一、眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒四个神经毒组份的纯化和某些性质的研究（论文文献综述）
刘锦花[1]（2018）在《中华眼镜蛇蛇（Naja atra）毒中的两种重要成分（氨肽酶和PLA2）的分离纯化及其性质研究》文中研究指明毒蛇咬伤（俗称蛇伤）被WHO规定为一种被忽视的热带疾病,其多发于热带或亚热带的贫困山村。蛇伤中毒常常给蛇伤患者带来身体损害、经济负担和心理恐慌后遗症等。蛇伤急救之首要前提是搞清蛇毒的组成成分及其致毒病理分子机制。研究表明,总体上看,蛇毒是一种复杂的混合物,含有多种酶、蛋白质、活性小肽及无机物等,因毒蛇种类不同其毒素成分有差异,依据毒性可以分为神经毒蛇毒、血循毒蛇毒以及混合毒蛇毒,其主要作用于蛇伤患者的神经、血液和肌肉系统,给他们带来在心血管系统、神经系统或肌肉系统等方面的损伤或紊乱。因此搞清蛇毒的组成成分及其功能对于蛇伤的急救是非常重要的。中华眼镜蛇（Naja atra）是我国引发蛇伤高发的毒蛇种类之一,其毒液主要为神经毒与血液毒的混合类型,尽管对该蛇毒的研究报道较多,但对该蛇毒的全貌成分的构成仍然缺乏系统研究,尤其是氨肽酶成分研究缺乏。当前,还未有从中华眼镜蛇毒中鉴定出氨肽酶的报道,为此,本研究首次主要针对该蛇毒中的氨肽酶成分进行分离鉴定,拟鉴定出该酶;同时,由于蛇毒中存在多种类型的磷脂酶A2（PLA2）亚型,故对该蛇毒中的PLA2进行分离纯化与鉴定研究也有一定的意义。这些研究为弄清该毒蛇引发蛇伤致毒致病的分子机制奠定基础。我们通过系列实验后,现将获取的结果,归纳整理如下:一,通过咬皿法采取新鲜毒液,经低温冻干后,将中华眼镜蛇毒进行HiTrap-Sepharos Fast Flow阳离子交换层析后,再将有氨肽酶活性的峰进行Amastatin-AH Sepharose 4B亲和层析,最终得到有氨肽酶活性的组分,该组分通过还原性SDS-PAGE分析鉴定,其呈现单一条带,其分子量约为150 kD,利用BCA蛋白法,测得纯化后最终所得目的蛋白浓度1.4 mg/ml。二,通过该氨肽酶组分的活性与性质实验表明:在研究pH值对氨肽酶活性的影响实验表明,该氨肽酶在反应体系的pH为8.5时,分解底物时活性最强;温度影响实验表明,该氨肽酶发生水解谷氨酸对硝基酰苯胺酸（Glu-pNA）的最适温度为35℃金属离子影响实验表明,有的金属离子(如Ba2+、Ca2+、Sr2+等)可明显增加氨肽酶水解Glu-pNA的活性,有金属离子(如Ni2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+以及Cd2+)则明显抑制氨肽酶水解Glu-pNA的活性,且当它们的离子浓度达到1 mM时,可完全抑制该氨肽酶水解Glu-pNA的活性;选用五种人工合成的底物Asp-pNA、Leu-pNA、Glu-pNA、Arg-pNA和Ala-pNA进行该氨肽酶组分的水解活性测试,结果表明,这五种底物中,Glu-pNA是最适的底物;通过中华眼睛蛇毒免疫鸡,从鸡蛋中获得抗蛇毒IgY抗体与该氨肽酶反应,实验表明,该氨肽酶组分与该IgY无明显中和效应,该结果提示该氨肽酶组分在中华眼镜蛇毒中的含量非常低,无法在该蛇毒免疫鸡时导致抗该氨肽酶组分的抗体产生。三,通过两步法,即Hi Trap-Sepharos Fast Flow阳离子交换层析和HPLC层析,从中华眼镜蛇毒中分离得到具有PLA2活性的组分,该组分通过SDS-PAGE鉴定为单一条带,其分子量大约为17 kD;该组分经HPLC分析呈单一峰。这些结果提示我们分离纯化得到的具有PLA2活性的组分为单一组分。四,采用磷脂酶活性检测法,测试该组分的酶活性以及温度、pH、金属离子对该酶活性的影响,实验表明,随pH升高,该酶水解鸡卵黄底物活性增强,且当pH为10左右时,水解活性最强;该酶水解鸡卵黄底物的最适温度为37℃。K+、Na+、Ca2+能增加PLA2的酶活性,而Zn2+、Fe2+能则抑制该酶的活性。五,我们通过用中华眼镜蛇毒免疫鸡,从鸡蛋中获得抗蛇毒的Ig Y抗体。把从该蛇毒中分离纯化PLA2组分分别与该Ig Y抗体进行中和能力实验,实验表明,PLA2组分与该Ig Y抗体有中和效应出现,并呈现量效关系,其ED50为4.568μg。结果提示,该蛇毒的PLA2组分含量较高,能在免疫鸡时产生抗PLA2组分的抗体。总之,本研究从中华眼镜蛇毒中获得两个重要组分氨肽酶和PLA2,并初步分析测试了它们的酶活力和部分性质,同时也初步评估了在该蛇毒免疫鸡时所产生的抗蛇毒Ig Y对这两个组分的中和能力,这些结果为制备抗蛇毒抗体和为进一步弄清该蛇毒致伤的分子机制提供了基础。但该两个组分的氨基酸序列和结构有待下一步研究。
李江兵[2]（2017）在《眼镜蛇神经毒镇痛小肽片段的作用机制研究》文中研究表明疼痛是各种疾病中最为常见的信号之一,给患者带来极大的痛苦,严重影响他们的工作和生活。目前,临床用于疼痛治疗的药物（如吗啡、可待因、芬太尼、哌替啶、舒林酸等）几乎均具有成瘾性、剂量依赖性、毒性等不良效应。因此天然类镇痛药物给疼痛患者带来了希望。在这类药物的研究中,蛇毒一直处于研究的热点。研究表明蛇毒神经毒素的镇痛活性良好,且具有无成瘾性、无剂量依赖性、镇痛时效长等优点,故蛇毒神经毒素是开发副作用小、无成瘾性等镇痛药物的潜在理想原料,但对其具体的作用机制尚未明确。以往的研究一般认为蛇毒的镇痛效应是由其毒性引起的,但近些年有研究表明蛇毒神经毒素的镇痛效应是通过中枢系统起效,与经外周神经系统起作用的毒性机制截然不同。另外,有研究表明口服蛇毒神经毒素具有镇痛效应,而且发现其中一些低神经毒性多肽具有显着的镇痛活性,故我们推测其镇痛活性中心与毒性中心可能是两个独立的组分,且镇痛组分不易被胃蛋白酶所分解。本文首先对文献中部分具有镇痛效应的蛇毒神经毒素的LD50和镇痛起效剂量的相关性作了分析,进一步确认两者间并非完全一致,表明蛇毒镇痛活性中心与毒性中心确有可能是两个独立区域。课题组前期的研究结果表明,来自中华眼镜蛇的短链神经毒蛋白short neurotoxin C/coborotoxin c（CBTc）具有相对很弱的神经毒性和显着的口服镇痛活性,意味着该神经毒素具有独立的、镇痛效应很强的活性中心,且该镇痛活性中心耐胃蛋白酶水解。鉴于此,对CBTc的氨基酸序列和结构进行分析,根据胃蛋白酶水解位点及其在三级结构上所处的位置,设计了具有10个氨基酸的10肽（KDHRGTRIER）,用热板法、醋酸扭体法、福尔马林注射法验证其确有镇痛活性,其LD50为8.4 g/kg,95%可信限为7.3-9.7g/kg,表明小肽的毒性很低或无毒性,进而验证了蛇毒镇痛活性中心与毒性中心可能是两个独立组分的推测。根据长链神经毒素也具有镇痛活性,故对10肽作相应改造,期望有更高的镇痛活性和更长的镇痛时效:包括增加Loop C前端氨基酸,预期能更全面结合靶蛋白;末端增加2个Cys,预期能自然氧化形成二硫键,能增加稳定性和活性。经热板法和醋酸扭体法测定改造肽的镇痛活性,结果显示16肽的镇痛活性明显高于13肽和15肽,且均高于10肽,表明设计的肽达到了预期的目的,也验证了我们的假设。5-TAMRA标记10肽在无疼痛模型、右腿疼痛模型、左腿疼痛模型的成像结果显示,我们可初步推断镇痛小肽在灌胃和腹腔注射两种给药方式中的镇痛机制具有差异性:镇痛小肽灌胃给药具有镇痛活性可能与胃肠道的特殊受体或离子通道相关;在腹腔给药后起到镇痛效应可能与背根神经节密切相关;标记小肽的荧光富集于疼痛部位,初步推测该镇痛小肽可能是主动镇痛。
