一、参与缺血缺氧性血管内皮细胞凋亡的因素（论文文献综述）
王擎擎[1]（2021）在《活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究》文中认为背景:当代以干细胞技术为核心的再生医学的迅速发展,为心肌梗死的治疗带来新的希望,其中干细胞移植治疗心梗,有望修复坏死的心肌组织,改善受损的心功能,但是梗死区缺血、缺氧局部微环境使MSCs移植后存活率降低,极大地限制了 MSCs用于治疗MI的疗效。中药促进MSCs移植后存活的研究目前也显示出了很好的疗效,可以调控MSCs的归巢、定植,提高MSCs移植后存活率。导师姚魁武教授基于中医胸痹心痛“阳微阴弦”的基本病机,常用活血温通法治疗冠心病,临床疗效显着,并根据多年临床经验拟定了具有活血温通效果的经验方—活血温通方。我们前期研究也发现活血温通方可以显着改善心肌缺血模型组大鼠心功能,明显缩小心肌梗死面积,而且能够降低炎症反应、抑制心肌细胞凋亡、减少胶原纤维面积以及促进血管新生,同时发现活血温通方减轻心肌缺血损伤可能与Sirt1信号通路激活有关。而活血温通方联合MSCs移植治疗心梗,还没有相关的报道。目的:1.总结导师姚魁武教授活血温通法治疗冠心病阳虚证的用药规律、治疗思路,并进行系统的经验总结。2探索活血温通方对BMSCs移植治疗心梗疗效的影响以及可能的作用机制。方法:1.收集2016年1月—2020年12月就诊于中国中医科学院广安门医院姚魁武主任医师门诊,应用中药汤剂治疗且符合纳排标准的全部初诊原始病案。通过“中医传承计算平台（V3.0）”软件系统进行数据分析,根据分析得到到药物频次、常用药物组合、潜在处方等,分析探讨姚魁武教授活血温通法治疗冠心病的用药规律、诊疗思路,并做系统总结。2.提取大鼠BMSCs,培养至第三代时,用流氏细胞仪进行细胞鉴定。用活细胞染色剂CM-Dil进行荧光标记,以检测移植后细胞的存活情况。3.通过结扎左冠状动脉前降支制备心机梗死模型。SD大鼠随机分为5组：假手术组（Sham组）：冠状动脉只穿线不结扎，术后灌胃纯水，持续28天；心梗组（MI组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的PBS。术后灌胃纯水,持续28天;BMSCs移植组（BMSCs组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的MSCs单细胞悬液（细胞浓度3x106个/100μL）。术后灌胃纯水,连续28天;活血温通方组（HXWTF组）:造模方法同心梗组。术后灌胃活血温通方,连续28天;活血温通方+BMSCs移植组（BMSCs+HXWTF组）:造模方法同BMSCs移植组。术后灌胃活血温通方,连续28天。4.超声心动图检测大鼠心功能、TTC染色用于观察心肌梗死面积大小、HE染色观察心梗大鼠心肌组织形态的改变、荧光显微镜观察BMSCs移植后的存活情况。5.用WST-1法测定大鼠血清SOD活力和TBA法测定大鼠血清MDA水平,以评价各组氧化损伤程度;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中炎性因子TNF-a、IL-6、IL-10与生长因子VEGF、bFGF水平,评价炎症反应程度;天狼猩红染色检测各组大鼠心肌纤维化程度;免疫组织化学染色检测梗死边缘区α-SMA和CD31的表达情况,以评价血管新生情况;Western blotting检测心肌组织Sirt1、NF-κB、FoxO1和p53的蛋白的表达水平。结果:1.从用药频次分析,196张处方中,共137味中药,用药频次≥20的中药有39味,用药频次≥50的有22味,用药频次≥50按频次由高到低依次为丹参（193）,桂枝（164）,砂仁（123）,川芎（117）,瓜蒌（109）,白芍（105）,炙甘草（95）,鸡血藤（93）,茯苓（88）,柴胡（87）,炒枳壳（80）,当归（78）,干姜（77）,炒白术（76）,杜仲（64）,党参（61）,麦冬（59）,肉苁蓉（58）,炒酸枣仁（56）,薤白（54）,葛根（54）,五味子（50）。2.196张处方中的137味中药按功效共分为16类,根据药物功效使用频次由高到低排列前10位的依次为补虚类（769）,活血化瘀类（436）,温里类（339）,清热类（210）,化湿类（198）,解表类（184）,理气类（177）,化痰类（155）,利水渗湿类（119）,安神类（114）。3.从药物组合频次分析,药物组合频次≥90的由高到低依次是丹参-桂枝（162）,丹参-砂仁（123）,丹参-川芎（115）,丹参-瓜蒌（108）,丹参-白芍（104）,丹参-桂枝-砂仁（99）;桂枝-砂仁（99）。基于关联规则深入分析用药组合,导师活血温通法治疗冠心病常用的2味药的组合是丹参-瓜蒌,丹参-砂仁,丹参-桂枝,丹参-鸡血藤等;3味药的组合是丹参-砂仁-瓜蒌,丹参-桂枝-瓜蒌,丹参-桂枝-鸡血藤等。从用药关联规则网络拓扑图可以看出,关联性比较大的药物组合是丹参、桂枝、鸡血藤、瓜蒌、川芎、砂仁。4.基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心组合。3种药物聚类核心组合为丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,鸡血藤;丹参,桂枝,川芎,白芍,砂仁;丹参,桂枝,川芎,砂仁,茯苓。4种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,鸡血藤;丹参,桂枝,麦冬,炙甘草,川芎,生地黄;丹参,桂枝,砂仁,鸡血藤,川芎,降香;丹参,桂枝,砂仁,干姜,茯苓,瓜蒌。5种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,鸡血藤,瓜蒌,川芎,党参;桂枝,丹参,麦冬,川芎,炙甘草,炒白术;丹参,桂枝,干姜,砂仁,茯苓,黄连;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,白芍;丹参,砂仁,桂枝,川芎,鸡血藤,降香。5.基于方剂频数分析,可以得出196例病案中共涉及方剂54个,方剂频数为2以上的药物有32个,方剂频数为5以上的方剂有24个,方剂频数为10以上的方剂有13个,方剂频数为20以上的药物有6个。可以看出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂有丹参饮（118）,四逆散（73）,桂枝甘草龙骨牡蛎汤（25）苓桂术甘汤（23）、瓜蒌薤白白酒汤（21）等。6.根据方剂配伍的使用频次,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散（47）,丹参饮-黄芪赤风汤（11）,丹参饮-交泰丸（11）,丹参饮-瓜蒌薤白白酒汤（11）,丹参饮-半夏泻心汤（11）,丹参饮-瓜蒌薤白半夏汤（11）等。基于关联规则深入分析用方组合,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散-瓜蒌薤白半夏汤,丹参饮-四逆散-黄芪赤风汤,丹参饮-四逆散-桂枝甘草龙骨牡蛎汤等。根据方剂组合规律关联规则网络拓扑图可以看出关联比较大的方剂是丹参饮、四逆散、生脉散、桂枝甘草龙骨牡蛎汤、瓜蒌薤白半夏汤、瓜蒌薤白白酒汤、交泰丸等。基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心方剂组合是生脉散,丹参饮,枳实薤白桂枝汤,补中益气汤,四君子汤;丹参饮,交泰丸,半夏泻心汤,苓桂术甘汤,越鞠丸;丹参饮,四逆散,黄芪赤风汤,瓜蒌薤白半夏汤,桂枝甘草龙骨牡蛎汤。7.BMSCs的鉴定:用流氏细胞仪检测第3代BMSCs表面标记物CD44、CD90、CD45的表达情况,结果显示CD44表达率为99.2%,CD90表达率为97.4%,CD45的表达率为6.7%。8.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心功能的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组EF均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合 BMSCs 移植组 EF比BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组FS均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合BMSCs移植组FS 比 BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,***P<0.001）。9.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌梗死面积的影响:假手术组无梗死,完整心脏表面和心脏切片均呈现红色,无苍白色区域。心梗组完整心脏表面和心脏切片苍白色区域均最大,故心梗面积最大,且心梗处明显凹陷,心梗处心肌明显变薄。BMSCs移植组和活血温通方组较心梗组,完整心脏表面和心脏切片的苍白色区域均明显减少,说明BMSCs移植和活血温通方药物干预均能减少心梗面积。活血温通方联合BMSCs移植组心脏苍白色区域最小,心梗处轻微凹陷,说明活血温通方能提高BMSCs移植改善心梗大鼠心肌梗死面积的疗效。10.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌组织形态的影响:HE染色显示与假手术组相比,其余各组梗死区均有不同程度的炎性细胞浸润。心梗组细胞排列紊乱,细胞间隙增大,炎性细胞浸润最严重。BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组这些病变均有明显改善,炎性细胞浸润有不同程度的降低。与BMSCs移植组、活血温通方组相比较,活血温通方联合BMSCs移植组细胞排列更有序,炎性细胞浸润更少。11.活血温通方对BMSCs移植四周后存活的影响:在全景数字扫描显微镜下观察,可以看到活血温通方联合BMSCs移植组红色荧光分布更广。红色荧光与蓝色荧光重叠的数量明显更多。12.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清SOD、MDA的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（***P<0.001,**P<0.01）;与心梗组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组MDA水平均有显着降低（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs 移植组 MDA 均有显着降低（***P<0.001,**P<0.01）。13.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌细胞凋亡的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平均有显着降低（***P<0.001,***P<0.001）。14.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10的影响:与假手术组相比,MI组TNF-α、IL-6和IL-10水平水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合 BMSCs 移植组 TNF-α 显着降低（**P<0.01,**P<0.01,***P<0.001）,IL-6 显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）,IL-10 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组TNF-α显着降低（**P<0.01,**P<0.01）,IL-6显着降低（***P<0.001,**P<0.01）,IL-10显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。15.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌纤维化的影响:与假手术组相比,MI组心肌纤维化明显（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（*P<0.05,**P<0.01）。16.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠梗死边缘区α-SMA、CD31表达的影响:与假手术组相比,MI组α-SMA、CD31的表达明显增多（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs 移植组 α-SMA、CD31 的表达均显着增多（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组 α-SMA、CD31 的表达显着增多（**P<0.01,*P<0.05;*P<0.05,***P<0.001）。17.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清生长因子VEGF、bFGF的影响:与假手术组相比,MI组VEGF、bFGF水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。18.活血温通方联合BMSCs移植对心肌组织SIRT1、NF-kB、FoxO1和p53蛋白表达的影响:与假手术组相比,MI组Sirt1的表达明显降低（***P<0.001）,NF-kB、Foxo1、p53 的表达明显升高（**P<0.01,**P<0.01,**P<0.01）。与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,NF-κB的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）,FoxO1 的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05,*P<0.05）,p53 的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达均显着升高（**P<0.01,*P<0.05）,NF-kB的表达显着降低（**P<0.01,*P<0.05）,FoxO1的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）,p53的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）。结论:1.导师活血温通法治疗冠心病常活血药与温阳药并重,且用药平和,配伍主次分明,以经方为主。在活血温通法治疗冠心病的组方用药中常含有活血温通方,治疗效果短期的显着,可能是因为改善了心肌缺血缺氧微环境,也初步说明了活血温通方的临床疗效比较显着。2.活血温通方可能是通过改善心梗后缺血缺氧微环境而提高了 BMSCs移植后的存活率,而进一步提高BMSCs移植治疗心梗在抗细胞氧化损伤、抗细胞凋亡、降低炎症反应、抗心肌纤维化和促进血管新生方面的疗效,以及促进移植后的BMSCs的旁分泌功能而进一步修复受损的心肌,缩小心肌梗死面积,改善心功能。3.活血温通方能促进BMSCs移植后Sirt1信号通路的激活,以协同恢复心功能。
