一、壳聚糖及烷基化壳聚糖/DNA复合物介导的基因转染研究(论文文献综述)
陈琬雯[1](2020)在《基于硒活性的壳聚糖复合物的制备研究》文中进行了进一步梳理壳聚糖是自然界中来源广泛的碱性多糖,具有无毒性、良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性等特点,在食品、医药、生物、农业、材料等领域具有广阔的应用前景和实际应用价值。但是,其生物活性较弱,在很大程度上限制了壳聚糖的应用范围。通过复合其他活性纳米粒子或者利用化学改性引入特定的功能基团是提高壳聚糖生物活性并赋予其新的功能特性的有效手段。纳米硒和有机硒因具有较低的毒性、较高的生物利用率和生物活性而成为研究热点。然而,其稳定性差、极易被氧化等缺点限制了硒在食品、医药等领域的应用。目前,研究者们已经尝试利用多糖和硒结合制备稳定的多糖硒复合物,其可以提高多糖和硒的生物活性,但仍然存在制备能耗高、结构与功能关系不明确、接枝的硒含量较低等问题。基于此,本论文利用壳聚糖为稳定剂和还原剂制备壳聚糖纳米硒,探索壳聚糖及其衍生物的结构、相对分子质量以及还原性对壳聚糖纳米硒的稳定性和抗氧化活性的影响。同时利用化学改性制备壳聚糖有机硒,探讨亚硒酸钠和硒代二乙酸的引入对壳聚糖有机硒的硒含量和抗氧化活性的影响,并评价壳聚糖纳米硒和壳聚糖有机硒抑制肿瘤细胞增殖的能力和机制,旨在提高壳聚糖和硒的生物活性,同时克服两者的局限性。主要研究结果如下:1.利用壳聚糖和羧甲基壳聚糖为稳定剂成功制备粒径约为50 nm的均一、单分散的球形纳米硒。壳聚糖和羧甲基壳聚糖的功能化修饰使纳米硒表面的ζ-电位分别为+38.2mV和-40.7 mV,其均能提高纳米硒在水溶液中的稳定性和抗氧化活性。壳聚糖功能化纳米硒的抗氧化活性高于羧甲基壳聚糖功能化纳米硒。当浓度为0.6 mM时,壳聚糖功能化纳米硒的DPPH自由基清除率达到93.48%。2.利用相对分子质量分别为1.5×103、4.8×104和5.1×105的壳聚糖为稳定剂成功制备不同相对分子质量壳聚糖功能化纳米硒,其水合粒径和ζ-电位与壳聚糖相对分子质量呈正相关性。壳聚糖的相对分子质量越大,其与纳米硒表面的相互作用越强,经功能化修饰的纳米硒的稳定性越好。不同相对分子质量壳聚糖功能化纳米硒的抗氧化活性随着壳聚糖相对分子质量的增加而增强。3.利用壳聚糖作为还原剂和稳定剂,通过还原性羟基还原亚硒酸成功制备均一、单分散的球形纳米颗粒。通过调节反应温度为90℃、120℃和150℃,分别合成粒径大小约为80 nm、140 nm和210 nm的壳聚糖纳米硒,其表面的ζ-电位分别为+42.9 mV、+45.7mV和+46.1 mV。合成的壳聚糖纳米硒在水溶液中具有较高的稳定性,其抗氧化活性随着纳米硒粒径的减小而增强。4.利用壳聚糖C2位氨基的羧基化反应制备N-(2-羧乙基)壳聚糖,其不仅能增加硒化改性的反应位点,同时也提高了产物的溶解性,有利于下一步反应的进行。在此基础上,利用亚硒酸钠-稀硝酸体系将亚硒酸钠通过硒化反应引入C2位羧基和C6位羟基,成功制备N,O-硒化-N-(2-羧乙基)壳聚糖。当N-(2-羧乙基)壳聚糖和亚硒酸钠的反应摩尔比为1:3时,产物的硒含量达到1553μg/g。硒化改性能显着增强N-(2-羧乙基)壳聚糖的抗氧化活性,其抗氧化活性随着硒的取代度的增加而增强。5.利用壳聚糖为原料,通过甲烷磺酸保护壳聚糖C2位氨基,利用酰化反应将硒代二乙酰氯引入壳聚糖C6位羟基,然后脱除保护基团成功制备O-硒代二乙酯壳聚糖。同时利用壳聚糖的氨基和硒代二乙酸的羧基的静电作用成功制备N-硒代二乙酸壳聚糖。O-硒代二乙酯壳聚糖和N-硒代二乙酸壳聚糖的硒含量分别为15720μg/g和26363μg/g。壳聚糖和硒代二乙酸的共价和非共价结合均能显着增强壳聚糖的抗氧化活性,其中,O-硒代二乙酯壳聚糖的抗氧化活性高于N-硒代二乙酸壳聚糖。6.体外抗肿瘤活性结果表明壳聚糖纳米硒和壳聚糖有机硒均能明显抑制HepG2人肝癌细胞和MCF-7人乳腺癌细胞的增殖,其抗肿瘤活性的大小为壳聚糖功能化纳米硒>O-硒代二乙酯壳聚糖>N-硒代二乙酸壳聚糖。细胞对壳聚糖纳米硒的吸收显着高于壳聚糖有机硒,壳聚糖氨基的保护能有效地增强细胞对O-硒代二乙酯壳聚糖的吸收。壳聚糖纳米硒和壳聚糖有机硒均能通过诱导细胞周期阻滞、染色体浓缩、线粒体跨膜电位的降低和caspase-3活性的升高诱导肿瘤细胞凋亡。在本论文中,通过壳聚糖与硒结合成功构建了具有高稳定性的壳聚糖纳米硒和高硒含量的壳聚糖有机硒,显着增强壳聚糖和硒的抗氧化活性,而且合成的壳聚糖纳米硒和壳聚糖有机硒具有良好的抗肿瘤活性。本研究不仅为壳聚糖高附加值产品的开发提供理论支持,还为拓宽壳聚糖和硒在食品和医药等领域的实际应用提供科学依据。
