胞中加入10-6mol/L甲泼尼龙溶液进行诱导,72小时后收集细胞冻存备用。2.利用Arraystar大鼠LncRNA芯片V2.0芯片对正常成骨细胞和激素诱导后成骨细胞进行差异表达基因的筛查,采用实时定量PCR技术对其中10个具有明显差异表达的LncRNAs进行验证。利用基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路对差异表达的基因进行生物学功能和信号通路分析。3.构建过表达LncRNA MEG3载体,并转染成骨细胞。分为正常对照组和MEG3过表达组,利用CCK8法和流式细胞技术检测两组成骨细胞在不同干预条件下(10%空白血清组、10%空白血清+10-6mol/L甲强龙组和10%含药血清+10-6mol/L甲强龙组)的增殖和凋亡情况,利用Western-Bolt技术检测P53蛋白的表达情况。结果:1.培养出的细胞表现出了典型的成骨细胞形态特征,且碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Ⅰ型胶原免疫荧光染色均表现为阳性。2.根据基因芯片结果,与正常成骨细胞相比,激素诱导后成骨细胞中,共有8059个具有差异表达的LncRNAs,其中明显上调的LncRNAs有302个,明显下调的LncRNAs有151个（Fold change>2.0,P value<0.05）。具有差异表达m RNAs有20078个,其中明显上调的有548个,明显下调的有565个（Fold change>2.0,P value<0.05）。实时定量PCR验证发现了5个明显上调的LncRNAs（ENSRNOT00000076045、NR＿131064、uc.420+、XR＿147168和XR＿596946）和2个明显下调的LncRNAs（ENSRNOT00000061527和XR＿589471）表达结果与基因芯片结果一致。GO分析结果显示,差异表达基因中存在与激素反应相关基因,KEGG信号通路显示差异表达基因富集多条信号通路。3.LncRNA MEG3的相对表达量在MEG3过表达组中明显高于正常对照组（P<0.05）。且与正常对照组相比,MEG3过表达组中成骨细胞增殖能力显着下降,凋亡情况明显增强,P53蛋白的表达量明显提高（P<0.05）,但在中药干预后又可显着提高成骨细胞的增殖能力,减少细胞凋亡,降低P53蛋白的表达（P<0.05）。结论:1.采用酶交替消化法分离新生大鼠颅骨的成骨细胞并进行传代培养,可获得高质量和足够数量的成骨细胞。2.LncRNA MEG3在激素诱导后的成骨细胞中表达上调,并可以抑制成骨细胞增殖,且可能通过激活P53蛋白的表达而发挥其诱导成骨细胞凋亡的作用,未来有望成为诊断激素性股骨头坏死的新型生物标志物和生物学治疗的靶点。3.中药袁氏生脉成骨片可有效促进成骨细胞增殖,抑制成骨细胞凋亡,降低P53蛋白的表达,从而在激素性股骨头坏死的治疗中发挥作用,可为今后相关药物的研发提供新的参考依据。
二、阿仑磷酸钠对成骨细胞增殖、分泌和成骨功能的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、阿仑磷酸钠对成骨细胞增殖、分泌和成骨功能的影响（论文提纲范文）
（1）NiTi合金表面几种纳米结构涂层的构建及其腐蚀行为与生物学性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRCT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 生物医用材料的发展 |
| 1.2 生物医用NiTi合金研究现状 |
| 1.2.1 牙科领域 |
| 1.2.2 骨科领域 |
| 1.2.3 心血管领域 |
| 1.3 NiTi合金存在的问题 |
| 1.3.1 NiTi合金的免疫反应 |
| 1.3.2 NiTi合金Ni~(2+)的释放 |
| 1.3.3 NiTi合金的耐蚀性 |
| 1.3.4 NiTi合金的抗菌性能 |
| 1.4 NiTi合金的表面改性 |
| 1.4.1 离子注入 |
| 1.4.2 等离子喷涂 |
| 1.4.3 溶胶-凝胶法 |
| 1.4.4 渗氮处理 |
| 1.4.5 阳极氧化 |
| 1.4.6 水热处理 |
| 1.4.7 酸碱处理 |
| 1.5 课题研究意义和内容 |
| 第2章 Ni-Ti-O纳米孔涂层的制备及其腐蚀行为与生物学性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.2.3 样品制备及表征 |
| 2.2.4 耐腐蚀性测试 |
| 2.2.5 内皮细胞的培养 |
| 2.2.6 细胞毒性 |
| 2.2.7 细胞增殖 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 纳米孔表面形貌及成分表征 |
| 2.3.2 样品的耐腐蚀性 |
| 2.3.3 样品的细胞相容性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 Ni-Ti-O纳米纺锤体涂层的制备及其腐蚀行为与生物学性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 样品制备与表征 |
| 3.3.1 样品制备 |
| 3.3.2 样品形貌、组成及微结构表征 |
| 3.3.3 接触角测试 |