浦延鹏[2]（2021）在《基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制》文中研究说明目的:探索眼针对MCAO/R大鼠神经功能缺损的保护作用机制。观察眼针干预后,对MCAO/R大鼠脑组织尼氏体和血管新生的影响,探究眼针能否通过促进尼氏体恢复,促进血管新生,增加Wnt3a、β-catenin、LEF1及HIF-1α因子的表达,以减轻脑损伤,加快神经功能的恢复,希望能够通过此研究为临床眼针治疗缺血性脑卒中提供可靠的研究依据。材料与方法:1动物及分组选用SPF级健康雄性成年SD大鼠,采用随机数字表法将大鼠分为空白组（blank）、假手术组（sham）、模型组（model）、眼针组（eye acupuncture）、针刺组（acupuncture）,每组12只,遵照《关于善待实验动物的指导性意见》（科技部2006年颁布）中动物的使用及伦理学规定。2模型制备方法采用改良线栓法制备大鼠MCAO/R模型,具体方法见正文。3干预方法空白组,不进行干预;假手术组,在行手术后,不再做其他干预措施;模型组,造模成功后,不再做其他干预措施。针刺组,造模成功后,用13mm的毫针,分别取大鼠的百会穴和曲鬓穴,平刺,进针大约3mm,透过真皮达皮下组织,然后开始计时,在10min时和20min时,各刮针柄5下,共留针20min;眼针组,在造模成功后,选取双侧上焦区、下焦区、肝区和肾区进行眼针针刺治疗,主要采用平刺法,深度透过真皮,留针20min。两组针刺皆在脑缺血再灌注一小时后开始,每隔8h针刺一次,在各时间节点前30min,行最后一次针刺治疗,对3h,24h及72h三个时间节点进行评测,取材检测。4指标检测及方法造模前、后及治疗前、后,观察大鼠的一般情况,应用Longa评分法、Bederson评分法及前肢踩空试验三种方法,对大鼠的神经功能进行评测,应用TTC染色法观察大鼠脑梗死的情况,采用尼氏体染色的方法观察大鼠脑组织神经元的变化情况;通过免疫组织化学观察缺血区大脑皮层CD34+的阳性表达变化,另采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达变化;应用免疫组织化学法和Western blot两种方法,检测大鼠脑组织缺血半暗带区域中HIF-1α因子,及Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路相关因子的表达水平。5统计学分析采用SPSS25.0进行统计分析,以均数加减标准差为统计量（x±s）,采用单因素方差分析（One-Way-Anova）进行总体比较,有差异的采用最小显着差异法（LSD）进行两两比较,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1 TTC染色法评价大鼠脑梗死结果显示,空白和假手术组的脑组织呈红色,无明显梗死灶,而模型组则有明显的苍白色梗死灶。2大鼠神经功能障碍评分Longa评分和Bederson评分结果显示,与空白和假手术组比较,模型组大鼠的评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;而空白与假手术组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3大鼠前肢踩空试验评分变化在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分改变不明显（P>0.05）,差异无统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义。4大鼠尼氏体染色结果尼氏体染色结果显示,在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组尼氏体增加较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而空白和假手术组,眼针组和针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。5免疫组织化学法检测大鼠脑组织CD34+的表达在3h时,各组之间CD34+的表达无明显差异（P>0.05）;而在24h和72h时,与空白和假手术组比较,模型组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组,眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。6酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠血清VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,且在24h时,眼针组与针刺组比较,眼针组的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组比较,3h和72h时眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7 Western blot法检测大鼠脑组织缺血半暗带区域相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,β-catenin,LEF1的表达明显较多,Wnt3a的表达较低（P<0.05）,而HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,Wnt3a,β-catenin的表达明显较多（P<0.05）,而LEF1和HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在72h时,Wnt3a,HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin和LEF1的表达无明显差异（P>0.05）。8免疫组织化学法检测大鼠脑组织相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠脑组织Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,Wnt3a,β-catenin,LEF1及HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,β-catenin及HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,Wnt3a及LEF1的表达差异无统计学意义（P>0.05）;在72h时,Wnt3a的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin,LEF1和HIF-1α的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.眼针可以改善MCAO/R大鼠的神经功能缺损,其机制可能是通过改善神经元的损伤,从而促进神经功能的恢复,且疗效好于针刺组。2.眼针可以促进MCAO/R大鼠血清VEGFA的增多,从而促进血管新生,改善脑损伤。3.眼针可以增加MCAO/R大鼠HIF-1α因子及经典Wnt信号传导通路中Wnt3a,β-catenin,LEF1的表达,从而促进血管新生,减轻神经元损伤,促进神经功能的恢复,这可能是眼针治疗缺血性脑卒中的作用机制之一。
李力[3]（2021）在《新生大鼠缺氧缺血脑白质损伤模型少突胶质细胞发生与血管新生的研究》文中研究表明目的早产儿脑血管发育缺陷及少突胶质细胞的选择易损性与早产儿缺氧缺血脑白质损伤（white matter injury,WMI）发生密切相关,而WMI后内源性血管新生和少突胶质细胞发生以及与之相关的营养因子表达是否呈时间依赖性变化,目前尚不清楚。本课题拟通过建立新生大鼠缺氧缺血WMI模型,明确少突胶质细胞发生和内源性血管新生的动态变化趋势,为进一步探讨WMI发病机制及开发治疗靶向药物提供理论基础和实验依据。方法1.选取新生3日龄SD大鼠,随机分为WMI组和Sham组。WMI组以双侧颈总动脉电凝联合缺氧法建立WMI动物模型;Sham组仅分离双侧颈总动脉,不予电凝和缺氧。2.通过体重测试等观察大鼠生长发育情况;通过MBP免疫荧光染色和Western Blot测定判断缺氧缺血后大鼠脑白质损伤情况。3.采用不同阶段少突胶质细胞标记物Olig2、PDGFRα、APC抗体分别与细胞增殖特异性标记物Ki67进行免疫荧光双标染色,结合DAPI进行核复染,应用Image J 6.0软件计数术后不同时间点少突胶质细胞数量和增殖情况,判断少突胶质细胞发生的动态变化情况。4.采用血管内皮细胞特异性标记物血小板血管内皮粘附分子（PECAM-1/CD31）抗体和细胞增殖标记物Ki67进行免疫荧光双标染色,结合DAPI进行核复染,计数术后不同时间点脑脑白质血管内皮细胞总数及新生血管内皮细胞数量,分析血管新生的动态变化情况。5.应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定脑白质脑源性营养因子BDNF含量,以明确与血管新生和少突胶质细胞发生相关的内源性营养因子的动态变化情况。结果1.WMI模型评价:WMI组大鼠生长发育迟缓,睁眼时间与Sham组相比延长,术后14天体重低于Sham组（p<0.05）;免疫荧光染色及Western Blot结果显示术后28天WMI组MBP的表达明显低于Sham组（p<0.05）。2.少突胶质谱系的动态变化:Sham组少突胶质细胞谱系总数在术后逐渐增加,14天时达高峰,随后开始下降,28天后趋于平稳,此时细胞总数与术后3天相当;WMI组少突胶质细胞谱系数量于术后3天增加达峰值,随后保持该水平。术后1天与3天WMI组少突胶质细胞系数量均明显高于Sham组,而术后7天与14天却低于Sham组。对于增殖的少突胶质细胞,WMI组和Sham组随时间的变化趋势基本一致,均呈现先下降、后上升、再下降、最后趋于平稳态势。术后1天,WMI组增殖的少突胶质细胞数量高于Sham组,但术后3天和7天却明显低于Sham组,术后7天两组少突胶质细胞增殖数量均达高峰。3.少突胶质前体细胞的动态变化:Sham组OPCs总数和增殖的OPCs数量均在术后3天减少、术后7天显着增加达峰值、术后14天下降,并稳定保持在较低水平。WMI组OPCs总数及增殖的OPCs数量随时间变化趋势与Sham组相一致,但术后1天,WMI组OPCs总数及增殖的OPCs数量均明显高于Sham组,术后3天与7天WMI组OPCs总数及增殖的OPCs数量却显着低于Sham组。4.成熟少突胶质细胞的动态变化:Sham组成熟少突胶质细胞总数总体呈上升趋势;WMI组于术后3天、14天和28天均明显少于Sham组,但术后56天和84天上升达Sham组水平。Sham组成熟少突胶质细胞在术后7天增殖最明显,其次是术后3天和28天;而WMI组成熟少突胶质细胞增殖数量较少,在各时间点均无明显变化。5.脑白质MBP表达变化:术后56天和84天,免疫荧光染色结果显示,WMI组胼胝体区域MBP免疫荧光强度均明显弱于Sham组;WB显示MBP表达量显着低于Sham组。6.血管总数及新生血管的变化:Sham组血管内皮总数于术后14天达高峰后逐渐下降;WMI组于术后28天达高峰后逐渐减少;术后3天,WMI组血管内皮总数明显低于Sham组。对新生血管数量进行统计显示:Sham组新生血管内皮数量呈先上升后下降趋势,14天时达高峰;WMI组于术后14天内新生血管内皮无明显变化,从14天开始逐渐上升,28天时达峰值,随后下降;术后1天、3天、7天、14天、56天,WMI组新生血管内皮数量明显低于Sham组。7.脑白质BDNF含量变化:Sham组大鼠BDNF含量总体呈下降趋势;WMI组大鼠BDNF水平呈先下降后上升趋势,术后14天最低。术后1天、3天、14天,WMI组BDNF表达水平低于Sham组,但术后56天和84天却高于Sham组。结论1.脑白质（CC区）少突胶质细胞谱系于术后3天至14天（P6～P17）达发育高峰;OPCs增殖与发育亦主要发生于术后14天（P17）内;成熟少突胶质细胞数量总体呈上升趋势,其增殖随时间发生动态变化。2.缺氧缺血使少突胶质细胞发生过程受到影响,表现为:缺氧缺血可下调少突胶质细胞谱系数量;短暂缺氧缺血（1天）可促进OPCs增殖,但缺氧缺血（>3天）却能抑制OPCs增殖,缺氧缺血3～14天时OPCs总数明显减少;缺氧缺血（<28天）使成熟少突胶质细胞数量减少,长期缺氧缺血（56天、84天）虽可使成熟少突胶质细胞数量恢复,但髓鞘生成依然障碍。3.血管内皮细胞总数和增殖于术后14天（P17）达高峰;缺氧缺血使血管发生的高峰延迟至术后28天,并且血管新生受到明显抑制（P17内）。4.缺氧缺血14天内,BDNF表达下调可能是导致内源性血管新生及少突胶质细胞发生不足的重要原因;缺氧缺血14天后,BDNF表达上调可能有利于少突胶质发生及新生血管的生成。
