一、内皮细胞生长因子与血管生成（论文文献综述）
吴姝涵,祝旭龙,白璐,张菲菲,蔺光帅,李江,杜嘉,李建辉[1]（2022）在《水凝胶组织工程脂肪的血管化策略》文中研究表明背景:当前,从种子细胞、支架材料及细胞外微环境三方面着手构建工程化脂肪组织,是软组织缺损修复及重建最具发展潜力的方向之一,但由于缺乏有效的血管生成及血液供应,移植物再吸收一直是脂肪组织工程广泛应用的主要限制。目的:对基于水凝胶支架的组织工程脂肪如何建立血管网络、有效达到血管化的相关研究予以综述。方法:利用计算机检索CNKI中国知网、万方医学网、PubMed数据库2010年1月至2020年6月发表的相关文章,检索词为"组织工程,脂肪组织,血管化,水凝胶,脂肪干细胞,Adipose-derived stem cell,tissue engineering,adipose tissue,hydrogel,vascularization"。总结相关文章,最终共纳入88篇文献进行结果分析。结果与结论:利用水凝胶材料构建的组织工程化脂肪,其血管化策略主要有以下4种:使用组织工程室模型;将脂肪干细胞与血管内皮细胞共培养;水凝胶支架材料负载细胞因子促进新生血管形成;应用具有血管生成特性的水凝胶材料。因此,应用水凝胶材料建立高度仿生化的脂肪组织单元,结合有效的血管化技术手段,将进一步提高软组织的修复重建效果。
吴迪[2]（2021）在《人羊膜来源上皮细胞调节主动脉内皮细胞血管生成及其分子机制的探究》文中研究指明目的:动脉粥样硬化如今已成为危害人类健康的重要疾病,血管内皮受损是其始动因素。血管内皮细胞是是一层有活性的细胞,其完整性及生理特性对人体至关重要。除了动脉粥样硬化过程,血管内皮细胞还参与血管生成、血管收缩与舒张、凝血功能、炎症反应调控、内分泌功能、物质交换等重要的生理和病理过程。血管生成（Angiogenesis）指从毛细血管后微静脉出芽形成新的毛细血管网络,过程极其复杂,其中血管内皮细胞的激活、增殖、迁移、重建形成新的血管和血管网是非常重要的环节,是促进血管生成因子和抑制血管生成因子相互协调作用的结果。正常情况下二者处于平衡状态,一旦平衡打破就会激活血管系统,使血管生成过度或抑制,导致病理性事件。干细胞在血管生成方面的作用一直是研究热点,但是作用机制始终未能完全明确,特别是干细胞通过旁分泌功能对靶细胞的调控作用备受关注。人羊膜来源上皮细胞是干细胞的一种,能够旁分泌大量的生长因子及趋化因子等生物活性因子,旁分泌是其对靶细胞功能进行调控的重要方式之一。本研究的目的是:（1）建立人羊膜来源上皮细胞（hAECs）的体外分离、培养方法,并对其进行表型鉴定和纯度分析。（2）检测人羊膜上皮细胞条件培养液（hAEC-CdM）中的细胞因子,并对其相关信号通路进行富集分析。（3）观察不同浓度的人羊膜上皮细胞条件培养液对体外培养的人主动脉内皮细胞（hAoECs）增殖、迁移及血管生成作用的影响。（4）探究人羊膜上皮细胞条件培养液调节人主动脉内皮细胞相关生理作用的分子机制。研究方法:（1）采用胰蛋白酶消化法分离、体外培养人羊膜上皮细胞,应用免疫荧光染色分析其表型特征。（2）将收集的hAEC-CdM进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测,并对结果进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。（3）实验分组情况:我们设计用ECM培养hAoECs为对照组,标记为Control组;在ECM中加入0.5倍、1倍及2倍浓度的hAEC-CdM设为3个实验组,标记为0.5×CdM组、1×CdM组、2×CdM组,分别用四种培养液培养hAoECs,然后进行相关实验验证hAoECs功能的变化。抑制剂干预实验分组:ECM组（Control）、1×CdM组、抑制剂组（SB431542或K02288）、CdM+抑制剂组。（4）经hAEC-CdM处理24小时、48小时及72小时后,通过CCK-8实验观察不同浓度hAEC-CdM对hAoECs增殖能力的影响。（5）经hAEC-CdM处理12小时及24小时后,通过细胞划痕实验评估不同浓度hAEC-CdM对hAoECs迁移能力的影响。（6）基质胶血管生成实验验证不同浓度hAEC-CdM对hAoECs管腔形成能力的影响。（7）Western Blot检测不同浓度hAEC-CdM对hAoECs TGF-β通路活化的影响。结果:（1）消化下来的人羊膜上皮细胞贴壁后呈多角形,长满后呈现上皮细胞特有的铺路石样,可在体外大量扩增。上皮细胞传至第2代用于细胞鉴定及实验。免疫荧光结果显示:上皮细胞高表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物Vimentin,纯度在90%以上。（2）本次质谱分析鉴定蛋白273种,参与信号通路88种。GO富集分析结果显示:人羊膜上皮细胞条件培养液主要调节靶细胞的代谢过程、内吞作用和磷酸化进程;KEGG信号通路分析结果显示:羊膜上皮细胞条件培养液主要影响靶细胞的PI3K-Akt通路、mTOR通路和TGF-β通路。（3）CCK-8实验结果:在24小时节点,不同浓度实验组的hAoECs增殖能力与对照组相比均无显着差别（p>0.05）;在48小时节点,0.5×CdM组的hAoECs增殖能力与对照组相比无明显差别（p>0.05）,1×CdM组和2×CdM组的hAoECs增殖能力均明显高于对照组（p<0.05）;在72小时节点,不同浓度实验组hAoECs增殖能力均明显高于对照组（p<0.05）。根据以上结果可知:hAEC-CdM促进hAoECs增殖,随着hAEC-CdM浓度增加,其对hAoECs增殖的促进作用增强。（4）划痕实验结果:在12小时节点,0.5×CdM组细胞迁移能力与对照组无显着差别（p>0.05）,1×CdM组和2×CdM组细胞迁移能力显着高于对照组（p<0.05）;在24小时节点,不同浓度实验组细胞迁移能力均明显高于对照组（p<0.05）。根据以上结果可知:hAEC-CdM促进hAoECs迁移,随着hAEC-CdM浓度增加,其对hAoECs迁移的促进作用增强。（5）基质胶血管生成实验结果:对照组hAoECs在6小时开始逐渐形成管腔结构,0.5×CdM组和1×CdM组hAoECs在6小时形成管腔结构多于对照组,且1×CdM组形成的管腔结构多于0.5×CdM组。但是2×CdM组在6小时几乎没有形成管腔结构。根据以上结果可知:低浓度hAEC-CdM促进hAoECs管腔形成。（6）加入不同浓度hAEC-CdM刺激后的Western Blot结果:（1）ALK5-Smad3-Snail-Postn通路相关蛋白的表达:0.5×CdM组、1×CdM组和2×CdM组的ALK5和Smad3蛋白表达水平与对照组相比无显着差异（p>0.05）,0.5×CdM组和1×CdM组p-Smad3、Snail和Postn蛋白表达水平明显高于对照组（p<0.05）,但2×CdM组p-Smad3、Snail和Postn蛋白表达水平明显低于于对照组（p<0.05）。（2）ALK1-Smad5-Snail-Postn通路相关蛋白的表达:0.5×CdM组、1×CdM组和2×CdM组的ALK1和Smad5蛋白表达水平与对照组相比无显着差异（p>0.05）,0.5×CdM组和1×CdM组p-Smad5、Snail和Postn蛋白表达水平明显高于对照组（p<0.05）,但2×CdM组p-Smad5、Snail和Postn蛋白表达水平明显低于于对照组（p<0.05）。（7）加入抑制剂后的Western Blot结果:（1）加入SB431542后p-Smad3及其下游相关蛋白的western blot结果:加入抑制剂SB431542后,相较于对照组Smad3的蛋白表达水平无显着差异（p>0.05）,p-Smad3、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。1×CdM组p-Smad3、Snail和Postn的表达水平相较于对照组显着升高（p<0.05）,说明1×CdM促进了上述蛋白的表达;加入SB431542后,（CdM+SB）组p-Smad3、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）,说明SB431542一定程度上抑制了1×CdM对hAoECs上述蛋白表达的促进作用。（2）加入K02288后p-Smad5及其下游相关蛋白的western blot结果:加入抑制剂K02288后,相较于对照组Smad5的蛋白表达水平无显着差异（p>0.05）,p-Smad5、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。1×CdM组p-Smad5、Snail和Postn的表达水平相较于对照组显着升高（p<0.05）,说明1×CdM促进了hAoECs的上述蛋白的表达;在加入K02288后（CdM+K02288组）p-Smad5、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）,说明K02288在一定程度上抑制了1×CdM对hAoECs上述蛋白表达的促进作用。（8）加入抑制剂后的血管生成实验结果:（1）使用1×CdM预培养主动脉内皮细胞24小时后进行基质胶血管生成实验,对照组细胞在6小时开始逐渐形成管腔结构,1×CdM组细胞形成的管腔结构明显多于对照组。（2）加入SB431542抑制Smad3磷酸化后,在6小时节点,SB431542组未见管腔结构形成,而（CdM+SB431542）组形成管腔数目明显少于1×CdM组,说明抑制Smad3磷酸化水平确实可以抑制hAEC-CdM促hAoECs血管生成的能力。（3）加入K02288抑制Smad5磷酸化后,在6小时节点,K02288组未见管腔结构形成,而（CdM+K02288）组形成管腔数目明显少于1×CdM组,说明抑制Smad5磷酸化水平确实可以抑制hAEC-CdM促hAoECs血管生成的能力。结论:（1）成功分离培养人羊膜上皮细胞,高表达CK19,不表达Vimentin,纯度在90%以上,在体外培养条件下快速增殖。（2）本次质谱分析鉴定蛋白273种,参与信号通路88种。GO富集分析结果提示人羊膜上皮细胞条件培养液主要调节靶细胞的代谢过程、内吞作用和磷酸化进程;KEGG信号通路分析结果提示人羊膜上皮细胞条件培养液主要影响靶细胞的PI3K-Akt通路、mTOR通路和TGF-β通路。（3）hAEC-CdM促进hAoECs增殖及迁移。（4）低浓度hAEC-CdM激活TGF-β信号通路促进hAoECs管腔形成的能力,而高浓度hAEC-CdM的抑制作用可能与其抑制hAoECs的Snail和Postn表达相关。