| 3.3.4 Ni~(2+)的释放 |
| 3.3.5 耐腐蚀性测试 |
| 3.3.6 细胞培养 |
| 3.3.7 成骨细胞毒性 |
| 3.3.8 成骨细胞增殖 |
| 3.3.9 碱性磷酸酶(ALP)活性 |
| 3.3.10 Ⅰ型胶原的分泌 |
| 3.3.11 细胞外基质矿化 |
| 3.3.12 内皮细胞黏附和骨架组装 |
| 3.3.13 内皮细胞形态 |
| 3.3.14 内皮细胞毒性 |
| 3.3.15 内皮细胞增殖 |
| 3.3.16 NO染色 |
| 3.3.17 VEGF酶联免疫测定 |
| 3.3.18 内皮细胞迁移 |
| 3.3.19 内皮细胞体外血管生成 |
| 3.3.20 巨噬细胞培养及生物学响应 |
| 3.3.21 巨噬细胞条件培养基对内皮细胞功能的影响 |
| 3.3.22 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 纳米纺锤体涂层的表征 |
| 3.4.2 样品的耐腐蚀性 |
| 3.4.3 样品表面理化性质对成骨细胞功能的影响 |
| 3.4.4 样品表面理化性质对内皮细胞的功能的影响 |
| 3.4.5 样品表面理化性质对巨噬细胞的功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 NaOH碱蚀制备纳米片涂层及其腐蚀行为与生物学性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料及试剂 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.3 样品制备与表征 |
| 4.3.1 样品制备 |
| 4.3.2 样品表征 |
| 4.3.3 接触角测试 |
| 4.3.4 Ni~(2+)的释放 |
| 4.3.5 耐腐蚀性测试 |
| 4.3.6 细菌培养基的配制 |
| 4.3.7 抗菌性能测试 |
| 4.3.8 细胞培养 |
| 4.3.9 样品表面成骨能力评估 |
| 4.3.10 样品表面内皮细胞功能评估 |
| 4.3.11 巨噬细胞培养及生物学响应 |
| 4.3.12 巨噬细胞条件培养基对内皮细胞功能的影响 |
| 4.3.13 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 样品表征 |
| 4.4.2 腐蚀行为 |
| 4.4.3 抗菌能力 |
| 4.4.4 样品表面理化性质对成骨细胞功能的影响 |
| 4.4.5 样品表面理化性质对内皮细胞功能的影响 |
| 4.4.6 样品表面理化性质对巨噬细胞细胞免疫调节的影响 |
| 4.4.7 巨噬细胞条件培养基对内皮细胞功能的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 KOH碱蚀制备纳米片和纳米片/纳米球复合涂层及其腐蚀行为与生物学性能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料及试剂 |
| 5.2.2 实验设备 |
| 5.3 样品制备与表征 |
| 5.3.1 样品制备 |
| 5.3.2 样品表征 |
| 5.3.3 接触角测试 |
| 5.3.4 Ni~(2+)的释放 |
| 5.3.5 耐腐蚀性测试 |
| 5.3.6 细胞培养 |
| 5.3.7 样品表面成骨能力评估 |
| 5.3.8 样品表面内皮细胞功能评估 |
| 5.3.9 巨噬细胞培养及生物学响应 |
| 5.3.10 巨噬细胞条件培养基对内皮细胞功能的影响 |
| 5.3.11 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 样品表征 |
| 5.4.2 腐蚀行为 |
| 5.4.3 样品表面理化性质对成骨细胞功能的影响 |
| 5.4.4 样品表面理化性质对内皮细胞功能的影响 |
| 5.4.5 样品表面理化性质对巨噬细胞功能的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 本论文创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）阿仑磷酸钠对大鼠成骨细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 成骨细胞的概述 |
| 1.2.1 成骨细胞的概念以及功能特点 |
| 1.2.2 成骨细胞增殖与分化的调控因子 |
| 1.3 骨质疏松症的概述 |
| 1.3.1 骨质疏松症的流行病学 |
| 1.3.2 骨质疏松症的诊断和分期 |
| 1.3.3 骨质疏松症的治疗 |
| 第2章 临床资料和方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验器材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验试剂的配制 |
| 2.3.2 SD系大鼠成骨细胞的培养 |
| 2.3.3 大鼠成骨细胞的传代培养 |
| 2.3.4 成骨细胞形态学观察 |
| 2.3.5 碱性磷酸酶染色 |
| 2.3.6 成骨细胞增殖实验 |
| 2.3.7 成骨细胞分化实验 |
| 2.3.8 阿仑膦酸钠对去势后雌鼠的影响试验 |
