干细胞在细胞移植治疗心肌损伤中的应用

一、干细胞在细胞移植法治疗心肌损伤中的应用（论文文献综述）

赵旭,毛鑫,李春天,王峰^[1]（2022）在《间充质干细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的作用》文中指出背景:间充质干细胞在缺血性心脏疾病中具有抑制炎症及细胞凋亡、促进组织修复及血管再生、免疫调节等作用。目的:综述间充质干细胞应用于心肌缺血再灌注损伤的最新研究进展,为其深入研究及临床领域应用提供思路及依据。方法:检索PubMed数据库、万方数据库、CNKI中国期刊全文数据库收录的相关文献。英文检索词为"mesenchymal stem cell,MSCs,myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI,exosomes,inflammation,tissue repair,vascular regeneration",中文检索词为"间充质干细胞,心肌缺血再灌注损伤,炎症,外泌体,组织修复,血管再生",最终纳入48篇文献进行归纳总结。结果与结论:心肌缺血再灌注损伤是临床心脏疾病中常见的病理生理过程,常见于缺血性心肌病、体外循环及心脏移植等,其机制包括自由基损伤、钙离子超载、能量代谢障碍以及炎症反应等。近年来间充质干细胞移植治疗引人注目,其外泌体作用、心肌组织修复、减少心肌细胞凋亡及抑制炎症反应等方面的治疗能力,为其治疗心肌缺血再灌注损伤提供了一种全新的思路。成体间充质干细胞是当前治疗心肌缺血再灌注损伤的首选细胞,因此,更好地了解间充质干细胞在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制及最新的研究进展,对其今后深入研究及临床应用极为重要。

颉丽英^[2]（2021）在《人脐带间充质干细胞通过调节巨噬细胞极化参与小鼠心肌肥厚的修复过程》文中指出研究背景:高血压（hypertension）是以体循环动脉血压持续升高（≥140/90 mm Hg）为主要表现的一类临床综合征。高血压所并发的左心室肥厚是最为常见的高血压靶器官损害之一。高血压诱发的左心室肥厚可使心血管疾病的发病及死亡风险升高2倍以上,其已成为临床预测心血管疾病总死亡率的强预测因子。因此,逆转高血压所导致的左心室肥厚是降低临床心血管事件发生风险,并提高患者生存率的最有效途径。压力负荷型心肌肥厚是长期血压增高导致的慢性病理损伤。目前,临床上主要通过药物治疗将患者血压控制在正常范围,以此来延缓心肌肥厚乃至心力衰竭的发生;然而,左心室肥厚并不会因为血压水平的降低而发生完全逆转,在血压达标的患者中仍有高达20%的人存在左心室肥厚,提示:压力负荷型心肌肥厚可能存在未知的发病机制。因此,寻找针对左心室肥厚的更加有效的治疗措施就势在必行。间充质干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的多能干细胞。研究发现,间充质干细胞可以在心脏受损后,定向归巢到损伤部位,并在这些部位存活、增殖、分泌细胞因子,发挥调节炎症反应的作用。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs）是一种来源广泛,免疫原性低,无伦理问题限制的干细胞类型;其在体外培养时,可稳定生长、细胞均一性较好,同时对多种损伤,如:神经损伤、心肌缺血、骨质疏松及自身免疫性疾病等均有良好的修复作用,作为一种新型种子细胞,其具有更广阔的应用前景。那么,h UC-MSCs对心肌肥厚是否有良好的缓解能力,同时,经腹腔和静脉进行干细胞移植的疗效有无差别;如果h UC-MSCs对压力负荷型心肌肥厚有效的话,其可能的调节机制是什么?尚缺乏有效的实验证据。综上所述,本项目以脐带间充质干细胞为切入点,通过腹腔及尾静脉注射两种方式进行干细胞移植治疗小鼠心肌肥厚。观察h UC-MSCs是否对心肌肥厚小鼠的心功能、心肌肥厚程度、局部炎症反应、微血管再生以及心室重构进程等有影响;然后进一步在细胞水平探讨h UC-MSCs是否可以直接抑制药物诱导的心肌肥大;并通过h UC-MSCs与RAW264.7巨噬细胞共培养,探讨h UC-MSCs抑制心肌肥厚的可能机制。通过以上的研究,旨在为后期h UC-MSCs应用于临床心肌肥厚病人的治疗,提供可行的移植方式及理论和实验依据。目的:本研究以人脐带间充质干细胞为切入点,通过不同移植途径,观察h UC-MSCs移植治疗小鼠心肌肥厚的疗效,并对h UC-MSCs抑制心肌肥厚的可能机制进行了探索。方法:（1）采用主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）构建C57BL/6J小鼠心肌肥厚模型,通过测量左室质量/体重、心重/肺重,评价模型是否建立成功。（2）模型建立成功后,h UC-MSCs通过尾静脉（TAC+MSCs-iv）以及腹腔（TAC+MSCs-ip）注射移植入小鼠体内连续治疗4周,对照组给予等量PBS（TAC+PBS）,观察h UC-MSCs对各组小鼠生存率,心功能（超声心动图）,心肌肥厚指标（心重/体重比、心重/肺重比、心重/胫骨长比、左室质量/体重比、心肌组织ANP、BNP和β-MHC蛋白含量）,心电轴偏移（心电图）,心肌细胞横截面积大小（HE染色）,心肌胶原容积分数（Masson三色染色）,微血管再生情况（CD31免疫组化染色）,炎症细胞浸润情况（CD45免疫组化染色）以及巨噬细胞分布（CD68免疫组化染色）的影响。（3）在离体实验中,首先对复苏后的人脐带间充质干细胞相关表面抗原的表达（流式细胞术）及h UC-MSCs分化成骨（茜素红染色）、成脂（油红O染色）能力进行鉴定。然后通过异丙肾上腺素（isopropyl adrenaline,ISO）诱导H9c2细胞肥大,并将h UC-MSCs与肥大的H9c2细胞共培养于Transwell TM小室中,观察共培养48h后,h UC-MSCs对H9c2细胞面积（F-actin染色）、H9c2细胞内ANP、BNP和β-MHC m RNA表达量（q RT-PCR）的影响。（4）使用IFN-γ+LPS诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,IL-4诱导RAW264.7巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。