人乳腺癌完全抗体可变区基因的扩增与克隆

人乳腺癌完全抗体可变区基因的扩增与克隆

一、人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆(论文文献综述)

蒋小华[1](2020)在《Trop2单克隆抗体的制备与鉴定》文中指出肿瘤是人类常见的疾病之一,近年来肿瘤的发病率与死亡率在全球范围内均呈上升趋势。目前临床上治疗早期肿瘤的最主要的方式为手术切除,可使大部分肿瘤获得根治。对于中晚期肿瘤,化疗和放疗是主要治疗方式,但常规的化疗药物和放疗缺乏靶向性和选择性,其毒副作用较大以及因癌细胞获得性耐药的产生,极大地影响了治疗效果。随着分子生物学技术的发展和在细胞受体及增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制的深入认识,肿瘤靶向治疗成为肿瘤治疗的重要发展方向,其中单克隆抗体药物由于其良好的靶向性成为肿瘤靶向治疗研究的热点。肿瘤相关钙信号转导蛋白2(Trop2)是一种细胞表面糖蛋白,是肿瘤相关钙信号转导蛋白(TACSTD)家族成员之一。Trop2在正常组织中不表达或低表达,但在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中过表达,并在肿瘤细胞自我更新、增殖和转化中起调节作用。目前,以Trop2为靶点研发的抗体、抗体偶联物以及联合用药等多种形式的药物正处于研发中或已进入临床阶段。Trop2已成为肿瘤治疗的重要靶点。本研究以Trop2为靶点,利用杂交瘤技术制备了鼠Trop2单克隆抗体,并通过ELISA、流式细胞术及SPR等技术得到靶向Trop2的亲和力高、内化效率快和特异性好的鼠单克隆抗体。进一步研究了该抗体人源化后的成药性,为肿瘤的治疗提供了新的途径。主要结果如下:1.利用GEPIA 2.0、HPA等数据库进行大数据分析,结果显示Trop2在多种实体瘤(如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等)中的m RNA水平和蛋白水平均高表达,且与患者预后不良相关,提示Trop2可作为肿瘤靶向治疗的潜在靶点。2.构建了PTT5/Trop2胞外段表达载体,表达纯化了Trop2胞外段蛋白。PTT5/Trop2胞外段表达载体由EcoR I-信号肽-Trop2胞外段碱基序列-6×His Tag-终止密码子-NcoI组成。Trop2胞外段蛋白分子量约40 kDa左右,分子量大于理论预测值,推测是由于糖基化修饰所致。3.以表达纯化的Trop2胞外段蛋白作为抗原,通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法检测小鼠血清抗体,效价在1:100,000以上,可进行杂交瘤制备。4.通过PEG1450介导免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,得到杂交瘤融合原始细胞克隆约4,500多个。利用ELISA初步筛选得到与抗原结合活性较好的174株阳性克隆。利用流式细胞术筛选得到具有与细胞水平的抗原结合活性较强的阳性杂交瘤抗体18株。5.通过有限稀释法将筛选得到的融合原始克隆进行亚克隆,获得近180株单克隆。利用ELISA初步筛选得到与抗原结合活性较好的71株阳性克隆。利用流式细胞术筛选得到具有与细胞水平的抗原结合活性的阳性杂交瘤抗体32株。利用SPR技术筛选到与抗原亲和活性好,抗体分泌量较高的阳性杂交瘤抗体13株。利用流式细胞术筛选到内化效率高的阳性杂交瘤抗体4株,综合考虑选择杂交瘤单克隆细胞株9-F11进行后续实验。6.将筛选到的9-F11细胞株通过PCR技术获得候选杂交瘤单克隆抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,利用DNA tools软件、NCBI BLAST数据库等进行序列分析,结果显示此抗体序列符合抗体可变区特征。7.利用MOE软件进行将上述抗体进行人源化改造和成药性分析,结果显示人源化得分排名靠前的种系模板共29个,选取4个轻链与5个重链进行组合后得到最优组合为hIgG1κ-6序列。预测此序列具有良好的理化性质,具有成药性。研究结果为Trop2抗体的进一步研发与应用奠定了基础。

王志文[2](2013)在《人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选》文中指出目的:构建大容量的人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,从中筛选出抗乳腺癌HER-2特异性单链抗体,并对其进行鉴定。方法:[1]取经临床确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA,并设计可变区引物;[2)通过RT-PCR方法,扩增抗体轻重链可变区基因,并连入T载体,构建可变区基因的T载体库;[3]设计Linker序列,合成Linker模板,并连入pCANTAB-5E载体,构建pCANTAB-Linker;(4)将VH和VL可变区基因与pCANTAB-Linker拼接,得到pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌T61;[5]收集转化后菌落,加入M13K07辅助噬菌体进行感染,收集噬菌体上清即为噬菌体抗体库;[6]噬菌体抗体库先经低表达HER-2的乳腺癌细胞株MCF-7进行吸附,再通过高表达HER-2的乳腺癌SKBR3细胞株进行淘洗筛选;[7]用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测噬菌体抗体的活性,并用免疫组织化学方法检测抗体亲和力及测序进行鉴定。结果:(1)通过RT-PCR方法,扩增出VH区基因片段约375bp,VL区基因片段约330bp,并连入T载体,构建可变区基因T载体库;[2]成功构建pCANTAB-Linker,并通过酶切连接,将轻重链可变区基因拼接,成功构建pCANTAB-scFv,获得scFv的长度为750bp;(3]电转化E.coli TG1,在含有青霉素的平板上长出阳性菌落,抽提质粒并进行酶切验证插入片段大小正确,插入率为80%,并计算库容得到库容为2.4×108的大容量抗体库;[4)通过噬菌体展示的方法,经过高表达HER-2的乳腺癌SKBR3细胞株进行4轮淘洗筛选,富集针对乳腺癌SKBR3细胞表面抗原的抗体库;[5]通过酶联免疫吸附试验(ELISA)证实所得抗体对HER-2抗原有良好亲和力和高度的特异性,免疫组化结果显示阳性克隆对乳腺癌组织HER-2抗原有较高亲和力;[6]测序结果表明,所得到单链抗体基因与人IgG抗体进行对比,具有高度的人源性。结论:本研究主要利用基因工程和噬菌体展示技术构建人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体单链抗体库,再通过多轮筛选,获得能特异性识别人乳腺癌HER-2的高亲和力单链抗体,并通过ELISA.免疫组织化学及测序等方法,对抗体的结构和功能进行初步鉴定分析。为乳腺癌的分子诊断及靶向治疗提供新的思路和奠定良好的基础,同时也为以HER-2为靶点的融合蛋白抗肿瘤疗法提供载体。