王冰[3]（2021）在《替沃扎尼对脉冲染料激光诱导的血管再生的作用及机制初探》文中研究说明鲜红斑痣（port wine stains,PWS）是一种毛细血管畸形,好发于头面部,严重影响患者的心理健康及精神情感。PWS既可作为单一疾病发病,也可以作为多种综合征的临床表现,本文报告1例具有大面积PWS皮损的色素血管性斑痣性错构瘤病（phakomatosis pigmentovascularis,PPV）Ⅱb型合并克利佩尔-特农那综合症（Klippel-Trenauney syndrome,KTS）及巩膜黑变病的罕见病例,并以此为线索对PWS相关综合征进行综述,PWS皮损在其相关综合征中面积较大且呈进行性发展,使治疗较为困难。脉冲染料激光（pulsed dye laser,PDL）是PWS最主要的治疗方法,但研究显示有相当一部分患者的皮损清除率较低,对治疗具有抵抗,疗效不佳的原因与PDL诱导的血管再生有关。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在PDL诱导的血管再生中发挥重要作用,可以激活血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）的酪氨酸激酶活性,在内皮细胞中引发全方位的反应,进而参与调控血管生成过程。研究表明,替沃扎尼是VEGFR酪氨酸激酶活性抑制剂,能阻断VEGF的促血管生成作用并降低血管通透性,临床上被批准用于晚期及转移性肾细胞癌的治疗,目前对替沃扎尼的研究主要集中在肿瘤方面,本文旨在探索替沃扎尼对PDL诱导的血管再生的作用及机制,为临床治疗PWS提供新的可行方案。本研究中,使用不同能量密度的PDL照射大鼠腹部皮肤,根据照射区域大体及病理变化,选取皮肤表面结痂较小、对血管作用相对较强的能量密度8J/cm2进行后续试验。将大鼠腹部皮肤分为4个区域,使用能量密度8J/cm2对其中的3个区域进行均匀照射,并于激光照射区域分别涂抹不同浓度的替沃扎尼涂膜剂及其基质成分,分组如下:（1）空白组（不用药、无激光照射）、（2）对照组（药物基质、激光照射）、（3）0.5%替沃扎尼组、（4）1%替沃扎尼组。利用相机及皮肤镜进行大体观察、HE染色、免疫组化染色及血管计数对血管再生情况进行检测。结果显示,第7天、第10天及第14天0.5%替沃扎尼组及1%替沃扎尼组分别与对照组相比血管数量明显减少,1%替沃扎尼组与0.5%替沃扎尼组相比血管数量明显减少,表明替沃扎尼成功抑制了PDL诱导的血管再生,且1%替沃扎尼比0.5%替沃扎尼抑制效果更加显着。为探究替沃扎尼抑制PDL诱导的血管再生的作用机制,选取大体及病理结果出现明显差异的第7天作为时间点,并选取血管抑制作用最强的1%替沃扎尼组与对照组组织样本,进行转录组测序。测序结果显示共有588个显着差异表达基因,其中包括90个上调基因,498个下调基因。GO富集分析显示有1004个GO功能条目被显着富集（q<0.05）,差异表达基因在对外界刺激的反应、免疫系统过程、细胞表面受体信号通路、细胞运动、细胞迁移、细胞趋化等条目显示富集较高。KEGG富集分析显示有20个代谢通路被显着富集（q<0.05）,其中细胞因子与受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、局部黏附、趋化因子信号通路、RAS信号通路、RAP1信号通路为血管生成相关最主要的富集通路。最后利用实时定量聚合酶链式反应（Real Time Polymerase Chain Reaction,real-time PCR）验证表达差异倍数较高排名靠前的及与血管生成密切相关的基因,分别为Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、Ccl3、Csf3、IL1β、i NOS、Mmp9、Mmp13、Plau、Ets1、Spp1、Nr4a1,得到的结果与转录组测序结果趋势一致,证明了本次研究的可靠性。本研究探索了替沃扎尼对PDL诱导的血管再生的抑制作用,为临床PWS的治疗提供了新的思路,转录组测序对替沃扎尼抑制PDL诱导的血管再生作用机制进行了探索,为以后的深入研究提供了可靠线索。
张蒙[4]（2021）在《VEGFR2/mTOR/S6K1通路在洛克沙胂促血管生成中的作用》文中提出洛克沙胂（Roxarsone,Rox）是一种有机砷化合物,具有抗球虫、促进动物生长等作用,目前仍在许多发展中国家作为饲料添加剂使用。洛克沙胂吸收率较低,大多随粪便排出体外,可通过环境及动物性食品途径增加人砷暴露的风险。现有研究发现Rox在体内体外具有促进血管生成的作用。本实验室前期研究表明Rox可通过血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）信号,促进血管或肿瘤血管生长。本文拟通过体外血管内皮细胞培养,体内基质胶塞模型及小鼠B16细胞移植瘤模型,采用特异性信号抑制剂或RNA干扰技术,研究VEGFR2/mTOR/S6K1信号在洛克沙胂促血管生成中的作用,为Rox促血管生成的作用机制研究积累资料。在大鼠血管内皮细胞体外培养中,不同处理分组如下:对照组（PBS）、0.1μmol/L、1.0μmol/L和10.0μmol/LRox处理组、雷帕霉素处理组（25 nmol/L）、Rox+雷帕霉素共处理组（1.0μmol/L+25 nmol/L）、SU5416处理组（0.2μmol/L）、Rox+SU5416处理组（1.0μmol/L+0.2μmol/L）、10ng/mLVEGF阳性组、VEGF+SU5416共处理组。采用MTT法检测细胞活性、EdU法检测细胞增殖、划痕试验检测细胞迁移能力、管形成试验检测血管样结构的生成,Western Blot及荧光定量PCR检测细胞中VEGFR、mTOR/S6K1等相关蛋白的表达。结果表明1.0μmol/LRox能够显着提高血管内皮细胞的活性、增殖、迁移和管形成能力,上调mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、VEGF和VEGFR2蛋白表达,显着提高mTOR和S6K1 mRNA表达。雷帕霉素能够显着抑制Rox对内皮细胞的活性、增殖、迁移和管形成的促进作用,显着降低p-mTOR、p-S6K1和VEGF蛋白表达。SU5416能够降低Rox对内皮细胞的增殖、迁移和管形成的能力的促进作用,显着降低Rox对细胞中p-mTOR和p-S6K1蛋白表达的促进作用。在小鼠B16移植瘤模型研究中,小鼠腋下注射B16黑色素瘤细胞构建移植瘤模型。见瘤后荷瘤鼠不同处理分组如下:对照组（PBS）、25mg/kg Rox灌胃处理组、SU5416注射处理组（10mg/kg）、Rox+SU5416共处理组（25mg/kg+10mg/kg）。试验期间测量小鼠体重、肿瘤体积。至注射B16细胞14d后,剥离肿瘤并称重;肿瘤切片进行HE染色和CD34免疫组化分析,并检测肿瘤组织中mTOR/S6K1通路相关蛋白表达。结果表明Rox处理组肿瘤的体积和重量,及肿瘤组织中血管生成显着增加;mTOR、S6K1及其磷酸化蛋白,以及VEGF的蛋白水平和mRNA水平均显着上调。VEGFR2拮抗剂SU5416能够显着降低Rox对肿瘤生长和瘤内血管生成的促进作用。在小鼠基质胶塞模型研究中,利用已经建立的靶向重组慢病毒RNA干扰大鼠血管内皮细胞中VEGFR2的表达。将不同处理后的血管内皮细胞注入小鼠皮下,形成胶塞,检测基质胶塞的体积和重量;HE染色和CD34免疫组化分析胶塞中血管的生成。血管内皮细胞的不同处理如下:对照组（PBS）、1.0μmol/LRox处理组、RNAi干扰组、Rox+RNAi共处理组、NC组。结果表明,Rox显着增加胶塞的体积和重量,促进基质胶中血管的生成。SU5416能够显着降低Rox对基质胶塞中血管生成的促进作用。综上所述,Rox在体外能够促进大鼠血管内皮细胞的生长、迁移和管样结构的形成;抑制VEGFR2或mTOR信号,能够显着抑制Rox对内皮细胞生长的促进作用。Rox在体内能够促进移植瘤和基质胶塞的生长及其血管生成,抑制VEGFR2能够显着降低Rox对肿瘤生长的促进作用;靶向VEGFR2 RNA干扰,能够抑制Rox对基质胶塞中血管生成的促进作用。VEGFR2/mTOR/S6K1通路在Rox体内体外促血管生成中发挥着重要的调节作用。
陈芳芳[5]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中提出研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。