| 2.3.9 骨密度值测定试验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 成骨细胞形态学观察 |
| 3.2 用MTT法测定阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞增殖的影响 |
| 3.3 成骨细胞分化实验结果显示 |
| 3.4 阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞OPG和 RANKL的表达的影响 |
| 3.5 骨密度值测定试验 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 成骨细胞的体外培养 |
| 4.2 阿仑膦酸钠对于骨质疏松症的治疗作用 |
| 4.3 本实验阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞影响分析 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（3）乙酰基-11-酮基-β-乳香酸对钛颗粒诱导骨溶解成骨影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 乙酰基-11-酮基-β-乳香酸通过促进骨形成减轻钛颗粒引起的骨溶解 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙酰基-11-酮基-β-乳香酸对钛颗粒干预下成骨细胞功能的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 阻断GSK-3β/β-Catenin信号通路可抑制AKBA的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 调控成骨细胞分化和成骨的信号通路研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 人工关节假体周围骨溶解的机制,调节和治疗 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间科研情况 |
| 致谢 |
（4）氟对骨细胞调控成骨作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 代谢性骨病 |
| 1.1 代谢性骨病发病机制 |
| 1.2 代谢性骨病——骨质疏松症 |
| 1.3 代谢性骨病——侏儒症 |
| 1.4 代谢性骨病——骨软化症 |
| 第2章 骨细胞在代谢性骨病中的作用 |
| 2.1 骨细胞 |
| 2.2 骨细胞参与骨的生理性重建 |
| 第3章 氟骨症的机制研究进展 |
| 3.1 氟元素与氟骨症 |
| 3.2 氟骨症发病机理 |
| 第4章 成骨细胞在氟骨症中的作用 |
| 4.1 成骨细胞与骨形成 |
| 4.2 成骨细胞在氟骨症发病机制中的作用 |
| 第5章 研究设想及意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 单独培养骨组织细胞染氟实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验细胞株 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验器械 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 骨组织细胞的诱导培养及鉴定 |
| 1.2.1.1 小鼠骨髓成骨细胞祖细胞(BMSCS)的分离、培养及鉴定 |
| 1.2.1.2 IDG-SW3 细胞的矿化诱导培养及检测 |
| 1.2.1.3 RAW264.7 细胞的诱导培养及检测 |
| 1.2.1.4 MC3T3-E1 细胞的诱导培养 |
| 1.2.2 MTT法检测骨组织细胞的增殖活性 |
| 1.2.3 流式细胞仪检测骨组织细胞的凋亡率 |
| 1.2.4 Western Blot法检测成骨细胞内相关蛋白的表达 |
| 1.2.5 Western Blot法检测骨细胞内相关蛋白的表达 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 骨组织中BMSCs、IDG-SW3和RAW264.7 细胞的鉴定 |
| 1.3.1.1 BMSCs细胞上表面抗原的测定 |
| 1.3.1.2 IDG-SW3 细胞经矿化诱导成为骨细胞的测定 |
| 1.3.1.3 RAW264.7 细胞经RANKL诱导成为破骨细胞样细胞的测定 |
| 1.3.2 染氟不同时间不同浓度对骨组织中细胞增殖活性的影响 |
| 1.3.3 染氟不同浓度对骨组织中细胞凋亡的影响 |
| 1.3.4 染氟成骨细胞内特征性蛋白的表达变化 |
| 1.3.4.1 染氟成骨细胞内Smad3/P-Smad3以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表达 |
| 1.3.4.2 染氟成骨细胞内Runx2和PTH1R蛋白的表达 |
| 1.3.5 染氟骨细胞内调控成骨和破骨相关蛋白的表达 |
| 1.3.5.1 染氟骨细胞内SOST、 DKK1、以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表达 |