吴少军[4]（2021）在《Septin4在缺氧诱导的H9c2心肌细胞损伤中的作用与机制研究》文中进行了进一步梳理目的:缺血性心脏病（IHD）已然是全球导致死亡的首要原因。2017年全球疾病负担（GBD）统计表明,IHD影响了全球约1.26亿人,约占世界总人口的1.72%。其中,IHD导致死亡的约有900万人,这使得IHD成为全球导致死亡的主要原因;同时,基于构建的预测模型得到的患病率数据表明,到2030年,IHD的患病率可能会增加到每1,000,000人中1,845人以上。在中国,IHD同样是导致死亡的首要原因。研究结果显示,IHD是2017年中国全国范围内死亡和DALYs的主要原因,经过年龄调整的IHD也是YLL最主要病因。IHD是由冠状动脉循环不足而引起的心肌缺血、缺氧性心脏病。在特定因素影响下,冠脉内皮会产生损伤,在一系列过程之后,动脉内膜变硬、变僵直,并有钙盐、脂肪脂质和异常的炎症细胞沉积,从而形成斑块;这些斑块和斑块破溃后形成的血栓会阻塞冠脉腔,最终使得缺血与缺氧在心肌中产生。研究表明,其他诸如炎症反应、微血管功能障碍、内皮功能障碍、心理应激（神经系统）和血管生成等也能够促进心肌缺血。然而,不管由什么原因引起,IHD的病理特征都是冠状动脉血流量降低从而导致的心肌供血、供氧不足。而心肌的供血供氧不足则会导致许多心脏方面的疾病发生,比如心肌梗死等。也就是说,IHD中的缺血缺氧诱导的心肌细胞损伤最终都会导致正常的心脏功能受损,从而给患者带来极大的危害甚至是生命危险。缺氧诱导因子1（HIF-1）是介导细胞适应缺氧环境的主要转录因子,主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成。HIF-1主要是从以下三个方面使细胞适应新的低氧环境:下调耗氧过程,上调厌氧过程以及恢复正常的氧气输送。HIF-1活性的激活实际上是由环境氧气浓度变化引起的HIF-1α的m RNA以及蛋白水平的波动实现的。HIF-1α的心肌保护作用在缺血性心脏的应激反应的早期阶段很重要。很多研究都表明HIF-1α在心肌缺氧时具有保护心肌细胞、减少缺氧诱导的心肌细胞损伤的作用。Septin4基因主要编码两种蛋白,Septin4＿i1（H5/PNUTL2）和Septin4＿i2（ARTS）。Septin4＿i2（ARTS）是一种肿瘤抑制蛋白,它位于线粒体外膜。一般认为,ARTS是在与XIAP发生拮抗作用后导致凋亡发生。也有研究发现Septin4＿i1具有促进人肝癌细胞细胞凋亡的作用,并且有其他研究发现这有可能是经过PI3K/Akt通路实现。近年来,还有学者发现在一些肿瘤细胞中,BAX和Bcl-2也是Septin4发挥促凋亡作用的蛋白底物。但是,Septin4在缺氧诱导的心肌细胞损伤甚至凋亡与坏死中的作用从来没有被研究过;另外,也没有研究探讨过心肌细胞中是否存在一种全新的Septin4底物。本研究旨在探讨Septin4在缺氧诱导的心肌细胞中的表达水平及其参与缺氧诱导的心肌细胞损伤的作用与机制。方法:1.探讨缺氧刺激对Septin4表达水平的影响。我们使用缺氧刺激作为构建心肌细胞损伤模型的刺激因素。首先我们将心肌细胞分为四组,分别对其进行缺氧0h、6h、12h和24h处理。然后,我们使用CCK8和FITC-PI试剂盒分别检测细胞活力和凋亡率。最后,通过western blot实验（免疫印迹实验）,我们检测Septin4蛋白表达量、凋亡相关蛋白cleaved caspase3蛋白表达量。2.探讨过表达Septin4对缺氧诱导的心肌细胞损伤的影响。首先我们将细胞分为八组:空载+缺氧0h组,空载+缺氧6h组,空载+缺氧12h组,空载+缺氧24h组,Flag-Septin4+缺氧0h组,Flag-Septin4+缺氧6h组,Flag-Septin4+缺氧12h组,Flag-Septin4+缺氧24h组;然后分别使用CCK8试剂盒与FITC-PI试剂盒检测细胞活性与凋亡率。接着,我们将细胞分为四组:空载组,空载+缺氧24h组,Flag-Septin4组,Flag-Septin4+缺氧24h组;然后,通过免疫印迹实验,我们检测Septin4蛋白表达量、cleaved caspase3蛋白表达量。3.探讨敲减Septin4对缺氧诱导的心肌细胞损伤的影响。首先我们将细胞分为八组:si-con+缺氧0h组,si-con+缺氧6h组,si-con+缺氧12h组,si-con+缺氧24h组,si-Septin4+缺氧0h组,si-Septin4+缺氧6h组,si-Septin4+缺氧12h组,si-Septin4+缺氧24h组;然后分别使用CCK8试剂盒与FITC-PI试剂盒检测细胞活性与凋亡率。接着,我们将细胞分为四组:si-con,si-con+缺氧24h组,si-Septin4组,si-Septin4+缺氧24h组;然后,通过免疫印迹实验,我们检测Septin4蛋白表达量、cleaved caspase3蛋白表达量。4.探讨Septin4是否通过降低HIF-1α表达参与缺氧诱导的心肌细胞损伤。首先我们将细胞分为六组:sh-con组,sh-con+缺氧24h组,sh-Septin4组,sh-Septin4+缺氧24h组,sh-Septin4+Flag-Septin4组,sh-Septin4+Flag-Septin4+缺氧24h组;然后,使用CCK8和FITC-PI试剂盒分别检测细胞活力和凋亡率。最后,通过免疫印迹实验,我们检测Septin4蛋白表达量、cleaved caspase3蛋白表达量。5.探讨Septin4与HIF-1α在正常及缺氧条件下的结合情况及具体的结合部位。首先,我们将蛋白样品按照所加抗体分为两组:Septin4抗体（或HIF-1α抗体）组和Ig G组,然后用免疫共沉淀实验检测HIF-1α（或Septin4）的表达量。接着,我们将蛋白样品分为三组:Septin4抗体（或HIF-1α抗体）组,Septin4抗体+缺氧24h（或HIF-1α抗体+缺氧24h）组和Ig G组,然后用免疫共沉淀实验检测HIF-1α（或Septin4）的表达量。最后,我们将蛋白样品分为六组:Flag-Septin4组、截短序列1组、截短序列2组、截短序列3组、截短序列4组、空载组,其中每组均加入等量Flag beads,然后用免疫共沉淀实验检测HIF-1α的表达量。6.探讨过表达Septin4与使用CHX或过表达Septin4与使用MG132对HIF-1α表达量的影响。首先我们将细胞分为四组,分别转染0μg、1μg、3μg、5μg的Flag-Septin4质粒,然后用western blot检测HIF-1α表达量。接着,我们还是将细胞分为四组,分别转染si-con、si-Septin4 1、si-Septin4 2、si-Septin4 3片段,然后用western blot检测HIF-1α表达量。再接下来,我们将细胞分为六组:空载+CHX 0h、空载+CHX 4h、空载+CHX 8h、Flag-Septin4+CHX 0h、Flag-Septin4+CHX 4h、Flag-Septin4+CHX 8h,然后用western blot检测HIF-1α表达量。最后,我们还是将细胞分为六组:空载+MG132 0h、空载+MG132 4h、空载+MG132 8h、Flag-Septin4+MG132 0h、Flag-Septin4+MG132 4h、Flag-Septin4+MG132 8h,然后用western blot检测HIF-1α表达量。7.探讨Septin4对HIF-1α泛素化的影响。首先我们将蛋白样品按照所加抗体分为三组:HIF-1α抗体（或Septin4抗体）组,HIF-1α抗体+MG132（或Septin4抗体+MG132 8h）组和Ig G组,然后用免疫共沉淀实验检测Septin4（或HIF-1α）蛋白表达。接着,我们将细胞分为三组:空载+HA-UB+MG132组,Flag-Septin4+HA-UB+MG132组和纯对照组或者是:si-con+HA-UB+MG132组,si-Septin4+HA-UB+MG132组和纯对照组,然后用免疫共沉淀实验检测HA表达。8.探讨Septin4影响HIF-1α降解的具体中间分子。首先,我们将细胞分为六组:空载组、空载+缺氧24h组、Flag-Septin4组、Flag-Septin4+缺氧24h组、Flag-Septin4+BAY85-3934组、Flag-Septin4+BAY85-3934+缺氧24h组,然后用western blot实验检测HIF-1α表达。接着,我们将细胞分为三组:空载+HIF-1α抗体组、Flag-Septin4+HIF-1α抗体组和空载+Ig G组或者si-con+VHL抗体组、si-Septin4+VHL抗体组和si-con+Ig G组,然后用免疫共沉淀检测VHL或HIF-1α表达。最后,我们将细胞分为三组:空载+HA-UB,Flag-Septin4+HA-UB组和Flag-Septin4+HA-UB+BAY85-3934组,然后用免疫共沉淀检测HA表达。结果:1.随着缺氧刺激时间的延长,心肌细胞活性逐渐降低,凋亡逐渐升高;另外,缺氧处理延长时Septin4表达也逐渐增多。2.无论给予缺氧多长时间处理,与空载组相比较,过表达Septin4组的心肌细胞活性都更低,凋亡率都更高;另外,给予缺氧24h处理后,与空载组相比较,Septin4蛋白表达量更高,凋亡相关蛋白cleaved caspase3表达量也更高。3.无论给予缺氧多长时间处理,与对照组相比较,敲减Septin4组的心肌细胞活性都更高,凋亡率都更低;另外,给予缺氧24h处理后,与对照组相比较,Septin4蛋白表达量更低,凋亡相关蛋白cleaved caspase3表达量也更低。4.稳定敲除Septin4心肌细胞中:Septin4表达量下降,HIF-1α蛋白表达量上升,细胞活力升高,细胞凋亡降低;稳定敲除Septin4心肌细胞中重新过表达Septin4:Septin4表达量上升,HIF-1α蛋白表达量下降,细胞活力降低,细胞凋亡升高。5.未给予缺氧刺激时,Septin4与HIF-1α可以相互结合;在给予缺氧刺激时,Septin4与HIF-1α的结合作用得到增强;通过构建的截短序列,发现Septin4主要通过其GTPase结构域与HIF-1α结合。6.梯度过表达Septin4时,随着Septin4表达量上升,HIF-1α表达量下降;转染Septin4 si RNA不同序列时,当Septin4表达量下降,HIF-1α表达量上升;CHX实验中,实验组和对照组HIF-1α下降速度几乎一致;MG132实验中,实验组HIF-1α量的积累明显比对照组快而明显。7.在MG132刺激下,Septin4与HIF-1α结合增强;过表达Septin4增强HIF-1α泛素化水平,敲减Septin4减弱HIF-1α泛素化水平。8.BAY85-3934抑制剂挽救Septin4下调的HIF-1α表达;过表达Septin4增强HIF-1α与VHL结合,敲减Septin4减弱HIF-1α与VHL结合;BAY85-3934抑制剂减弱Septin4增强的HIF-1α泛素化水平。结论:1.缺氧刺激可以引起Septin4蛋白表达量的增加。过表达Septin4加重缺氧诱导的心肌细胞损伤,敲减Septin4减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤。2.Septin4通过降低心肌保护因子HIF-1α的表达加重缺氧诱导的心肌细胞损伤。3.Septin4通过其GTPase结构域与HIF-1α结合,并且在缺氧刺激下结合增强。4.Septin4通过蛋白酶体途径降低HIF-1α稳定性。5.Septin4增强HIF-1α泛素化水平。6.Septin4通过增强E3泛素化连接酶VHL与HIF-1α的结合,促进HIF-1α的UPS途径降解,从而参与缺氧诱导的心肌细胞损伤。
杨晓英[5]（2021）在《激肽释放酶结合蛋白（KBP）修饰骨髓间充质干细胞在氧诱导视网膜病变中的作用及机制研究》文中提出背景:近年来研究表明,骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可分化为心肌细胞、肝细胞、胰腺细胞和视网膜细胞等多种细胞,并参与调节细胞或组织修复,可抑制细胞凋亡,同时容易植入外源基因,使其在组织修复和基因治疗方面的潜在临床应用受到越来越多的积极关注。激肽释放酶结合蛋白（KBP）,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,可在心、胰腺、眼部等多部位表达。多项研究发现KBP具有很好的抗炎、抗氧化应激、抗新生血管等作用。氧诱导的视网膜病变（oxygen-induced retinopathy,OIR）已成为缺血引起的病理性视网膜新生血管的主要模型。本研究通过构建OIR模型,研究小鼠玻璃体腔注射过表达KBP修饰的BMSCs对OIR的影响及作用机制,研究慢病毒能否转染骨髓间充质干细胞,且有效表达具有血管形成抑制活性的KBP,以及对OIR小鼠视网膜等相关表型的影响。目的:本研究拟通过观察过表达KBP修饰的BMSCs对OIR模型小鼠的视网膜新生血管的抑制作用,为其临床转化应用提供基础依据。方法:（1）体外分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞并鉴定;（2）过表达KBP的慢病毒转染骨髓间充质干细胞并摸索MOI值及q PCR验证转染效率;（3）建立OIR小鼠模型:7日龄C57BL/6小鼠随机分为正常（Normal）组、OIR组、DMEM组、BMSCs组、vector-BMSCs组和KBP-overexpressing-BMSCs组共6组,持续高浓度吸氧5日,12日龄时分别行玻璃体腔注射。第17日行HE染色计数突破内界膜的视网膜新生血管细胞数,TUNEL法评估视网膜细胞凋亡,IB4视网膜铺片观察视网膜血管闭塞区面积大小及局部新生血管情况,免疫组化法观察小鼠视网膜KBP蛋白表达的影响,蛋白免疫印迹法检测小鼠视网膜中相关凋亡蛋白表达情况。结果:成功体外提取并培养小鼠骨髓间充质干细胞,并成骨、成脂分化鉴定。视网膜铺片示正常组视网膜无血管闭塞区和新生血管形成,而OIR组血管排列紊乱,可见大片血管闭塞区,HE染色发现OIR组可见突破内界膜的视网膜新生血管内皮细胞,TUNEL见视网膜凋亡细胞阳性率升高。BMSCs组显示血管闭塞区面积以及突破内界膜的新生血管内皮细胞核数减少,TUNEL显示BMSCs降低了视网膜细胞的凋亡率。过表达KBP-BMSCs组视网膜内界膜新生血管内皮细胞及凋亡细胞明显减少。视网膜铺片仅可见大血管稍迂曲,血管径向较规整,血管闭塞区面积明显降低,WB相关凋亡蛋白表达显着下降,免疫组化显示过表达KBP-BMSCs组KBP蛋白高度表达。结论:过表达KBP-BMSCs可抑制OIR小鼠视网膜新生血管,可使血管闭塞区面积降低,降低细胞凋亡率。这可能与BMSCs的转分化有关。