张迎征[3]（2016）在《野生与人工养殖的中华眼镜蛇（Naja Atra）毒液的比较研究》文中指出近年来,中华眼镜蛇的食用和药用等价值逐渐被重视,但由于多种因素导致野生中华眼镜蛇数量减少,因此,为达到满足市场需求和保护野生动物等目的,目前普遍采用人工饲料喂养和无冬眠快速养殖等技术大量养殖中华眼镜蛇。但是,已有报道指出野生与养殖毒蛇的毒液间存在一定差异,而目前为止,暂未见对其具体差异进行系统性比较分析的相关报道。蛇毒主要由几十种蛋白质（酶）或多肽构成的混合物（或“弹药库”）,这些蛋白或多肽是由毒腺细胞里的毒素基因转录翻译表达出的,已有研究表明编码这些毒素的基因是经过亿万年的加速进化被募集到毒腺细胞里产生的,进而造成毒素蛋白的差异性。因此,本研究从毒液组成、成分活性、毒理学研究、毒素基因的转录组水平、不同喂养的食物等方面对野生和人工养殖的中华眼镜蛇毒液进行了比较分析,为人工养殖中华眼镜蛇的蛇毒生产及其咬伤治疗所用的抗蛇毒血清生产提供理论支持或指导。本研究通过系统性研究与分析,得到以下结果:（1）SDS-PAGE比较结果:变性SDS-PAGE显示,野生比养殖的眼镜蛇毒液多一条蛋白带（95 kD）,且在55 kD处的蛋白含量较高;非变性SDS-PAGE显示,野生比养殖眼镜蛇毒液在170 kD处的含量高;RP-HPLC显示,野生比养殖眼镜蛇毒液在20min、50min处的出峰面积大。（2）酶活性比较结果:卵磷脂平板法进行PLA2活性测定,结果显示:上样量为30μg的野生的与养殖的眼镜蛇毒液水解卵磷脂后的透明圈平均直径分别为16.45 mm、18.38 mm;透明质酸平板法进行透明质酸酶活性测定,结果显示:上样量为30μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液水解透明质酸后的透明圈平均直径分别为12.81 mm、11.57 mm;亮氨酸为底物,测得上样量为10μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液L-AAO酶活性分别为0.341、0.397（用490 nm处吸光值表示活性大小）;PNPP为底物,测得上样量为30μg野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液的碱性磷酸单酯酶活性分别为0.199、0.184（405 nm处的吸光值表示活性大小）;碘化乙酰胆碱为底物,测得30μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液的乙酰胆碱酯酶活性分别为0.297、0.413（用405 nm处的吸光值表示活性大小）;Azo-casein为底物,测得30μg的野生的与养殖的眼镜蛇毒液的蛋白水解酶活性吸光值分别为0.104、0.106（630 nm处的吸光值表示活性大小）,二者活性无显着差异;AMP为底物,测得20μg的野生的与养殖的眼镜蛇毒液的5’-核苷酸酶活性,酶活力大小分别为82.17 U、75.83 U。（3）毒理活性比较结果:经小鼠足趾皮下注射8μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液后的足趾胀胀厚度分别为3.6 mm、3.86 mm;经小鼠尾静脉注射8μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液后镇痛时间分别延长至7.5 s、6.86 s;经小鼠腹腔注射野生的与养殖的眼镜蛇毒液引起LD50的量无明显差异,分别为0.79μg/g、0.81μg/g,但野生眼镜蛇毒液的致死速度比养殖的中华眼镜蛇毒液的快。（4）转录组分析结果显示人工养殖的中华眼镜蛇毒腺中5’-NT、L-AAO、蛋白水解酶、乙酰胆碱酯酶的表达量相对于野生的呈上调趋势;PLA2、3-FTX的表达量相对于野生的呈下调趋势。（5）养殖组中华眼镜蛇的食物不同,导致其生长速度存在一定差异:食用活小鼠的中华眼镜蛇其生长速度较慢,喂养人工饲料的蛇则生长速度较快。而非还原SDS-PAGE显示:食用活体小鼠的成蛇,其毒液蛋白比喂养人工饲料的成蛇的毒液蛋白多一条蛋白带（90 kD）;而食用活体小鼠的幼蛇,其毒液的大分子蛋白含量比食用人工饲料的幼蛇的高;喂食小鼠四个月后:喂食小鼠的养殖眼镜蛇毒液中的PLA2活性、蛋白水解酶活性比喂食人工饲料的高,喂食人工饲料的养殖眼镜蛇毒液中的透明质酸酶活性比喂食小鼠的高。
贺宜龙[4]（2014）在《眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定》文中研究表明蛇毒中含有多种具有药理作用的多肽及蛋白质,三指蛋白属于其蛋白家族中的一种。近年来,三指蛋白止痛无成瘾性、无依赖性,用量少,镇痛作用时间长等优点已不断引起人们的关注,揭示其镇痛机制,从而开发出选择性高、安全性好、副作用小的镇痛药已成为亟待解决的问题。本文旨在探寻基于蛇毒三指蛋白的镇痛小肽并研究其镇痛作用,将眼镜蛇毒进行胃蛋白酶水解后分离纯化,寻找可口服并能快速起效的镇痛小肽,为研究三指蛋白的镇痛机制奠定一定基础并为相关研究提供参考依据。本实验首先将眼镜蛇蛇毒进行沸水浴处理以获得含有三指蛋白在内的热稳定性高的碱性蛋白混合物,再模拟胃部条件不同时间梯度水解眼镜蛇蛇毒,用热板法检测不同水解时长的产物的镇痛活性;采用高效液相色谱对水解产物进行分离纯化以及纯度鉴定;用热板法观察所得小肽的镇痛作用。结果表明眼镜蛇蛇毒经胃蛋白酶适当水解后灌胃有显着镇痛效果,并且水解6 h后对小鼠灌胃的镇痛效果最好,10 min即可起效并且药效稳定维持至48h以上;腹腔注射组与灌胃组结果相反,随着水解程度的加深至彻底水解,腹腔注射水解混合小肽基本无镇痛效应。HPLC分离纯化后在12 min左右收集的组分经热板法验证与之前结果较一致,经纯化后进行MALDI-TOF鉴定,其分子量约为1267.727,比对数据库确定其氨基酸序列为KDHRGTRIER,合成此段小肽,通过对小鼠灌胃的镇痛实验效果来看,10 min即观察到明显痛阈提高,镇痛持续时间较长,可维持48 h,小鼠痛阈值可提高60%左右,与之前的结果较一致。初步认为我们已获得快速起效、镇痛药效时间长且可口服的镇痛小肽,其镇痛机制尚待进一步研究。