王净,王慧,袁媛,李青[3](2011)在《全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建》文中研究说明目的:利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法:从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞(PBMC),提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链(VH)和轻链(VL)基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR),在体外将两者连接成单链抗体(scFv)基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果:得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论:本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。

常德[4](2011)在《1、全基因组筛选和鉴定ARPC1B基因在胰腺癌转移中的作用和机理 2、抗Aβ42鼠源单抗的人源化改造》文中认为目的:利用分子遗传学的方法构建一种全基因组随机基因突变调控技术平台,并通过该技术筛选和鉴定控制胰腺癌转移有因果关系的关键候选基因和遗传通路,为进一步研究恶性肿瘤转移的分子病理机理打下基础,为胰腺癌的临床诊断、治疗和预防提供新的靶点和策略。方法:选择低转移性人胰腺癌细胞株AsPC-1为研究对象,建立包含四环素基因调控系统转录激活子(transactivator, tTA or Tet-off)的AsPC-1稳定表达细胞株;构建基于piggyBac转座子(PB)并含有双份四环素反应元件(double tetracycline responsive element,2TRE,14Tet)的基因搜寻载体(GSV);通过脂质体共转染方法将GSV质粒和mPB质粒导入Tet-off稳定表达细胞系,经G418筛选后获得全基因组范围内的纯合细胞随机基因突变文库,并鉴定所得突变库的特点;通过裸鼠体内移植模型筛选和鉴定高转移性AsPC-1细胞;利用Splinkette PCR法从高转移性细胞株中克隆GSV插入位点确定候选基因,并进行生物信息学分析;功能验证上述候选突变基因与高转移表型的因果关系,分析候选基因在癌症转移中的临床意义、作用和分子机理。结果:建立了稳定和高效表达tTA的Tet-off人胰腺癌细胞株AcPC-1-2D2、AsPC-l-2B6与AsPC-1-5A3,其受Dox的调控倍数均超过100倍;成功组建了基于piggyBac基因搜寻载体(PB-GSV),在AcPC-1-2D2中建立了全基因组纯合细胞随机基因突变文库,含有100多万个突变克隆;经鉴定PB-GSV在基因组上整合范围广、转座效率高和偏向突变编码基因,是一种理想的基因搜寻工具;利用裸鼠体内筛选得到14株高转移性胰腺癌细胞株,克隆到16个肿瘤转移相关的候选基因,包括3个已知与肿瘤转移密切相关和13个新发现的基因;并对ARPC1B基因进行了功能验证和机理研究,结果表明其能促进细胞生长和运动,与胰腺癌肺转移具有直接的因果关系。结论:成功构建了全基因组随机突变调控技术平台并利用它筛选得到了多个控制胰腺癌转移的候选基因,功能验证和机理研究显示ARPC1B基因是胰腺癌肺转移中的关键基因之一;为胰腺癌转移的分子病理机制研究提供了新的切入点,为胰腺癌的临床诊断和靶向治疗提供了潜在的生物标志物和靶点。目的:通过基因工程抗体技术对抗阿尔茨海默病Aβ42鼠源单克隆抗体进行人源化改造,构建和表达抗β-淀粉样多肽人-鼠嵌合抗体和改型抗体,减低鼠源单克隆抗体(mAb)在临床应用中引起的人体免疫排斥反应(HAMA反应)。方法:从分泌抗Aβ鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取总RNA,用RT-PCR扩增抗Aβ鼠单克隆抗体全长基因,对其序列进行分析,确定能与抗原Aβ结合的抗体重轻链可变区基因;利用重组PCR技术拼接重轻链可变区与人IgG1的恒定区基因构建嵌合抗体,在此基础上对嵌合抗体可变区中的框架区改造,获得只保留抗Aβ42鼠源单克隆抗体可变区的改型抗体,并进一步对抗Aβ42嵌合抗体和改型抗体重链Fc段进行定点突变以降低排斥反应;分别构建抗Aβ42人-鼠嵌合基因和改型抗体基因重轻链真核表达载体,用脂质体法将其同时导入COS-7细胞中表达,并对分泌的抗体功能和性质进行初步鉴定。结果:Blast比对分析结果显示克隆的基因序列符合小鼠抗体基因序列,获得全新的能与抗原Aβ结合的可变区基因;将可变区基因与人IgG1的恒定区基因拼接后构建嵌合抗体真核表达载体,共转染COS-7细胞后能分泌抗Aβ的嵌合抗体,其保持了亲本鼠源单克隆抗体的生物学活性;利用固定模板方案设计的抗Aβ改型抗体经真核细胞表达后,所分泌的改型抗体继续保持亲本抗体的生物学特性;利用重组PCR对嵌合抗体和改型抗体Fc进行定点突变并构建重轻链表达载体,并实现真核表达:ELISA和免疫组化实验证实了所分泌抗体的人源性和与Ap的结合特异性。结论:成功地克隆了抗Aβ42鼠源单克隆抗体可变区基因,并实现了对其人源化改造,构建和表达了抗Aβ42嵌合抗体以及改型抗体,为其在阿尔茨海默病的临床诊治中应用和进一步研究奠定了基础。

方晨[5](2011)在《Her2全人源抗体的制备及生物学功能研究》文中研究表明目的:Her2是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,它的过表达与肿瘤形成、恶性程度及预后密切相关。本研究的目的是通过构建全人源大容量噬菌体抗体库从而筛选鉴定具有高效抗肿瘤活性的Her2全人源抗体。方法:本实验构建了全人源大容量噬菌体抗体库,表达纯化了人Her2膜外区蛋白(Her2ECD),并利用Her2 ECD对噬菌体抗体库进行筛选,获得了异性结合Her2的噬菌体单链抗体ScFv,并构建完整L/pcDNA3.1(+)和H/pcDNA3.1(+)表达载体,在真核细胞CHO细胞中成功地表达了抗Her2抗体并对它们的体外抗肿瘤作用进行了研究。结果:我们制备的Her2抗体在体外能有效抑制乳腺癌细胞的MAPK、Akt信号通路,抑制Her2高表达乳腺癌细胞系SK-BR-3和BT-474的生长。结论:通过噬菌体抗体库的筛选,我们获得了具有抗肿瘤活性的Her2全人源抗体。