使用Transwell TM小室完成h UC-MSCs与诱导极化后的RAW264.7细胞共培养,观察h UC-MSCs对RAW264.7细胞极化分型（M1型巨噬细胞鉴定:CD68+CD86免疫荧光染色,M2型巨噬细胞鉴定:CD68+CD206免疫荧光染色）以及分泌炎症因子TNF-α、IL-10（ELISA）的影响。结果:（1）TAC术后第4周,与假手术组（左室质量/体重:3.06±0.21;心重/肺重:0.78±0.01）相比,模型组左室质量/体重（5.58±0.47）、心重/肺重（1.00±0.04）均明显增加（P<0.01）,提示小鼠心肌肥厚模型成功建立。术后11周时,TAC+MSCs-ip组生存率（83.33%）与同期TAC+PBS组（70.59%）相比呈上升趋势,但无显着差异（P>0.05）,TAC+MSCs-iv组生存率（70.59%）与同期TAC+PBS组相比无明显差异。超声心动图结果证实:术后第10周,与同期TAC+PBS组相比（LVEF:28.92±0.64%;LVFS:14.85±0.22%）,TAC+MSCs-ip组LVEF（45.59±1.43%）、LVFS（23.19±0.86%）及TAC+MSCs-iv组LVEF（45.23±1.18%）、LVFS（21.91±1.47%）均明显升高（P<0.05）;与同期TAC+PBS组（7.28±0.04 mm）相比,TAC+MSCs-ip组LVID,d（5.87±0.11 mm）及TAC+MSCs-iv组LVID,d（6.66±0.02 mm）均明显降低（P<0.05）。（2）将心重/体重比（HW/BW）、心重/肺重比（HW/LW）、心重/胫骨长比（HW/TL）、左室质量/体重比（LVM/BW）作为衡量心肌肥厚程度的指标,结果显示:TAC术后第10周,TAC+MSCs-ip组小鼠HW/BW（8.69±0.87）、HW/LW（0.83±0.07）、HW/TL（11.11±0.67）、LVM/BW（3.57±0.14）均明显低于同期TAC+PBS组（HW/BW:10.00±0.19;HW/LW:1.18±0.04;HW/TL:14.92±0.80;LVM/BW:5.56±1.86,P<0.05）;TAC+MSCs-iv组小鼠HW/LW（0.93±0.04）、LVM/BW（3.90±0.44）亦明显低于同期TAC+PBS组（P<0.05）。（3）心电图结果发现:术后第11周,TAC+MSCs-ip组（-37.76±4.66°）及TAC+MSCs-iv组（-55.68±1.76°）小鼠的心电轴左偏较TAC+PBS组（-89.11±0.32°）均明显减轻（P<0.05）。（4）术后第10周,HE染色结果显示:TAC+MSCs-ip及TAC+MSCs-iv组小鼠出现心肌细胞肥大、间质增加、纤维断裂等情况均明显弱于同期TAC+PBS组（P<0.05）;Massson染色结果显示:TAC+MSCs-ip及TAC+MSCs-iv组小鼠心肌纤维化面积分别为17.06±0.65μm2、18.64±0.76μm2,均小于PBS组（24.51±0.59μm2,P<0.01）;免疫组化染色结果显示:与TAC+PBS组（1.00±0.57个/10×视野）相比,TAC+MSCs-ip（5±0.57个/10×视野）及TAC+MSCs-iv（2.33±0.33个/10×视野）组小鼠心肌均出现明显的的毛细血管增生（P<0.05）;同时,小鼠心肌组织中CD45阳性细胞占比、巨噬细胞的数量在TAC+MSCs-ip组（23.48±0.44%,10.40±0.46%）及TAC+MSCs-iv组（26.28±0.57%,13.44±0.56%）明显低于同期TAC+PBS组（28.73±0.83%,19.47±0.60%,P<0.05）;Western blot结果显示:从第9周开始,与同期TAC+PBS组（ANP:2.50±0.06;BNP:2.99±0.07;β-MHC:1.46±0.03）比较,在TAC+MSCs-ip组（1.36±0.03,1.56±0.12,0.79±0.03）和TAC+MSCs-iv组（1.81±0.10,1.88±0.06,1.11±0.03）小鼠心肌组织中ANP、BNP及β-MHC蛋白含量均显着下降（P<0.01）。（5）流式细胞术结果提示:复苏后的人脐带间充质干细胞高表达MSCs相关的标记（CD90、CD73、CD105的标记表达均为阳性）,而CD45、CDl9、CD31、CD34和CD11b、HLA-DR等内皮细胞特异性抗原及移植排斥相关的细胞表面标记表达则为阴性。茜素红、油红O染色结果证实:复苏后的人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,可以成功分化为骨和脂肪组织。F-actin染色结果显示:与对照组（7151.10±33.53μm2）相比,与h UC-MSCs共培养48h后的H9c2细胞面积明显减小（4915.93±75.18μm2,P<0.01）;同时,q RT-PCR结果显示:H9c2细胞中ANP（1.07±0.02）、BNP（1.52±0.13）和β-MHC（1.31±0.06）m RNA水平明显少于对照组（ANP:1.26±0.05,BNP:1.66±0.04,β-MHC:1.44±0.03,P<0.05）。（6）CD68+CD86免疫荧光染色鉴定M1型巨噬细胞及CD68+CD206免疫荧光染色鉴定M2型巨噬细胞,免疫荧光染色结果显示:与未共培养的对照组（M1型:46.79±1.39%,M2型:51.16±1.43%）相比,与h UC-MSCs共培养48h后,诱导极化的RAW264.7巨噬细胞向M1型（CD68、CD86阳性）极化比例（37.18±0.85%）明显减少,而向M2型（CD68、CD206阳性）极化比例（66.15±1.15%）明显增多（P<0.05）。ELISA结果显示:相较于对照组上清液中炎性因子的含量（TNF-α:83.24±0.87 pg/m L;IL-10:51.63±0.64 pg/m L）,与h UC-MSCs共培养48小时之后,诱导极化的RAW264.7细胞上清液中M1型巨噬细胞相关因子TNF-α含量明显降低（71.43±0.70 pg/m L,P<0.05）,与M2型巨噬细胞相关的因子IL-10的含量明显增加（65.07±0.94 pg/m L,P<0.05）。结论:经腹腔和尾静脉移植人脐带间充质干细胞治疗小鼠心肌肥厚,可显着缓解压力负荷型心肌肥厚的发生,改善小鼠心功能,其机制可能与减少心肌细胞肥大相关基因表达、促进细胞因子分泌、微血管生成以及巨噬细胞向M2型分化增多有关。