鄢航[5]（2013）在《广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测》文中研究表明眼镜蛇神经毒素（Neurotoxin, NT）是一种潜在的麻醉剂和解毒药物,在医用研究领域发挥巨大的作用。但由于蛇毒的产量小且分离难度大,限制了蛇毒在医用上的应用范围。因此,本研究旨在利用昆虫杆状病毒表达系统在体外获得具有镇痛活性的广西眼镜蛇蛇毒蛋白（Cobortoxin, CT）和凝脂酶A2（Phospholipase A2, PLA2）。分别利用分段克隆和反转录PCR的方法克隆了广西眼镜蛇CT和PLA2基因的编码序列。然后将携带和不携带His标签的CT和PLA2插入杆状病毒穿梭载体pFastBacTM Dual启动子PH和p10的下游,获得不携带His标签的重组质粒：pD-CT、pD-PLA2、pD-CT-PLA2和携带His标签的重组质粒：pD-H-CT、pD-H-PLA2、pD-HCT-HPLA2。将6种穿梭载体转入DH10Bac中,用抗生素（庆大霉素、卡那霉素和四环素）和蓝白斑筛选、PCR和测序鉴定,得到携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体：BM-CT、BM-PLA2、BM-CT-PLA2、BM-HCT, BM-HPLA2、BM-HCT-HPLA2。利用转染试剂CellfectinⅡ将携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体和空载体转入Sf9昆虫细胞,经PCR鉴定,成功获得了7种病毒颗粒。用病毒颗粒感染细胞,经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达,结果显示,在细胞裂解上清中检测到特异目的条带,提示目的蛋白是可溶的。分别利用电洗脱和Ni柱亲和纯化的方法成功从细胞裂解上清中纯化出不携带His标签的目的蛋白CT和PLA2和携带His标签的目的蛋白HCT和HPLA2。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性,结果显示：CT镇痛效果极显着（P<0.05）,并且Ni柱纯化的效果显着好于电洗脱（P<0.05）。HPLA2的镇痛效果不很明显（P>0.05）。
丁晓兰[6]（2013）在《中华眼镜蛇毒不同剂型和给药途径的镇痛作用研究》文中研究表明目的：研究中华眼镜蛇毒不同剂型和给药途径对ICR与昆明种小鼠的镇痛作用。方法：采用三种疼痛模型（冰醋酸致扭体反应、小鼠热板法致痛实验和甲醛致炎性疼痛反应）观察中华眼镜蛇毒的镇痛作用。结果：在扭体模型中，中华眼镜蛇毒水溶剂灌服给药大剂量组（270μg/kg）动物扭体次数明显减少（p<0.05）；在热板模型中，灌服给药0.5h，3.0h后大剂量组能延长动物对热引起的疼痛反应的潜伏期；在甲醛模型中，各剂量均能不同程度地抑制小鼠的舔足时间，以30μg/kg的效果最佳。中华眼镜蛇毒口腔速溶药膜剂口腔黏膜给药在三种疼痛模型中各剂量（大剂量90μg/kg、中剂量30μg/kg、小剂量10μg/kg）均产生不同程度的镇痛作用，尤其以大剂量（90μg/kg）效果最佳。中华眼镜蛇毒凝胶剂皮肤给药对扭体和甲醛致痛模型均无明显疗效，但足部局部给药可以产生一定的镇痛作用。中华眼镜蛇毒短链神经毒素灌服给药有一定的镇痛作用，在热板和扭体模型中大剂量镇痛效果（90μg/kg）优于小剂量（10μg/kg）和中剂量（30μg/kg），在甲醛模型中中剂量的镇痛效果不仅优于小剂量（10μg/kg）和大剂量（90μg/kg），而且强于阿司匹林阳性对照品。结论：中华眼镜蛇粗毒和纯化的短链神经毒素水溶剂灌服给药具有良好的镇痛作用；中华眼镜蛇毒口腔速溶药膜剂口腔黏膜给药各剂量具有不同程度的镇痛作用；中华眼镜蛇毒凝胶剂皮肤给药不能产生镇痛的效果，而通过足部局部给药可发挥一定的镇痛作用。中华眼镜蛇毒灌服给药、口腔黏膜给药、足部局部给药途径方便、安全范围大，具有进一步开发成新型镇痛药的潜力。
张慧[7]（2013）在《乌苏里蝮蛇磷脂酶A2的分离、纯化及性质测定》文中进行了进一步梳理蛇毒被誉为是自然界最集中的酶、活性蛋白质的来源之一，其蛋白质大多数是由具有各种催化活性的酶类组成的，目前已经发现近40种酶，许多酶已经得到了分离和纯化，这些酶，无论在生物化学研究还是在临床应用等实践中，都具有非常重要的意义。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一种重要的代谢和调节酶类，广泛分布于蛇毒、蜂毒和哺乳动物的组织中，它能够水解甘油磷脂的第二位酯酰键（Sn-2），将磷脂（磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等）水解生成溶血磷脂和游离脂肪酸[1-3]，在调节细胞内和细胞外的代谢中起着关键性的作用。根据存在的部位、氨基酸序列同源性和生化功能的特征，将PLA2超家族一般分为五种类型：分泌型（sPLA2）、胞质型（cPLA2）、非Ca2+依赖型（iPLA2）、血小板激活因子型（PAF-PLA2）、溶酶体型[4-9]。蛇毒中的PLA2具有广泛的药理学活性，由于各种蛇毒磷脂酶A2基因编码序列、蛋白表达调控机制不同，结构及生物学特性各异，可引起极为广泛的生理学效应，如神经毒性、肌肉毒性、心脏毒性、抗凝效应、促进或抑制血小板聚集、溶血活性、促水肿活性和引起惊厥等[10-15]。其中神经毒性和肌肉毒性是两种最主要的效应[16]。根据酸碱性，蛇毒PLA2可分为酸性、中性和碱性3类[17,18]。近年来，国内外有很多关于从具窍蝮蛇[19-21]、丛林巴西蝮蛇[22,23]、响尾蛇[24]、短尾蝮蛇[25]、尖吻蝮蛇[26]、竹叶青蛇、五步蛇[27]、眼镜王蛇[28]等蛇毒中分离出PLA2的报道，并进行了大量相关的生物学活性研究，已有280多种蛇毒PLA2的氨基酸序列被确定。对PLA2的分离纯化主要采用凝胶过滤，离子交换，高效液相等方法。如Julián Fernández[9]等利用CM-Sephadex C-25层析柱、DEAE-Sepharose层析柱、高效液相色谱RP-HPLC C8从具窍蝮蛇中获得一种分子量为14.2kD、PI为4.9的PLA2；Fuly AL等[23]利用丙烯葡聚糖凝胶Sephacryl S-200HR、C2∕C18反相色谱柱从丛林巴西蝮蛇中纯化出分子量为18kD、PI为5.4的PLA2；张维文等[28]采用CM-Sephadex C-25、Sephadex G-75、DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-75多步柱层析法从广东眼镜王蛇毒中得到一种分子量为14kD、pI=3.8的酸性PLA2；罗艳萍等[25]采用CM-Sephadex C-25、DEAE-Sepharose CL-6B、Sephacryl S-200、Sephadex G-75柱层析法从短尾腹蛇中得到分子量为17.6kD的PLA2；潘剑茹等[29]通过嗜硫色谱Sephadex G-75、Blue胶和POROS HQ20离子交换色谱，从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到分子量为14.4kD的酸性PLA2单体，PI为5.66；黄立峰[3]运用一系列色谱层析分离方法Sephadex G-50和SephadexG-150凝胶过滤色谱、CM-Sepharose FastFlow离子交换层析色谱及POROS CM4.6/100预装柱色谱层析从舟山眼镜蛇粗毒中分离获得一种分子量为13.3kD的PLA2；Yuping Yuan[30]等利用阴离子交换柱Q-Sepharose、阳离子交换柱S-Sepharose、C8反相HPLC等方法从澳大利亚铜斑蛇中得到一种分子量为15kD的PLA2。本文首先采用醇沉的方法除去大部分杂蛋白，然后通过两次Sephadex G-50凝胶过滤层析法从长白山乌苏里蝮蛇蛇毒复杂的组分中分离纯化出一种分子量约为16.2kD的PLA2单体，并对其磷脂酶活性进行分析研究，国内外尚未有利用此方法获得此种PLA2的研究。