洪茂[6]（2021）在《15-羟二十烷四烯酸对胎盘滋养细胞功能的影响及其作用机制研究》文中研究表明子痫前期（preeclampsia,PE）是一种初发于妊娠20周后的多系统功能紊乱性疾病,全球每年约有5%-8%的孕妇受其影响,是导致孕产妇及新生儿病死的主要疾病,其临床表现主要为高血压及蛋白尿。虽然子痫前期的相关研究取得了重大进展,但目前对其病因学和病理学机制仍然知之甚少,已成为该领域亟待探讨的重大课题。在我们前期研究中,利用超高压液相色谱串联六级杆质谱技术建立了15-羟二十烷四烯酸（15-hydroxyeicosatetraenoic acid,15-HETE）的检测方法。本课题主要研究:15-HETE是否参与子宫螺旋动脉重塑过程的细胞生物学行为及在人绒毛膜滋养细胞介导子宫微血管内皮细胞凋亡的作用,来探讨15-HETE在螺旋动脉重塑障碍中的作用,本课题的完成可能为子痫前期的病因提供新线索。方法:1.收集孕妇产检全程的血清标本,建立PE生物样本库。2.15-HETE及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）拮抗剂（MMP-2 Inhibitor）干预人传代绒毛膜滋养细胞（HTR8/SVneo）。3.使用Annexins V/PI双染色-流式细胞技术对细胞凋亡进行测定,利用Transwell迁移实验对绒毛膜滋养细胞的迁移能力进行测定。4.通过Western Blot技术检测MMP-2在绒毛膜滋养细胞的表达。结果:1.子痫前期孕妇胎盘内的滋养细胞合成的15-HETE水平显着高于正常孕妇组,且子痫前期重度组血清15-HETE显着高于子痫前期轻度组、妊高症组及对照组。2.15-HETE促进HTR8/SVneo迁移、侵袭,同时对血管内皮细胞EAhy926的凋亡具有促进作用。3.与对照组相比,15-HETE处理HTR8/SVneo后,MMP2的表达升高。结论:1.孕妇血清中15-HETE可能影响人类子宫螺旋动脉重塑过程。2.15-HETE具有通过促进MMP2的表达进而促进滋养细胞迁移和侵袭,但对内皮细胞EAHY926的凋亡具有促进作用。
高毅洁[7]（2021）在《从外泌体角度探讨活血益气方促大鼠心梗后血管新生的作用机制》文中研究说明治疗性血管新生作为缺血性心脏病血运重建的代偿策略之一,对于恢复缺血区的血流供应和及时挽救受损心肌具有重要的意义。而外泌体作为细胞间通讯的新型传导介质,为血管新生的“无细胞”策略提供了新的思路。活血益气方可促进大鼠梗死边缘区心肌组织的血管新生,但其具体作用机制尚不明确。因此,本研究拟以外泌体为切入点,进一步探索活血益气方促心梗后血管新生的作用。目的:观察活血益气方血清外泌体促大鼠心梗后血管新生的作用,及其对缺氧HUVECs增殖、迁移、成管能力和血管新生相关信号通路的影响,进而从外泌体角度揭示活血益气方促心梗后血管新生的作用机制。方法:（1）制备大鼠去离子水血清及活血益气方含药血清,超速离心提取血清外泌体,通过透射电镜观察外泌体形态变化,NanoSight检测外泌体粒径,Western blot检测外泌体标志蛋白CD9、CD63及TSG101的表达进行鉴定。（2）采用左冠状动脉前降支结扎术制备大鼠急性心肌梗死模型,随机分为活血益气方血清外泌体组、去离子水血清外泌体组和模型组,冠脉结扎后立即于心梗交界区的四个方向分别注射活血益气方血清外泌体、去离子水血清外泌体和等量的PBS;假手术组只穿线,不结扎和注射,常规饲养四周。HE染色法观察梗死边缘区心肌组织病理形态学变化;免疫组织化学染色法检测内皮特异性CD31和α-SMA表达以观察梗死边缘区心肌组织微血管内皮细胞的增生情况;小动物超声成像系统检测大鼠心功能改善的情况;全自动生化分析仪检测大鼠血清心肌酶CK、CK-MB及LDH变化;实时荧光定量PCR、Western blot法分别检测梗死边缘区心肌组织HIF-1 α、VEGF及其mRNA的表达。（3）构建HUVECs缺氧细胞模型,分别给予活血益气方血清外泌体、去离子水血清外泌体进行干预,缺氧组给予0.5%无外泌体血清培养;以常氧组为对照,常规换液培养。免疫荧光检测HUVECs与外泌体的融合;CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell迁移实验及Matrigel基质胶实验分别检测缺氧HUVECs细胞增殖、迁移和成管能力。实时荧光定量PCR、Western blot法分别检测缺氧HUVECs HIF-1 α、VEGF、FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 及其 mRNA 的表达。结果:（1）透射电镜下可观察到外泌体的特征形态为茶托状;粒径分析验证外泌体的大小集中在30-150nm;Westernblot检测出外泌体标志蛋白CD9、CD63及TSG101的表达,证明本实验所提取纯化的样本为外泌体。（2）光镜下可见,假手术组心肌肌束形态完整,心肌细胞排列致密,胞核轮廓清晰;模型组和去离子水血清外泌体组梗死区心肌横纹消失,心肌肌束断裂且排列紊乱,纤维结缔组织增生;活血益气方血清外泌体组梗死区心肌肌束断裂且排列紊乱,胞核不清晰,但范围和程度较模型组和去离子水血清外泌体组有所减轻。（3）与假手术组比较,模型组的LVEF、LVFS降低,LVIDd、LVIDs升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,去离子水血清外泌体组LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs均有上升趋势,但未见统计学意义（P>0.05）;活血益气方血清外泌体组LVEF、LVFS均升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,LVIDd、LVIDs有降低趋势,但未见统计学意义（P>0.05）。与去离子水血清外泌体组比较,活血益气方血清外泌体组LVEF、LVFS有上升趋势,LVIDd、LVIDs有降低趋势,但均未见统计学意义（P>0.05）。（4）与假手术组比较,模型组大鼠血清CK、CK-MB及LDH有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）。与模型组相比,去离子水血清外泌体组大鼠血清CK、CK-MB及LDH有降低趋势,但未见统计学差异（P>0.05）;活血益气方血清外泌体组大鼠血清CK、CK-MB及LDH均降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。与去离子水血清外泌体组比较,活血益气方血清外泌体组大鼠血清LDH降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;CK及CK-MB有降低趋势,但未见统计学差异（P>0.05）。（5）与假手术组比较,模型组梗死边缘区心肌组织CD31及α-SMA的表达升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,去离子水血清外泌体组梗死边缘区心肌组织CD31及α-SMA的表达有降低趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;活血益气方血清外泌体组梗死边缘区心肌组织CD31及α-SMA的表达升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。与去离子水血清外泌体组比较,活血益气方血清外泌体组梗死边缘区心肌组织CD31及α-SMA的表达升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。（6）与假手术组相比,模型组梗死边缘区心肌组织HIF-1 α、VEGF及其mRNA的表达水平均上调,差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与模型组比较,去离子水血清外泌体组梗死边缘区心肌组织HIF-1 α、VEGF及其mRNA的表达水平有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;活血益气方血清外泌体组梗死边缘区心肌组织VEGF mRNA的表达水平有上升趋势,HIF-1 α mRNA的表达水平有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;活血益气方血清外泌体组梗死边缘区心肌组织HIF-1和VEGF的表达水平上调,差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与去离子水血清外泌体组相比,活血益气方血清外泌体组梗死边缘区心肌组织HIF-1 α和VEGF mRNA的表达水平有上升趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;活血益气方血清外泌体组梗死边缘区心肌组织HIF-1 α和VEGF的表达水平上调,差异具有统计学意义（P<0.01）。（7）与常氧组比较,缺氧组细胞增殖减少,差异具有统计学意义（P<0.01）。与缺氧组比较,去离子水血清外泌体组细胞增殖增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;活血益气方血清外泌体组细胞增殖增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。与去离子水血清外泌体组比较,活血益气方血清外泌体组细胞增殖,但未见统计学差异（P>0.05）。（8）与常氧组比较,缺氧组细胞迁移面积百分比及迁移的面积减少,差异具有统计学意义（P<0.01）。与缺氧组比较,去离子水血清外泌体组和活血益气方血清外泌体组细胞迁移百分比有增多的趋势,但无统计学差异（P>0.05）。与缺氧组比较,去离子水血清外泌体组迁移面积有增加的趋势,但无统计学差异（P>0.05）;活血益气方血清外泌体组细胞迁移面积增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。与去离子水血清外泌体组比较,活血益气方血清外泌体组细胞迁移百分比有增多的趋势,但无统计学差异（P>0.05）;细胞迁移面积增多,差异具有统计学意义（P<0.01）。（9）与常氧组比较,缺氧组细胞形成新生血管的长度明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。与缺氧组比较,去离子水血清外泌体组和活血益气方血清外泌体组形成新生血管的长度增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。与去离子水血清外泌体组比较,活血益气方血清外泌体组形成新生血管的长度增加,但未见统计学差异（P>0.05）。（10）与常氧组比较,缺氧组细胞HIF-1 α和VEGF mRNA的表达水平上调,差异具有统计学意义（P<0.01）;HIF-1 α表达水平下调,差异具有统计学意义（P<0.05）;VEGF表达下调,但未见统计学差异（P>0.05）。与缺氧组比较,去离子水血清外泌体组细胞HIF-1 α和VEGF mRNA的表达水平上调,差异具有统计学意义（P<0.01）;HIF-1 α和VEGF的表达水平有下降趋势,但未见统计学差异（P>0.05）。与缺氧组比较,活血益气方血清外泌体组细胞HIF-1α、VEGF及其mRNA的表达水平均上调,差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与去离子水血清外泌体组相比,活血益气方血清外泌体组细胞HIF-1 α mRNA的表达水平下调,差异具有统计学意义（P<0.01）;VEGF mRNA的表达水平上调,差异具有统计学意义（P<0.01）;HIF-1 α和VEGF的表达水平均上调,差异具有统计学意义（P<0.01）。（11）与常氧组比较,缺氧组细胞FAK、p38、MAPKAPK mRNA表达水平均上调,差异具有统计学意义（P<0.01）,HSP27 mRNA表达有上调趋势,但未见统计学差异（P>0.05）;FAK、p38、MAPKAPK及HSP27蛋白表达水平有下调趋势,但未见统计学差异（P>0.05）。与缺氧组比较,去离子水血清外泌体组细胞FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表达均上调,差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）,FAK、p38蛋白表达水平有下调趋势,但未见统计学差异（P>0.05）;MAPKAPK、HSP27蛋白表达均下调,差异具有统计学意义（P<0.05）;活血益气方血清外泌体组细胞FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表达均上调,差异具有统计学意义（P<0.01）,FAK、p38、HSP27蛋白表达均上调,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,MAPKAPK蛋白表达有上调趋势,但未见统计学差异（P>0.05）。与去离子水血清外泌体组比较,活血益气方血清外泌体组细胞FAK、p38、MAPKAPK、HSP27及其mRNA表达均上调,差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。结论:活血益气方血清外泌体可促进大鼠心梗后血管新生,减少心肌损伤,改善心功能,还可促进缺氧内皮细胞增殖、迁移及成管能力,其具体的作用机制可能与上调HIF-1α、VEGF及FAK/p38/MAPKAPK/HSP27信号通路的表达有关。