王擎擎^[3]（2021）在《活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究》文中进行了进一步梳理背景:当代以干细胞技术为核心的再生医学的迅速发展,为心肌梗死的治疗带来新的希望,其中干细胞移植治疗心梗,有望修复坏死的心肌组织,改善受损的心功能,但是梗死区缺血、缺氧局部微环境使MSCs移植后存活率降低,极大地限制了 MSCs用于治疗MI的疗效。中药促进MSCs移植后存活的研究目前也显示出了很好的疗效,可以调控MSCs的归巢、定植,提高MSCs移植后存活率。导师姚魁武教授基于中医胸痹心痛“阳微阴弦”的基本病机,常用活血温通法治疗冠心病,临床疗效显着,并根据多年临床经验拟定了具有活血温通效果的经验方—活血温通方。我们前期研究也发现活血温通方可以显着改善心肌缺血模型组大鼠心功能,明显缩小心肌梗死面积,而且能够降低炎症反应、抑制心肌细胞凋亡、减少胶原纤维面积以及促进血管新生,同时发现活血温通方减轻心肌缺血损伤可能与Sirt1信号通路激活有关。而活血温通方联合MSCs移植治疗心梗,还没有相关的报道。目的:1.总结导师姚魁武教授活血温通法治疗冠心病阳虚证的用药规律、治疗思路,并进行系统的经验总结。2探索活血温通方对BMSCs移植治疗心梗疗效的影响以及可能的作用机制。方法:1.收集2016年1月—2020年12月就诊于中国中医科学院广安门医院姚魁武主任医师门诊,应用中药汤剂治疗且符合纳排标准的全部初诊原始病案。通过“中医传承计算平台（V3.0）”软件系统进行数据分析,根据分析得到到药物频次、常用药物组合、潜在处方等,分析探讨姚魁武教授活血温通法治疗冠心病的用药规律、诊疗思路,并做系统总结。2.提取大鼠BMSCs,培养至第三代时,用流氏细胞仪进行细胞鉴定。用活细胞染色剂CM-Dil进行荧光标记,以检测移植后细胞的存活情况。3.通过结扎左冠状动脉前降支制备心机梗死模型。SD大鼠随机分为5组：假手术组（Sham组）：冠状动脉只穿线不结扎，术后灌胃纯水，持续28天；心梗组（MI组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的PBS。术后灌胃纯水,持续28天;BMSCs移植组（BMSCs组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的MSCs单细胞悬液（细胞浓度3x106个/100μL）。术后灌胃纯水,连续28天;活血温通方组（HXWTF组）:造模方法同心梗组。术后灌胃活血温通方,连续28天;活血温通方+BMSCs移植组（BMSCs+HXWTF组）:造模方法同BMSCs移植组。术后灌胃活血温通方,连续28天。4.超声心动图检测大鼠心功能、TTC染色用于观察心肌梗死面积大小、HE染色观察心梗大鼠心肌组织形态的改变、荧光显微镜观察BMSCs移植后的存活情况。5.用WST-1法测定大鼠血清SOD活力和TBA法测定大鼠血清MDA水平,以评价各组氧化损伤程度;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中炎性因子TNF-a、IL-6、IL-10与生长因子VEGF、bFGF水平,评价炎症反应程度;天狼猩红染色检测各组大鼠心肌纤维化程度;免疫组织化学染色检测梗死边缘区α-SMA和CD31的表达情况,以评价血管新生情况;Western blotting检测心肌组织Sirt1、NF-κB、FoxO1和p53的蛋白的表达水平。结果:1.从用药频次分析,196张处方中,共137味中药,用药频次≥20的中药有39味,用药频次≥50的有22味,用药频次≥50按频次由高到低依次为丹参（193）,桂枝（164）,砂仁（123）,川芎（117）,瓜蒌（109）,白芍（105）,炙甘草（95）,鸡血藤（93）,茯苓（88）,柴胡（87）,炒枳壳（80）,当归（78）,干姜（77）,炒白术（76）,杜仲（64）,党参（61）,麦冬（59）,肉苁蓉（58）,炒酸枣仁（56）,薤白（54）,葛根（54）,五味子（50）。2.196张处方中的137味中药按功效共分为16类,根据药物功效使用频次由高到低排列前10位的依次为补虚类（769）,活血化瘀类（436）,温里类（339）,清热类（210）,化湿类（198）,解表类（184）,理气类（177）,化痰类（155）,利水渗湿类（119）,安神类（114）。3.从药物组合频次分析,药物组合频次≥90的由高到低依次是丹参-桂枝（162）,丹参-砂仁（123）,丹参-川芎（115）,丹参-瓜蒌（108）,丹参-白芍（104）,丹参-桂枝-砂仁（99）;桂枝-砂仁（99）。基于关联规则深入分析用药组合,导师活血温通法治疗冠心病常用的2味药的组合是丹参-瓜蒌,丹参-砂仁,丹参-桂枝,丹参-鸡血藤等;3味药的组合是丹参-砂仁-瓜蒌,丹参-桂枝-瓜蒌,丹参-桂枝-鸡血藤等。从用药关联规则网络拓扑图可以看出,关联性比较大的药物组合是丹参、桂枝、鸡血藤、瓜蒌、川芎、砂仁。4.基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心组合。3种药物聚类核心组合为丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,鸡血藤;丹参,桂枝,川芎,白芍,砂仁;丹参,桂枝,川芎,砂仁,茯苓。4种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,鸡血藤;丹参,桂枝,麦冬,炙甘草,川芎,生地黄;丹参,桂枝,砂仁,鸡血藤,川芎,降香;丹参,桂枝,砂仁,干姜,茯苓,瓜蒌。5种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,鸡血藤,瓜蒌,川芎,党参;桂枝,丹参,麦冬,川芎,炙甘草,炒白术;丹参,桂枝,干姜,砂仁,茯苓,黄连;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,白芍;丹参,砂仁,桂枝,川芎,鸡血藤,降香。5.基于方剂频数分析,可以得出196例病案中共涉及方剂54个,方剂频数为2以上的药物有32个,方剂频数为5以上的方剂有24个,方剂频数为10以上的方剂有13个,方剂频数为20以上的药物有6个。可以看出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂有丹参饮（118）,四逆散（73）,桂枝甘草龙骨牡蛎汤（25）苓桂术甘汤（23）、瓜蒌薤白白酒汤（21）等。6.根据方剂配伍的使用频次,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散（47）,丹参饮-黄芪赤风汤（11）,丹参饮-交泰丸（11）,丹参饮-瓜蒌薤白白酒汤（11）,丹参饮-半夏泻心汤（11）,丹参饮-瓜蒌薤白半夏汤（11）等。基于关联规则深入分析用方组合,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散-瓜蒌薤白半夏汤,丹参饮-四逆散-黄芪赤风汤,丹参饮-四逆散-桂枝甘草龙骨牡蛎汤等。根据方剂组合规律关联规则网络拓扑图可以看出关联比较大的方剂是丹参饮、四逆散、生脉散、桂枝甘草龙骨牡蛎汤、瓜蒌薤白半夏汤、瓜蒌薤白白酒汤、交泰丸等。基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心方剂组合是生脉散,丹参饮,枳实薤白桂枝汤,补中益气汤,四君子汤;丹参饮,交泰丸,半夏泻心汤,苓桂术甘汤,越鞠丸;丹参饮,四逆散,黄芪赤风汤,瓜蒌薤白半夏汤,桂枝甘草龙骨牡蛎汤。7.BMSCs的鉴定:用流氏细胞仪检测第3代BMSCs表面标记物CD44、CD90、CD45的表达情况,结果显示CD44表达率为99.2%,CD90表达率为97.4%,CD45的表达率为6.7%。8.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心功能的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组EF均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合 BMSCs 移植组 EF比BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组FS均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合BMSCs移植组FS 比 BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,***P<0.001）。9.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌梗死面积的影响:假手术组无梗死,完整心脏表面和心脏切片均呈现红色,无苍白色区域。心梗组完整心脏表面和心脏切片苍白色区域均最大,故心梗面积最大,且心梗处明显凹陷,心梗处心肌明显变薄。BMSCs移植组和活血温通方组较心梗组,完整心脏表面和心脏切片的苍白色区域均明显减少,说明BMSCs移植和活血温通方药物干预均能减少心梗面积。活血温通方联合BMSCs移植组心脏苍白色区域最小,心梗处轻微凹陷,说明活血温通方能提高BMSCs移植改善心梗大鼠心肌梗死面积的疗效。10.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌组织形态的影响:HE染色显示与假手术组相比,其余各组梗死区均有不同程度的炎性细胞浸润。心梗组细胞排列紊乱,细胞间隙增大,炎性细胞浸润最严重。BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组这些病变均有明显改善,炎性细胞浸润有不同程度的降低。与BMSCs移植组、活血温通方组相比较,活血温通方联合BMSCs移植组细胞排列更有序,炎性细胞浸润更少。11.活血温通方对BMSCs移植四周后存活的影响:在全景数字扫描显微镜下观察,可以看到活血温通方联合BMSCs移植组红色荧光分布更广。红色荧光与蓝色荧光重叠的数量明显更多。12.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清SOD、MDA的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（***P<0.001,**P<0.01）;与心梗组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组MDA水平均有显着降低（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs 移植组 MDA 均有显着降低（***P<0.001,**P<0.01）。13.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌细胞凋亡的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平均有显着降低（***P<0.001,***P<0.001）。14.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10的影响:与假手术组相比,MI组TNF-α、IL-6和IL-10水平水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合 BMSCs 移植组 TNF-α 显着降低（**P<0.01,**P<0.01,***P<0.001）,IL-6 显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）,IL-10 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组TNF-α显着降低（**P<0.01,**P<0.01）,IL-6显着降低（***P<0.001,**P<0.01）,IL-10显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。15.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌纤维化的影响:与假手术组相比,MI组心肌纤维化明显（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（*P<0.05,**P<0.01）。16.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠梗死边缘区α-SMA、CD31表达的影响:与假手术组相比,MI组α-SMA、CD31的表达明显增多（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs 移植组 α-SMA、CD31 的表达均显着增多（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组 α-SMA、CD31 的表达显着增多（**P<0.01,*P<0.05;*P<0.05,***P<0.001）。17.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清生长因子VEGF、bFGF的影响:与假手术组相比,MI组VEGF、bFGF水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。18.活血温通方联合BMSCs移植对心肌组织SIRT1、NF-kB、FoxO1和p53蛋白表达的影响:与假手术组相比,MI组Sirt1的表达明显降低（***P<0.001）,NF-kB、Foxo1、p53 的表达明显升高（**P<0.01,**P<0.01,**P<0.01）。与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,NF-κB的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）,FoxO1 的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05,*P<0.05）,p53 的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达均显着升高（**P<0.01,*P<0.05）,NF-kB的表达显着降低（**P<0.01,*P<0.05）,FoxO1的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）,p53的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）。结论:1.导师活血温通法治疗冠心病常活血药与温阳药并重,且用药平和,配伍主次分明,以经方为主。在活血温通法治疗冠心病的组方用药中常含有活血温通方,治疗效果短期的显着,可能是因为改善了心肌缺血缺氧微环境,也初步说明了活血温通方的临床疗效比较显着。2.活血温通方可能是通过改善心梗后缺血缺氧微环境而提高了 BMSCs移植后的存活率,而进一步提高BMSCs移植治疗心梗在抗细胞氧化损伤、抗细胞凋亡、降低炎症反应、抗心肌纤维化和促进血管新生方面的疗效,以及促进移植后的BMSCs的旁分泌功能而进一步修复受损的心肌,缩小心肌梗死面积,改善心功能。3.活血温通方能促进BMSCs移植后Sirt1信号通路的激活,以协同恢复心功能。