梁倩[8]（2011）在《Cobratoxin镇痛及其机制的研究》文中研究指明目的:本实验旨在研究泰国眼镜蛇长链神经毒素cobratoxin的镇痛作用及其机制。方法:用热板法、von Frey法、福尔马林法、醋酸扭体法等行为学方法研究鞘内注射泰国眼镜蛇长链神经毒素cobratoxin对小鼠急性痛的镇痛作用。建立大鼠坐骨神经部分结扎（PSNL）的神经病理性疼痛模型,采用压爪-缩腿法和辐射热-缩腿法测定动物的机械痛阈和热痛阈;观察鞘内注射cobratoxin后PSNL大鼠痛觉过敏的变化;运用免疫组织化学,检测PSNL大鼠脊髓背角c-fos表达,计数Fos免疫反应阳性细胞;用药理学方法观察M4亚型毒蕈碱型胆碱受体（mAChR）拮抗剂托吡卡胺（tropicamide）和α7烟碱型胆碱受体（nAChR）拮抗剂甲基牛扁亭碱（methyllycaconitine,MLA）是否能翻转cobratoxin的镇痛作用,以探讨其相关机制。结果:（1）鞘内注射cobratoxin（5μg/kg）对小鼠由热、机械和化学刺激引起的多种急性痛都具有镇痛作用;而且,这种镇痛可以被静脉注射M4受体拮抗剂托吡卡胺所阻断。（2）PSNL大鼠术后第7天痛阈明显降低,出现机械痛敏和热痛敏;脊髓背角c-fos表达明显上调（P<0.01）,神经元处于激活状态。（3）PSNL大鼠鞘内注射不同剂量的cobratoxin（0.56μg/kg,1.12μg/kg,,4.5μg/kg）对机械痛敏具有剂量依赖性的抑制作用,脊髓背角c-fos表达也明显减少（P<0.001）。（4）PSNL大鼠鞘内注射M4受体拮抗剂托吡卡胺或者α7-N受体拮抗剂MLA均可明显翻转cobratoxin的镇痛作用和脊髓背角c-fos的表达。结论:cobratoxin对急、慢性痛具有镇痛作用;其镇痛机制涉及胆碱能系统的两大类受体（mAChR和nAChR）,尤其是M4和α7亚型受体介导了cobratoxin的镇痛作用。
马虎飞[9]（2011）在《中介蝮蛇毒组织损伤及粗毒抗血清的制备》文中提出中介蝮（Gloudius intermedius）属蝰科（Viperidae）蝮亚科（Crotalinae）亚洲蝮属（Gloydius）,广泛分布于我国西北、华北部分地区,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,它与分布区人民生活密切相关。蛇毒（snake venom）是蛇毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物,分别作用于不同的靶分子／靶细胞,可能造成多种中毒效应,包括肌肉组织损伤、出血、水肿、血压下降等。早在1979年,赵尔宓等人的研究发现,国产抗蝮蛇血清对中介蝮蛇毒没有中和作用,发现中介蝮的蛇毒组成与其它5种蝮蛇(短尾蝮（G. brevicaudus）、高原蝮（G. strauchii）、黑眉蝮（G. saxitilis）、乌苏里蝮（G. ussuriensis）及蛇岛蝮（G. shedaoensis）〕蛇毒相比有较大差异。由于中介蝮在北方分布广泛,危害大,目前还没有中介蝮蛇毒组织损伤方面的资料,加之缺乏特异性抗血清,这妨碍了蛇伤的有效治疗。研究内容及方法：（1）中介蝮粗毒对小鼠的毒理学效应及组织损伤,包括小鼠爪肿胀实验,粗毒皮下注射小鼠后,对肌肉组织（心肌、骨骼肌）损伤的形态学观察,大鼠尾静脉注射引起肌肉损伤后肌酸激酶（CK）释放检测,兔耳静脉注射后对血压的影响；（2）抗蛇毒血清的制备及中毒保护效果,包括将中介蝮粗毒与弗氏佐剂混合乳化,将其作为抗原免疫新西兰大白兔（初次免疫、5次加强免疫）后,收集兔抗血清,用免疫双向扩散法和间接ELISA法检测抗血清的滴度和效价,Western blot检测抗原结合特异性；（3）抗血清的中毒保护作用：将制备的抗血清按一定比例分别与致死剂量的蛇毒在体外混合孵育后,腹腔注射小鼠（体重18-20g）,24h后,根据小鼠存活率,计算抗血清对中介蝮蛇毒的解毒效应。结果及讨论：（1）小鼠注射中介蝮蛇毒1.5小后,发现小鼠爪部开始有肿胀,3小时后出现明显肿胀；（2）与对照组相比,小鼠腹腔注射中介蝮蛇毒12h后,骨骼肌中有部分肌原纤维被水解破坏,肌纤维排列无序,肌浆有溶解现象；心肌纤维排列无序,部分肌丝出现溶解,肌原纤维间隙加大,出现明显损伤。（3）尾静脉注射中介蝮蛇毒后,在3h-6h CK活力逐渐上升,6h达最高（1.174U/mL）,是注射前的7.2倍,之后逐渐下降；注射蛇毒后,血压90min后呈快速下降趋势,至120min时,血压已降至给药前的40%以下,与同期生理盐水组相比差异非常显着（P<0.01）,这与国内已经报道的中介蝮咬伤人后的中毒症状相符。（4）琼脂双向免疫扩散试验显示,抗体1：2、1：4、1：8倍稀释后,可见明显免疫沉淀线,表明在免疫接种第十五周时,兔血液中已经有高滴度的抗血清产生。（5）ELISA检测后发现,抗血清的有效效价不低于1：128000；而抗体Western blotting检测结果显示,阳性反应条带主要针对分子量14.4kD-18.4kD之间、41kD部位、70kD左右3组毒素部位,表明主要毒素蛋白刺激免疫系统产生了相应的抗体。（6）在体外中和后,兔抗血清为0.2mL以上时,对0.76mg/kg中介蝮蛇毒有明显的保护作用,一半以上的受试小鼠存活。可见抗血清能明显延迟小鼠死亡时间,有解毒作用。结论：本研究所得结果为将来开发抗中介蝮蛇毒血清,用于蛇伤治疗奠定了基础。
周升铭[10]（2011）在《舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1优化分离及其活性研究》文中研究表明背景和目的:细胞毒素（Cadiotoxins CTXs）是眼镜蛇毒中一类重要的活性蛋白,约占蛇毒总蛋白含量40%左右,它们的氨基酸序列和空间结构相当保守,但生物学活性却多种多样,如引起可兴奋性组织去极化[1]、溶解肿瘤细胞[2]、心脏毒性[3]和抗菌活性[4]等。不同地区、不同蛇种的蛇毒中含有不同的CTXs,且即使是同种蛇毒中也含有2～5个CTXs,它们的结构及生物学活性有一定差异[5] [6],对它们的结构与功能的研究是当今生物毒素研究的热点之一。本课题运用CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析一步法对舟山眼镜蛇蛇毒分离纯化,以提高分离效率和纯度;利用RP-HPLC内标法鉴定分离得到的单体;CTXs具有广泛的生物活性,如镇痛、抑制肿瘤增殖等,本研究利用热板法和醋酸扭体法初探CTX1的镇痛活性。利用125I同位素标记法观察在生理条件下和吗啡成瘾条件下,研究CTX1在体内的分布情况,对比两种情况下其脑组织内的分布情况,以考察在不同病理生理条件下,CTX1在血脑屏障的通透性。为进一步研究CTX1的药理作用打下基础。方法:一、舟山眼镜蛇毒CTX1层析分离的流速优化1.