| 1.3.5.2 染氟骨细胞内Smad3/P-Smad3 蛋白的表达 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 共培养骨组织细胞染氟实验研究 |
| 2.1 共培养实验材料 |
| 2.1.1 共培养实验细胞株 |
| 2.1.2 共培养实验仪器 |
| 2.1.3 共培养实验试剂 |
| 2.1.4 共培养实验器材 |
| 2.2 共培养实验方法 |
| 2.2.1 PCR法检测成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别与骨细胞共培养系统中下层骨细胞特定基因的表达变化 |
| 2.2.2 激活骨细胞的SOST对成骨细胞祖细胞增殖的影响 |
| 2.2.3 成骨细胞与骨细胞共培养7 天 |
| 2.2.4 成骨细胞与骨细胞共培养28 天 |
| 2.2.5 干扰骨细胞中的SOST对成骨细胞活性的影响 |
| 2.2.5.1 筛选siRNA最适浓度 |
| 2.2.5.2 实验流程 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成骨细胞祖细胞和破骨细胞前体对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.1.1 成骨细胞祖细胞对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.1.2 破骨细胞前体对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.2 激活骨细胞中SOST经迪夫染色观察成骨细胞祖细胞的增殖 |
| 2.3.3 染氟骨细胞对共培养系统中成骨细胞分化的影响 |
| 2.3.3.1 通过碱性磷酸酶染色观察Transwell小室上层成骨细胞分化的情况 |
| 2.3.3.2 Transwell小室下层染氟7 天骨细胞内调控成骨相关信号通路因子的变化 |
| 2.3.4 染氟骨细胞对共培养系统中成骨细胞矿化成熟的影响 |
| 2.3.4.1 通过茜素红染色观察Transwell小室上层成骨细胞矿化结节形成的情况 |
| 2.3.4.2 Transwell小室下层染氟28 天骨细胞内调控成骨相关信号通路因子的变化 |
| 2.3.5 干扰骨细胞表达SOST对骨细胞内调控成骨、破骨相关因子的影响 |
| 2.3.5.1 siRNA最适浓度 |
| 2.3.5.2 干扰染氟骨细胞中SOST的表达对共培养系统中骨细胞内调控成骨、破骨基因表达的影响 |
| 2.3.5.3 干扰染氟骨细胞中SOST的表达对共培养系统中成骨细胞内相关因子表达的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三篇 讨论与结论 |
| 第四篇 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）Sufu基因敲除对破骨细胞分化及钛颗粒诱导骨溶解的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Sufu基因敲除小鼠的构建及验证 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LysM-Cre~(+/+);Sufu~(fx/fx)小鼠的构建及基因型鉴定 |
| 3.2 脾脏中Sufu基因的表达 |
| 3.3 BMMs中Sufu基因的表达 |
| 3.4 BMMs中Hh信号通路中Glil的表达 |
| 3.5 BMMs中Sufu基因敲除后Hh信号通路中Ptchl的检测 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 在体外BMMs中敲除Sufu基因抑制破骨细胞形成及机制研究 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.4 鬼笔环肽染色（F-actin belts染色）和DAPI染色 |
| 2.5 RNA提取与RT-QPCR (定量逆转录-聚合酶链反应） |
| 2.6 蛋白提取及Western-blot实验 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TRAP染色显示在体外BMMs中条件性敲除Sufu基因抑制了破骨细胞的形成 |
| 3.2 鬼笔环肽染色和DAPI染色显示在体外BMMs中条件性敲除Sufu抑制了F-肌动蛋白环的形成 |
| 3.3 在体外BMMs中条件性敲除Sufu抑制破骨细胞活化相关基因的mRNA表达 |
| 3.4 条件性敲除Sufu抑制了体外破骨细胞分化重要转录因子NFATc1和c-fos蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 在体内BMMs中敲除Sufu基因抑制了钛颗粒诱导的颅骨骨溶解 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Micro-CT显示在BMMs中敲除Sufu基因抑制了体内钛粒子诱导的骨溶解 |
| 3.2 HE染色显示在BMMs中敲除Sufu基因抑制了钛粒子诱导的骨组织孔洞形成 |