陶俊[6](2010)在《人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选,表达及鉴定》文中研究说明目的和背景FGF-2又称为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF-2),是成纤维生长因子家族的一员,最早由Gospodarowicz (1974)从牛脑垂体中提取的一种对BALB/C 3T3细胞等有明显促进生长作用的细胞因子。FGF-2有五种分子量,从18kD到34kD不等。所有的FGF-2异构体都缺乏信号肽,是通过一种现在还不十分清楚的机制分泌到细胞外的,其中18kD FGF-2在体内分布广泛,存在于中胚层及神经外胚层来源的细胞及多种肿瘤细胞中,对这些细胞有促增殖分化功能,参与了胚胎发育、血管生成、损伤修复、神经再生、肿瘤生长、组织纤维化等多项生理及病理过程。FGF-2的生物学效应,除对成纤维细胞和血管内皮细胞具有显着的促增殖作用外,还参与肿瘤发生和发展,特别对肿瘤的浸润和转移具有重要作用。有相当部分的肿瘤(如乳癌、结肠癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等)存在FGF-2的高表达(表2)。已知其作用环节主要有(1)FGF-2能促进表皮、内皮细胞再生,促进血管内皮细胞分裂,诱导其从基膜中分离出来,以刺激内皮细胞向肿瘤组织趋化运动,并形成管状结构,还提高组织中血纤维蛋白溶解酶原激活因子类及诱导内皮细胞产生其他蛋白酶,从而促进毛细血管的形成;(2)FGF-2能促进多种生长因子的分泌,如VEGF、HGF、FGF-1等,这些因子相互调节,共同促进肿瘤的生长;(3)肿瘤细胞存在FGF-2受体的高表达,通常比正常细胞上FGF-2R高10倍以上,许多肿瘤细胞(如神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、白血病、肺瘤、黑色素瘤、肝癌等)既表达FGF2又表达FGFRs,因此FGF2可直接作用于肿瘤细胞,使肿瘤织的各种蛋白酶及胶原酸分泌增加,从而加速肿瘤细胞的转移过程;(4)FGF-2还与肿瘤的耐药性有关,增强肿瘤对药物诱导的细胞凋亡的抵抗能力[20]。故FGF-2与肿瘤生长、转移、预后有着非常密切的关系。FGF-2与肿瘤肿瘤生长、转移、耐药有关,用抗体阻断FGF-2的活性被认为是一种治疗肿瘤的有效方法。已有多株抗FGF-2抗体体内外抑制肿瘤试验的报道。在多种动物体内,一株中和性的的单抗(GD2)能抑制FGF-2或肿瘤组织诱导的血管新生。在大鼠体内内GD2能抑制骨肉瘤的生长。另一株单抗,3H3,能抑制十二指肠溃疡的血管新生,从而延迟溃疡的愈合,同时它还能抑制一种转染的致瘤性细胞在裸鼠体内的生长。Aonuma等制备了两株中和性单抗,2G11和1E6,前者识别的是FGF-2的肝素结合位点,后者识别的是FGF-2与受体结合的位点,体内实验证实1E6能抑制肿瘤生长,而2G11不具备抗瘤作用。国内,谢庆祥等[7]通过建立裸鼠皮下移植膀胱癌动物模型进行研究,发现FGF-2抗体治疗组皮下瘤体积和重量比对照组均显着减少,瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)指数和微血管密度(MVD)也显着降低,表明FGF-2抗体对膀胱癌的生长具有明显抑制作用,其主要通过抑制膀胱癌细胞增殖和减少肿瘤血管形成的途径而在荷瘤裸鼠体内发挥抗肿瘤作用。林卫等观察了FGF-2抗体对人卵巢癌细胞的增殖、卵巢癌腹腔移植瘤裸鼠的生存率和人卵巢癌移植瘤血管生成和肿瘤生长的影响。研究结果显示,FGF-2抗体能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,卵巢癌的生长和血管生成,并呈浓度依赖性,提示FGF-2单抗有望成为卵巢癌生物治疗的新方法。本实验室前期制备了19株鼠抗FGF-2单抗,通过体外实验证实,其中三株抗体能够诱导B16细胞凋亡,近期的体内试验发现其中一株抗体能够明显抑制黑色素瘤的生长和转移,延长荷瘤小鼠的生存期,同时与化疗药物顺铂、紫杉醇等联合使用能够明显抑制黑色素癌的生长,而对于那些对化疗药物耐药的肿瘤抗FGF-2单抗能逆转其耐药性。这些报道证实在多种试验条件下,抗FGF-2抗体能阻断血管新生和抑制肿瘤生长。但这些抗体都是动物来源的抗体,用于人类疾病的治疗存在半衰期短、血清病发生率高、易在人体内产生抗体导致不能重复使用等弊。制备全人源性的抗FGF-2抗体,是克服上述弊端有效方法。人源性抗体的制备技术主要有三种,第一种是通过表面展示技术从人源性抗体库中筛选人源性抗体,第二种技术是通过免疫转入人免疫球蛋白基因的转基因鼠来获得针对特异抗原的人源性抗体,第三种技术是通过细胞分选技术,从某些病人骨髓细胞或外周血细胞中筛选特异性针对某种抗原的B细胞或记忆性B细胞,通过某些技术如与人骨髓瘤融合或用EB病毒使其永生化,使得这些B细胞能在体外无限繁殖,从而分泌人源性抗体。这三种技术中第二种技术需要购买或构建转基因小鼠,需要耗费大量财力和物力。第三种技术需要特殊病人的血细胞,并且需要获得人源性杂交瘤或刺激B细胞的永生化,这些技术目前还不成熟。表面展示技术具有极强的筛选功能,将序列互不相同的一组多样化的抗体表达到细菌,酵母,病毒表面,得到抗体展示库因此,利用其表型与基因型的统一以及易于扩增的特性,可很容易的从库中筛选出针对某种特异抗原的抗体。其中以噬菌体展示技术应用最为广泛。从噬菌体抗体库中直接筛选获得高亲和力抗体,其主要影响因素是抗体库容量大小和抗体基因的成熟度,其多样性要能保证有这种抗体存,并且在经过扩增后具有被筛选出来所要求的拷贝数,因此增加噬菌体抗体库的库容量尤其重要。根据已有报道,从大于109的大容量天然抗体库中,往往可以得到高亲和力的抗体,无需进行抗体亲和力成熟。本研究所用的抗体库为经过单载体细胞内重组法(Lxop-cre定位重组系统)两次重组配对后的人源性大容量抗体库,重组后库容约为6×1010,沉淀浓缩后滴度约为1013cfu/ml,具有良好的多样性,可以充分满足筛选的需要,在获得高亲和力抗体以及进行抗体性能改造方面具有较强的优势。在抗体的进化过程中,基因突变并不是随机发生于可变区内的,而是倾向性的集中在CDR区的某些位置,即突变热点,有多种类型,其中研究较详细的热点类型有AGY/RGYW和TAY(R=A/G,Y=C/T,W=A/T)。