一步法对舟山眼镜蛇蛇毒进行纯化分离收集舟山眼镜蛇原毒样本,经采集处理后,运用CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析,研究不同洗脱速度对蛇毒蛋白分离纯化的影响。2. Sephadex G-25层析洗脱脱盐利用分子筛原理,将洗脱峰内含有的蛇毒蛋白和盐溶液洗脱分离。研究不同洗脱速度对脱盐效率和结果的影响。3.舟山眼镜蛇毒单体成分的鉴定采用RP-HPLC,内标法鉴定分离纯化的舟山眼镜蛇蛇毒单体,与标准品比较保留时间,确定分离单体的成分。二.CTX1的毒性及镇痛活性测定1.急性毒性实验Bliss法检测CTX1的LD50。通过预实验确定100%致死量和0%致死量。由高浓度开始,药物浓度依次稀释0.8倍,共设5个浓度梯度。给药后观察48h,记录死亡时间和中毒症状。2.急性疼痛实验运用热板实验和醋酸扭体实验测定CTX1对生理性疼痛的镇痛作用。三.CTX1的体内分布及对不同模型小鼠血脑屏障的通透性1.小鼠吗啡成瘾模型的建立采用吗啡剂量递增法建立小鼠吗啡成瘾模型,腹腔注射纳洛酮,观察小鼠的戒断症状以及体重变化,评价成瘾模型的是否成功。2. 125I同位素标记CTX1采用氯胺酮氧化法,将CTX1标记125I,利用Sephadex G-50分子筛将标记与未标记的125I分离;纸层析法检验125I的标记率。3.小鼠尾静脉注射125I- CTX1,不同的时间点取各脏器,检测cpm值,以比较CTX1在体内的分布情况;通过两种模型的对比,研究CTX1在不同病理生理条件下,通过血脑屏障的能力。四.统计分析采用t检验、χ2检验,SPSS软件等统计分析实验数据。结果:1.运用CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析一步法对舟山眼镜蛇蛇毒分离纯化,流速V=1.6ml/min时,分离结果理想,得到高纯度的蛇毒单体。2.运用RP-HPLC法,将分离的组分SV6与CTX1内标法对比,结果保留时间一致,判断组分SV6与CTX1为同一成分（注:文中用CTX1表示组分SV6）。3. CTX1急性毒性和镇痛活性的测定结果显示CTX1的LD50为4.33±0.56 mg/kg。CTX1具有良好的镇痛活性,具有剂量依赖性,治疗指数高。4.在生理条件下,CTX1在肾脏的分布最高,脑部的分布量很少;在吗啡成瘾模型条件下,CTX1在脑内的分布量明显增加。结论:1.舟山眼镜蛇原毒经CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析分离得到高纯度单体,洗脱流速为1.6ml/min时分离效果最佳。2. CTX1具有镇痛作用,且呈剂量依赖性。3. CTX1在生理条件下,较少通过血脑屏障;在吗啡成瘾模型小鼠,能明显通过血脑屏障。
二、眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒四个神经毒组份的纯化和某些性质的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒四个神经毒组份的纯化和某些性质的研究（论文提纲范文）
（1）中华眼镜蛇蛇（Naja atra）毒中的两种重要成分（氨肽酶和PLA2）的分离纯化及其性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景、目的与意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.2.1 中华眼镜蛇粗毒的制备 |
| 1.2.2 中华眼镜蛇粗毒的生物活性检测 |
| 1.2.3 蛇毒中氨肽酶的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 1.2.4 蛇毒中PLA_2的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 1.3 本研究技术路线 |
| 2 中华眼镜蛇粗毒的制备及其活性的测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器与设备 |
| 2.1.2 材料与试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.1.4 中华眼镜蛇粗毒的制备 |
| 2.1.5 中华眼镜蛇粗毒活性的检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 中华眼镜蛇蛇毒中蛋白含量 |
| 2.2.2 中华眼镜蛇蛇毒LD50的测定 |
| 2.2.3 氨肽酶和PLA_2活性检测 |
| 2.3 讨论 |
| 3 中华眼镜蛇毒中氨肽酶的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器与设备 |
| 3.1.2 主要材料与试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 步骤与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 氨肽酶的分离纯化 |
| 3.2.2 蛇毒中氨肽酶分离纯化效果及分子量的确定 |
| 3.2.3 蛇毒中氨肽酶浓度的测定 |
| 3.2.4 蛇毒中氨肽酶性质的的测定 |
| 3.3 讨论 |
| 4 蛇毒中PLA_2的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要仪器与设备 |
| 4.1.2 主要材料与试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 方法与步骤 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PLA_2的分离纯化 |
| 4.2.2 蛇毒中PLA_2分离纯化效果及目标组分纯度检测 |
| 4.2.3 PLA_2浓度的测定 |
| 4.2.4 PLA_2性质的测定 |
| 4.3 讨论 |
| 5 全文小结 |
| 6 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录A 作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况 |
| 致谢 |
（2）眼镜蛇神经毒镇痛小肽片段的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛的影响 |
| 1.2 疼痛机理 |
| 1.2.1 生理性疼痛 |
| 1.2.2 病理性疼痛 |
| 1.3 镇痛药物 |
| 1.3.1 抗炎镇痛药 |
| 1.3.2 中枢性镇痛药 |
| 1.4 蛇毒镇痛 |
| 1.4.1 蛇毒(Snake venom,SV) |
| 1.4.2 三指毒素(TFTs) |
| 1.5 三指毒素与烟碱型乙酰胆碱受体的相互作用 |
| 1.5.1 α-NTX及其结构 |
| 1.5.2 nAChRs的分类及结构 |
| 1.5.3 α-NTX与nAChRs的相互作用 |