谌程程[6]（2021）在《c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响》文中进行了进一步梳理研究背景和意义:足部溃疡创面经久不愈是糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者容易罹患的严重并发症之一,这种以周围神经损害及缺血为特征的足部溃烂,临床上称之为糖尿病足。研究显示糖尿病人群中并发糖尿病足的患者比例从15%到20%不等,这其中大约20%的患者需要接受截肢治疗[1],而截肢对患者来说是心理和生理的双重打击。糖尿病溃疡创面延迟愈合涉及多种复杂机制,目前关于糖尿病足部溃疡的病理研究主要集中在微生物侵袭、再上皮化障碍、持续的炎症反应和免疫功能受损等一些致病因素上[2,3]。而血运障碍是伴随所有糖尿病溃疡形成的另一个潜在致病因素,血运障碍会严重影响创面的正常愈合,多项研究强调了充分的血运和血管生成在组织修复中的重要性,并认为局部血管生成障碍和血供减少是糖尿病慢性创面愈合延迟的重要病理改变之一[4-6]。因此,加强创面血管生成反应的治疗策略可能可以有效地促进糖尿病慢性创面的愈合。血管生成是一个由内皮细胞（endothelial cells,ECs）、与其相关的血管周围支持细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）以及免疫细胞协调参与的动态过程。血管生成失调已被认为是多种疾病的共同病理改变,包括癌症、外周动脉疾病、糖尿病性血管病变、类风湿性关节炎和炎症性肠病等[7-10]。血管生成受到生长因子、细胞内信号和细胞外成分的微妙和动态平衡关系的调节。多种类型的细胞（包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板、免疫细胞和干/祖细胞）可通过分泌相关生长因子参与这一过程,其中发挥主要作用的是碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）[11]、转化生长因子α[12]、转化生长因子β[13]、肿瘤坏死因子α[14]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）[15-17]和磷脂酶C-γ（phospholipase C gamma,PLCγ1）[18-20]等。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）具有分化、旁分泌及免疫调控等功能,被认为在血管生成的过程中起到重要作用[21]。此外,Shin等人的研究发现在糖尿病动物模型中内源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的功能受损、以及迁移到受损创面的细胞数量明显降低是导致创面难以愈合重要因素之一[22]。目前已发现MSCs通过促进血管生成加速创面愈合的几种机制,包括分泌促血管生成因子、向内皮细胞和（或）周细胞分化促进血管生成、募集内源性干/祖细胞、调控细胞外基质产生和重塑以及免疫抑制作用等[23]。近年来,外源性MSCs在多种疾病动物模型中的治疗效果,特别是在创伤和缺血性疾病的治疗上受到了广泛的关注[24-26]。多项动物实验研究表明,外源性MSCs的注射治疗可以通过促进创面基底血管生成来加速糖尿病等慢性创面的愈合[27,28]。但是,从组织中获取的原代MSCs,其细胞生物学功能在经过体外培养和增殖后大幅降低,导致治疗效果低于预期[29]。因此,亟待寻找一种方法来增强长期扩增培养BM-MSCs的修复功能,并通过动物实验进一步检测其对糖尿病创面的促愈合作用和安全性。c-Cbl（c-Casitas b-lineage lymphoma）是细胞中的一种原癌基因,属于Cbl家族的成员之一,其编码的蛋白被认为是一种E3泛素连接酶且包含特征性的环指（RING Finger,RNF）结构域,能够调控细胞膜表面受体介导的多种信号[30,31]。实验证实在肿瘤及视网膜血管新生的病理过程中,抑制c-Cbl可以增强VEGF诱导的内皮细胞增殖和血管生成,从而促进这一进程[19]。另外,研究还发现在糖尿病小鼠模型中,敲除c-Cbl基因可以改善高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗[32]。这些结果提示,c-Cbl能够通过调控信号分子转导影响细胞的功能改变进而参与血管生成的过程,并且c-Cbl基因在糖尿病动物模型中也起到重要作用。然而,c-Cbl在BM-MSCs及其长期扩增培养后的功能变化中是否起到作用,起到何种作用,目前尚不清楚。因此,在本文中我们通过向SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）并以血糖值建模标准筛选Ⅰ型糖尿病大鼠,用于制作创面模型。通过体外实验研究c-Cbl在长期扩增培养的BM-MSCs功能改变中的作用,并在动物模型上观察经过调控的BM-MSCs对促进糖尿病创面愈合的作用。研究结果对MSCs在糖尿病等慢性创面治疗的应用上具有重要意义,并为改善MSCs在体外扩增培养后的功能降低提供理论依据。此外,探索c-Cbl对MSCs促血管生成功能的调控作用,可以更好的阐明MSCs的功能变化与血管生成的关系,具有一定参考价值。实验研究方法:1.体外扩增培养大鼠BM-MSCs,检测c-Cbl与蛋白激酶B（Akt）的活化水平及相互作用关系将购买的Sprague-Dawley（SD）大鼠BM-MSCs在体外进行扩增培养,通过蛋白免疫印迹（western blot,WB）法分别检测传第3代（passage 3,P3）、传第6代（passage6,P6）及传第10代（passage 10,P10）细胞中Y731c-Cbl/c-Cbl和S473-Akt/Akt的蛋白表达水平;并且在P10细胞中使用锁核酸修饰的反义寡核苷酸间隔物（locked nucleic acid modified antisense oligonucleotide gapmers,LNA Gapmers）抑制c-Cbl表达,再次检测S473-Akt/Akt的蛋白表达变化。2.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs旁分泌血管生成因子及迁移能力的影响通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）分别定量P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 BM-MSCs在体外培养过程中分泌血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）及b FGF的水平,同时采用小管形成试验分别检测内皮细胞在各组细胞条件培养液中形成血管样结构的程度变化。另外,采用Transwell试验检测各组细胞的迁移功能。3.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs增殖及衰老的影响采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒分别对P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs进行染色,以检测衰老细胞的比率。采用CCK-8（cell counting kit-8）试验检测各组细胞分别在24、48、72及96小时的细胞增殖速率。4.构建糖尿病大鼠创面模型首先我们以65mg/kg剂量对SD大鼠进行腹腔注射STZ,诱导构建Ⅰ型糖尿病大鼠模型。然后,以1.8cm的直径在大鼠背部制作对称的两处圆形皮肤全层创面。术后1天在创面周围注射BM-MSCs进行治疗干预。5.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面血管生成的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射下调c-Cbl表达的P10 BM-MSCs（转染c-Cbl LNA Gapmers）、阴性对照P10 BM-MSCs（转染Scramble LNA Gapmers）及等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）,采用免疫组化的方法检测术后7天和14天创面组织中血小板-内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）和VEGFA的表达,以判断创面血管生成情况。6.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射PBS、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs,在创面制造后0、3、7、14天拍照并计算创面愈合率。另外,收集术后14天创面组织制作石蜡切片进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色和马松（Masson）染色,并统计病理评分。实验结果:1.体外长期扩增培养的BM-MSCs中,c-Cbl的磷酸化水平明显增加而Akt的磷酸化水平受到抑制,c-Cbl LNA Gapmer转染能够下调c-Cbl的蛋白表达水平,并且c-Cbl下调后,Akt的磷酸化水平得到提高,表明c-Cbl在一定程度上介导了体外长期扩增培养诱导的BM-MSCs的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/Akt信号抑制。2.体外长期扩增培养的BM-MSCs,其旁分泌血管生成因子和迁移能力受到抑制,而下调c-Cbl的表达可改善其旁分泌和迁移能力。3.体外长期扩增培养的BM-MSCs增殖能力降低并呈现较高的衰老率,而下调c-Cbl的表达可增强其增殖能力并在一定程度上降低衰老率,但并没有过度激活MSCs的增殖活性。4.成功构建了STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠,并在此基础上制作了糖尿病大鼠创面模型,模型构建的成功率高、稳定性强。5.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对促进糖尿病创面血管生成的治疗效果,与对照组相比,局部注射c-Cbl下调的BM-MSCs可以显着促进创面组织中VEGFA的早期表达,并最终促进糖尿病创面的血管生成。6.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的速率。另外,通过HE及Masson染色统计分析的组织病理评分显示,经c-Cbl下调的BM-MSCs治疗后,创面评分明显高于对照组。结论:1.下调c-Cbl的表达可以改善BM-MSCs长期扩增培养后的Akt磷酸化抑制及促血管生成相关功能降低,表明c-Cbl的表达水平与BM-MSCs的Akt信号和功能变化具有一定的相关性。2.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对糖尿病大鼠创面的促血管生成及促愈合的治疗效果。