王默[8]（2021）在《催产素预处理减轻冠状动脉内皮功能障碍大鼠心肌缺血/再灌注损伤机制研究》文中研究表明第一部分建立冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心脏灌注模型[目 的]在Langendorff灌注模型的基础上,利用Triton X-100,尝试建立成功率更高,对鼠心功能影响更少,心律失常发生率更小的冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心肌灌注模型。[方法]选取SD大鼠,随机分为2组（N=6只/组）:CK组和ED组。离体鼠心跳动达标后灌注K-H缓冲液20min,(CK组:注入生理盐水10min,ED组:注入浓度为0.01%Triton X-100 10 min,随后K-H缓冲液灌注140 min。在T0和T1记录CPP降低率,在T0、T1、T2、T3、T4和T5记录血流动力学变化指标:LVSP、LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVDP,计算心率失常指数,搜集心肌损伤标志物hs-cTnT,TTC法检测心肌梗死面积,术后解剖冠脉扫描电镜观察内皮细胞形态变化。[结 果]CPP变化:注射组胺的情况下,与T1时间点CK组CPP降低率相比,ED组离体鼠心CPP降低率有明显的下降。硝普钠注射各组鼠心造成CPP下降程度无统计学差异。血流动力学变化指标、心率失常指数、心肌损伤标志物、梗死面积:两组鼠心各时间点组间及组内各项指标无统计学差异。扫描电镜下冠脉内皮形态:CK组冠脉内皮呈叠瓦状排布,形态完整,连续且光滑;ED组冠脉内皮粗糙杂乱,多有破损,露出内皮下层结构。[结 论]Triton X-100试剂可以成功的造成离体大鼠心脏内皮功能障碍,不影响心肌细胞功能。冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心脏模型制作成功。第二部分催产素预处理对冠脉内皮功能障碍的大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响[目 的]在第一部分实验基础上,研究催产素预处理对于冠脉内皮功能障碍的大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。比较血流动力学、心肌损伤标志物和梗死面积变化和电镜下冠脉内皮形态,探索催产素预处理是否能减轻存在内皮功能障碍大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤。[方法]选取SD大鼠,随机分为6组（N=10只/组）:CK组、I/R组、OT-I/R组、ED组、ED-I/R组、OT-ED-I/R组。离体鼠心跳动达标后灌注K-H缓冲液20 min。CK组:注入生理盐水10 min;ED处理:注入浓度为0.01%Triton X-100 10 min;OT处理:注入催产素（0.01 μmol/L）40 min;I/R处理:缺血30 min,再灌注60 min。在T1和T5记录CPP降低值,在T0、Tl、T2、T3、T4和T5记录血流动力学变化指标:LVSP、LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVDP、RPP、SI,计算心率失常指数,搜集心肌损伤标志物hs-cTnT,TTC法检测心肌梗死面积,术后解剖冠脉扫描电镜观察内皮细胞形态变化。[结 果]CPP变化:注射组胺的情况下,与T5时间点CK组CPP降低率相比,T5时间点I/R组和OT-I/R组、T1和T5时间点ED组、ED-I/R组、ED-OT-I/R组CPP有显着下降;与T5时间点I/R组CPP降低率相比,OT-I/R组CPP降低率有显着上升;与T5时间点L/R组CPP降低率相比,ED组、ED-I/R组和ED-OT-I/R组CPP降低率有显着下降。硝普钠注射各组鼠心造成CPP下降程度无统计学差异。各组离体鼠心在T0-T5时间点HR无统计学差异。与CK组相比,ED组各项血流动力学指标无统计学差异;与CK组相比,I/R组、OT-I/R组、ED-I/R组与ED-OT-I/R组复灌后各时间点LVDP、±dp/dtmax、RPP下降,心率失常指数、hs-cTnT、SI、梗死面积上升;与I/R组相比,OT-I/R组复灌后各时间点LVDP、±dp/dtmax、RPP上升,心率失常指数、hs-cTnT、SI、梗死面积下降;与ED-I/R组相比,ED-OT-I/R组复灌后各时间点LVDP、±dp/dtmax、RPP上升,心率失常指数、hs-cTnT、SI、梗死面积下降;OT-I/R组与OT-ED-I/R组各项指标无统计学差异。扫描电镜下冠脉内皮形态:CK组:内皮细胞基本完好,平整,内皮呈叠瓦状排列,无损伤。I/R组:内皮细胞破裂,完整性被破坏。OT-I/R组:内皮损伤程度减轻,有轻微的断层,孔洞。ED组、ED-I/R组、ED-OT-I/R组:内皮迁移、游离。异常杂乱,内皮几乎完全剥离,比I/R组更彻底。[结 论]催产素预处理能减轻离体鼠心受到的缺血/再灌注损伤,改善鼠心收缩和舒张功能,降低心率失常发生率及恶性程度,提升速率压力乘积,降低休克指数、心肌损伤标志物表达和梗死面积。此治疗作用在冠脉内皮功能完好和冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心脏中同时存在,治疗效果没有区别。第三部分催产素预处理对大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤的治疗机制研究[目 的]在Transwell培养模型的基础上,建立大鼠冠脉内皮细胞和H9C2细胞共培养模型,观察催产素预处理对于大鼠冠脉内皮细胞和H9C2细胞的影响。在细胞层面和分子生物学水平探索催产素减轻心肌细胞和内皮细胞缺氧/复氧损伤的作用机制。[方法]大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞单独培养和Transwell共培养,分为8组:H组、C 组、H-H/R 组、C-H/R 组、C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R组。H组:H9C2细胞正常培养8h;C组:大鼠冠脉内皮细胞正常培养8h;H/R处理:细胞缺氧4h/复氧4h培养;OT处理:催产素（0.01 μmol/L）预处理细胞40 min。显微镜下观察细胞形态,CCK 8法检测细胞活力,ELISA法检测cTnT及eNOS,Griess法检测NO释放量。[结 果]显微镜下细胞形态:H组细胞生长健康,扁长梭形、形态大体一致分布均匀。C组细胞健康生长,呈铺路石状;H-H/R组细胞破裂变形;C-H/R细胞贴壁率下降,呈圆点状;H-C-H/R组中H9C2细胞形态与H-H/R组H9C2细胞形态相似;催产素处理组细胞形态均有改善。与 H 组相比,H-H/R 组、OT-H-H/R 组、C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R 组细胞活性下降,cTnT表达增加;与C组相比,C-H/R组细胞活性下降;与H-H/R组相比,OT-H-H/R组、OT-C-H-H/R组细胞活力上升,cTnT表达减少;与C-H-H-H/R组相比、OT-C-H-H/R组细胞活力上升,cTnT表达减少;与C-H/R组相比,OT-C-H/R组细胞活力上升;与OT-H-H/R组相比,OT-C-H-H/R细胞活力和cTnT表达无统计学差异。与H组相比,H-H/R组、OT-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量下降;与C组相比,C-H/R组eNOS表达和NO释放量下降,OT-C-H/R组、OT-C-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量上升;与OT-H-H/R组相比,OT-C-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量显着上升;与H-H/R组相比,OT-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量无统计学差异;与OT-C-H/R组相比,OT-C-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量无统计学差异。[结 论]催产素预处理能够减轻H9C2细胞缺氧/复氧损伤。催产素预处理对于减轻H9C2细胞缺氧/复氧损伤的治疗作用,在H9C2单独培养和与大鼠冠脉内皮细胞共培养情况下没有区别。催产素预处理对于H9C2细胞治疗效果H9C2细胞缺氧/复氧损伤的治疗作用,与大鼠冠脉内皮细胞无关。催产素预处理能够增加大鼠冠脉内皮细胞的eNOS表达和NO释放,减轻缺氧/复氧损伤。第四部分ERK1/2通路在催产素预处理减轻大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤中机制研究[目 的]在Transwell培养模型的基础上,建立大鼠冠脉内皮细胞和H9C2细胞共培养模型,利用ERK1/2磷酸化抑制剂U0126,探索ERK1/2通路在催产素预处理减轻大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤中机制作用。[方 法]大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞单独培养和Transwell共培养,分为6组:H组、H-H/R 组、OT-H-H/R 组、OT-H-H/R-U0126 组、OT-C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R-U0126组。H组:H9C2细胞正常培养8 h;H/R处理:细胞缺氧4 h/复氧4 h培养;OT处理:催产素预处理细胞40 min。OT-U0126处理:催产素+U0126预处理细胞40 min。显微镜下观察细胞形态,CCK 8法检测细胞活力,ELISA法检测cTnT及eNOS,Griess法检测NO释放量,Western blot检测ERK1/2与p-ERK1/2 表达。[结 果]显微镜下细胞形态:H组细胞健康,呈长梭形,贴壁率正常;H-H/R细胞变形破裂,部分细胞漂浮在培养基上;OT-H-H/R组:细胞损伤程度较H-H/R组轻,细胞形态破坏较少;OT-H-H/R-U0126:细胞形态、受损情况大致与H-H/R组细胞相似。OT-C-H-H/R组:细胞受损程度减轻,状态明显改善,其中H9C2细胞形态与OT-H-H/R组相似。OT-H-H/R-U0126组:H9C2细胞形态与OT-H-H/R-U0126组细胞相似,内皮细胞与OT-C-H-H/R组相似。与 H 组相比,H-H/R 组、OT-H-H/R组、OT-H-H/R-U0126 组、OT-C-H-H/R组、OT-C-H-H-H/R-U0126组细胞活力明显下降,cTnT表达上升;与H-H/R组相比,OT-H-H/R组、OT-C-H-H/R组细胞活性上升,cTnT表达下降;与OT-H-H/R组相比,OT-H-H/R-U0126组细胞活性下降,cTnT表达增加;与OT-C-H-H/R组相比、OT-C-H-H/R-U0126组细胞活性下降,cTnT表达增加。与 H 组相比,H-H/R 组、OT-H-H/R 组、OT-H-H/R-U0126 组细胞的 eNOS表达和NO释放量减少;与H组相比,OT-C-H-H/R组和OT-C-H-H/R-U0126组细胞的eNOS表达和NO释放量上升;与OT-H-H/R组相比,OT-H-H/R-U0126组细胞的eNOS表达和NO释放量无统计学差异。与H/R组相比,H-H/R组细胞ERK1/2磷酸化率下降;与H-H/R组相比,OT-H-H/R 组 ERK1/2 磷酸化率上升;与 OT-H-H/R 组相比,OT-H-H/R-U0126 组细胞ERK1/2磷酸化率下降。[结论]催产素预处理可通过增加ERK1/2磷酸化减轻H9C2细胞受到的缺氧/复氧损伤,U0126能够阻断ERK1/2磷酸化从而极大削弱催产素的上述治疗作用。U0126不能影响冠脉内皮细胞eNOS表达和NO释放量,ERK1/2磷酸化没有参与催产素预处理改善冠脉内皮缺氧/复氧损伤的治疗作用。