| 3.3 TRAP染色显示条件性敲除如/?基因抑制了钛粒子诱导的破骨细胞生成 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 人工关节置换术后骨溶解及假体松动的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（6）二至丸对绝经后骨质疏松症的干预作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 1 中医学对绝经后骨质疏松症的认识 |
| 2 现代医学对绝经后骨质疏松症的认识 |
| 3 二至丸防治绝经后骨质疏松症理论探讨 |
| 第二章 体内实验研究 |
| 1 绝经后骨质疏松症大鼠模型建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 2 二至丸对绝经后骨质疏松症大鼠骨强度的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 3 二至丸对绝经后骨质疏松症模型大鼠的效应评价 |
| 3.1 血清中骨代谢相关因子的浓度变化 |
| 3.2 骨组织中骨代谢相关因子mRNA的表达变化 |
| 4 二至丸对绝经后骨质疏松症大鼠的chemerin机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 第三章 体外实验研究 |
| 1 二至丸对成骨细胞分化的干预效应 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 2 二至丸对破骨细胞分化的干预效应 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 3 二至丸对炎性环境chemerin表达及分泌的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果、参加学术会议及获奖 |
| 致谢 |
（7）雷尼酸锶在磨损颗粒诱导小鼠假体周围骨溶解中的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 雷尼酸锶抑制磨损颗粒引起的小鼠假体周围骨溶解 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 雷尼酸锶促进钛颗粒诱导的炎性成骨细胞增殖与分化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 雷尼酸锶调控WNT/β-catenin信号通路治疗人工关节无菌性松动 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 人工关节无菌性松动药物治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（8）硫化氢对内毒素导致成骨细胞凋亡影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:对革兰阴性菌在体外及体内释放硫化氢能力的研究 |
| l 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂及器材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 革兰阴性菌培养及细菌悬液制备 |
| 2.2.2 革兰阴性菌体外释放硫化氢的检测 |
| 2.2.3 实验动物的饲养 |
| 2.2.4 实验动物的分组及骨髓炎模型制备方法 |
| 2.2.5 实验动物样品的采集 |
| 2.2.6 组织样品中硫化氢的测定 |
| 2.2.7 组织样品病理学观察 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 革兰阴性菌在体外可以释放硫化氢 |
| 3.2 革兰阴性菌在体内引发慢性骨髓炎 |
| 3.3 革兰阴性菌在体内可以释放硫化氢 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:硫化氢对内毒素诱导的成骨细胞凋亡及成骨分化能力的影响 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 主要试剂及器材 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞复苏 |
| 6.2.2 细胞换液和细胞传代 |
| 6.2.3 细胞冷冻保存 |
| 6.2.4 细胞计数 |
| 6.2.5 MTT细胞活性检测 |
| 6.2.6 细胞的形态学观察 |
| 6.2.7 Hoechst33342/DAPI细胞染色 |
| 6.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 6.2.9 细胞成骨诱导分化 |
| 6.2.10 Western blot检测 |
| 6.2.11 碱性磷酸酶试剂盒检测成骨能力 |
| 6.2.12 实时定量PCR检测 |
| 6.2.14 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 硫化氢及内毒素对成骨细胞增殖情况的影响 |
| 7.2 硫化氢及内毒素对成骨细胞凋亡情况的影响 |