刘家杰[7]（2021）在《Ⅰ型胶原蛋白对ADSCs及EPCs体外增殖与分化的调控机制研究》文中提出[目 的]探讨I型胶原蛋白（Collagen I）在体外对脂肪干细胞（Adipose Derived Stem Cells,ADSCs）及内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）增殖与分化的调控机制,为种子细胞生长增殖提供良好微环境,为干细胞体外培养提供简便方法,为脂肪移植物早期血管化和提高其成活率提供理论依据。[方法]（1）体外培养并鉴定大鼠成纤维细胞、ADSCs及EPCs,大量扩增并收获成纤维细胞,采用酸提取法提取胶原蛋白、纯化,并采用Western Blot鉴定胶原蛋白。（2）CCK-8法探索适合ADSCs增殖的最佳浓度为0.1mg/ml,并描绘生长曲线;0.1mg/ml浓度的I型胶原蛋白对不同代次ADSCs增殖能力进行检测;0.Img/ml浓度的I型胶原蛋白包被Transwell小室下室（胶原组）,对照组小室下室不做处理,胶原组和对照组上室接种细胞数分别为3 ×104/孔,分别在24h、48h和72h染色并计数迁移细胞数;RT-qPCR分别检测胶原组与对照组中ADSCs表达VEGFA的量;胶原组细胞和对照组细胞分别进行成脂分化、成骨分化和成软骨分化,分别在第3天、第10天和第5天将各组细胞进行染色,观察其形态,另一部分细胞收样提取RNA,RT-qPCR检测各组早期成脂、成骨、成软骨基因表达量。（3）CCK-8法探索适合EPCs增殖的最佳浓度为5μg/cm2,并描绘生长曲线;5 μg/cm2浓度I型胶原蛋白对不同代次EPCs增殖能力进行检测;5μg/cm2浓度的Ⅰ型胶原蛋白包被Transwell小室下室（胶原组）,对照组小室下室不做处理,胶原组和对照组上室接种细胞数分别为3 ×104/孔,在24h、48h染色并计数迁移细胞数;RT-qPCR检测胶原组和对照组EPCs表达VEGFA、VEGFR1、vWF、CD133、CD31的量;基质胶上接种胶原组、对照组大鼠的EPCs,显微镜下在2h、4h时间点观察各组成管情况,随机选取5个视野拍照,用Image J统计成管总长度和分支节点数;用Trizol法收集成管前与成管时EPCs样品送公司测基因组序列,并用RT-qPCR验证测序结果;采用Trizol法提取胶原蛋白处理和对照组EPCs总RNA,采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测胶原组和对照组中EPCs基因表达量。[结 果]（1）成纤维细胞提取纯化出I型胶原蛋白。（2）0.1mg/ml浓度的I型胶原蛋白对ADSCs增殖能力最强（p<0.05）,且0.1mg/ml浓度的I型胶原蛋白对不同代次细胞的增殖能力均强于对照组（p<0.05）。（3）Ⅰ型胶原蛋白对ADSCs迁移能力明显强于对照组（p<0.05）。（4）Ⅰ型胶原蛋白组中 ADSCs 表达 VEGFA、PPARG、RUNX2、COMP 的量明显多于对照组（p<0.05）。（5）5μ/cm2浓度的Ⅰ型胶原蛋白对EPCs增殖能力最强（p<0.05）,且5μg/cm2浓度的Ⅰ型胶原蛋白对不同代次EPCs的增殖能力均强于对照组（p<0.05）。（6）Ⅰ型胶原蛋白对EPCs迁移能力明显比对照组差（p<0.05）。（7）Ⅰ型胶原蛋白组中EPCs表达CD31、VEGFR1、VEGFA、vWF的量明显低于对照组,表达CD133的量明显高于对照组（p<0.05）。（8）Ⅰ型胶原蛋白可以上调细胞周期、粘附分子、代谢过程。（9）Ⅰ型胶原蛋白可以激活PI3K/Akt信号通路,且Ⅰ型胶原蛋白组中表达PI3K和Akt基因的量明显高于对照组（p<0.05）。[结 论]（1）本实验成功从成纤维细胞提取出Ⅰ型胶原蛋白,为Ⅰ型胶原蛋白的提取提供新方法。（2）Ⅰ型胶原蛋白可以诱导ADSCs增殖、趋化,为脂肪移植后脂肪再生提供良好微环境。（3）Ⅰ型胶原白通过上调细胞周期和代谢过程促进EPCs增殖。（4）Ⅰ型胶原蛋白通过上调PI3K/Akt信号通路和粘附分子促进EPCs血管形成,为脂肪移植早期血管化提供理论依据。（5）Ⅰ型胶原蛋白可以保持干细胞多向分化潜能,为脂肪移植联合干细胞应用提供新方法。
刘一鸣[8]（2021）在《β分泌酶与血管病理在认知损伤相关疾病中的作用研究》文中提出β分泌酶（Beta-site APP Cleavage Enzyme 1,BACE1）是切割淀粉样蛋白前体（Amyloid Precursor Protein APP）产生淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）的关键限速蛋白酶,而Aβ的沉积被认为是阿尔兹海默病（Alzheimer’s Disease,AD）中的重要病理之一。研究发现,AD患者的脑实质、脑脊液和血浆中BACE1蛋白水平以及酶活性均有提高,并与AD病理进程密切相关,提示了升高的BACE1蛋白浓度和活性是AD的重要风险因素。BACE1在AD中升高的可能与很多压力因素有关,如氧化应激、炎症水平提高以及缺氧环境、高糖环境等等。研究发现许多疾病都可以提高认知损伤的风险,如高血压、脑血管疾病和糖尿病等。脑血管疾病可分为大血管疾病（如动脉硬化）和小血管疾病,小血管疾病一般指直径200um以下的小血管病变,其又可分为两种:1、衰老和高血压相关的脑小血管病（Cerebral Small Vascular Diseases,CSVD）,其主要影像学特征包括腔隙、微出血、脑白质高信号和血管周围间隙扩大等;2、Aβ相关的脑淀粉样血管病（Cerebral Amyloid Angiopathy,CAA）,其主要特征为Aβ在软脑膜、皮质下血管和小动脉的沉积,并与AD紧密相关。无论是CSVD还是CAA,都会导致患者的认知出现严重损伤。除此之外,二型糖尿病（Type-ⅡDiabetes Mellitus,T2DM）也是导致认知损伤的重要风险因素之一。T2DM是一种慢性代谢性疾病,典型特征包括肥胖、高血糖、胰岛素抵抗和炎症水平升高等。T2DM提高多种痴呆的发病率,如血管性痴呆和AD等,导致患者的认知损伤。我们注意到,以上几种促进认知损伤的疾病都伴随着炎症水平提高、局部缺氧或者高糖环境等压力因素,这都有可能引发BACE1的表达上调。因此我们提出,这些疾病是否通过引发BACE1的蛋白浓度或酶活性提高进而促进认知损伤的发生?针对这一问题,我们分别招募了AD患者队列、CAA患者队列、T2DM及T2DM伴随认知损伤患者队列和老年人社区队列,对其血浆中BACE1的蛋白浓度和酶活性进行检测,并结合患者的认知状况和病理特征,对BACE1的蛋白浓度和酶活性与患者病理及认知损伤的关系进行分析,得到了如下结果:1、BACE1蛋白浓度和酶活性与认知水平相关:在AD患者队列中,AD患者相对于健康组对照有更高的血浆BACE1蛋白浓度,且在所有患者中BACE1蛋白浓度与认知评分相关,但酶活性无显着关联;在T2DM患者队列中,T2DM患者和T2DM伴随认知损伤患者血浆BACE1蛋白浓度和活性均提高,并且与认知评分相关;CAA患者队列中患者血浆BACE1酶活性提高,并与认知评分相关,另外在CAA转换痴呆的患者中BACE1酶活性和浓度均提高;最后在社区队列中我们发现校正年龄性别后的血浆BACE1蛋白浓度与患者认知评分负相关,而血浆Aβ42/40比例与认知评分也有关。以上结果提示我们,血浆BACE1的蛋白浓度与患者认知水平有关,这可能是通过影响Aβ病理来达到的;而在一些其他病理如T2DM和CAA中,BACE1的酶活性与认知也有相关。2、BACE1酶活性与生理及病理指标相关:①CAA患者队列中,血浆BACE1酶活性在高血压和糖尿病患者中提高;社区队列中,校正年龄性别后血浆BACE1酶活性与血压、血糖和血脂水平均有关。②在T2DM患者队列中,血浆BACE1酶活性与炎症水平相关;CAA患者队列中,血浆BACE1酶活性与白质高信号体积正相关;在社区队列中,校正年龄性别后血浆BACE1酶活性与动脉硬化相关指标有关,并且与部分血管炎症因子正相关。这部分结果显示,环境压力如高血压和高血糖可能提高了BACE1的酶活性,而BACE1酶活性与血管损伤和炎症水平有一定相关性。结论:脑小血管病和糖尿病患者中高血压和高血糖等压力因素导致的BACE1的酶活性和蛋白浓度提高可能是促进其认知损伤的共同机制。本研究中我们完成了国际上第一个多中心的BACE1酶活性和蛋白浓度检测,并以病例对照研究作为发现组,以社区队列研究作为验证组,发现患者血浆BACE1蛋白浓度的升高与认知下降有关,而BACE1酶活性则对压力因素如高血压和高血糖较为敏感,且与血管炎症的提高有关。阿尔兹海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是发病率最高的神经退行性疾病,在所有痴呆类型占据最主要的地位。