方涛[9]（2021）在《负载血管生成素1的PLGA-PEG纳米微粒对大鼠心肌梗死后心肌修复影响机制的研究》文中提出目的研究负载血管生成素1（Ang1）的聚乳酸羟基乙酸（PLGA）-聚乙二醇（PEG）纳米微粒（Ang1-PLGA-PEG）对心肌梗死后心肌修复的作用,并探索其效用机制。方法首先创建大鼠心梗模型通过缝扎左前降支冠状动脉的方式,1周后将LVEF相近的大鼠随机划分为3组,分别为:模型组（心肌梗死区域四周多点注射PBS溶液100mL）（n=8）、Ang-1组（注射含Ang1的PBS溶液（100mL,25ng/mL））（n=8）、Ang1-PLGA-PEG组（注射100mL纳米微粒混悬液（约含1.61±0.05mg Ang1））（n=9）。4周后,对所有大鼠进行心脏彩超检测心脏功能、利用Masson染色法检测瘢痕组织增生、免疫荧光法检测细胞凋亡和血管形成。结果免疫荧光染色检测结果显示:与其他两组相比,Ang1-PLGA-PEG组心梗周围区域血管密度和成熟度增加（P<0.05）;心肌细胞凋亡比例减少（P<0.05）;Masson染色法检测结果表明:心肌梗死区域面积显着减少（P<0.05）,相对心梗瘢痕厚度比值增大（P<0.05）,左室腔扩张指数减小（P<0.05）;心脏功能改善（P<0.05）。结论Ang1-PLGA-PEG纳米粒心肌局部注射可使心梗区域的面积减小、血管增生、心肌细胞凋亡的比例减少,从而改善了大鼠的心功能。为以后的心梗治疗的临床应用提供了新的理论依据。
邢晓辉[10]（2020）在《ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3调控动脉粥样硬化脑卒中神经损伤的作用研究》文中研究表明第一部分ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中神经损伤调节的作用研究研究背景脑卒中（Cerebral stroke）目前占脑血管病发病率约35%,40%的存活者遗留严重残疾,病死率高达50%以上,是威胁中、老年人健康的主要疾病之一,是世界范围内引起人类残疾和死亡的主要原因之一,是一个重要的公共健康问题。近年来临床中多采用手术清除血肿、去骨瓣减压术、动脉内膜剥脱术、脱水降颅内压、神经营养及高压氧等综合治疗手段,虽然能挽救部分病人的生命,但脑卒中存活者仍有很高的致残率。脑卒中后血肿及脑组织水肿的机械压迫和破坏可对神经系统细胞产生直接杀伤作用,而脑卒中后周围脑组织继发缺血缺氧会进一步导致神经元细胞等的坏死和凋亡,造成严重的神经功能缺失。已经开始有大量的研究试图阐明脑卒中神经损伤的病理机制以及脑卒中的治疗靶点,同时试图发现更好更快可以直接避免缺血性卒中损伤的治疗措施。如何减少脑卒中后神经元细胞的坏死和凋亡,是改善这类患者预后的关键。脂肪间充质干细胞（Adipose Derived Stem Cells,ADSCs）是一种从成体脂肪间充质中获得的干细胞,因其无明显的免疫排斥反应、亦可自体移植,具有多向分化潜能等优点,近年来成为干细胞移植研究的热点。ADSCs移植治疗多种疾病所致的神经功能缺损已获得有价值的研究进展。本人所在课题组前期已成功构建了 SD大鼠脑卒中模型,同时分离出ADSCs进行体外培养扩增,并诱导成神经元样细胞,然后注射到大鼠损伤脑组织局部,观察到受损脑组织局部不成熟神经元细胞增多、神经突触再生明显、细胞有丝分裂活动增强,局部神经组织损失面积减少,可促进大鼠的神经功能恢复。在综合大量动物实验的基础上,课题组又开展了自体ADSCs局部注射治疗脑卒中临床试验研究。研究结果证实在脑卒中患者血肿腔周围损伤的脑组织局部注射ADSCs治疗,可在近期（6个月）内有效改善患者的神经功能缺失,且效果优于静脉注射和蛛网膜下腔注射。但同时我们也发现ADSCs治疗组患者在12个月之后的神经功能评分与对照组比较无明显统计学差异,表明ADSCs治疗脑卒中后神经损伤远期效果较差,仍不能令人满意。如何提高移植后ADSCs神经修复效果是研究者面临的课题之一。这就提示我们要对ADSCs治疗脑卒中的作用机制进行深入研究,找到关键作用分子并进行靶向调控,是提高ADSCs临床治疗效果的关键。间充质干细胞在过去被认为能分化成不同类型的细胞,但是现在更多的研究关注间充质干细胞和其他细胞的相互作用和对其他细胞的影响,特别是研究和其他细胞的信息交流。近来通过细胞外囊泡进行信息交流吸引了更多的研究兴趣。有许多不同类型的分泌细胞外囊泡,它们在大小、细胞来源、生物合成、内容物和释放的生理环境都有不同。外泌体（Exosomes）是一种由细胞内溶酶体微粒内陷形成、直径在40-100nm的多囊泡体。它含有蛋白质、mRNAs和miRNAs等遗传物质,作用于靶细胞并调控相关靶基因表达,具有实现细胞间物质交换及信息传递等功能,参与体内多种病理生理过程。外泌体能够通过多种途径进行分离,通过电子显微镜进行特征描述和标记蛋白进行鉴定。目前研究认为,ADSCs移植治疗神经损伤性疾病,神经功能的改善主要获益于细胞的旁分泌机制,而外泌体是干细胞旁分泌效应中发挥主要作用的因子。干细胞来源的外泌体可提供生长因子等细胞保护因子,能够起到抗凋亡、促进血管生成、增强神经细胞分化及修复受损组织等多种作用。外泌体在ADSCs神经修复中的作用已经成为其作用机制研究的热点。已有大量研究证实脂肪间充质来源的干细胞可分泌外泌体,并在干细胞的生理作用中起到重要作用。在脑卒中相关外泌体研究中,Xin等报道ADSCs可通过分泌外泌体miR-133b被神经元及星形胶质细胞摄取后促进轴突生长。且ADSCs移植联合miR-133b过表达治疗对神经轴突可塑性及神经突触重塑方面效果优于单纯ADSCs治疗。该团队还首次用ADSCs源外泌体替代ADSCs治疗脑卒中动物模型,同样可改善脑卒中预后。然而,外泌体的内容物在不同的病理情况下发挥的作用不同,这种不同也许会导致靶细胞完全相反的命运。因此,研究在特定病理情况例如缺氧和缺血情况下外泌体的生物学功能将会大有收获。此外,本研究将尝试为缺血缺氧神经损伤的治疗提供新的理论依据。在外泌体的内容物中,有研究显示miRNAs调控缺血性脑卒中病理生理学结局中的重要过程。它是一组小（大约22核苷酸）、单链非编码RNA,在基因表达中具有重要的作用。miRNAs既能促进亦能抑制神经胶质细胞及脑血管内皮血细胞的凋亡,也能够调节急性脑缺血介导的脑卒中。但是脂肪间充质干细胞外泌体来源的miRNA是否可以在脑缺氧、缺血情况下参与神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的凋亡调节过程还不是很清楚。在此研究中,我们探讨了脂肪间充质干细胞来源的外泌体对缺血、缺氧模型中神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的保护作用,认为其机制主要是通过外泌体miR-21及miR-342对该两种细胞中caspase-3蛋白的调节来完成的。同时通过我们大量的研究工作亦可以为缺血性脑卒中提供潜在的细胞治疗策略。研究目的1.检测miR-21、miR-342在干细胞外泌体及脑卒中体外模型中的表达水平。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。研究方法1.培养人源脂肪间充质干细胞,采用超速离心法成功提取外泌体并利用电子显微镜进行鉴定。培养人源神经胶质T98细胞及血管内皮细胞HCMEC,配置适当浓度氯化钴溶液（COC12）成功建立T98及HCMEC缺血缺氧模型,RNA-Seq、MTT及qRT-PCR方法分别检测、筛选差异表达miRNAs,并从中选取特异性高的 miRNA（miR-21、miRNA-342）。2.电子显微镜下观察T98及HCMEC细胞凋亡情况,并采用LP3000瞬时转染方法转染miR-21及miR-342的mimic及inhibitor,观察细胞凋亡及改善情况与miRNA表达的关系。3.间充质干细胞利用qRT-PCR方法验证差异表达miRNAs,将外泌体与缺血缺氧细胞模型共培养,观察细胞凋亡及改善情况。干扰干细胞miR-21及miR-342表达量,再次分离得到外泌体并共培养,通过qRT-PCR方法、Western Blot及流式细胞学技术方法观察细胞凋亡及改善情况。4.通过荧光素酶检测方法检测miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点及蛋白caspase-3,结合生物信息技术验证miRNAs及其靶基因作用的细胞信号通路,同时观察脑卒中细胞凋亡情况与caspase-3表达的相关性,再次验证miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点,尝试为脑卒中损伤的调节提供潜在的细胞治疗策略。研究结果1.miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平分析结果表明利用氯化钴溶液可以成功建立缺氧缺血模型,miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平具有明显特异性。脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低（mean±SD,2.53±1.94）,miR-342表达升高（mean±SD,2.57±1.95）,miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低,miR-342表达升高（mean±SD,2.57±1.95）,miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。干细胞利用LP3000成功瞬时转染mi-R-21及miR-342的生物模拟物,并利用qRT-PCR检测到相应miRNA的表达改变。干细胞外泌体干扰miR-21及miR-342表达对脑卒中损伤发挥相应调控作用,干细胞外泌体miR-21过表达可以改善脑卒中损伤模型中细胞凋亡情况,miR-342过表达则起到促进细胞凋亡作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。外泌体作为一个转运微粒,通过细胞间miRNA和蛋白的交换在细胞间的信息交流中发挥重要的作用,研究特定病理情况下分泌的具有潜在生物学功能外泌体中的miRNA等内容物是很有必要的。因此,我们选择了此前文献报道的12种miRNA,既包括缺血缺氧过程中的miR-24,miR-146,又包括少突胶质细胞凋亡过程中的miR-21,592,138,342等。在这些miRNA中,脂肪间充质干细胞来源的外泌体miR-21在经过缺氧处理后被显着下调,而miR-342显着上调。这提供了一个潜在的外泌体两种miRNA的共同靶点,其在缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中也许会影响caspase-3的表达。我们检测了缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中的miR-21及miR-342,结果显示miR-21被显着下调、miR-342显着上调,提示缺氧过程中miR-21、342的改变和caspase-3表达改变之间有可能存在联系。因此使用两种miRNA的抑制物进行过表达及低表达功能实验,结果显示miR-21的表达与caspase-3的表达水平呈负相关,miR-342与caspase的表达呈正相关。结论1.脑卒中损伤后神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡进展与miR-21及miR-342的表达具有明显相关性。2.间充质干细胞来源的外泌体可通过miR-21及miR-342参与改变神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡。3.间充质干细胞外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中损伤调节。意义本课题明确了我们能得出一个结论,即脂肪间充质干细胞源外泌体miR-21及miR-342、caspase-3有希望成为脑卒中治疗的潜在靶点。第二部分ADSCs外泌体通过miR-342-5p调控血管内皮细胞抗动脉粥样硬化改善脑卒中的作用研究研究背景脑血管疾病、心血管疾病和癌肿是导致人类死亡最常见的3类疾病。脑血管病的年人发病率在每十万人有150～200人,其中缺血性脑血管病约75%85%、脑出血约10%15%以及自发性蛛网膜下腔出血约5%9%。脑梗死30天病死率约15%33%,生存者均有程度不同的病残。虽然发达国家已大力开展对脑血管危险因素的防治,曾使脑血管病的发病率和死亡率在20世纪70年代有所降低,但在80年代初又有所回升。近年来,虽然神经科学在诊断、治疗以及基础研究上有很大的发展,但是脑血管病的治疗依旧是我们要面临的重大挑战。缺血性脑卒中见于很多种神经外科疾病的病理及生理过程中,如脑血管病、颅内肿瘤、脑外伤、术中暂时性血管阻断等;亦可见于心脏骤停、休克等全身性的病理过程。脑缺血可表现为不同的形式,例如局灶性和弥漫性脑缺血、永久性及暂时性脑缺血之分。但不论以哪种方式出现,脑缺血后的病理生理机制和生化改变基本相似,且与脑缺血的程度和持续时间高度相关。基本病理过程包括:能量衰竭、细胞离子平衡失调、酸中毒、钙内流、兴奋毒性作用和氧自由基介导的毒性作用等。研究表明,当颈动脉管腔狭窄程度<70%时,脑血流保持不变。可是,当狭窄≥70%时,管腔的横切面减少90%,即引起显着脑血流减少。动脉管腔内血栓形成或者栓塞是错综复杂的过程,受很多种因素相互作用:血液成分改变、血管壁内膜损伤、局部脑血流的特征例如流速、漩涡等。因颈动脉粥样硬化引起管腔高度狭窄进而导致脑供血不足是促成缺血性脑卒中的主要病因,因此颈动脉内膜剥脱术不仅可以增加CBF,而且可以消除潜在的脑血栓和栓塞风险进而达到防治缺血性脑卒中的目的。颈动脉粥样硬化,通常是由颈动脉壁上充满脂质的巨噬细胞积聚引起的,是脑血管疾病的主要潜在贡献者,并在全球范围内具有高发病率和高死亡率。一系列高脂血症引发的慢性炎症过程:包括修饰后的脂蛋白、单核细胞和T淋巴细胞与来自血管壁的细胞成分之间复杂的相互作用,均促进了动脉粥样硬化病变的形成。迄今为止,许多诊断技术已被用来评估脑血管疾病的风险和寻找其治疗方法,这些诊断技术通常分为侵入性和非侵入性:前者以侵袭性血管造影和光学断层扫描为例,后者以血液生物标志物、压力测试、CT和核扫描为例。值得注意的是,经过大量关于动脉粥样硬化发生的细胞及分子生物学方面的研究增强了人们对动脉粥样硬化发生的潜在危险因素及其临床特征的认识。