官格^[4]（2021）在《负载hiPSC-CM和hiPSC-EC的三维纳米纤维SpGel对心梗的治疗》文中进行了进一步梳理背景:心血管疾病（CVD）仍然是世界范围内死亡和疾病负担的主要致病因素。心肌梗死后功能性心肌组织的大量死亡,以及心肌组织自身有限的再生能力,导致了心脏损伤的不可逆性。由于心梗后,心肌组织很难再生,临床上心梗（MI）的治疗仍然面临巨大的挑战。近年来,心梗后的细胞治疗已经成为一种具有临床应用前景的治疗方法,通过将人源性诱导多能干细胞（hi PSC）定向诱导成心肌细胞（CMs）或内皮细胞（ECs）可获得大量的移植细胞。由于细胞移植后的低细胞滞留率,以及心肌梗死后恶劣的微环境,导致细胞移植物递送效率低下,成为细胞治疗面临的重大挑战。有研究表明,可注射的水凝胶可作为有效的载体,通过微创的方式递送治疗细胞和生物分子,促进组织再生。不同组织的细胞外基质水凝胶在组织再生和修复中具有组织特异性。脾脏在心肌梗死后,可以分泌心肌保护因子,且在胚胎期,脾脏具有造血干细胞巢的功能。目前尚不清楚脾脏细胞外基质是否可用于人体多能干细胞（hi PSCs）的培养,并为细胞移植提供适宜的生存环境以对抗心梗组织缺血微环境。目的:验证脾脏细胞外基质水凝胶是否可能提供诱导多能干细胞（hi PSCs）培养和分化的平台,以获得诱导成熟的内皮细胞（i ECs）和心肌细胞（i CMs）。以及探究脾脏细胞外基质水凝胶是否能作为心肌递送的有效载体,负载hi PSCs来源的心血管细胞。方法:1.脾脏脱细胞基质水凝胶的制备与表征取猪的脾脏组织进行脱细胞、冻干、酶消化处理后,制备可注射的Sp Gel。通过H&E、Masson’s染色和样本内残留DNA浓度测定证明脾脏组织成功脱细胞。通过Picrosirius Red,Verhoeff’s和Alcian Blue染色验证Sp Gel内蛋白成分。通过蛋白质组学分析鉴定Sp Gel中组织特异性蛋白成分。扫描电镜分析凝胶的微观结构。用流变仪测试Sp Gel的粘弹性。通过CCK-8细胞毒性实验和皮下移植实验检测凝胶的细胞相容性和生物降解性。2.脾脏脱细胞基质水凝胶对hi PSCs体外培养和向内皮细胞、心肌细胞的分化影响通过流式细胞术、免疫荧光染色和q PCR分析,证明hi PSCs在脾脱细胞基质水凝胶上向i ECs诱导分化。通过扫描电镜（SEM）分析了纳米纤维凝胶表面的i ECs形貌。通过成管实验验证Sp Gel上诱导分化的i ECs是否具有内皮细胞功能。3.脾脏脱细胞基质水凝胶对hi PSC向心肌细胞分化的影响通过免疫荧光染色和q PCR分析,证明hi PSCs在脾脏脱细胞基质水凝胶上定向诱导分化为i CMs。通过扫描电镜（SEM）观察凝胶上i CMs的形貌。检测Sp Gel水凝胶上诱导的i CMs的收缩频率和电生理特性。通过透射电镜对分别在Sp Gel水凝胶上、Matrigel胶上诱导分化的i CMs的超微结构进行表征。4.脾脏脱细胞基质水凝胶包埋对H2O2的细胞保护作用将在脾脏脱细胞基质水凝胶上诱导成熟的i ECs和i CMs消化下来,包裹在纳米纤维状的Sp Gel中进行3D培养。加入200μM H2O2至培养体系,体外诱导细胞氧化应激损伤,双氧水处理2 h后,活/死细胞染色观察Sp Gel对i ECs/i CMs抗氧化应激的保护作用。Sp Gel包裹和无Sp Gel包裹的细胞经H2O2处理后,用透射电镜观察细胞的超微结构。5.脾脏脱细胞基质水凝胶联合hi PSCs来源的心肌细胞、内皮细胞治疗小鼠心梗建立小鼠急性心肌梗死模型,探究Sp Gel联合i ECs/i CMs注射后,心梗区的细胞滞留率,以及Sp Gel-i ECs/i CMs联合治疗对于心功能的修复作用。通过小动物活动成像检测移植细胞的滞留率。H&E染色和免疫荧光染色比较PKH26标记的i ECs/i CMs在Sp Gel-i ECs/i CMs组和PBS-i ECs/i CMs组中的心梗区滞留率。4周后对小鼠行心脏超声检测,评估各治疗组对心功能修复的影响。通过Masson染色法比较不同组的心肌纤维化程度。通过免疫荧光染色,比较不同治疗组梗死区域的血管新生情况。6.基因修饰的过表达CCL22的hi PSCs募集Treg细胞通过构建过表达CCL22的慢病毒载体,在体外转染hi PSCs。通过q PCR分析和细胞免疫荧光染色鉴定CCL22在m RNA水平的表达。ELISA验证hi PSC-CCL22细胞培养上清中CCL22的分泌。Transwell趋化实验检测hi PSC-CCL22细胞培养上清对Treg的趋化作用。为了验证hi PSC-CCL22细胞的多向分化能力,我们诱导hi PSC-CCL22细胞向心肌细胞和内皮细胞分化。结果1.我们成功研发了一种脾脏脱细胞基质来源的,温敏性的纳米纤维水凝胶（Sp Gel）,可在37°C孵育下成胶。H&E染色、Masson染色和样本内残留的DNA浓度测定均证明无细胞残留。Picrosirius Red染色,Verhoeff’s染色和Alcian Blue染色分别证明Sp Gel保留了胶原蛋白,弹性蛋白和糖胺聚糖（GAGs）等成分。Sp Gel蛋白组学分析鉴定出1481种蛋白。GO富集分析表明,Sp Gel高表达与细胞外结构组织、小分子代谢过程、细胞外结构组织、细胞底物粘附、细胞连接组织、细胞迁移等生物学过程相关的蛋白。KEGG富集分析表明,细胞凋亡、缝隙连接、紧密连接、粘附连接、局灶性粘连、心肌收缩、CMs中肾上腺素能信号通路和Wnt信号通路相关蛋白在Sp Gel中高表达。在扫描电镜下观察,Sp Gel具有多孔的纳米纤维结构,平均纤维直径为66.67±10.60 nm。水凝胶流变学实验中,通过快速升高温度（从4℃到37℃）,实现了Sp Gel快速凝胶化的过程。CCK-8细胞相容性试验证实了Sp Gel具有良好的生物相容性,皮下移植实验表明Sp Gel是可降解材料。2.免疫荧光染色证实了hi PSCs（OCT4+）在Sp Gel包被培养皿上培养,可维持其细胞多能性。Sp Gel上的hi PSCs可以有效分化为i ECs（CD31+,v WF+）。流式细胞仪分析显示,通过定向诱导内皮分化,CD31+/CD144+双阳性的内皮细胞,比例由诱导分化前的0.05%增加到分化后的94.6%。q PCR表明i ECs低表达干细胞多能性标志物OCT4,高表达内皮细胞特异性标志物CD31、CD144、v WF和CDH5。扫描电镜观察到诱导的内皮细胞粘附在凝胶上,与细胞基质相互作用。Sp Gel上诱导的i ECs成管能力和HUVECs无明显差异。3.免疫荧光染色显示i CMs高表达心肌细胞标记蛋白,如α-actinin、c Tn T和MLC2V。q RT-PCR同样证实了i CMs高表达心肌细胞标志物MYL3、SLC8A1和TNNT2。电镜下观察i CMs,心肌纤维束排列紧密、整齐。相对于传统的Matrigel包被的诱导方法,Sp Gel上诱导的i CMs收缩幅度更大,搏动频率更高（约60次/分钟）,传统诱导方法心肌搏动频率约10次/分钟。透射电镜下观察,Sp Gel上诱导的i CMs可见明显的肌节、z线结构和缝隙连接,而传统的Matrigel诱导的i CM肌节紊乱,未见z线结构。4.伪彩处理的扫描电镜图像和H&E染色可见Sp Gel中i ECs/i CMs的形态和分布。共聚焦显微镜采集图片发现共培养体系中,i ECs（红色,hu CD31）和i CMs（绿色,α-actin）之间的细胞连接和相互作用。活/死细胞染色结果表明,H2O2处理2 h后,i ECs/i CMs在Sp Gel内的存活率显着提高（p<0.0001）。透射电镜下观察Sp Gel H2O2处理过的细胞,无Sp Gel组细胞结构破坏、空泡化和坏死。而Sp Gel组的细胞未出现严重的结构畸形,胞浆中可见自噬空泡。5.小动物荧光活体成像结果显示,Sp Gel负载i ECs/i CMs移植后第7天,Sp Gel联合注射组细胞滞留率显着提高（p=0.0014）。H&E染色和免疫荧光染色表明,移植后的第1天,Sp Gel-i ECs/i CMs的细胞滞留率大约是PBS-i EC/i CM组的3倍。移植后的第7天,Sp Gel-i ECs/i CMs的细胞滞留率大约是PBS-i EC/i CM组的7倍,表明Sp Gel可有效提高心梗区移植细胞的滞留率。4周后,对各组小鼠行超声心功能检测。Sp Gel-i ECs/i CMs治疗组的左心射血分数恢复最好,约54.53±2.09%,PBS-i EC/i CM组为46.88±1.73%。单独Sp Gel注射组为39.91±1.34%比PBS注射组（31.68±2.17%）稍高。免疫荧光染色表明Sp Gel-i ECs/i CMs治疗组动脉（α-SMA+）和毛细血管（CD31+）密度明显高于PBS组,证明Sp Gel联合i ECs/i CMs治疗可促进梗死区新生血管形成。6.成功构建了过表达CCL22的慢病毒载体,在体外转染hi PSCs实现CCL22基因过表达。q PCR分析证明CCL22在m RNA水平高表达。细胞免疫荧光染色证明CCL22在细胞水平的表达。ELISA验证CCL22可以以外分泌蛋白形式进行表达。Transwell趋化实验验证hi PSC-CCL22细胞培养上清对Treg的趋化作用。免疫荧光染色分别验证了hi PSC-CCL22向心肌细胞和内皮细胞高效分化。结论:我们制备了一种温敏性、纳米纤维状脾脏脱细胞基质水凝胶（Sp Gel）,可维持hi PSCs的培养并促进其分化。体内移植实验表明,Sp Gel负载i ECs/i CMs治疗可有效提高移植细胞的滞留率,促进心功能修复,抑制心肌纤维化,促进缺血区血管新生。此外,Sp Gel还可以作为3D打印类器官的生物相容性生物墨水。本研究表明Sp Gel可作为hi PSCs培养和分化的新平台,并为再生医学研究和临床应用提供一种可注射的细胞移植的载体。