AD的典型病理学特征包含淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）沉积形成的斑块,过度磷酸化的Tau蛋白造成的神经元纤维缠结以及胆碱能突触丢失和神经元凋亡等。除此之外,血管病变也是AD患者脑内的重要病理,80%的AD患者都伴随着小血管病变、微梗死、微出血等症状。最新的研究发现,AD患者脑内存在着血脑屏障（Blood-Brain Barrier,BBB）的结构与功能损伤。鉴于血脑屏障承担保护大脑稳态,物质运输等多个重要功能,其损伤使得营养物质不能转运至脑内,脑内的代谢废物如Aβ不能运出至血液,且血浆中其它蛋白、病原体甚至免疫细胞的渗漏还会使得脑内炎症的发生,这些都对AD病理起到了重要的推动作用。但是,AD患者中BBB结构和功能损伤的机制目前还并不十分清楚。有研究认为,异常激活的炎症以及Aβ对内皮细胞的毒性作用会引发BBB损伤。同时,有些中枢神经系统疾病中存在血管异常再生的现象,由于新生的血管紧密连接（Tight Junctions,TJs）结构的不完整性,导致其BBB功能异常,因此提高了整体上的血管通透性。而之前有研究报道,AD患者脑内血管密度增加,提示其脑内也存在着异常的血管再生。针对这一问题,我们结合AD患者捐献的脑组织样本以及招募的临床认知障碍队列的脑脊液样本,研究AD患者脑内是否有异常血管再生及其在AD病人BBB损伤中的可能作用。取得了如下结果:1、AD患者脑中存在血管过度生成的现象为了探究AD是否存在血管生成的病理现象,我们首先对AD患者脑组织样本的血管密度进行了检测,发现AD患者脑内的确有血管密度增加的现象。为了探究血管增加的原因,接下来我们又对脑实质内血管再生因子的表达进行检测,结果发现,多种血管再生因子在AD患者脑内的表达增加。由于大部分血管再生因子释放到脑间质液中,于是我们检测了临床队列脑脊液（Cerebrospinal Fluid,CSF）中血管再生因子的表达情况,发现多数血管再生因子也在AD患者CSF中显着提高。以上结果提示我们,AD患者脑内确实存在血管过度生成的现象。2、患者血管生成与AD病理的关系为了探究血管生成与AD典型病理之间的关系,我们将所有患者按照CSF pTau和Aβ的水平分成阴性和阳性两组,比较血管生成相关因子的表达。结果发现,多数血管生成相关因子在p-Tau阳性组中增加,而在Aβ组中无明显变化。线性回归的结果也显示了p-Tau变化与更多的因子升高有关。这可能提示我们,Aβ可能不是刺激异常血管再生的主要机3、AD患者脑血管通透性增加为了探究AD患者血管通透性的改变,我们首先检测了AD患者脑组织样本中紧密连接蛋白（Tight Junctions,TJs）的表达情况,结果发现AD患者脑中多种TJs表达降低,免疫荧光的结果显示,TJs在内皮细胞上的表达减少。接下来,我们又通过检测临床队列患者血管通透性指标白蛋白商（Albumin Quotient,Qalb）的比较发现,AD患者Qalb值显着提高,与此结果相一致的是,血管损伤组患者Qalb值也显着提高。以上结果显示,AD患者BBB结构不完整,血管通透性增加,血管损伤增加。4、AD患者血管通透性增加与血管生成有关为了探究血管生成与通透性的关系,我们首先检测了促血管再生转录因子Slug和Snail的表达,发现其在AD患者中表达升高。进一步的,我们将Slug和Snail的表达与TJs表达做相关性分析,发现Slug和Snail与多种TJs呈负相关,提示血管再生因子刺激下的血管再生抑制了TJs表达。接下来,我们将患者按照血管病理进行分组,结果发现,两种血管生成相关因子PAI-1和PlGF在血管损伤组显着提高。之后我们又对血管生成因子和血管通透性指标Qalb进行了分析,结果发现,所有患者中Qalb的增加与三种血管生成因子PlGF、VEGFR2和IL-8有关,而在进一步的患者分类中,AD患者Qalb与血管生成因子的回归系数相对健康对照显着提高,认知状况更差的患者也出现了类似的现象。该部分的结果说明,血管通透性的增加与血管生成有关,且在AD患者和认知障碍中更为明显。结论:异常的血管再生存在于AD病理发生过程中。在AD脑内,异常的血管再生因子表达促进了血管再生发生,同时通过上调表达Slug与Snail,抑制紧密连接蛋白的表达。这导致血管内皮之间的紧密连接结构的丢失,促进了BBB的损伤。临床队列的结果也表明,血管再生因子与血管通透性正相关。因此,异常血管再生可能是导致AD血管通透性增加的重要病理机制之一。
张珊珊[9]（2021）在《视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究》文中研究指明血管生成是通过已有的血管发芽而形成新血管的过程,胚胎发育完成后生理性与病理性血管均通过此过程产生。生理性的血管生成对损伤修复、组织的生长和再生都十分关键,而生理性血管的异常生成和病理性血管的形成往往与许多疾病的发生有关。视网膜血管作为视网膜中氧气和营养供应的通道,其异常发育会诱发许多眼病,如家族性渗出性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等。目前对于这些疾病仍缺少有效的诊疗方法,寻找影响血管生成的基因,明确生理性血管发育与病理性血管生成的机制,对于这些疾病的诊疗具有重要意义。本论文研究了三个基因在视网膜血管生成中的作用,并对其调控机制进行了研究,为血管性眼病的治疗提供了参考。论文的主要内容如下:1.首次就TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其机制进行了研究。研究发现,人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常。另外,在小鼠血管内皮细胞中特异性敲除Tmem30a导致视网膜表层血管发育迟缓、密度降低,血管末端膨大,顶端内皮细胞的数量减少,丝状伪足数目降低;在小鼠全身敲除Tmem30a还会导致血管壁的完整性遭到破坏。而在小鼠视网膜血管发育完成后敲除Tmem30a不会影响血管网络的维持。在转录水平进行分析发现在敲减TMEM30A的人视网膜血管内皮细胞与全身敲除Tmem30a小鼠的肺组织中与细胞周期有关的基因表达量减少;同时蛋白质免疫印迹分析发现其中涉及VEGF信号传导的相关蛋白质的磷酸化水平也明显降低。以上结果表明,Tmem30a在血管生成和维持血管屏障的完整性中发挥了作用,其通过调节VEGF的信号传导来控制血管生成。2.研究了TWIST1基因在视网膜病理性血管生成中的作用。研究发现在血管内皮细胞条件性过表达Twist1的小鼠中出现了视网膜表层血管发育迟缓、前端异常增生和局部渗漏的表型。免疫荧光染色发现该小鼠血管内皮细胞增殖速度显着加快,小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白表达增多,血管内皮生长因子分泌异常。而血管内皮细胞核染色显示血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠血管内皮细胞核多为椭圆形,且不指向无血管区。该结果说明Twist1过表达导致星形胶质细胞的异常激活,其分泌的血管内皮生长因子随之升高,进一步导致了血管的异常增生,同时Twist1过表达后引起的血管内皮细胞极性的丧失会导致血管发育迟缓。而在小鼠视网膜血管发育完成后过表达Twist1不会影响血管网络的维持。另外,全身过表达Twist1后,小鼠眼球变小,视网膜表层血管发育迟缓、密度下降、局部渗漏,与在血管内皮细胞过表达Twist1的表型不同,说明Twist1在其他细胞中同样发挥作用。体外荧光素酶实验发现过表达TWIST1导致Norrin/β-catenin信号通路活性增强。以上结果表明TWIST1可能通过异常激活Norrin/β-catenin信号通路导致视网膜病理性新生血管的生成。3.鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1,并对其致病机制进行了研究,首次将DLG1与FEVR相关联,进一步明确了DLG1影响血管生成的作用机制。研究表明DLG1的错义突变S598G使DLG1无法正常激活β-catenin信号的传导,血管形成实验表明敲减DLG1影响了人视网膜血管内皮细胞的管腔形成,蛋白免疫印迹实验证明了DLG1缺失后VEGFR2蛋白磷酸化水平降低。综上,本研究阐明了TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其分子机制,证实了TWIST1在病理性血管生成中的作用,鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1。为血管性眼病及其他病理性血管生成疾病的治疗提供了新的药物治疗靶点。