因此,继续研究动脉粥样硬化形成的潜在机制,可有助于更好地防治这一系列的慢性疾病。动脉粥样硬化的发病机制可分为启动期、进展期和并发症期三个阶段。内皮细胞的损伤或功能障碍被认为是动脉粥样硬化斑块形成的关键原因。血管内皮细胞对血流紊乱的适应及对动脉分支部位血流冲击的易感性成为动脉粥样硬化发生的决定性因素。因此,寻找有效的方法来保护内皮细胞可能是预防动脉粥样硬化进展的有效策略。MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA,被认为是特异性信使RNA（mRNA）的重要转录后调节因子。近年来,大量文献研究发现,几种与促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化相关的miRNA表达失调是动脉粥样硬化发生发展的关键因子。据报道,许多miRNAs在脂质代谢、炎症和动脉粥样硬化形成中发挥重要的调控作用:miR-19b和miR-144-3p参与脂质代谢调控,miR-92a和miR-155作为炎症的关键调控因子,miR-30c和miR-126-5p预防动脉粥样硬化。因此,靶向miRNAs可能会缓解动脉粥样硬化的发展。尽管已经报道了大量与动脉粥样硬化相关的miRNA,但在寻找新的或有价值的miRNA和探索其在动脉粥样硬化中的潜在生物学功能方面仍有许多工作要做。本研究旨在筛选动脉粥样硬化相关的miRNA,并初步探讨其可能的调控机制。首先,通过RNA测序对比分析动脉粥样硬化患者和相应健康对照组中差异表达的miRNA和mRNA。建立血管内皮细胞损伤模型。其次,我们的目标miRNA:miR-342-5p是在生物信息学分析和实验验证的基础上鉴定出来的。我们还评估了miR-342-5p对血管内皮细胞损伤模型凋亡的影响。通过一系列的生物信息学分析和实验证实,miR-342-5p被识别为动脉粥样硬化相关靶点。最后,我们对脂肪间充质干细胞（ADSCs）来源的外泌体进行了分离及鉴定,并研究了它们对血管内皮细胞损伤模型中mi R-342-5p表达的影响。总之,这项工作发现并鉴定了一个与动脉粥样硬化相关的miRNA（miR-342-5p）,并发现了这个miRNA在动脉粥样硬化中发挥作用的潜在机制。研究目的1.检测人颈动脉粥样硬化标本与正常人颈动脉相比,miRNA、mRNA等的表达情况。2.建立体外内皮细胞损伤模型,采用WB、Hoechst和FCM等技术检测凋亡相关基因和功能,其中还检测了 miR-342-5p对内皮细胞损伤模型的作用。3.寻找并验证miR-342下游目标靶基因,研究抑制和过表达miR-342后对下游目标靶基因和蛋白表达水平的影响。4.分别干扰和过表达miR-342下游靶基因,研究其对血管内皮细胞抗动脉粥样硬化作用的影响。5.研究干细胞来源外泌体对miR-342-5p表达的影响。研究方法1.检测人颈动脉粥样硬化标本与正常颈动脉相比,miRNA、mRNA等的表达情况。利用RNA测序数据,通过一系列合适的分析工具来观察动脉粥样硬化样本中差异表达的miRNA和mRNA。利用火山图的方法对miRNAs和mRNAs在动脉粥样硬化组与正常组之间的不同进行差异化表达分析,其标准为|log2FC|>1 and P<0.05,Sanger Box将其结果进行可视化。基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。在文氏图中,在miR-342-5p的重叠靶点中发现了 Hub基因。2.建立体外内皮细胞损伤模型,检测凋亡相关基因和功能,检测miR-342-5p对内皮细胞损伤模型的作用。MTT方法筛选适当浓度H202建立体外内皮细胞损伤模型,采用Hoechst染色试剂盒法及流式细胞术分析检测血管内皮细胞凋亡率,RNA分离和实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测并再次验证差异表达miRNA。3.研究干细胞来源外泌体对miR-342-5p表达的影响。ADSCs外泌体的分离和鉴定,提取干细胞外泌体与内皮细胞损伤模型共培养,利用RT-PCR和Western blot方法分别检测外泌体对miR-342表达的影响,免疫印迹分析（Western-blot）等技术对靶基因转录及蛋白表达水平的影响。分别干扰和过表达miR-342及靶基因。运用RT-PCR和Western blot验证干扰效率及过表达效率,检测血管内皮细胞凋亡情况的改善。研究结果1.通过RNA测序分析差异表达的miRNA和mRNA分别对3例动脉粥样硬化患者的粥样硬化斑块和2例意外车祸患者的颈动脉正常样本进行RNA测序。RNA-seq技术检测筛选差异表达miRNAs,火山图筛选条件为:|log2FC|>1,p<0.05;动脉粥样硬化标本中共有141个miRNA差异表达,其中上调68个,下调73个。血管内皮细胞在H202 0、1000、1500和2000 um时的凋亡率分别为2.6%、11.1%、20.5%和41.1%。western blot分析发现,随着 H202 浓度的升高,cleaved-PARP/PARP、cleaved-caspase3/caspase3、cytochrome C、p53 的表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。同时,随着H202浓度的升高,Bcl-2与BAX的比值呈下降趋势（P<0.05,P<0.01）。以上结果共同支持了血管内皮细胞病变模型的成功构建。2.目的miRNA miR-342-5p被识别并促进H2O2损伤的血管内皮细胞的凋亡根据log2FC值排序,筛选出前30位上调的miRNA,其表达谱热图如图3A所示。随后,10 个 miRNAs（即 miR-147b-3p、miR-378d、miR-10399-3p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-2277-5p、miR-342-5p、miR-181a-3p、miR-378a-3p 和miR-142-3p）被认为是候选,它们在RNA测序中排名第一,或据报道与动脉粥样硬化相关。在血管内皮细胞损伤模型中,10个miRNAs中,has-RNA-342-5p的相对表达量最高。随着H2O2（1000、1500或2000 uM）浓度的逐渐升高,检测到miR-342-5p的表达。显然,随着H202浓度的增加,这一 miRNA表达逐渐增强。将血管内皮细胞分别转染miR-342-5p mimic、inhibitor及其相应的NC,然后用1500um H202处理,结果表明miR-342-5p可以促进血管内皮细胞的凋亡。3.在H20损伤的血管内皮细胞中,PPP1R12B被鉴定为miR-342-5p的靶点通过聚类分析可以将表达模式相似的基因聚在一起,说明它们可能具有共同的功能或参与共同的代谢和信号通路。利用RNA测序得到的差异表达mRNA进行聚类分析在RNA测序中,有2694个mRNA下调,这240个基因分别来自三个数据库。因此获得了 25个基因,它们不仅是miR-342-5p的靶点,而且在动脉粥样硬化中也被下调。接下来,这25个基因被用于GO和KEGG富集分析。这25个重叠基因的相互作用首先通过STRING分析,然后导入到Cytoscape中。KEGG分析表明,在这些hub基因中,得分最高的PPP1R12B同时与血管平滑肌收缩和催产素信号通路相关。miR-342-5p可以抑制血管内皮细胞损伤模型中PPP1R12B的表达。上述证据表明,在H202受损的血管内皮细胞中,PPP1R12B是miR-342-5p的靶标。4.ADSCs源外泌体可抑制H2O2损伤血管内皮细胞中miR-342-5p的表达。将ADSCs分离培养,从ADSCs培养上清液中纯化的外泌体进行TEM表征。结果如图5B所示,外泌体为直径30～150nm的圆形膜囊。western blot检测作为外泌体常用标记蛋白的CD9、CD63和TSG101的表达水平。将外泌体加入浓度为1500um的H2O2损伤的血管内皮细胞中。随后用q RT-PCR检测miR-342-5p的表达。结果表明,在H2O2受损的血管内皮细胞中,ADSCs源外泌体抑制了 miR-342-5p的表达。结论1.间充质干细胞来源外泌体能够抑制miR-342-5p的表达,保护内皮细胞抗动脉粥样硬化,其主要抑制氧化应激诱导的线粒体凋亡信号通路来实现。2.在H2O2受损的血管内皮细胞中,PPP1R12B是miR-342-5p的靶标。3.由ADSCs源外泌体介导的miR-342-5p具有参与调控血管内皮细胞抵抗动脉粥样硬化的作用。意义我们的研究可能为动脉粥样硬化的发病机制提供更好的理解,并为动脉粥样硬化的潜在治疗靶点提供有价值的见解。
二、参与缺血缺氧性血管内皮细胞凋亡的因素（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、参与缺血缺氧性血管内皮细胞凋亡的因素（论文提纲范文）
（1）活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 活血温阳类药物治疗冠心病的文献研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药联合MSCs移植治疗心肌梗死的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 姚魁武教授论治冠心病阳虚证的经验以及发掘 |
| 导师姚魁武活血温通法治疗冠心病的经验总结 |
| 基于中医传承计算平台分析姚魁武教授治疗冠心病阳虚证用药特点 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 活血温通方联合BMSCs移植治疗大鼠急性心梗的疗效评价 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 活血温通方联合BMSCs移植改善大鼠心梗区缺血缺氧微环境的机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 查新报告 |
（2）基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 眼针对MCAO/R大鼠神经功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 眼针对MCAO/R大鼠缺血侧脑组织血管新生的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 眼针对MCAO/R大鼠脑组织缺血半暗带区域HIF-1α和Wnt3a/β-catenin/LEF1 信号转导通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 一 针刺治疗缺血性脑卒中研究进展 |
| 二 血管新生相关因子及信号传导通路在缺血性脑卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（3）新生大鼠缺氧缺血脑白质损伤模型少突胶质细胞发生与血管新生的研究（论文提纲范文）
| 附录:英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 缺氧缺血脑白质损伤模型的建立 |
| 2.2 体重监测与数据统计 |
| 2.3 冰冻切片的制备 |
| 2.4 术后大鼠脑组织 MBP 免疫荧光染色和 Western Blot 测定 |
| 2.5 少突胶质细胞发生和血管新生的研究 |
| 2.6 ELISA和免疫荧光组织化学染色检测BDNF表达变化 |
| 结果 |
| 1 WMI模型评价 |
| 1.1 术后动物的一般情况 |
| 1.2 体重和睁眼情况 |
| 1.3 术后 28 天大鼠脑白质 MBP 免疫荧光染色和 Western Blot 结果 |
| 2 脑白质少突胶质细胞发生呈时间依赖性变化 |
| 2.1 脑白质少突胶质细胞谱系随时间的变化情况 |
| 2.2 脑白质少突胶质前体细胞随时间的变化情况 |
| 2.3 脑白质成熟少突胶质细胞随时间的变化情况 |
| 2.4 脑白质术后56 天和84 天髓鞘碱性蛋白MBP的表达情况 |
| 3 脑白质血管新生随时间的变化情况 |
| 4 脑白质BDNF含量随时间的变化情况 |
| 讨论 |
| 1 WMI 动物模型的建立和评价 |
| 2 少突胶质细胞发生和血管新生变化趋势 |
| 2.1 少突胶质细胞发生的改变 |
| 2.2 血管新生变化 |
| 2.3 脑源性神经营养因子变化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 早产儿缺氧缺血脑白质损伤模型的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）Septin4在缺氧诱导的H9c2心肌细胞损伤中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞缺氧及药物处理 |
| 2.2.3 使用脂质体进行质粒转染 |
| 2.2.4 使用jet Prime进行si RNA转染 |
| 2.2.5 慢病毒感染构建Septin4 稳定敲除H9c2 细胞系 |
| 2.2.6 CCK8 实验 |
| 2.2.7 流式细胞术实验 |
| 2.2.8 免疫印迹法(western blot实验) |
| 2.2.9 免疫共沉淀实验(Co-IP实验) |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 缺氧刺激诱导H9c2 心肌细胞损伤并且促进Septin4 表达 |
| 3.2 过表达Septin4 加重缺氧诱导的H9c2 心肌细胞损伤 |
| 3.3 敲减Septin4 减轻缺氧诱导的H9c2 心肌细胞损伤 |
| 3.4 Septin4 通过降低HIF-1α的表达参与缺氧诱导的H9c2 心肌细胞损伤 |