| 1.6 研究三指毒素的意义 |
| 1.7 本文研究的主要内容和技术路线 |
| 1.7.1 本文研究的主要内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 设计10肽、合成并测定其镇痛活性 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛇毒神经毒素的镇痛活性中心与毒性中心的独立性分析 |
| 2.2.2 设计镇痛肽(10肽) |
| 2.2.3 合成10肽 |
| 2.3 测定10肽的镇痛活性 |
| 2.3.1 热板法 |
| 2.3.2 醋酸扭体法 |
| 2.3.3 福尔马林法 |
| 2.4 10肽的致死剂量(LD_(50))测定 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 合成10肽的纯度 |
| 2.5.2 合成10肽的镇痛活性 |
| 2.5.3 10肽的致死剂量(LD_(50)) |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 镇痛小肽的改造 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 镇痛小肽的改造及合成 |
| 3.3.2 测定改造肽的镇痛活性 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 热板法测定结果 |
| 3.4.2 醋酸扭体法测定结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 探究镇痛小肽的作用机制 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 标记小肽 |
| 4.2.2 标记小肽的浓度测定 |
| 4.2.3 标记小肽的镇痛活性鉴定 |
| 4.2.4 标记小肽的质谱鉴定 |
| 4.2.5 活体成像 |
| 4.2.6 疼痛模型 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 标记10肽的浓度 |
| 4.3.2 标记小肽(10肽)的质谱鉴定 |
| 4.3.3 标记小肽的镇痛活性 |
| 4.3.4 探究小肽的镇痛机制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（3）野生与人工养殖的中华眼镜蛇（Naja Atra）毒液的比较研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.2.1 野生与人工养殖的中华眼镜蛇的毒液组成及其生物活性比较研究 |
| 1.2.2 野生与人工养殖的中华眼镜蛇的毒腺细胞的转录组比较研究 |
| 1.2.3 不同食物对人工养殖的中华眼镜蛇及其毒液的影响研究 |
| 1.3 本研究技术路线 |
| 2 野生与人工养殖的中华眼镜蛇的毒液组成及其生物活性比较研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器与设备 |
| 2.1.2 材料与试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 方法与步骤 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 野生与人工养殖的中华眼镜蛇的毒腺细胞的转录组比较研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器与设备 |
| 3.1.2 材料与试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4 不同食物对人工养殖的中华眼镜蛇及其毒液的影响研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要仪器与设备 |
| 4.1.2 主要材料与试剂 |
| 4.1.3 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 不同食物对中华眼镜蛇体重的影响 |
| 4.2.2 SDS-PAGE的初步分离鉴定 |
| 4.2.3 酶活性测定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 全文小结 |
| 6 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛疾病 |
| 1.2 疼痛产生的机制 |
| 1.3 镇痛药 |
| 1.4 镇痛毒素 |
| 1.4.1 蛇毒(Snake venom,SV) |
| 1.4.1.1 蛇毒的镇痛机制 |
| 1.4.1.2 蛇毒类药物的应用 |
| 1.4.2 芋螺毒素(Conotoxin,CTX) |
| 1.4.3 河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) |
| 1.4.4 蜘蛛毒素(Spider toxin, ST) |
| 1.4.5 蝎毒素(Scorpion venom,SV) |
| 1.5 蛇毒三指蛋白(three-finger protein) |
| 1.5.1 蛇毒三指蛋白的结构多样性 |
| 1.5.1.1 额外的二硫键 |
| 1.5.1.2 N末端以及C末端的延伸 |
| 1.5.1.3 Bulongin以及相关毒素 |
| 1.5.1.4 三指蛋白的糖基化 |
| 1.5.1.5 非共价二聚物 |
| 1.5.1.6 共价二聚体 |
| 1.5.1.7 协同毒素 |
| 1.5.2 蛇毒三指蛋白的分类 |
| 1.5.3 蛇毒三指蛋白的功能位点 |
| 1.5.4 蛇毒三指蛋白的理化性质 |
| 1.5.5 蛇毒三指蛋白的应用 |
| 1.5.5.1 在镇痛方面的应用 |
| 1.5.5.2 在其他领域的应用 |
| 1.6 三指蛋白研究的目的及意义 |
| 1.7 研究的主要内容 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 第二章 眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 获取蛇毒三指蛋白 |
| 2.3.2 胃蛋白酶水解 |
| 2.3.3 给药方式 |
| 2.3.4 镇痛活性测定 |
| 2.3.5 HPLC法分离纯化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 蛇毒酶解液对小鼠进行腹腔注射及灌胃给药的影响 |
| 2.4.2 镇痛小肽的分离纯化 |
| 2.4.3 收集组分的镇痛活性 |
| 2.4.4 有效组分的纯化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 活性肽的鉴定与合成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 活性肽的鉴定 |