沈真如[10]（2021）在《基于DLL4/Notch1通路探讨麦粒灸促进薄型子宫内膜大鼠血管生成的机制》文中指出目的:宫腔操作等因素的增多导致子宫内膜损伤增多,薄型子宫内膜也越发常见。但薄型子宫内膜的发病机制还尚不明确,越来越多的证据表明血管生成与子宫内膜修复密切相关。因此,本研究通过建立薄型子宫内膜大鼠模型,观察麦粒灸“关元”、“子宫”穴对薄型子宫内膜大鼠血管生成相关因子及Notch信号通路相关分子的影响,从血管生成的角度初步探讨麦粒灸治疗薄型子宫内膜的可能机制。方法:将30只SPF级健康成年雌性SD大鼠按随机数字表法分为3组:对照组、模型组、麦粒灸组,每组10只。除对照组外,其余2组大鼠均于动情期采用95%乙醇宫腔注射法建立薄型子宫内膜模型。对照组与模型组每日麻醉后固定,麦粒灸组造模次日予以麦粒灸“关元”、“子宫”穴,每穴7壮。3个动情周期后于大鼠动情期取材,HE染色观察子宫内膜厚度及组织形态变化;免疫组织化学法和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测子宫内膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）及血管生成素-2（Ang-2）的表达情况;Western blot法和RT-qPCR法分别检测子宫内膜组织中Notch信号通路受体（Notchl）及配体（DLL4）的蛋白和基因表达情况。结果:（1）子宫内膜厚度及腺体、血管数量:与对照组相比,模型组大鼠子宫内膜厚度明显变薄,子宫内膜腺体、血管数量显着减少（P<0.01）;而麦粒灸组较模型组比,大鼠子宫内膜厚度明显增厚,子宫内膜腺体、血管数量显着增多（P<0.05,P<0.01）。（2）血管生成相关调节因子VEGF、Ang-2的表达:模型组大鼠子宫内膜中VEGF、Ang-2的MOD值较对照组显着下降（P<0.01）;麦粒灸组的MOD值较模型组显着上升（P<0.01,P<0.05）。模型组大鼠子宫内膜中VEGF、Ang-2的mRNA表达较对照组显着降低（P<0.01）;而与模型组相比,麦粒灸组表达均显着升高（P<0.05）。（3）Notch信号通路Notchl及DLL4的表达:模型组大鼠子宫内膜中Notch1、DLL4蛋白表达水平与对照组相比明显下降（P<0.01）;与模型组比较,麦粒灸组蛋白表达水平明显上升（P<0.05）。模型组大鼠子宫内膜中Notch1、DLL4的mRNA表达水平与对照组相比明显降低（P<0.01）;而与模型组比较,麦粒灸组mRNA表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01）。结论:麦粒灸“关元”、“子宫”穴能够改善薄型子宫模型大鼠的内膜组织形态,修复损伤的子宫内膜;其机制可能是通过上调子宫内膜中Notch信号通路相关分子的表达,从而影响薄型子宫内膜大鼠子宫内膜血管生成相关因子VEGF、Ang-2的表达,促进子宫内膜的血管生成,改善子宫内膜厚度,达到修复作用。
二、内皮细胞生长因子与血管生成（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、内皮细胞生长因子与血管生成（论文提纲范文）
（2）人羊膜来源上皮细胞调节主动脉内皮细胞血管生成及其分子机制的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:人羊膜来源上皮细胞原代提取、条件培养液浓缩物的制备及应用质谱鉴定结果预测人羊膜上皮细胞旁分泌因子及相关的信号通路 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人羊膜来源上皮细胞原代提取及鉴定 |
| 2.2.2 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 人羊膜来源上皮细胞的原代提取及培养 |
| 3.2 人羊膜来源上皮细胞的鉴定 |
| 3.3 质谱鉴定结果 |
| 3.3.1 质谱鉴定合并Uniprot数据库搜索结果 |
| 3.3.2 血管生成相关蛋白的筛选 |
| 3.4 GO注释及富集分析 |
| 3.4.1 按生物学功能分类 |
| 3.4.2 按分子成分分类 |
| 3.4.3 按分子功能分类 |
| 3.5 KEGG信号通路分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:不同浓度的人羊膜来源上皮细胞条件培养液对主动脉内皮细胞功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人主动脉内皮细胞培养 |
| 2.2.2 条件培养液(Conditioned medium,CdM)的收集及浓缩物的制作 |
| 2.2.3 实验分组方法 |
| 2.2.4 不同浓度hAEC-CdM对主动脉内皮细胞增殖能力的影响 |
| 2.2.5 不同浓度hAEC-CdM对主动脉内皮细胞迁移能力的影响 |
| 2.2.6 不同浓度hAEC-CdM对主动脉内皮细胞血管生成能力的影响 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 hAEC-CdM促进主动脉内皮细胞增殖 |
| 3.2 hAEC-CdM促进主动脉内皮细胞迁移 |
| 3.3 hAEC-CdM促进主动脉内皮细胞的血管生成能力 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:人羊膜来源上皮细胞条件培养液调节主动脉内皮细胞血管生成的分子机制探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 条件培养液的收集及冻干粉的制作 |
| 2.2.2 人主动脉内皮细胞的培养 |
| 2.2.3 实验分组方法 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 加入抑制剂的血管生成实验 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 加入不同浓度hAEC-CdM刺激后的western blot结果 |
| 3.1.1 加入不同浓度hAEC-CdM刺激后ALK5和Smad3的western blot结果 |
| 3.1.2 加入不同浓度hAEC-CdM刺激后ALK1和Smad5的western blot结果 |
| 3.2 加入抑制剂后的western blot结果 |
| 3.2.1 加入SB431542后p-Smad3及其下游相关蛋白的western blot结果 |
| 3.2.2 加入K02288后p-Smad5及其下游相关蛋白的western blot结果 |
| 3.3 加入抑制剂后的血管生成实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 血管再生研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）替沃扎尼对脉冲染料激光诱导的血管再生的作用及机制初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鲜红斑痣及其相关综合征 |
| 1.1.1 病例报告 |
| 1.1.2 鲜红斑痣相关综合征 |
| 1.2 脉冲染料激光治疗鲜红斑痣的研究进展 |
| 1.2.1 脉冲染料激光原理 |
| 1.2.2 脉冲染料激光发展历程 |
| 1.2.3 脉冲染料激光治疗鲜红斑痣的临床应用分析 |
| 1.2.4 脉冲染料激光联合其他方法治疗鲜红斑痣 |
| 1.3 脉冲染料激光诱导血管再生 |
| 1.3.1 炎症反应与血管再生 |
| 1.3.2 缺氧与血管再生 |
| 1.3.3 血管内皮生长因子与血管内皮生长因子受体 |
| 1.4 替沃扎尼 |
| 1.4.1 化学结构 |
| 1.4.2 药效学 |
| 1.4.3 药代动力学 |
| 1.4.4 不良反应及安全性评价 |
| 1.4.5 抗肿瘤效应 |
| 1.5 转录组测序 |
| 1.6 研究思路与研究内容 |
| 第二章 替沃扎尼对脉冲染料激光诱导的血管再生的作用研究 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 药物合成 |
| 2.2.2 动物模型实验 |
| 2.2.3 大体外相观察 |
| 2.2.4 组织病理切片HE染色 |
| 2.2.5 免疫组织化学染色及血管计数 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 脉冲染料激光诱导的大鼠血管再生模型参数选择 |
| 2.3.2 替沃扎尼对脉冲染料激光诱导的大鼠血管再生模型作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 脉冲染料激光诱导的大鼠血管再生模型参数选择 |
| 2.4.2 替沃扎尼对脉冲染料激光诱导的大鼠血管再生模型作用 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 替沃扎尼抑制脉冲染料激光诱导的血管再生的作用机制研究 |
| 3.1 主要试剂和仪器 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 转录组测序 |
| 3.2.2 Real-time PCR检测 |
| 3.2.3 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 转录组测序 |
| 3.3.2 Real-time PCR |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）VEGFR2/mTOR/S6K1通路在洛克沙胂促血管生成中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 血管生成及其调节因子 |
| 1.1 血管的生成 |
| 1.2 血管生成的调节因子 |
| 2 VEGF/VEGFR2及其对血管生成的调节 |
| 2.1 VEGF |
| 2.2 VEGFR |
| 2.3 VEGF/VEGFR2对血管生成的调节作用 |
| 2.4 VEGF/VEGFR2相关疾病与靶向治疗 |
| 3 mTOR/S6K1信号及其调节作用 |
| 3.1 mTOR |
| 3.2 S6Ks |
| 3.3 mTOR/S6K1信号的作用 |
| 4 洛克沙胂及其危害 |
| 4.1 洛克沙胂的残留 |
| 4.2 洛克沙胂对动物机体的损伤 |
| 4.3 洛克沙胂与血管生成 |
| 5 目的与意义 |