| 7.2.1 硫化氢加重内毒素介导的成骨细胞凋亡 |
| 7.2.2 硫化氢对内毒素介导成骨细胞凋亡相关蛋白表达影响 |
| 7.2.3 FAS特异性抑制剂减轻硫化氢对内毒素凋亡的促进作用 |
| 7.3 硫化氢及内毒素对成骨细胞成骨情况的影响 |
| 8 讨论 |
| 第三部分:硫化氢影响内毒素诱导的成骨细胞凋亡及成骨分化能力的作用机制 |
| 9 前言 |
| 10 材料与方法 |
| 10.1 主要试剂和仪器 |
| 10.1.1 主要试剂及器材 |
| 10.1.2 主要仪器 |
| 10.2 实验方法 |
| 10.2.1 Western blot检测AKT/NF-κB通路表达情况 |
| 10.2.2 免疫荧光染色检测AKT/NF-κB通路表达情况 |
| 10.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 10.2.4 qPCR对 COX-2 及成骨分化相关基因表达进行检测 |
| 10.2.5 茜素红染色 |
| 10.2.6 碱性磷酸酶试剂盒检测成骨能力 |
| 10.2.7 统计学分析 |
| 11 实验结果 |
| 11.1 硫化氢通过抑制AKT/NF-κB通路表达来促进凋亡 |
| 11.2 激活AKT通路可以改善成骨细胞凋亡 |
| 11.3 激活AKT通路可以促进成骨细胞成骨能力 |
| 11.4 硫化氢抑制COX-2表达 |
| 12 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 引言 |
| 第一部分 临床实验研究 |
| 实验一 基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能的发病机制 |
| 一、研究对象 |
| 二、主要试剂耗材与仪器设备 |
| 三、实验方法 |
| 1.hBMSCs获取 |
| 2.传代 |
| 3.细胞冻存 |
| 4.两组 hBMSCs 流式细胞仪细胞表面抗原检测 |
| 5.两组 hBMSCs 细胞增殖率检测(CCK-8 法) |
| 6.两组 hBMSCs 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 7.两组 hBMSCs 成骨能力检测——茜素红染色及定量 |
| 8.两组 hBMSCs 成脂能力检测——油红O染色及定量 |
| 9.RT-PCR |
| 10.Western Blot实验 |
| 四、统计学分析 |
| 五、结果 |
| 1.两组 h BMSCs 细胞培养结果 |
| 2. 两组 h BMSCs 细胞表面抗原鉴定结果 |
| 3.细胞增殖检测结果--CCK-8 法 |
| 4.细胞周期检测结果--流式细胞仪 |
| 5.两组 h BMSCs 成骨定向诱导后茜素红染色及定量结果 |
| 6.两组 h BMSCs 成脂定向诱导后油红 O 染色及定量结果 |
| 7.RT-PCR结果 |
| 8.Wstern blot结果 |
| 实验二 基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补总黄酮对激素性股骨头坏死患者BMSCs增殖、成骨-成脂分化的影响 |
| 一、主要实验试剂、耗材及仪器 |
| 二、实验方法及步骤 |
| 1. 激素性股骨头坏死患者 h BMSCs 获取、培养、传代方法(同实验一) |
| 2. 干预分组方法 |
| 3. ALP 活性定量检测 |
| 4. 茜素红染色及定量(方法同实验一) |
| 5.RT-PCR 检测 |
| 6.Western blot 检测 |
| 三、统计学分析 |
| 四、结果 |
| 1.不同浓度骨碎补总黄酮干预SONFH患者hBMSCs细胞增殖结果 |
| 2.ALP活性检测结果 |
| 3.茜素红染色及定量检测结果 |
| 4.RT-PCR结果 |
| 5.WB 结果 |
| 讨论 |
| 一、激素性股骨头坏死基于“髓枯骨痿”理论的中医认识 |
| 二、骨髓间充质干细胞与激素性股骨头坏死 |
| 1.骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定 |
| 2.两组骨髓间充质干细胞增殖活性的改变 |
| 3.两组骨髓间充质干细胞成骨-成脂活性的改变 |
| 三、激素性股骨头坏死基于Wnt/β-Catenin信号通路的现代研究 |
| 1.Wnt/β-Catenin信号通路与激素性股骨头坏死 |
| 2.Wnt/β-Catenin信号通路下游调控蛋白Cyclin D1、Runx2、Osterix、PPAR-γ功能及在激素性股骨头坏死中的作用机理 |
| 四、基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死疗效 |
| 1.补肾与激素性股骨头坏死 |
| 2.骨碎补药理学研究 |
| 3.骨碎补基于Wnt/β-catenin信号通路治疗SONFH |
| 结论 |
| 第二部分 动物实验研究 基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨大鼠SONFH可能机制及骨碎补对r BMSCs增殖、成骨-成脂分化影响的研究 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物及药物 |