邢胜^[5]（2021）在《由SETD4调控的静息c-Kit+细胞在激活后对心脏微血管生成作用的研究》文中研究指明血管在成年哺乳动物心脏中以高度成型和组织化的血管网的形态存在,生血管的过程往往只在血管组织缺氧等生理因素刺激的条件下才会发生。在缺血性损伤的心脏中,由于心肌层中血管网有限的增殖能力无法满足心肌细胞对氧气的需求,最终导致心肌组织经历不可逆转的损伤。近些年的研究表明,心脏内源性cKit阳性细胞已被证实能够产生大量心脏内皮细胞但极少向心肌细胞方向分化,而内皮细胞的产生对生血管过程至关重要,因此,c-Kit阳性细胞在心脏缺血性损伤治疗方面的潜力备受关注。成体心脏中,部分c-Kit阳性细胞以静息状态存在,而细胞静息作为体内一种保守机制也存在于一些其他组织的干细胞中,在应对组织损伤和维持稳态过程中发挥重要的作用。然而,心脏内调控c-Kit阳性细胞静息的关键因子以及静息的c-Kit阳性细胞的功能仍然还不清楚。本研究通过分析细胞增殖指标Ki67和H3p S10,以及利用Ed U掺入实验和Brd U滞留实验成功确认了心脏内一部分c-Kit阳性细胞处于长期静息状态。本课题组的前期研究发现了一个由SETD4蛋白表观遗传调控的细胞静息的进化保守机制。通过对静息的c-Kit阳性细胞的分子特征分析,明确了该类群静息的细胞是通过SETD4蛋白催化形成H4K20me3促进异染色质的形成,从而调控细胞静息的分子机制,并通过腺病毒过表达SETD4的体外实验进一步印证了其对c-Kit阳性细胞的静息调控机制。在此基础上,为了研究SETD4调控的静息的c-Kit细胞在小鼠心脏中的功能,我们构建了SETD4条件性敲除小鼠,并实现了在成年及新生小鼠心脏内c-Kit细胞中SETD4基因的条件性敲除。研究结果表明成年及新生小鼠中敲除SETD4基因均会导致心脏内皮细胞的大量产生并促进微血管的生成。而大口径的冠状血管中的内皮细胞则极少来源于c-Kit阳性细胞。同时,我们发现敲除SETD4基因从而激活静息的c-Kit阳性细胞是通过激活PI3K-Akt-m TOR信号通路实现的。此外,我们在心肌梗死模型小鼠上进行了SETD4基因的条件性的敲除,结果表明敲除了SETD4基因的c-Kit阳性细胞能够在心肌梗死的受损心脏中产生更多的微血管细胞,进而供给额外的氧气减缓心肌细胞的凋亡,改善由缺血性损伤引发的心功能受损。为了研究SETD4阳性细胞在心脏发育过程中的细胞生物学功能,我们构建了基于SETD4驱动的Cre组成型表达的SETD4谱系示踪小鼠。研究发现SETD4细胞在心脏发育的胚胎早期（E6.5）就已出现,并且在胚胎发育阶段能够产生包括c-Kit细胞在内的多种类型的细胞后代,其中一部分c-Kit细胞可能仍保留着SETD4蛋白到成年阶段保持长期静息的状态。综上所述,我们的研究发现了由SETD4调控的一类静息的c-Kit阳性细胞类群,揭示了SETD4蛋白在调控c-Kit阳性细胞静息以及静息激活后促进微血管的产生,缓解心肌梗死造成的损伤方面起着重要的作用。