| 第一章 洛克沙胂对血管内皮细胞及其mTOR/S6K1表达的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 实验设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 大鼠血管内皮细胞的培养 |
| 2.2 细胞处理的分组 |
| 2.3 MTT法检测细胞活性 |
| 2.4 荧光定量RT-PCR检测mTOR和S6K1 |
| 2.5 WB法检测相关蛋白表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 洛克沙胂对血管内皮细胞活力的影响 |
| 3.2 洛克沙胂对mTOR/S6K1蛋白表达的影响 |
| 3.3 洛克沙胂对血管内皮细胞中mTOR、S6K1 mRNA的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 第二章 VEGFR2/mTOR/S6K1在洛克沙胂促血管内皮细胞生长中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞处理的剂量及分组 |
| 2.2 MTT法 |
| 2.3 EdU法检测细胞增殖 |
| 2.4 划痕试验 |
| 2.5 管形成试验(Tube formation assay) |
| 2.6 WB法检测相关蛋白表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 mTOR被抑制后洛克沙胂对血管内皮细胞生长的影响 |
| 3.2 VEGFR2被抑制后洛克沙胂对血管内皮细胞生长的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 洛克沙胂在体内对血管生成及mTOR/S6K1表达的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 溶液配制配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠B16移植瘤模型 |
| 2.2 基质胶塞模型试验 |
| 2.3 HE染色及免疫组化分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 洛克沙胂对小鼠B16移植瘤生长的影响 |
| 3.2 洛克沙胂对基质胶塞血管生成的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 脂肪细胞来源外泌体介导的内皮间质转化在糖尿病血管再狭窄中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 脂肪细胞来源外泌体在血管新生中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
| SCI论文Ⅲ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 长期扩增培养的BM-MSCs中c-Cbl与Akt蛋白的活化水平及相互作用关系 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促血管生成相关功能的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面血管生成的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脂筏在血管生成调控中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）Ⅰ型胶原蛋白对ADSCs及EPCs体外增殖与分化的调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 早期脂肪移植物血管化的调节及机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）β分泌酶与血管病理在认知损伤相关疾病中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 β分泌酶提高多种血管相关疾病患者认知损伤风险研究 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 BACE1 |
| 1.1.1 BACE1与AD |
| 1.1.2 BACE1的表达调控 |
| 1.2 二型糖尿病 |
| 1.2.1 二型糖尿病的流行病学特征 |
| 1.2.2 二型糖尿病与认知损伤 |
| 1.3 脑血管疾病 |
| 1.3.1 脑小血管病 |
| 1.3.2 脑淀粉样血管病 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 患者血浆样本来源 |
| 2.1.2 荧光共振能量转移实验相关材料 |
| 2.1.3 ELISA检测相关材料 |
| 2.1.4 Luminex检测相关器材及试剂 |
| 2.1.5 其他材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 荧光共振能量转移实验 |
| 2.2.2 ELISA |
| 2.2.3 Luminex |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 血浆BACE1提高认知损伤的风险 |
| 3.1.1 AD队列患者血浆BACE1蛋白浓度显着上升,且与认知评分相关 |
| 3.1.2 T2DM队列患者BACE1酶活性和浓度升高,与认知评分相关 |
| 3.1.3 CAA患者血浆BACE1蛋白浓度和活性与认知相关 |
| 3.1.4 社区队列患者血浆BACE1与认知评分呈负相关 |
| 3.2 血浆BACE1酶活性与血管病理相关 |
| 3.2.1 T2DM队列患者BACE1酶活性与炎症水平相关 |
| 3.2.2 CAA队列患者BACE1酶活性与病理相关 |
| 3.2.3 社区队列患者BACE1酶活性与血管病理相关 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 第二部分 阿尔兹海默病脑内异常血管再生在血脑屏障损伤中的作用研究 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 阿尔兹海默病 |
| 1.1.1 阿尔兹海默病的流行病学特征 |
| 1.1.2 阿尔兹海默病的病理学特征 |
| 1.1.3 阿尔兹海默病的标志物 |
| 1.1.4 阿尔兹海默病的发病机制 |
| 1.2 血脑屏障与血管通透性 |
| 1.2.1 血脑屏障的结构和功能 |
| 1.2.2 阿尔兹海默病中的血脑屏障损伤和血管通透性改变 |
| 1.3 血管生成 |
| 1.3.1 血管生成 |
| 1.3.2 阿尔兹海默病中的血管生成 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.1.1 人脑组织样本 |
| 2.1.2 患者CSF样本 |
| 2.1.2.1 患者招募及出入组标准 |
| 2.1.2.2 患者脑脊液样本提取及保存 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 蛋白免疫印迹实验器材及试剂 |
| 2.2.2 免疫焚光及免疫组化实验相关材料 |
| 2.2.3 ELISA检测相关器材及试剂 |
| 2.2.4 Luminex检测相关器材及试剂 |
| 2.2.5 其他实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 免疫印迹实验 |
| 2.3.2 免疫荧光实验 |
| 2.3.3 免疫组织化学实验 |
| 2.3.4 ELISA |
| 2.3.5 Luminex |
| 2.3.6 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 AD人脑组织样本中存在血管过度生成现象 |
| 3.1.1 AD人脑组织样本中血管密度及新生血管密度增加 |
| 3.1.2 血管生成相关因子在AD人脑组织样本中表达增加 |
| 3.1.3 AD患者血管呈现活化的表型 |
| 3.1.4 AD患者CSF中血管生成相关因子相较于健康对照表达升高 |
| 3.2 患者CSF血管生成相关因子与AD病理标志物的关系 |
| 3.2.1 患者CSF血管生成相关因子在p-Tau阳性患者中增加 |
| 3.2.2 患者CSF多数血管生成相关因子在Aβ分类患者中无差别 |
| 3.2.3 患者CSF血管生成相关因子与Tau病理关系更密切 |
| 3.3 AD患者血管通透性增加 |
| 3.3.1 AD人脑组织样本中内皮细胞表面紧密连接蛋白表达降低 |
| 3.3.2 AD患者Qalb相较于健康对照提高、血管损伤加剧 |
| 3.3.3 血管损伤组患者Qalb显着高于健康对照 |
| 3.4 AD患者血管生成可能导致血管通透性增加 |
| 3.4.1 促血管生成转录因子与紧密连接蛋白表达呈负相关 |
| 3.4.2 脑出血患者血管生成相关因子表达增加 |
| 3.4.3 所有患者中CSF血管生成相关因子与Qalb呈显着正相关 |
| 3.4.4 AD患者CSF血管生成相关因子与Qalb回归系数相较于健康对照更高 |
| 3.5 患者CSF血管生成相关因子与生理指标的关系 |
| 3.5.1 CSF血管生成相关因子与生理指标的关系 |
| 3.5.2 其他生理指标间的关系 |