| (二)主要实验试剂、仪器及主要溶液配制 |
| 二、试验方法 |
| (一)分组和造模 |
| (二)各组SD大鼠股骨头组织获取及HE染色 |
| (三)各组SD大鼠股骨头生物力学测试 |
| (四)各组rBMSCs增殖情况 |
| (五)各组rBMSCs成骨-成脂分化功能改变 |
| 三、统计学分析 |
| 四、结果 |
| 1.五组大鼠基本情况 |
| 2.各组股骨头组织及HE染色结果 |
| 3.各组SD大鼠生物力学测试结果 |
| 4.各组P3代r BMSCs生长情况 |
| 5.各组rBMSCs增殖情况(CCK-8 法) |
| 6.成骨功能改变 |
| 1 )I型胶原SP染色及定量检测结果 |
| 2 )茜素红染色及定量结果 |
| 3 )ALP定量检测结果 |
| 4 )RT-PCR结果 |
| 5 )WB结果 |
| 7.成脂功能改变 |
| 1 )油红O染色及定量检测结果 |
| 2RT-PCR 结果(Wnt10b β-Catenin PPAR-γ) |
| 3 )WB结果 |
| 讨论 |
| 一、激素性股骨头坏死动物模型的建立 |
| (一)造模动物的选择 |
| (二)造模方法的选择 |
| (三)动物模型造模鉴定及疗效评价 |
| 二、基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对SD大鼠激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖、成骨-成脂分化的影响 |
| (一)不同梯度的骨碎补对SD大鼠激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖的影响 |
| (二)基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对SD大鼠激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化的影响 |
| 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 激素性股骨头坏死的机制探讨与治疗选择 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
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（10）大鼠成骨细胞LncRNA差异表达在激素性股骨头坏死中的中医药防治机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 股骨头缺血性坏死在中医药领域的研究概况 |
| 一、病名 |
| 二、病因病机 |
| 三、辨证分型 |
| 四、股骨头缺血性坏死的中医药治疗研究概况 |
| 第二节 股骨头缺血性坏死在现代医学领域的研究概况 |
| 一、定义 |
| 二、流行病学研究 |
| 三、病因病机研究 |
| 四、诊断分型 |
| 第三节 长链非编码RNA的研究概况 |
| 第二章 大鼠成骨细胞的原代培养、鉴定及激素诱导成骨细胞模型的建立 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 激素诱导后大鼠成骨细胞LncRNA差异表达研究 |
| 第一部分 激素诱导后大鼠成骨细胞LncRNA表达谱分析 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 第三节 结果 |
| 第二部分 差异LncRNAs在激素诱导后大鼠成骨细胞中的表达验证 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 激素诱导后大鼠成骨细胞中LncRNA MEG3及袁氏生脉成骨片的作用机制研究 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、阿仑磷酸钠对成骨细胞增殖、分泌和成骨功能的影响（论文参考文献）
- [1]NiTi合金表面几种纳米结构涂层的构建及其腐蚀行为与生物学性能研究[D]. 赵亚. 太原理工大学, 2021(01)
- [2]阿仑磷酸钠对大鼠成骨细胞的影响[D]. 赖蔚文. 南昌大学, 2020(08)
- [3]乙酰基-11-酮基-β-乳香酸对钛颗粒诱导骨溶解成骨影响及机制研究[D]. 王振. 苏州大学, 2020(06)
- [4]氟对骨细胞调控成骨作用的研究[D]. 蒋宁宁. 吉林大学, 2020(08)
- [5]Sufu基因敲除对破骨细胞分化及钛颗粒诱导骨溶解的作用和机制研究[D]. 刘青柏. 苏州大学, 2020(06)
- [6]二至丸对绝经后骨质疏松症的干预作用及机制研究[D]. 闵愈. 湖北民族大学, 2020(12)
- [7]雷尼酸锶在磨损颗粒诱导小鼠假体周围骨溶解中的治疗作用及机制研究[D]. 王博伦. 宁夏医科大学, 2020(02)
- [8]硫化氢对内毒素导致成骨细胞凋亡影响的研究[D]. 王汉石. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死实验研究[D]. 杨清毅. 山东中医药大学, 2019(05)
- [10]大鼠成骨细胞LncRNA差异表达在激素性股骨头坏死中的中医药防治机理研究[D]. 邓鹏. 广州中医药大学, 2019(05)