谢娟[2](2019)在《可注射壳聚糖缓释基因载体的构建及在骨缺损修复中的实验研究》文中认为由外伤、肿瘤、感染等疾病因素造成的骨缺损在临床工作者日益多见,严重影响患者的身心健康和生活质量。目前临床首选的治疗方案仍是自体骨或异体骨移植,但存在来源有限,供体损伤,免疫排斥等问题,因此近年来国内外成骨研究的热点逐步转变成了基因治疗及组织工程骨的研究。生理状态下骨缺损修复成骨量不足的主要原因之一是,随时间的推移诱导成骨的细胞因子缺乏。将外源性蛋白生长因子直接补给于骨缺损处,都存在半衰期短、易被体液稀释、剂量不易控制、代价较高等缺陷,因而限制了其应用,基因治疗为此提供了一种新的有效的解决办法。骨缺损的基因治疗时如何使各种介入的生长因子能够适量、适寸、稳定的表达和释放,是基因治疗研究中的难点,这涉及选择合适的基因载体。目前的文献报道中,运用病毒或脂质体作为基因治疗的载体,其主要的优势在于转染率较高。不过病毒类载体也存在着免疫原性、潜在致病性等缺陷问题;而非病毒基因载体中,常用的脂质体尽管可以获得较高转染率,但同时具有细胞毒性,且转染受血清抑制,因而不适宜用于体内治疗。实际上生理性成骨需要2-3月的时间,是以骨形成蛋白为主的多种细胞因子参与的复杂过程,目前实验研究报道的大多数基因载体(除部分可整合入宿主DNA的病毒载体外),其转染细胞后表达时效只能维持1-2周左右,不能满足生理性成骨时效要求(2-3月)。因此如何研发一种生物相容性好,具有基因缓释表达释放的基因载体是基因工程未来用于骨缺损临床工作所需要克服的技术难题。近年来,可注射式水凝胶在骨缺损中的应用研究,逐渐成为组织再生医学中的研究热点。主要优点是可通过微创注射方式使用,损伤小,操作简单,水凝胶对不规则的组织的充填更加精确。目前报道的水凝胶主要作为支架材料用于骨缺损的修复,而作为基因载体的水凝胶报道较少,如果将基因载体也制备成水凝胶形式,既可单独使用,亦或和水凝胶型的支架材料混合使用,发挥可注射治疗的优势,更加符合整形外科微创治疗的原则,在日后的临床治疗中有很广阔的应用前景。针对上述问题,我们选择非病毒载体壳聚糖作为研究对象,希望构建出可注射的,缓释基因载体以满足骨缺损修复的要求。壳聚糖作为非病毒载体中的阳离子多糖,具有天然可降解的生物活性,使其治疗安全性得到有效保障。作为基因载体的主要缺点是转染效率不高,但由于其含有活性基团氨基,利用分子链的官能团改性、配体修饰等方法,可以合成多种具有不同性能的壳聚糖衍生物,充分扩展了壳聚糖的应用范围。课题组的前期试验已证实通过对壳聚糖的烷基化巯基化改性可合成巯基烷基化壳聚糖(TACS),其转染效率较普通壳聚糖有明显的提升,在此基础上,为适应骨缺损治疗需要,增强其基因缓释表达的效果,我们在构建的TACS/pDNA复合粒子的外层包裹枝节聚乙二醇(PEG)的羟丁基壳聚糖(HBC),形成新型基因载体TACS@EG-HBC/pDNA复合粒子。羟丁基壳聚糖,独特的温敏特性使其可在37℃下变成凝胶状态,这为复合粒子作为可注射剂型使用奠定理论的基础。枝节PEG的目的是增加整个材料的水溶性、稳定性,进一步提高转染的效率。由于包裹了EH-HBC的外层结构,理论上TACS@EG-HBC/pDNA复合粒子在转染细胞后的降解、基因的表达及维持效果更长,更符合骨缺损修复基因治疗的缓释要求。为验证以上假设我们选择融合标记基因绿色荧光蛋白(EGFP)的骨形成蛋白BMP4质粒(pBMP4-EGFP),分别构建TACS/pBMP4-EGFP及TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子。检测两种复合粒子对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(BMSC)转染效果、成骨性能的影响,在小鼠肌肉内的缓释表达以及作为可注射式水凝胶对兔桡骨缺损的修复效果,为临床骨缺损治疗提供一种新的思路。实验一可注射壳聚糖缓释基因载体的构建、表征及温敏性能的鉴定目的:完成对壳聚糖的改性,合成巯基烷基化壳聚糖(TACS)以及枝节聚乙二醇的羟丁基壳聚糖(EG-HBC),利用TACS负载基因质粒,外包裹EG-HBC构建一种新型的可注射的基因载缓释系统。