| 第4章 总结及讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录：Mini-review article |
| References |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
（9）视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究意义 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 视网膜血管的发育 |
| 1.2.2 视网膜血管生成异常眼病的治疗进展 |
| 1.2.3 小鼠模型在视网膜血管发育研究中的应用 |
| 1.2.4 家族性渗出性玻璃体视网膜病变的研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的结构安排 |
| 第二章 TMEM30A在视网膜血管生成中的功能研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验所需溶液的配制 |
| 2.2.3 人视网膜细胞的培养 |
| 2.2.4 人视网膜血管内皮细胞的感染 |
| 2.2.5 Trizol法提取细胞总RNA |
| 2.2.6 RNA的逆转录及实时定量PCR |
| 2.2.7 血管形成实验 |
| 2.2.8 细胞蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印记实验 |
| 2.2.10 实验小鼠模型的构建与诱导 |
| 2.2.11 实验小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.12 视网膜铺片的制备 |
| 2.2.13 视网膜铺片的免疫荧光染色 |
| 2.2.14 冰冻切片的制备 |
| 2.2.15 免疫组化染色 |
| 2.2.16 视网膜铺片增殖染色 |
| 2.2.17 小鼠组织蛋白提取 |
| 2.2.18 细胞凋亡检测 |
| 2.2.19 转录组测序分析 |
| 2.2.20 实时荧光定量PCR |
| 2.2.21 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 磷脂内翻酶及TMEM30A在血管内皮细胞中广泛表达 |
| 2.3.2 人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常 |
| 2.3.3 血管内皮细胞敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
| 2.3.4 全身敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
| 2.3.5 TMEM30A影响血管内皮细胞增殖与VEGF的信号传导 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 TWIST1在视网膜病理性血管生成中的功能研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验小鼠模型的构建与诱导 |
| 3.2.3 实验小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.4 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
| 3.2.5 人视网膜血管内皮细胞中TWIST1的过表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TWIST1 在正常血管内皮细胞中表达量较低 |
| 3.3.2 血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠视网膜表层血管发育异常 |
| 3.3.3 血管内皮细胞过表达Twist1促进血管内皮细胞增殖 |
| 3.3.4 血管内皮细胞过表达Twist1影响血管内皮细胞极性 |
| 3.3.5 血管内皮细胞过表达Twist1影响VEGF分泌 |
| 3.3.6 过表达TWIST1后Norrin/β-catenin信号通路活性上调 |
| 3.3.7 全身过表达Twist1的小鼠的视网膜血管发育异常 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 家族性渗出性玻璃体视网膜病变家系致病相关突变筛查 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 样本收集及伦理审查 |
| 4.2.3 外周血收集及DNA提取 |
| 4.2.4 全外显子测序 |
| 4.2.5 全外显子测序结果的生物信息学分析 |
| 4.2.6 致病基因筛选原则 |
| 4.2.7 Sanger测序验证筛选到的致病基因 |
| 4.2.8 点突变质粒的构建 |
| 4.2.9 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
| 4.2.10 人视网膜血管内皮细胞中DLG1的敲减 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 家族性渗出性玻璃体视网膜病变患者临床表型评估 |
| 4.3.2 家族性渗出性玻璃体视网膜病变致病基因筛选 |
| 4.3.3 S598G突变影响了DLG1功能的正常发挥 |
| 4.3.4 DLG1在人视网膜血管内皮细胞及小鼠各组织中广泛表达 |
| 4.3.5 敲减DLG1影响了血管内皮细胞的正常成管 |
| 4.3.6 敲减DLG1影响了VEGFR2的磷酸化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（10）基于DLL4/Notch1通路探讨麦粒灸促进薄型子宫内膜大鼠血管生成的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 薄型子宫内膜的古今研究 |
| 1.1 祖国医学对薄型子宫内膜的认识 |
| 1.2 薄型子宫内膜的现代研究 |
| 2. 针灸治疗薄型子宫内膜的研究进展 |
| 2.1 针刺疗法 |
| 2.2 艾灸疗法 |
| 2.3 温针灸疗法 |
| 2.4 针药结合疗法 |
| 2.5 其他针灸疗法 |
| 3. 血管生成与薄型子宫内膜 |
| 3.1 人子宫内膜的组成与功能 |
| 3.2 血管生成在子宫内膜生理性修复中的作用 |
| 3.3 血管生成对薄型子宫内膜的影响 |
| 3.4 血管生成相关调节因子与薄型子宫内膜 |
| 3.5 DLL4/Notch1信号通路与薄型子宫内膜 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1. 实验动物与材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 模型制备 |
| 2.2 分组方法 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 组织取材 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学法 |
| 2.7 Western blot法 |
| 2.8 RT-qPCR法 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 子宫内膜组织厚度、腺体及血管数 |
| 4.2 子宫内膜组织中VEGF及Ang-2表达量 |
| 4.3 子宫内膜组织中Notch1及DLL4表达量 |
| 第三部分 讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
四、内皮细胞生长因子与血管生成（论文参考文献）
- [1]水凝胶组织工程脂肪的血管化策略[J]. 吴姝涵,祝旭龙,白璐,张菲菲,蔺光帅,李江,杜嘉,李建辉. 中国组织工程研究, 2022(22)
- [2]人羊膜来源上皮细胞调节主动脉内皮细胞血管生成及其分子机制的探究[D]. 吴迪. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]替沃扎尼对脉冲染料激光诱导的血管再生的作用及机制初探[D]. 王冰. 吉林大学, 2021(01)
- [4]VEGFR2/mTOR/S6K1通路在洛克沙胂促血管生成中的作用[D]. 张蒙. 扬州大学, 2021(02)
- [5]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
- [6]c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响[D]. 谌程程. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [7]Ⅰ型胶原蛋白对ADSCs及EPCs体外增殖与分化的调控机制研究[D]. 刘家杰. 昆明医科大学, 2021
- [8]β分泌酶与血管病理在认知损伤相关疾病中的作用研究[D]. 刘一鸣. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [9]视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究[D]. 张珊珊. 电子科技大学, 2021(01)
- [10]基于DLL4/Notch1通路探讨麦粒灸促进薄型子宫内膜大鼠血管生成的机制[D]. 沈真如. 南京中医药大学, 2021(01)