这些位点也常常是位于和抗原直接结合的区域中。针对这类位点引入突变,相较于这类位点之外的区域将更可能得到亲和力提高的基因工程抗体,而且可以通过构建小型的突变库来实现。Ho等研究发现,CDR区的突变热点分为胚系热点和非胚系热点,只有突变胚系热点才能提高抗体的亲和力。因此对抗体胚系热点进行突变将是本文采取的方法。方法1.利用固相筛选技术从大容量噬菌体抗体库(6×1010)中筛选能特异性结FGF-2的克隆,经过三到四轮的洗脱筛选,将得到的阳性克隆通过酶切鉴定,可变区多样性分析,基因测序和序列比对,确定能特异性结合FGF-2的序列正确的阳性克隆。2.将测序正确的阳性克隆的基因插入到原核表达载体pComb3XSS中,在低温培养条件下,利用IPTG诱导scFv基因的可溶性表达,离心后收集菌体,PBS重悬后超声破碎,收集破碎上清,通过SDS-PAGE, Western-blot, ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过竞争ELISA检测者几株scFv能否抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。3.将能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合的44克隆通过重叠延伸PCR构建成全长的人源性抗FGF-2抗体,插入到真核表达载体pIGG中,构建成真和表达载体pIGG-44,利用转染试剂FuGene HD转染HEK293T细胞,进行真核可溶性表达,收集细胞培养上清,通过SDS-PAGE, Western-blot,ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过硫酸铵沉淀和蛋白G纯化抗体,通过夹心ELISA测定抗体的浓度。4.表达的全长的人源性抗体通过体外细胞实验验证抗体的中和FGF-2的活性,通过血管内皮细胞促增值实验,迁移实验和成管实验验证抗体对血管内皮细胞的作用,通过肿瘤细胞增殖抑制试验验证抗体对肿瘤细胞的增值抑制作用,通过Hoechst 33258染色观察抗体作用后肿瘤细胞细胞核的变化情况,来观察细胞是否发上了凋亡5.对具有中和活性的44号克隆进行亲和力成熟,利用基因比对从Genebank中搜索出与44号克隆序列最接近的抗体胚系基因序列,然后通过IMTG中的抗体可变区基因在线分析工具V-QUEST,找出重链胚系基因中CDR区的突变热点,并与44号克隆进行比较,确定这些热点在44号克隆重链CDR区中的位置,随后我们通过定点突变对重链可变区CDR1区中的三个胚系热点进行定点随机突变,构建噬菌体抗体突变库,通过三轮洗脱筛选,每轮逐渐增加洗脱次数和减少包被的FGF-2的量来得到亲和力提高的抗体突变株,将高亲和力突变株进行可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力。计算抗体亲和力提高倍数。同时通过竞争ELISA法检测突变株是否还能抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。结果1.经过3到4轮筛选从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗FGF-2的抗体,通过对抗体可变区基因多样性分析,发现有8种不同抗体可变区基因型,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行DNA酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌HB2151成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中三株scFv能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合,其中44号克隆的抑制效果最好。2.通过对转染试剂,转染方法,培养温度,转染试剂与细胞的孵育时间,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗FGF-2抗体在HEK293T细胞中的表达量从1.5mg/L提高到了15.1mg/L。表达产物经硫酸铵沉淀,透析后上蛋白G亲和层析柱纯化,纯化后的产物经超滤管超滤除盐,最后经SDS-PAGE鉴定,获得纯度为90%的电泳纯抗体,双抗夹心法测定抗体含量,显示产量可以达到每升细胞培养上清12mg抗体。3.通过一系列体外实验证实44号克隆能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖,迁移和成管,同时还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖,Hoechst 33258染色后发现抗FGF-2抗体作用能够诱导U87MG的凋亡4.通过热点随机突变构建44号克隆的单链抗体噬菌体突变库,通过三轮洗脱筛选,筛选到了4株亲和力提高的抗体突变株,经过可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力,显示其中最高的一株亲和力比44号克隆的亲和力提高了4倍。结论1.通过对人源性噬菌体抗体库的筛选得到了七株不同的人源性抗FGF-2抗体,经过体外实验证实其中一株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,如促血管内皮增殖作用,促细胞迁移作用,内皮细胞成管作用等,更为重要的此株抗体还能诱导神经胶质瘤细胞株U87MG的凋亡。2.通过胚系热点突变使此株中和性抗体的亲和力提高了4倍,与此同时也提高了抗体的中和活性,从而证实了胚系热点突变提高抗体亲和力的可行性。本研究的创新处:1.成功筛选到三株人源性中和性抗FGF-2抗体,其中一株的抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1结合的效果最好,通过细胞实验证实此株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,为FGF-2抗体药物研究奠定基础。2.成功利用CDR区胚系热点突变提高了一株中和性抗体的亲和力,同时也使得抗体的中和活性增强,证实了此方法可在不改变抗原识别位点的情况下提高抗体的亲和力。