石顺^[6]（2020）在《糖聚肽仿生生物材料的合成制备与性能研究》文中研究指明组织损伤或终末器官衰竭通常难以自愈,严重影响人们的生活质量甚至危及生命。现有疗法包括器官移植、手术治疗、人工假体和机械装置等,针对较大缺损难以取得令人满意的治疗效果。组织工程作为现有疗法的补充和替代,是结合生物材料、细胞和信号因子构建工程化组织以修复、替换或提升损伤组织与器官的潜在治疗方案。然而,缺乏适宜化学、物理和生物学性质的生物材料限制了组织工程在临床应用上的成功。在组织形成或修复过程中,生物材料不仅需要提供力学支撑,还需要引导细胞的行为。具体来说,生物材料需要具有适宜的生物相容性,生物降解性,力学性质,营养物、气体小分子和蛋白等传输的微环境,生物活性和形状结构。糖聚肽可模拟天然糖蛋白或糖胺聚糖结构与功能的特性,使以其为构建组分的生物材料十分有希望满足上述性能要求。本论文为了以糖聚肽为构建组分设计出临床可用的生物材料,从结构-性能关系出发,研究了化学结构与二级结构、降解、力学性质和生物相容性等的关系。具体研究内容和结论如下。（1）制备了侧链半乳糖、葡萄糖或甘露糖修饰的苯酚功能化糖聚肽,接着用辣根过氧化氢酶催化反应原位制备了水凝胶,并研究了其成胶时间、力学性能、体内降解行为和生物相容性,用以评估其作为生物材料的前景。实验结果显示,成胶时间可通过调整辣根过氧化氢酶浓度介于11～380秒。力学性质对糖聚肽侧基单糖具有依赖性。水凝胶体内可在21天左右完全降解,具有良好的生物相容性。体内免疫反应随糖聚肽侧基单糖不同而略有不同。上述结果显示,糖聚肽构建生物材料极具前景。（2）制备了一系列长度不同,主链为聚谷氨酸残基,侧链为半乳糖残基的糖聚肽,进一步研究了其二级结构、体外酶降解行为、生物活性和生物相容性。糖聚肽二级结构均主要为α-螺旋构象,螺旋含量先随主链聚合度增加而增加（24-44）,之后随主链聚合度增加略微降低（44-68）。糖聚肽外侧刚性糖环不利于降解酶直接与聚氨基酸主链接触,可降低酶降解速率。糖聚肽可保留侧链糖基生物活性,并具有良好的生物相容性。（3）制备了一系列主链由L和/或D型谷氨酸残基组成,侧链为半乳糖修饰的糖聚肽,并研究了其二级结构、体外降解和生物相容性。仅含L型谷氨酸残基和仅含D型谷氨酸残基的糖聚肽主要采取α-螺旋构象,但二者螺旋方向相反。同时含有L型谷氨酸残基和D型谷氨酸残基的糖聚肽无规卷曲含量明显增加,L型谷氨酸残基和D型谷氨酸残基比例越接近,无规卷曲含量越高,但仍含有部分α-螺旋构象。D型谷氨酸残基的引入可显着延长酶降解所需时间,且糖聚肽仍具有良好的生物相容性。本论文以糖聚肽作为生物材料构建组分,对糖聚肽组织工程相关性能的研究为生物材料的设计提供了新的思路,为糖聚肽仿生生物材料的性能调控提供了有价值的原始参考。