对其完成表征及温敏凝胶性能的鉴定。方法:(1)通过改性壳聚糖化学合成TACS、EG-HBC,傅里叶红外光谱鉴定合成结果,测定EG-HBC对PH值及温度响应性,及随温度改变粘滞度的变化,鉴定其温敏凝胶特性。(2)融合EGFP标记基因的质粒pBMP4-EGFP与TACS以复凝方式相结合形成TACS/pBMP4-EGFP,再通过EG-HBC物理沉降于其外层,合成TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP。利用动态光散射仪器、透射电镜对两种纳米复合粒子进行表征,凝胶电泳检测两种纳米复合粒子对基因质粒的携载以及保护作用。结果:(1)傅里叶红外光谱提示与CS相比,TACS存在(-CH3)基团,HBC存在(-OH)基团,EG-HBC里存在-CH2基团及酰胺键,证实TACS、HBC及EG-HBC的合成是成功的。(2)EG-HBC溶液在PH值从6.0升至6.5及7.0时,溶液也明显由清澈变浑浊絮状析出状,温度从25℃升到37℃时溶液呈凝胶状态。溶液粘度随温度改变从125.6 mPa·s(20℃)可升至157.5 mPa·s(50℃)。(3)取N/P比20的情况下制备的TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子多呈球形,粒径为192.6±16.11nm。TACS/pBMP4-EGFP复合粒子表面zeta电势为24.79±1.3mv,而TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子的zeta电势为-21.65±1.1mv。凝胶电泳实验证明TACS/pBMP4-EGFP与TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP两种复合粒子,均可保护质粒不被DNA酶降解,通过肝素的解离实验证明,经TACS/pBMP4-EGFP释放出的质粒维持原来的稳定性。体外缓释实验证明TACS/pBMP4-EGFP复合粒子5天释放量达80%,而TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子30天的释放量为37.8%,证实TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子基因质粒缓释效果更好,而在溶菌酶存在时,两种复合粒子均在3天内释放基因质粒80%,说明改性壳聚糖仍可被溶菌酶降解,生物安全性好。结论:本章节实验对壳聚糖的改性是成功的,成功制备TACS和EG-HBC。EG-HBC显示了良好的温敏和PH值响应性,在37℃时可出现凝胶化变性。最终合成的基因载体TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子,与TACS/pBMP4-EGFP复合粒子都显示出对基因载体较好的保护作用和粒子稳定性。但对携载基因的体外缓释效果,TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子缓释效果更明显。实验二可注射壳聚糖缓释载体介导BMP4-EGPF基因转染兔BMSC基因缓释,成骨性能影响及体内缓释的实验研究目的:探讨TACS/pBMP4-EGFP以及TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP两种复合粒子,作为缓释基因载体,转染兔BMSC的转染效率,基因缓释表达效果,及对其成骨诱导分化的影响。以小鼠骨骼肌内注射进行体内转染,探讨注射后两种基因载体复合粒子体内缓释表达效果。方法:(1)体外培养兔BMSC,流式细胞仪检测及成骨、成脂诱导,鉴定其干细胞特性。(2)采用两种基因载体复合粒子TACS/pBMP4-EGFP以及TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP转染兔BMSC,以脂质体2000做阳性对照,流式细胞仪及荧光显微镜下测试其EGFP基因转染效率与缓释表达的情况。免疫印迹实验(Weston Blot)及酶联免疫吸附测定(ELISA)比较TACS组和TACS@EG-HBC组BMP4的缓释表达情况。