| 3.3.1.1 肽段纯化 |
| 3.3.1.2 质谱检测 |
| 3.3.1.3 查询条件 |
| 3.3.2 活性肽的合成 |
| 3.3.3 合成肽的镇痛活性测定 |
| 3.3.4 合成肽的HPLC |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 活性肽的分子量及氨基酸序列 |
| 3.4.2 活性肽的合成 |
| 3.4.3 合成肽的镇痛活性 |
| 3.4.4 合成肽与活性肽的液相色谱对比 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（5）广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 眼镜蛇神经毒素 |
| 1.1 眼镜蛇神经毒素的种类 |
| 1.2 眼镜蛇神经毒素的结构 |
| 1.3 眼镜蛇神经毒素的作用 |
| 1.4 眼镜蛇神经毒素分离纯化概述 |
| 2 眼镜蛇蛇毒蛋白 |
| 2.1 眼镜蛇毒蛋白的发现 |
| 2.2 眼镜蛇毒蛋白的结构 |
| 2.3 眼镜蛇毒蛋白的功能 |
| 3 凝脂酶A_2 |
| 3.1 蛇毒凝脂酶A_2的作用原理和结构 |
| 3.2 蛇毒凝脂酶A_2的作用 |
| 4 广西眼镜蛇概述 |
| 5 昆虫杆状病毒表达载体研究进展 |
| 5.1 昆虫杆状病毒转移载体和原理 |
| 5.2 昆虫杆状病毒表达系统的优越性 |
| 6 研究目的和意义 |
| 第二章 广西眼镜蛇CT和PLA_2基因的克隆和序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广西眼镜蛇血液的DNA提取 |
| 2.2 广西眼镜蛇毒腺RNA提取 |
| 2.3 广西眼镜蛇毒腺cDNA的内参基因(GAPDH)PCR检测 |
| 2.4 CT目的基因成熟肽序列的获得 |
| 2.5 PLA_2目的基因成熟肽序列的获得 |
| 2.6 两种基因四种pMD质粒的鉴定 |
| 2.7 测序结果 |
| 2.8 同源性分析 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 神经毒素基因来源的选择 |
| 3.2 成熟肽序列克隆方法的比较 |
| 3.3 神经毒素的保守性 |
| 3.5 小结 |
| 第三章 CT和PLA_2昆虫表达载体的构建和体外表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单基因真核穿梭载体构建 |
| 2.2 双基因共表达真核穿梭载体构建 |
| 2.3 重组Bacmid的筛选与鉴定 |
| 2.4 重组BacMid质粒提取 |
| 2.5 质粒浓度测定 |
| 2.6 Sf9细胞的培养 |
| 2.7 细胞病变情况观察 |
| 2.8 重组杆状病毒的DNA鉴定 |
| 2.9 目的蛋白表达的位置检测 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 转座过程中筛选效率 |
| 3.2 昆虫Sf9细胞培养 |
| 3.3 Sf9细胞的转染效率分析 |
| 3.4 眼镜蛇CT蛋白的分子大小分析 |
| 3.5 目的蛋白的表达量分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 CT和PLA_2蛋白的纯化和镇痛活性的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳 |
| 2.2 蛋白定量 |
| 2.3 各组的扭体次数 |
| 3 讨论和小结 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）中华眼镜蛇毒不同剂型和给药途径的镇痛作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、 炎性疼痛的形成 |
| 二、 动物模型 |
| 三、 中华眼镜蛇毒研究现状 |
| 四、 不同剂型和给药途径的优劣 |
| 五、 课题设计思路 |
| 第一部分 中华眼镜蛇粗毒的镇痛作用研究 |
| 第一节 中华眼镜蛇粗毒水溶剂口服给药的镇痛作用研究 |
| 一 实验材料 |
| 二、 实验方法 |
| 三、 数据处理 |
| 四、 实验结果 |
| 第二节 中华眼镜蛇粗毒口腔黏膜剂口腔黏膜给药的镇痛作用研究 |
| 一、 实验材料 |
| 二、 方法 |
| 三、 数据处理 |
| 四、 实验结果 |
| 第三节 中华眼镜蛇粗毒凝胶剂皮肤给药的镇痛作用研究 |
| 一、 实验材料 |
| 二、 实验方法 |
| 三、 数据处理 |
| 四、 实验结果 |
| 第四节 中华眼镜蛇粗毒凝胶剂足部给药的镇痛作用研究 |
| 一、 实验材料 |
| 二、 实验方法 |
| 三、 数据处理 |
| 四、 实验结果 |
| 第二部分 中华眼镜蛇短链神经毒素的镇痛作用研究 |
| 一、 实验材料 |
| 二、 方法 |
| 三、 数据处理 |
| 四、 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 眼镜蛇蛇毒的化学成分研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）乌苏里蝮蛇磷脂酶A2的分离、纯化及性质测定（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 蛇毒的毒性成分及毒理作用 |
| 1.2 磷脂酶 A_2 |
| 1.2.1 磷脂酶 A_2的一般性质 |
| 1.2.2 磷脂酶 A_2的来源分布 |
| 1.3 蛇毒磷脂酶 A_27 |
| 1.3.1 蛇毒磷脂酶 A_2的理化性质 |
| 1.3.2 蛇毒磷脂酶 A_2的分类 |
| 1.3.3 蛇毒磷脂酶 A_2的结构特征 |
| 1.3.4 蛇毒磷脂酶 A_2的酶活性 |
| 1.3.5 蛇毒磷脂酶 A_2的药理活性 |
| 1.3.6 蛋白质的分离纯化 |
| 1.3.7 蛇毒磷脂酶 A_2的酶活性检测方法 |
| 1.3.8 蛇毒磷脂酶 A_2的分离方法的进展 |
| 1.4 本论文的立题依据 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 分离纯化条件摸索 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Gloydius-PLA_2的分离纯化 |
| 2.2.2 Gloydius-PLA_2的相对分子量测定 |
| 2.2.3 Gloydius-PLA_2的浓度测定 |
| 2.2.4 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定方法一 |
| 2.2.5 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定方法二 |
| 2.2.6 Gloydius-PLA_2纤维蛋白原水解活性测定 |