李晓莉,姚慧,周登远,焦振山[7](2010)在《人源性抗乳腺癌Her-2/neu噬菌体单链抗体库构建》文中认为目的构建乳腺癌患者抗Her-2/neu全人源性噬菌体单链抗体可变区(ScFv)文库,筛选抗Her-2/neu单链抗体。方法收集40例乳腺癌患者前哨淋巴结(SLN),提取总RNA,反转录为cDNA作模板,在目前常用的引物基础上重新设计可变区的引物,用PCR扩增全套抗体可变区,构建T载体库。并改造pCANTAB-5E构建了pCANTAB-Linker。将T载体库酶切连接入pCANTAB-Linker构建出ScFv文库。最后构建噬菌体单链抗体库并进行初级筛选。结果成功改良ScFv文库的构建方法。初步得到12株对人乳腺癌组织有高亲和力的Her-2/neu单链抗体。结论改良了ScFv文库的构建方法,可以获得较大库容量的单链抗体库,并从中筛选到人源性抗Her-2/neu单链抗体。

崔向丽[8](2007)在《抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究》文中进行了进一步梳理乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,占女性肿瘤死亡第二位,其发病率逐年增高,人们迫切需要采用新的治疗方法来提高患者的生存率及生存质量。分子靶向治疗在肿瘤治疗中的地位逐渐上升,成为肿瘤治疗的一个热点。目前已有多种分子靶向治疗的药物应用于乳腺癌的治疗或正在临床试验阶段,如赫赛汀(Herceptin)、细胞周期调节蛋白抑制剂、环氧化酶-2(COX-2)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂等。HER2受体是人表皮生长因子受体家族四成员之一,定位于人类17q21,编码分子量为185kD的氨基酸,命名为P185,具有酪氨酸激酶活性,蛋白从结构上分为胞外区、跨膜区和胞内区,后者具有酪氨酸激酶活性,与表皮生长因子受体具有同源性。HER2的功能是作为生长因子受体在细胞分化、粘附和运动中起作用。Her2基因扩增导致HER2高表达,导致细胞恶性转化见于30%转移性乳腺癌患者和部分卵巢癌,肺癌,胃癌和口腔癌患者。HER2过表达增加肿瘤细胞侵袭、转移的能力,通过启动多种转移相关机制而增加转移能力,包括细胞迁移率,体外侵袭力,Ⅳ型胶原酶活性,也影响某些粘附分子如上皮细胞钙粘蛋白等的合成,从而促进转移。妇女患HER-2阳性肿瘤预后差,复发快。因此,HER2高表达可成为判断上述肿瘤恶性程度的独立预后指标。研究表明HER2表达的高低与乳腺癌的临床诊断、药物的疗效及预后判断关系密切。HER2是治疗乳腺癌及卵巢癌的明确靶点。分子靶向治疗在临床肿瘤治疗方面起重要的影响。赫赛汀(Herceptin)是人源化的HER2胞外段单克隆抗体,代表着治疗女性HER2阳性转移性乳腺癌的重大突破。临床病例单用赫赛汀或与紫杉醇联合用药取得良好治疗效果,并且成为治疗HER2阳性肿瘤的一线用药。赫赛汀在转移性肿瘤中的应用将HER2阳性的地位从不良预后的标志变成良好的治疗成果,并且正在进行的研究将为HER2阳性的转移性乳腺癌提供更多治疗的选择机会。抗体导向治疗可以利用抗体为载体将药物导向肿瘤病灶,提高药物疗效,降低药物的副作用。研究表明,单链抗体片段组织穿透能力强,较易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞。与完整抗体相比,单链抗体的免疫原性较弱,可降低人体抗鼠抗体反应。但是,另一方面,由于单链抗体片段缺乏Fc段,丧失完整抗体的效应功能,难以杀伤靶细胞。因此,研究小型抗体需要使用“弹头”分子,包括高效的药物、毒素、细胞因子等。高活性的“弹头”药物力达霉素(lidamycin,LDM,又称C1027),是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的由一株球孢链霉菌(Streptiomyces globisporus)产生的烯二炔类抗生素,是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。LDM的分子由两部分组成:一部分为烯二炔结构的发色团(AE),具有强烈的细胞毒作用,但不稳定;另一部分为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP),对发色团的稳定性起保护作用。二者可以拆分与重建,重建的力达霉素与天然状态力达霉素具有相同的活性。Smith在1985年最先将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示技术,从此,这一领域得到了发展。噬菌体技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术。噬菌体展示通过与特定的靶抗原结合,可以从大的单链抗体库中快速筛选出特异抗体。经过3轮或更多轮的筛选,与抗原有高度亲和力的单链抗体scFv可以被富集。针对数百种抗原的抗体已经从噬菌体展示文库中得到,包括细胞表面标志,肽类激素,其他人类蛋白及碳水化合物等。噬菌体展示技术的优点在于,一旦抗体库建立,就可以用来筛选针对靶抗原的抗体。一个抗体库可以被数千研究者用作无限抗原的克隆抗体的来源。并且筛选的过程非常迅速,可以在2~3周内完成。运用ELISA、Western-blot方法通过免疫检测鉴定筛选抗体的亲和力。通常,这个过程包括亚克隆与表达scFv片段得到大量抗体,是耗时与繁琐的。为了解决这个问题,最近研究者着重研究利用免疫检测和功能研究筛选噬菌体克隆。本研究利用将单链抗体连接在M13噬菌体衣壳蛋白PⅢ的N端构建噬菌体抗体库。本研究主要目的是利用噬菌体展示技术筛选HER2高亲和力的单链抗体,与力达霉素构建具有靶向杀伤HER2高表达肿瘤的强化融合蛋白,有助于乳腺癌、卵巢癌等HER2高表达肿瘤的导向治疗。一、抗HER2噬菌体抗体库构建与筛选本研究利用纯化的HER2胞外段蛋白免疫小鼠,从脾细胞提取mRNA,利用RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。利用重叠延伸反应(SOE-PCR)将VH、VL用连接肽(Gly4Ser)3进行连接,克隆至噬菌粒pCANTAB5E,转染E.coli TG1,得到噬菌体抗体库。以高表达HER2的人乳腺癌细胞SKBR3为抗原进行4轮筛选,得到库容为7.5×107的次级抗体库5F-10。从初级抗体库中随机挑取20个克隆进行菌体PCR,结果显示其中15个克隆有scFv片段插入,克隆效率为75%。BstNⅠ酶切随机克隆提取的质粒,酶切图谱显示多样性,表明抗体库具有多样性。用ELISA法鉴定各单克隆与HER2蛋白结合能力,获得与HER2高亲和力克隆scFv6,经序列分析,此基因全长732bp,编码243个氨基酸序列,通过Blast序列比对,此抗体为鼠源性,与以往报道的任何抗体序列都不相同。二、抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建、表达、纯化及强化融合蛋白活性分析利用基因重组技术将筛选出来的HER2高亲和力抗体scFv6片段克隆至含有力达霉素辅基蛋白基因的重组质粒pET-LDP,构建含有融合蛋白的质粒pET-Fv-LDP,转化到大肠杆菌BL21(DE3)starTM中,IPTG诱导表达带有组氨酸标签肽(His-tag)的融合蛋白HER2(Fv-LDP)。经SDS-PAGE分析,表达产物分子量40kD,主要以可溶形式表达在周质腔中,表达占全菌蛋白的7%,用Ni离子亲和柱进行纯化,1L菌液诱导后可产生约2mg可溶性融合蛋白。然后与力达霉素发色团AE重组,得到强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)。研究其免疫学活性及其对HER2高、低表达肿瘤细胞的细胞毒作用。Western-blot分析显示,融合蛋白与纯化的HER2蛋白胞外段有结合活性。细胞ELISA和免疫荧光结果表明,融合蛋白HER2(Fv-LDP)与SKBR3、SKOV3都有较高的亲和活性,略低于商品化HER2单抗L87,而与MCF7无结合力。0.01M,0.1M,1M的强化融合蛋白可降低SKBR3细胞HER2的mRNA与蛋白表达水平。流式细胞周期测定结果融合蛋白将SKBR3细胞周期阻滞于G1期,而强化融合蛋白将细胞周期阻滞于G2/M期。HE染色和Hoechest染色显示,强化融合蛋白可以诱导细胞凋亡。MTT结果显示,强化融合蛋白对HER2高、低表达的细胞都有强烈的杀伤活性,较好地保留了力达霉素的细胞毒作用。在裸鼠皮下移植人乳腺癌SKBR3肿瘤模型中检测强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)的体内抗肿瘤活性,接种肿瘤的第10天和17天分别尾静脉给药2次,观察肿瘤体积和裸鼠体重变化。实验结果表明0.2mg/kg,0.3mg/kg,0.4mg/kg三个剂量的强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)对人乳腺癌SKBR3裸鼠移植瘤生长都有抑制作用,抑瘤率分别为60%,70%,89.7%。强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)0.3mg/kg,0.4mg/kg的抑瘤率与LDM(0.05mg/kg)抑瘤率56.8%相比有显着差异(P<0.05)。体内实验结果说明,强化融合蛋白可以提高动物对力达霉素的耐受剂量,同时显着改善治疗效果,是具有很好前景的抗体靶向药物。