李记泉^[7]（2020）在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中研究说明目的:本文以急性心肌缺血（Acute Myocardial Ischemia,AMI）大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只（SPF级,4周龄,体重150-160g）,采用7%水合氯醛（5 m L/kg）腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD44、CD45）,并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛（5 m L/kg）麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs（2×106个/ml）,同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。（1）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。（2）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异（P>0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高（P<0.01）,缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组（P<0.01）。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低（P<0.01）;针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组（P<0.01）。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。

倪达^[8]（2020）在《外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究》文中认为背景:近年来,外泌体在心肌保护的研究中逐渐受到越来越多的关注。心血管系统是外泌体进行细胞间信号传递的重要场所之一,外泌体介导的心肌细胞间信号传递广泛涉及心血管系统疾病的生理及病理过程。在心肌缺血后,不同细胞来源的外泌体介导的信号传递和组织修复可能发挥着重要作用,其含有的大量与其结构和功能密切相关的物质可通过自分泌或旁分泌的方式作用于自身或远隔的靶细胞,修复受损心肌,对心肌梗死以及心肌缺血再灌注损伤引发的心肌细胞凋亡具有一定保护作用,可能减少梗死面积、增加新生血管数量,从而改善心脏功能。但外泌体如何发挥心肌保护作用的具体机制仍有待进一步研究。本课题研究拟从两部分内容进行阐述:首先从探讨多种来源外泌体在体外循环围手术期的水平变化的角度阐述外泌体与心肌保护之间的关联与作用,然后选取来源广泛且具有多向分化功能的骨髓间充质干细胞来源外泌体,拟从细胞和整体动物两个层面,通过一系列实验,深入研究外泌体介导心肌损伤保护作用的具体机制。第一部分研究多种来源外泌体在体外循环围手术期的表达变化情况目的:探究外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板等多种来源的外泌体在体外循环围手术期的变化情况。方法:选择2017年1月-2017年12月行体外循环下先天性心脏畸形矫治术患儿60例,于体外循环前、再灌注1h、6h、12h、24h、48h、72h分别采集桡动脉血,采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测患儿血浆中c Tn T的浓度水平,并提取桡动脉血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板,分别采用超速离心法分离内皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞来源的外泌体,采用离心法分离血小板来源的外泌体。结果:体外循环再灌注1h、6h、12h、24h、48h c Tn T浓度[（1.352±0.233、1.653±0.231、1.263±0.224、0.623±0.145、0.231±0.025）μg/l]均明显高于体外循环前[（0.013±0.001）μg/l]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h内皮细胞来源外泌体含量[（167.55±26.67、210.57±31.12、189.56±26.32、142.28±4.27、91.02±3.16）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（76.78±13.14）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h树突状细胞来源外泌体含量[（87.51±6.28、92.12±5.37、83.14±4.29、68.37±3.28、50.49±3.94）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（34.27±4.52）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h巨噬细胞来源外泌体含量[（92.16±2.73、101.26±3.47、88.19±3.20、65.45±2.76、43.28±1.97）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（28.78±2.64）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h血小板来源外泌体含量[（134.27±4.28、141.28±3.06、135.84±3.29、105.61±2.58、65.24±3.10）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（41.51±2.02）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注72h各指标和体外循环前比较无统计学意义（P>0.05）。结论:外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、血小板来源的外泌体浓度水平在体外循环围手术期明显增高,且与代表心肌损伤的c Tn T浓度变化一致,证明外泌体具有心肌保护作用。第二部分研究骨髓间充质干细胞来源外泌体调控自噬发挥心肌保护作用机制目的:探讨骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死的影响是否与自噬有关,以及外泌体在其中发挥的作用。方法:1.建立小鼠心肌梗死模型,将骨髓间充质干细胞注入梗死周围心肌（4处20μl,共2×105个细胞）,分别于术后1、3、7、14、28天检测心功能的变化;术后28天取心脏标本,经Masson染色后,比较梗死面积的差异;TUNNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况。2.在心肌梗死后1天采集心肌细胞,比较各组心肌组织自噬水平的变化。3.将骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养,在缺氧培养箱中模拟心肌梗死情况,检测心肌细胞自噬水平,并观察使用自噬抑制剂3-MA后的变化情况。4.提取骨髓间充质干细胞来源的外泌体,在缺氧条件下与心肌细胞共培养,检测心肌细胞自噬水平。结果:1.骨髓间充质干细胞移植组术后28天时心功能较心肌梗死组明显改善;骨髓间充质干细胞移植组小鼠心肌梗死面积较心肌梗死组明显减少;骨髓间充质干细胞移植组心肌细胞凋亡率低于心肌梗死组。2.骨髓间充质干细胞移植组LC3-I、LC3-II、p53和BNIP3的表达明显降低。3.缺氧组p53和BNIP3水平升高,骨髓间充质干细胞共培养组p53和BNIP水平降低,使用自噬抑制剂后,心肌细胞死亡率下降。4.骨髓间充质干细胞来源外泌体共培养组LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p53和BNIP3在蛋白和m RNA水平上均明显低于缺氧组。结论:骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可通过P53/BNIP3信号通路下调心肌细胞自噬水平,减少心肌细胞自噬死亡,从而改善心功能,减少心肌重塑,发挥心肌保护作用。