| 2.2.7 Gloydius-PLA_2的最适 pH 测定 |
| 2.2.8 Gloydius-PLA_2致水肿活性测定 |
| 2.2.9 Gloydius-PLA_2出血毒活性检测 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 醇溶蛇毒蛋白经两次 Sephadex G-50 凝胶过滤色谱结果 |
| 3.2 Gloydius-PLA_2的电泳图谱及相对分子质量测定 |
| 3.3 Gloydius-PLA_2的蛋白浓度测定 |
| 3.4 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定一 |
| 3.5 Gloydius-PLA_2的磷脂水解活性测定二 |
| 3.6 Gloydius-PLA_2纤维蛋白原溶解活性测定 |
| 3.7 Gloydius-PLA_2磷脂水解活性最适 pH 测定 |
| 3.8 Gloydius-PLA_2致水肿活性测定 |
| 3.9 Gloydius-PLA_2出血毒活性测定 |
| 3.10 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）Cobratoxin镇痛及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料及方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 第一部分 Cobratoxin 对小鼠急性痛的镇痛作用及可能机制 |
| 第二部分 Cobratoxin 对大鼠慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及可能机制 |
| 一、坐骨神经部分结扎（PSNL）大鼠的痛阈变化和c-fos 表达 |
| 二、Cobratoxin 对PSNL 大鼠痛觉过敏和脊髓背角c-fos 表达的影响 |
| 三、Cobratoxin 对PSNL 大鼠镇痛作用的胆碱能机制 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）中介蝮蛇毒组织损伤及粗毒抗血清的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 附录:缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒组成及效应概述 |
| 1.1.1 蛇毒神经毒素 |
| 1.1.2 蛇毒金属蛋白酶—出血毒素 |
| 1.1.3 蛇毒丝氨酸蛋白酶 |
| 1.1.4 舒缓激肽增强肽 |
| 1.1.5 蛇毒肌肉毒素 |
| 1.2 蛇毒抗血清研究进展 |
| 1.2.1 抗蛇毒血清 |
| 1.2.2 抗蛇毒血清的种类及特点 |
| 1.2.3 抗血清的制备技术 |
| 1.2.4 抗血清的质量评价 |
| 1.2.5 抗蛇毒血清临床应用 |
| 1.2.6 抗蛇毒血清的将来发展 |
| 1.3 本论文的选题依据 |
| 第2章 中介蝮蛇毒组织损伤 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 水肿效应的测定 |
| 2.2.2 组织切片的分析 |
| 2.2.3 血清肌酶分析 |
| 2.2.4 血压检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 水肿形成 |
| 2.3.2 组织学分析 |
| 2.3.3 血清肌酸激酶检测 |
| 2.3.4 血压检测 |
| 第3章 中介蝮蛇毒抗血清的制备 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗原预处理 |
| 3.2.2 抗原乳化 |
| 3.2.3 动物接种 |
| 3.2.4 抗血清的收集 |
| 3.2.5 免疫双向扩散试验 |
| 3.2.6 间接ELISA法测定抗体效价 |
| 3.2.7 Western blot检测抗体特异性 |
| 3.3 实验结果及分析 |
| 3.3.1 抗体制备及免疫双向扩散试验 |
| 3.3.2 ELISA检测 |
| 3.3.3 Western blot结果 |
| 第4章 中介蝮粗毒兔抗血清的中毒保护作用 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 体外预实验 |
| 4.2.2 体外中和实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 体外预实验结果 |
| 4.3.2 体外中和与解毒作用 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 中介蝮蛇毒的局部组织损伤 |
| 5.2 中介蝮蛇毒液的兔抗血清制备 |
| 5.3 中介蝮蛇毒素抗血清的解毒作用 |
| 第6章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（10）舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1优化分离及其活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
四、眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒四个神经毒组份的纯化和某些性质的研究（论文参考文献）
- [1]中华眼镜蛇蛇（Naja atra）毒中的两种重要成分（氨肽酶和PLA2）的分离纯化及其性质研究[D]. 刘锦花. 重庆师范大学, 2018(01)
- [2]眼镜蛇神经毒镇痛小肽片段的作用机制研究[D]. 李江兵. 昆明理工大学, 2017(01)
- [3]野生与人工养殖的中华眼镜蛇（Naja Atra）毒液的比较研究[D]. 张迎征. 重庆师范大学, 2016(10)
- [4]眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定[D]. 贺宜龙. 昆明理工大学, 2014(06)
- [5]广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测[D]. 鄢航. 广西大学, 2013(03)
- [6]中华眼镜蛇毒不同剂型和给药途径的镇痛作用研究[D]. 丁晓兰. 苏州大学, 2013(S1)
- [7]乌苏里蝮蛇磷脂酶A2的分离、纯化及性质测定[D]. 张慧. 吉林大学, 2013(08)
- [8]Cobratoxin镇痛及其机制的研究[D]. 梁倩. 苏州大学, 2011(06)
- [9]中介蝮蛇毒组织损伤及粗毒抗血清的制备[D]. 马虎飞. 陕西师范大学, 2011(11)
- [10]舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1优化分离及其活性研究[D]. 周升铭. 广州医学院, 2011(05)