彭玲[9](2007)在《抗骨桥蛋白单链抗体可抑制乳腺癌转移和血管生成》文中认为骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)与肿瘤的生长和转移有密切的关系。为系统研究抗OPN抗体在抑制肿瘤转移过程中的作用,探讨OPN作为肿瘤转移治疗靶点的可能性,本实验在建立噬菌体抗体展示平台的基础上,筛选得到抗OPN单克隆单链抗体,构建并表达获得抗OPN单链抗体-Fc融合蛋白;研究抗OPN单链抗体-Fe融合蛋白在体内外对乳腺癌转移和血管生成的作用。结果表明抗OPN单链抗体-Fc融合蛋白1A12和2H8不但能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-435s在体外的粘附、侵袭、迁移和锚定非依赖生长,而且可以抑制OPN体内外的促血管生成作用;该血管生成抑制作用是通过抑制NF-κB介导的细胞生存调节通路,促进内皮细胞凋亡而实现的。在体内模型中,1A12和2H8能够抑制MDA-MB-435s在裸鼠体内的原发肿瘤生长和自发性肺转移,并能够降低肿瘤组织中微血管密度,增加肿瘤内皮细胞凋亡。本研究发现OPN是抑制肿瘤转移的有效治疗靶点,抗OPN单链抗体-Fc融合蛋白可以通过抑制肿瘤细胞的转移活性同时阻碍肿瘤血管生成,从而达到抑制肿瘤转移的目的。

刘斌[10](2007)在《成人急非淋M2型患者AML1/ETO mRNA表达与临床意义及其scFv单链抗体文库构建的初步研究》文中研究表明t(8;21)(q22;q22)染色体易位形成的AML1/ETO(AE)融合基因编码产物是一种多功能蛋白质,可通过影响细胞内许多信号传导系统和靶分子而参与细胞的分化与增值,细胞凋亡以及自我更新等过程。因此,AE融合蛋白被认为是引起t(8;21)(q22;q22)染色体易位阳性的成人急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)即急非淋,特别是ANLL-M2型患者发病的关键因素,也是靶向治疗该类患者一个潜在的靶分子,而高效、特异性靶向传递药物抑制或干扰AE的表达是靶向治疗AE融合基因表达阳性患者的关键。近期发现,单链抗体可变区片段(scFv)即单链抗体能够高效、特异性传递药物到达靶细胞。为此,本研究在分析了AE融合基因mRNA在ANLL-M2型患者中的表达及其临床意义的基础上进一步初步构建了AE融合基因表达阳性患者的scFv单链抗体文库。第一章ANLL-M2型患者AE基因mRNA表达及其临床意义目的:分析ANLL-M2型患者AE融合基因的表达,并探讨其与临床表现,疗效的关系以及在预后判断中的意义。方法:采用巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析ANLL-M2患者AE融合基因mRNA表达,根据AE融合基因表达结果将患者分成AE融合基因表达阳性组(A)和AE融合基因表达阴性组(B)。然后,对两组患者的临床症状,体征,白细胞计数及骨髓原始细胞数等进行比较分析,并比较其治疗缓解率。通过8个月随访,评价其在预后判断中的意义。结果:在23例ANLL-M2患者中,12例可检测到AE融合基因mRNA表达,占所检测患者的52.2%。其中,11例为M2a,1例为M2b。与AE融合基因mRNA表达阴性患者比较,AE融合基因mRNA表达阳性患者平均年龄较轻,外周血白细胞计数较低,临床上易出现发热,出血。经治疗后,AE融合基因mRNA表达阳性患者缓解率为75%,而AE融合基因mRNA表达阴性患者为36%。经8个月随访发现,1例AE融合基因mRNA表达阴性患者在缓解后第4个月复发并出现中枢神经系统白血病而死亡,另1例在缓解后第7个月复发,而AE融合基因mRNA阳性患者在8个月随访中无复发。结论:在ANLL-M2患者中50%左右表达AE融合基因mRNA,AE融合基因mRNA表达阳性患者更易出现发热,出血倾向,但是他们的治疗效果较好,预后良好。第二章AE基因表达阳性患者scFv单链抗体文库构建的初步研究目的:构建AE融合基因mRNA表达阳性患者scFv单链抗体文库。方法:通过RT-PCR分别扩增全套AE融合基因mRNA表达阳性患者重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,切胶回收目的片段,用连接肽(Linker)将VH、VL连接成VH-Linker和VL-Linker。结果:通过67种PCR扩增,从AE融合基因mRNA阳性M2型患者骨髓淋巴细胞中扩增出全套人抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因并得到6种VH家族基因,11种VL家族基因(5种Vκ和6种Vλ)。同时通过连Linker将VH、Vκ和Vλ拼接成6种VH-Linker、5种Vκ-Linker和6种Vλ-Linker。结论:通过大量的PCR扩增,成功地从AE融合基因mRNA表达阳性患者骨髓淋巴细胞中扩增出人全套重链(VH)和轻链(VL)可变区,并通过连接肽(Linker)拼接成VH-Linker和VL-Linker,为下一步构建scFv单链抗体库奠定了基础。