刘卒^[9]（2020）在《诱导多能干细胞来源的外泌体在体外心肌细胞损伤中的作用及miRNA组学分析》文中指出[目的]急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是由于急性持续性冠状动脉缺血缺氧引起的心肌坏死,最终导致心肌重构及难以逆转的心功能下降。目前,对于心肌梗死的治疗方法主要包括药物、溶栓治疗、介入及手术治疗等,但这些措施不能从根本上解决心肌修复的问题,因此再生和修复疗法对于心肌梗死起着至关重要的作用。而目前,干细胞疗法被认为是治疗心肌梗死具有前景的方法,同时,基于干细胞的旁分泌功能,目前干细胞来源的外泌体在急性心肌损伤中的修复作用成为了研究的热点。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）是利用重编程技术将重编程因子转入成体细胞得到的具有与胚胎干细胞相似的全能性的一类干细胞,基于其来源广泛,同时可以排除免疫排斥及伦理等问题,其在修复损伤组织和器官的治疗中具有广泛的应用前景,但基于其细胞治疗中仍然面临着致瘤性的影响。在外泌体的研究中,基于诱导多能干细胞与胚胎干细胞的相似性,目前有研究已经发现诱导多能干细胞来源的外泌体（induced pluripotent stem cells derived exosome,iPSC-Exo）也可通过抗细胞凋亡、促进细胞存活、促新生血管形成和减少心肌纤维化等来发挥心肌保护作用,而且其分泌的外泌体表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。同时,发现其治疗效果主要是通过旁分泌因子（如:miRNA等）介导。但目前对于iPSC-Exo研究仍处于起步阶段,其发挥作用的具体机制尚未明确。因此为进一步研究iPSC-Exo在心肌损伤修复中的功能,本课题通过提取iPSC-Exo及同一株人包皮成纤维细胞来源的外泌体（human foreskin fibroblast derived from exosome,HFF-Exo）,首先探索两组外泌体在心肌损伤修复中的功能差异;然后,通过miRNA组学及生物信息学分析,探索两组间显着差异表达的miRNA,为阐明iPSC-Exo在心肌梗死的治疗中的作用机制提供理论依据。[方法]第一部分:使用蔗糖密度梯度离心法从iPSC及HFF无血清的培养基上清液中提取外泌体;然后,通过透射电镜观察、纳米颗粒追踪技术及Western Blot对提取的外泌体进行鉴定;再通过CCK8、细胞划痕、Transwell、Western Blot及TUNEL凋亡染色来比较两组外泌体对心肌细胞H9C2的增殖、迁移及凋亡能力的影响,以及Matrigel基质胶成管样结构形成实验对内皮细胞HUVEC血管生成的影响;最后进行外泌体摄取实验证实外泌体能被靶细胞所吞噬从而发挥作用。第二部分:随机抽取经鉴定过的iPSC-Exo和HFF-Exo各3组,提取各组外泌体总RNA并进行质检,使用高通量测序技术对样本miRNA组进行测序,对测序后的数据进行分析,寻找iPSC-Exo组和HFF-Exo对照组间的显着差异表达miRNA及其主要调控通路,通过生物信息学分析探索关键的差异miRNA,最后使用miRNA组学再测序验证对关键的差异miRNA进行验证分析。[结果]第一部分:通过蔗糖密度梯度离心法我们成功分离得到iPSC-Exo及HFF-Exo,并通过透射电镜观察、纳米颗粒追踪技术及Western Blot鉴定后均符合外泌体的特性,可用于后续实验;通过CCK8检测显示iPSC-Exo 比 HFF-Exo干预更能够促进H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤模型的存活,但两者对正常H9C2细胞增殖效果不明显;通过Western Blot检测Cleaved caspase-3的表达,结果显示iPSC-Exo 比 HFF-Exo干预更能够减少H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡,TUNEL凋亡染色检测结果也显示跟该结果一致;通过细胞划痕及Transwell实验显示iPSC-Exo比HFF-Exo干预更能促进H9C2细胞迁移能力;通过Matrigel基质胶成管样结构形成实验显示iPSC-Exo 比 HFF-Exo干预更能促进HUVEC血管生成能力;将PKH67荧光标记的iPSC-Exo及HFF-Exo加入到H9C2细胞孵育后显示iPSC-Exo及HFF-Exo均可以被H9C2细胞摄取到细胞内。第二部分:在iPSC-Exo组与HFF-Exo对照组间通过miRNA高通量测序筛选差异miRNA,以P<0.05,Fold Change>1为显着性差异,筛选出70个显着差异的miRNA,iPSC-Exo组与HFF-Exo组相比其中10个miRNA表达上调,60个表达下调;在筛选的70个显着差异的miRNA中,发现了 8个基因簇,包含19个显着差异的miRNA,其中1个基因簇上调、7个基因簇下调;通过对miRNA基因簇所调控的靶基因进行GO分析、pathway分析发现主要参与着细胞存活、细胞凋亡、细胞迁移、血管生成以及肿瘤的发生等过程。进一步对显着差异miRNA进行通路分析,发现它们调控4个参与心肌损伤修复最有可能相关的通路,它们分别为PI3K/Akt信号通路、NF-κB信号通路、AMPK信号通路和JAK/STAT信号通路;最后我们重点挑选调控信号通路中靶基因数最多及结合在心肌损伤修复中可能发挥抗凋亡、促细胞存活、血管生成等作用的miRNA:其中有上调的 miR-92a-3p、miR-103a-3p、miR-106a-5p,下调的 miR-27b-3p、miR-199a-5p、miR-143-3p、miR-221-3p,对其进行 miRNA 表达量验证分析,结果也显示上述miRNA的表达与上述测序的结果一致,因此我们推测iPSC-Exo携带的这些miRNA可能参与着心肌损伤修复过程。[结论]1.iPSC-Exo相比于HFF-Exo在促心肌细胞存活能力、抗心肌细胞凋亡能力、促心肌细胞迁移能力以及促内皮细胞血管生成能力更为显着。2.通过高通量测序,iPSC-Exo与HFF-Exo对照组的miRNA表达谱有明显差异,共筛选出70个显着差异的miRNA,其中10个miRNA表达上调,60个表达下调,这些差异miRNA可能通过调控靶基因参与的PI3K/Akt、NF-κB、AMPK和JAK/STAT四个信号通路参与心肌损伤修复。3.miR-92a-3p、miR-103a-3p、miR-106a-5p、miR-27b-3p、miR-199a-5p、miR-143-3p、miR-221-3p可能与iPSC-Exo发挥心肌损伤修复作用有关。

邓俊豪,李苗,张里程,唐佩福^[10]（2020）在《三维悬滴法培养间充质干细胞在组织损伤修复中的应用及优势》文中研究表明背景:近年来,间充质干细胞因其易于分离培养、具备高度自我增殖和多向分化潜能以及强大的免疫调控作用等优点,被广泛用于各种组织的损伤修复。传统的二维培养常常导致细胞的多能性及分泌能力受损。三维成球培养的间充质干细胞,不仅能很好继承间充质干细胞本身的优点,还能通过增强的旁分泌能力和增殖分化能力,扩大其在多种组织损伤中的修复作用。目的:从三维间充质干细胞的基本特征、修复机制、培养方法以及对于各类疾病损伤修复的组织工程应用等多个方面进行综述,阐述其未来应用的可能性,为将来三维间充质干细胞的临床应用提供理论支持。方法:计算机检索近10年收录于PubMed数据库、中国期刊全文数据库（CNKI）以及万方数据库中的相关文章,检索关键词为"间充质干细胞、三维培养、悬滴法培养、损伤修复""mesenchymalstemcells、three-dimension culture、hanging-drop、tissue repair",文献类型不限,纳入51篇文献进行综述分析。结果与结论:多项研究表明,三维间充质干细胞确实在多个方面如增殖分化、旁分泌及免疫调控作用等要远强于二维间充质干细胞,从而更好地修复组织损伤。随着干细胞移植治疗的广泛开展和三维成球培养体系的深入研究,三维间充质干细胞用于多种组织损伤的修复具备巨大潜力。

二、干细胞在细胞移植法治疗心肌损伤中的应用（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、干细胞在细胞移植法治疗心肌损伤中的应用（论文提纲范文）

（1）间充质干细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的作用（论文提纲范文）

（2）人脐带间充质干细胞通过调节巨噬细胞极化参与小鼠心肌肥厚的修复过程（论文提纲范文）

（3）活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究（论文提纲范文）

（4）负载hiPSC-CM和hiPSC-EC的三维纳米纤维SpGel对心梗的治疗（论文提纲范文）

（5）由SETD4调控的静息c-Kit+细胞在激活后对心脏微血管生成作用的研究（论文提纲范文）

（6）糖聚肽仿生生物材料的合成制备与性能研究（论文提纲范文）

（7）针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究（论文提纲范文）

（8）外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究（论文提纲范文）

（9）诱导多能干细胞来源的外泌体在体外心肌细胞损伤中的作用及miRNA组学分析（论文提纲范文）

（10）三维悬滴法培养间充质干细胞在组织损伤修复中的应用及优势（论文提纲范文）

四、干细胞在细胞移植法治疗心肌损伤中的应用（论文参考文献）

• [1]间充质干细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的作用[J]. 赵旭,毛鑫,李春天,王峰. 中国组织工程研究, 2022(01)
• [2]人脐带间充质干细胞通过调节巨噬细胞极化参与小鼠心肌肥厚的修复过程[D]. 颉丽英. 山西医科大学, 2021(01)
• [3]活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究[D]. 王擎擎. 中国中医科学院, 2021(02)
• [4]负载hiPSC-CM和hiPSC-EC的三维纳米纤维SpGel对心梗的治疗[D]. 官格. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
• [5]由SETD4调控的静息c-Kit+细胞在激活后对心脏微血管生成作用的研究[D]. 邢胜. 浙江大学, 2021(01)
• [6]糖聚肽仿生生物材料的合成制备与性能研究[D]. 石顺. 中国科学技术大学, 2020(01)
• [7]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
• [8]外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究[D]. 倪达. 苏州大学, 2020(06)
• [9]诱导多能干细胞来源的外泌体在体外心肌细胞损伤中的作用及miRNA组学分析[D]. 刘卒. 昆明医科大学, 2020(02)
• [10]三维悬滴法培养间充质干细胞在组织损伤修复中的应用及优势[J]. 邓俊豪,李苗,张里程,唐佩福. 中国组织工程研究, 2020(07)

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