| 3.5 Septin4 通过其GTPase结构域与HIF-1α结合 |
| 3.5.1 HIF-1α被鉴定为Septin4 的新结合蛋白并且在缺氧时结合增强 |
| 3.5.2 Septin4 通过其GTPase结构域与HIF-1α结合 |
| 3.6 Septin4 通过蛋白酶体途径调节HIF-1α稳定性 |
| 3.7 Septin4 促进HIF-1α的泛素化 |
| 3.8 Septin4 增强VHL与 HIF-1α结合促进HIF-1α的泛素化蛋白酶体降解 |
| 3.8.1HIF-PHDs 抑制剂 BAY85-3934 挽救 Septin4 对 HIF-1α表达的抑制 |
| 3.8.2 Septin4 增强E3 泛素化连接酶VHL与 HIF-1α的结合 |
| 3.8.3 HIF-PHDs 抑制剂 BAY85-3934 下调 Septin4 促进的 HIF-1α泛素化 |
| 3.9 Septin4 参与缺氧诱导的H9c2 心肌细胞损伤的工作模式图 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 Septin 家族介绍及 Septin4 在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）激肽释放酶结合蛋白（KBP）修饰骨髓间充质干细胞在氧诱导视网膜病变中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 构建过表达KBP的慢病毒 |
| 实验一 过表达KBP慢病毒载体构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 慢病毒包装与滴度检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二部分 小鼠BMSCs培养和KBP过表达慢病毒载体感染BMSCs |
| 实验一 骨髓间充质干细胞的提取、培养和诱导分化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 KBP过表达慢病毒载体感染BMSCs |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第三部分 KBP修饰骨髓间充质干细胞对氧诱导的视网膜病变的影响 |
| 一、小鼠氧诱导视网膜病变模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 二、玻璃体腔注射KBP修饰骨髓间充质干细胞对氧诱导的视网膜病变的观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 激肽释放酶结合蛋白在视网膜新生血管疾病中的作用机制研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）15-羟二十烷四烯酸对胎盘滋养细胞功能的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 15-HETE对胎盘滋养细胞功能的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验标本收集及临床资料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞生物学行为检测 |
| 2.2.2 细胞划痕实验 |
| 2.2.3 细胞迁移实验 |
| 2.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同浓度15-HETE处理HTR8/Svneo后划痕实验结果 |
| 2.3.2 不同浓度15-HETE处理HTR8/Svneo后 Transwell实验结果 |
| 2.3.3 不同浓度15-HETE处理后EAhy926 细胞后流式细胞术结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 15-HETE对滋养细胞功能作用的机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞生物学行为检测 |
| 3.2.2 细胞蛋白的提取 |
| 3.2.3 Western blot实验 |
| 3.2.4 细胞划痕实验 |
| 3.2.5 细胞迁移实验 |
| 3.2.6 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 15-HETE处理HTR8/Svneo后 MMP-2 的蛋白水平 |
| 3.3.2 MMP-2 Inbitor处理HTR8/Svneo后划痕实验结果 |
| 3.3.3 MMP-2 Inhibitor处理HTR8/Svneo后 Transwell结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 15-羟二十烷四烯酸与子痫前期发病机制的相关研究 |
| 参考文献 |
（7）从外泌体角度探讨活血益气方促大鼠心梗后血管新生的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 益气活血法治疗缺血性心脏病的研究进展 |
| 1 益气活血法治疗缺血性心脏病的中医理论基础 |
| 2 益气活血法治疗缺血性心脏病的作用机制 |
| 综述二 外泌体治疗心肌梗死后血管新生的研究进展 |
| 1 外泌体的生物学特征 |
| 2 内源性心脏细胞来源的外泌体与血管新生 |
| 3 外源性干细胞来源的外泌体与血管新生 |
| 4 循环血液来源的外泌体与血管新生 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 第一部分 血清外泌体的提取及鉴定 |
| 实验一 外泌体的提取与鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 活血益气方血清外泌体对大鼠心梗后血管新生的影响 |
| 实验一 大鼠急性心梗模型的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 活血益气方血清外泌体对心梗后大鼠心肌损伤及心功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 活血益气方血清外泌体对梗死边缘区心肌组织CD31、α-SMA表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 活血益气方血清外泌体对梗死边缘区心肌组织HIF-1α、VEGF及其mRNA的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 活血益气方血清外泌体促心梗后血管新生的细胞分子机制 |
| 实验一 活血益气方血清外泌体对缺氧HUVECs增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 活血益气方血清外泌体对缺氧HUVECs迁移的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 活血益气方血清外泌体对缺氧HUVECs成管能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 活血益气方血清外泌体对缺氧HUVECs HIF-1α、VEGF及其mRNA的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 活血益气方血清外泌体对缺氧HUVECs VEGF及其信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）催产素预处理减轻冠状动脉内皮功能障碍大鼠心肌缺血/再灌注损伤机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 建立冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心脏灌注模型 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 催产素预处理对冠脉内皮功能障碍的大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 催产素预处理对大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤的治疗机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 ERK1/2通路在催产素预处理减轻大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤中机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 血管内皮细胞与心肌保护机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）负载血管生成素1的PLGA-PEG纳米微粒对大鼠心肌梗死后心肌修复影响机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文词汇对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料及实验方法 |
| 2.1 实验技术路线图 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验主要试剂 |
| 2.2.3 实验主要仪器与耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 负载血管生成素1的PLGA-PEG纳米微粒的制备 |
| 2.3.2 纳米微粒包封率测定 |
| 2.3.3 纳米微粒体外释放曲线测定 |
| 2.3.4 大鼠心梗模型的分组及处理 |
| 2.3.5 Masson染色 |
| 2.3.6 血管免疫荧光染色 |
| 2.3.7 细胞凋亡TUNEL检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 纳米微粒包封率及体外释放测定结果 |
| 3.2 心脏彩超检查结果 |
| 3.3 Masson染色结果 |
| 3.4 血管免疫荧光结果 |
| 3.5 细胞凋亡TUNEL测定 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 血管生成因子在心肌梗死后心力衰竭治疗中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3调控动脉粥样硬化脑卒中神经损伤的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 ADSCs外泌体miR-21-5p、miR-342-5p通过caspase-3参与脑卒中神经损伤调节的作用研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADSCs外泌体通过miR-342-5p调控血管内皮细胞抗动脉粥样硬化改善脑卒中的作用研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 资助致谢 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文全文Ⅰ REGULATION OF STROKE INJURY BY ADSCS EXOSOMES MIR-21 AND MIR-342 THROUGH CASPASE-3 |
| 英文全文Ⅱ Adipose-derived mesenchymal stem cells-derived exosome-mediatedmicroRNA-342-5p protects endothelial cells against atherosclerosis |
四、参与缺血缺氧性血管内皮细胞凋亡的因素（论文参考文献）
- [1]活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究[D]. 王擎擎. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制[D]. 浦延鹏. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [3]新生大鼠缺氧缺血脑白质损伤模型少突胶质细胞发生与血管新生的研究[D]. 李力. 福建医科大学, 2021(02)
- [4]Septin4在缺氧诱导的H9c2心肌细胞损伤中的作用与机制研究[D]. 吴少军. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]激肽释放酶结合蛋白（KBP）修饰骨髓间充质干细胞在氧诱导视网膜病变中的作用及机制研究[D]. 杨晓英. 福建医科大学, 2021
- [6]15-羟二十烷四烯酸对胎盘滋养细胞功能的影响及其作用机制研究[D]. 洪茂. 南昌大学, 2021(01)
- [7]从外泌体角度探讨活血益气方促大鼠心梗后血管新生的作用机制[D]. 高毅洁. 北京中医药大学, 2021(01)
- [8]催产素预处理减轻冠状动脉内皮功能障碍大鼠心肌缺血/再灌注损伤机制研究[D]. 王默. 昆明医科大学, 2021
- [9]负载血管生成素1的PLGA-PEG纳米微粒对大鼠心肌梗死后心肌修复影响机制的研究[D]. 方涛. 兰州大学, 2021(12)
- [10]ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3调控动脉粥样硬化脑卒中神经损伤的作用研究[D]. 邢晓辉. 山东大学, 2020