二、人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆(论文提纲范文)

(1)Trop2单克隆抗体的制备与鉴定(论文提纲范文)

摘要
Abstract
主要符号对照表
第1章 前言
    1.1 肿瘤靶向治疗
    1.2 肿瘤相关钙信号转导蛋白2
    1.3 靶向Trop2抗肿瘤研究现状
    1.4 本研究的目的与意义
第2章 材料与方法
    2.1 实验材料、试剂及仪器
        2.1.1 菌株、细胞系、抗体与实验动物
        2.1.2 主要实验试剂与耗材
        2.1.3 实验仪器和设备
        2.1.4 溶液配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 Trop2 胞外段(Trop2 ECD)表达载体构建及鉴定
        2.2.2 Trop2胞外段蛋白表达、纯化及鉴定
        2.2.3 流式细胞术筛选细胞表面Trop2高表达肿瘤细胞系
        2.2.4 抗Trop2杂交瘤细胞制备
        2.2.5 抗Trop2阳性杂交瘤母克隆筛选
        2.2.6 亚克隆制备及筛选
        2.2.7 杂交瘤候选抗体轻重链可变区基因克隆和测序
        2.2.8 杂交瘤抗体序列的人源化
        2.2.9 Trop2蛋白的生物信息学分析
第3章 结果与分析
    3.1 Trop2在多种肿瘤中的表达谱分析
        3.1.1 Trop2 在肿瘤中m RNA水平和蛋白水平表达
        3.1.2 Trop2 m RNA表达与病人生存期关系
        3.1.3 Trop2在不同乳腺癌亚型中的表达及预后分析
    3.2 Trop2胞外段蛋白表达载体的构建
    3.3 Trop2胞外段蛋白的表达、纯化和鉴定
    3.4 Trop2在肿瘤细胞系的表达
    3.5 抗Trop2杂交瘤的制备
    3.6 母克隆的筛选
    3.7 杂交瘤亚克隆和筛选
        3.7.1 杂交瘤亚克隆
        3.7.2 杂交瘤亚克隆筛选
    3.8 候选克隆抗体轻链和重链可变区扩增鉴定、测序及分析
    3.9 抗体人源化
        3.9.1 抗体可变区同源建模
        3.9.2 经典残基预测,人源抗体模板搜索及轻重抗体人源化分析
        3.9.3 人源化抗体构建及成药性预测
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
致谢
在学期间的科研情况

(2)人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选(论文提纲范文)

目录
摘要
Abstract
引言
材料与方法
    1. 主要试剂和材料
    2. 仪器
    3. 组织来源
    4. 随菌粒及菌株
实验方法
    1. 总RNA的提取
    2. 构建可变区基因T载体库
    3. pCANTAB-Linker载体的改造
    4. 噬菌体抗体库的构建
    5. 噬菌体scFv抗体的富集、筛选
    6. 筛选后scFv基因的初步鉴定
实验结果
    1. 确定RNA质量
    2. 轻重链基因片段的扩增
    3. 可变区基因连接T载体,插入率验证
    4. Linker模板合成及PCANTAB-Linker构建鉴定
    5. scFv构建及重组率测定
    6. 抗体库库容估算
    7. SKBR3细胞对单链抗体的富集
    8. ELISA验证单链抗体与HER-2抗原结合活性
    9. scFv抗体的免疫组化验证
    10. 筛选后序列分析
讨论
结论
参考文献
致谢
附录A 主要英文缩略词简表
附录B 个人简介
附录C 已发表论文
附录D 综述
    参考文献

(3)全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建(论文提纲范文)

1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 乳腺癌患者血样
        1.1.2 噬菌粒、菌株及试剂
        1.1.3 PCR引物
    1.2 方法
        1.2.1 外周血淋巴细胞的分离及RNA的提取
        1.2.2 cDNA第一链的合成及全套VH和VL基因片段的扩增
        1.2.3 重叠PCR法随机拼接VH和VL并扩增scFv片段
        1.2.4 scFv片段与载体的连接与纯化
        1.2.5 初级噬菌体抗体库的构建
        1.2.6 初级抗体库重组率的检测及多样性的鉴定
2 结果
    2.1 VL和VH基因的扩增
    2.2 scFv基因的拼接
    2.3 噬菌体抗体库的构建及检验
    2.4 库容量测定及核酸序列分析
3 讨论

(4)1、全基因组筛选和鉴定ARPC1B基因在胰腺癌转移中的作用和机理 2、抗Aβ42鼠源单抗的人源化改造(论文提纲范文)

目录
第一部分:全基因组筛选控制胰腺癌转移的关键基因
    缩略语表
    中文摘要
    英文摘要
    前言
    实验材料
    实验方法
    实验结果
    讨论
    小结
    参考文献
第二部分:抗Aβ_(42)鼠源单抗的人源化改造
    缩略语表
    中文摘要
    英文摘要
    前言
    实验材料
    实验方法
    实验结果
    讨论
    小结
    参考文献
文献综述
    参考文献
致谢
博士期间发表论文、摘要和专利

(5)Her2全人源抗体的制备及生物学功能研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
详细摘要
英文摘要
缩略词表
前言
第一部分 全人源大容量噬菌体抗体库的构建
    一、材料与方法
    二、实验结果
    三、讨论
    四、小结
第二部分 噬菌体抗体库的筛选和鉴定
    一、材料与方法
    二、实验结果
    三、讨论
    四、小结
第三部分 噬菌体单克隆抗体的构建表达和鉴定
    一、材料与方法
    二、实验结果
    三、讨论
    四、小结
第四部分 抗HER2抗体的体外功能学实验
    一、材料与方法
    二、实验结果
    三、讨论
    四、小结
全文小结
参考文献
综述一 以HER2为靶点的肿瘤靶向治疗研究进展
    参考文献
综述二 噬菌体抗体库的构建和应用前景
    参考文献
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
    一、在读期间发表论文
    二、参加科研工作情况
致谢

(6)人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选,表达及鉴定(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第一章 前言
技术路线
第二章 材料与方法
第三章 噬菌体抗体库的筛选
第四章 人源性抗FGF-2抗体的原核表达
第五章 人源性抗FGF-2抗体的真核表达
第六章 抗体生物学活性的鉴定
第七章 抗体亲和力成熟
全文总结
参考文献
文献综述
英文缩略词表
博士期间发表论文情况
致谢
研究生毕业论文统计学审稿证明

(7)人源性抗乳腺癌Her-2/neu噬菌体单链抗体库构建(论文提纲范文)

1 材料与方法
    1.1 实验材料
        1.1.1 质粒与菌株
        1.1.2 试剂
    1.2 实验方法
        1.2.1 总RNA的提取
        1.2.2 cDNA的合成
        1.2.3 抗体可变区的扩增及克隆T载体
        1.2.3. 1 抗体可变区基因的引物设计[4]
        1.2.3. 2 VH、Vκ、Vλ基因的PCR扩增及克隆T载体
        1.2.4 p CANTAB-Linker载体改造
        1.2.5 ScFv基因文库的构建
        1.2.6 ScFv噬菌体抗体库的构建
        1.2.7 ScFv抗体库的初级筛选
2 结果
    2.1 总RNA提取
    2.2 抗体可变区基因的扩增
    2.3 pVH-T、pVκ-T、pVλ-T文库构建
    2.4 pCANTAB-Linker的构建
    2.5 ScFv的构建
    2.6 单链噬菌体库滴度测定
    2.7 抗Her-2/neu单链抗体筛选
3 讨论

(8)抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一部分 抗HER2噬菌体单链抗体库的构建与筛选
    前言
    技术路线
        1.实验材料
        2.实验方法
        3.实验结果
        4.讨论
    参考文献
第二部分 抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白HER2(FV-LDM)构建及活性分析
    前言
    技术路线
        1.实验材料
        2.实验方法
        3.实验结果
        4.讨论
    参考文献
论文结论
文献综述 噬菌体抗体库技术及应用
致谢
附录
    附表1 VH-BLAST Blast结果
    附表2.VL-Blast结果
    附表3.scFv-Blast结果
    附表4.测序结果

(9)抗骨桥蛋白单链抗体可抑制乳腺癌转移和血管生成(论文提纲范文)

缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 噬菌体抗体展示平台的建立
    一、材料与方法
    二、结果
    三、讨论
    四、小结
第二部分 抗OPN单链抗体的筛选和鉴定
    一、材料与方法
    二、结果
    三、讨论
    四、小结
第三部分 抗OPN单链抗体-Fc融合蛋白对血管生成的抑制
    一、材料与方法
    二、结果
    三、讨论
    四、小结
第四部分 抗OPN单链抗体-Fc融合蛋白抑制血管生成的机理
    一、材料与方法
    二、结果
    三、讨论
    四、小结
第五部分 抗OPN单链抗体-Fc融合蛋白对乳腺癌转移和血管生成的抑制
    一、材料与方法
    二、结果
    三、讨论
    四、小结
全文小结
参考文献
综述一 骨桥蛋白与肿瘤研究进展
综述二 噬菌体抗体库的构建和应用前景
致谢

(10)成人急非淋M2型患者AML1/ETO mRNA表达与临床意义及其scFv单链抗体文库构建的初步研究(论文提纲范文)

一、中文摘要
二、英文摘要
三、缩略词简表
四、论文正文
    前言
    第一章 ANLL-M_2型患者AE基因mRNA表达及其临床意义
        1.1 材料和方法
        1.2 结果
        1.3 讨论
        1.4 结论
    第二章 AE基因表达阳性患者scFv单链抗体文库构建的初步研究
        2.1 材料与方法
        2.2 结果
        2.3 讨论
        2.4 结论
五、参考文献
六、综述
七、致谢

四、人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆(论文参考文献)

  • [1]Trop2单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 蒋小华. 西华师范大学, 2020(12)
  • [2]人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选[D]. 王志文. 蚌埠医学院, 2013(10)
  • [3]全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建[J]. 王净,王慧,袁媛,李青. 现代肿瘤医学, 2011(11)
  • [4]1、全基因组筛选和鉴定ARPC1B基因在胰腺癌转移中的作用和机理 2、抗Aβ42鼠源单抗的人源化改造[D]. 常德. 北京协和医学院, 2011(12)
  • [5]Her2全人源抗体的制备及生物学功能研究[D]. 方晨. 第二军医大学, 2011(09)
  • [6]人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选,表达及鉴定[D]. 陶俊. 南方医科大学, 2010(12)
  • [7]人源性抗乳腺癌Her-2/neu噬菌体单链抗体库构建[J]. 李晓莉,姚慧,周登远,焦振山. 生物医学工程与临床, 2010(02)
  • [8]抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究[D]. 崔向丽. 中国协和医科大学, 2007(09)
  • [9]抗骨桥蛋白单链抗体可抑制乳腺癌转移和血管生成[D]. 彭玲. 第二军医大学, 2007(04)
  • [10]成人急非淋M2型患者AML1/ETO mRNA表达与临床意义及其scFv单链抗体文库构建的初步研究[D]. 刘斌. 中南大学, 2007(06)

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人乳腺癌完全抗体可变区基因的扩增与克隆
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