(3)未转染组作对照,碱性磷酸酶染色及活性测定、茜素红染色,比较采用两种复合粒子转染后的BMSC经体外成骨诱导,成骨性能的影响。(4)通过激光共聚焦显微镜观察TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP注射于小鼠骨骼肌内,基因缓释表达效果。结果:(1)通过梯度离心法提取培养的兔BMSC,长梭形,呈旋涡状生长,5-7天传代一次。P3代兔BMSC阳性表达CD44(96.6%)、CD90(98.9%),阴性表达CD45(0.21%)、CD34(0.06%),成脂诱导油红染色可见红色脂滴,成骨诱导后可见Vocanssa染色的黑褐色结节。(2)体外细胞转染实验,经流式细胞仪测定,TACS/pBMP4-EGFP对BMSC转染率在转染后3天、7天、14天分别是24.8±5.1%、31.1±3.3%和34.5±4.6%,TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP对应时间的转染率分别是5.9±2.4%、17.5±3.9%和35.3±4.2%。荧光显微镜下观察结果基本与其一致。Weston Blot及ELISA实验测试两种复合粒子转染后的BMSC均可表达BMP4,而TACS@EG-HBC组的缓释表达作用更强。(3)对成骨诱导的影响以未转染组细胞为对照,三组细胞经成骨诱导后,14天时TACS@EG-HBC组较TACS组及未转染组的ALP磷酸酶活性更强,21天茜素红染色的钙结节更加明显。(4)激光共聚焦显微镜可观察到TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP注射于小鼠骨骼肌内,基因缓释表达效果可维持12周。结论:两种基因载体复合粒子均可转染BMSC使其缓释表达EGFP和BMP4,与TACS/pBMP4-EGFP复合粒子相比,TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP显示出更好的基因缓释表达效果,转染后的BMSC具有更好成骨诱导能力。小鼠的肌肉内注射可证实TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP在体内基因缓释表达可持续到12周。实验三携载BMP4-EGFP的可注射型壳聚糖缓释基因复合粒子对骨缺损修复的实验研究目的:进一步探讨携载pBMP4-EGFP基因的两种改性壳聚糖复合粒子,修复兔桡骨缺损时的体内成骨效果,及质粒在骨缺损处缓释表达情况。方法:将24只新西兰白兔分随机分三组,均构建双前肢18mm完全性骨缺损模型,于模型建立后7天,予骨缺损局部分别注射含80ug质粒pBMP4-EGFP的TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP复合粒子混悬液或TACS/pBMP4-EGFP复合粒子混悬液,空白对照组不做任何处理。术后2、4、8、12周处死实验动物,行缺损处大体标本,X摄片,Lane-SandhuX线评分以及新生骨组织HE染色了解骨缺损修复情况。12周对已对合修复缺损的骨组织行生物力学测试评价其承重能力。新生骨组织BMP4免疫组化了解基因在体内的转染缓释表达情况。结果:所有试验动物均存活良好,大体组织学检查,空白组自4周开始有少量新骨生长,至第12周仍存在较大缺损,新骨生成缓慢。TACS组和TACS@EG-HBC组从2周即可观察到骨缺损断端出现不规则骨痂,后期随时间推移,TASC@EG-HBC组的新骨生成较TACS组快,至12周时TACS@EG-HBC组4个标本,桡骨基本对接修复完全,但生物力学检测,较正常桡骨强度弱,差异有统计学意义(n=4 P<0.05)。X线摄片修复效果评价与大体标本一致。Lane-SandhuX线评分,显示4,8,12周不同组别间的分值比较具有统计学差别,TACS@EG-HBC组在8,12周两个时间点分值均高于其他两组,且差别具有统计学意义(P<0.05 n=4)。新骨生成处HE染色12周时,空白对照组有骨小梁结构但骨皮质结构不明显。TACS组板层骨不成熟。TACS@EG-HBC组骨小梁连接成片,可见大量板层骨形成,骨质致密,皮髓质界限清晰。免疫组化提示在12周时TACS@EG-HBC组新生骨组织内仍可观察到零散部分的少量BMP4阳性细胞,因此较TACS组缓释表达作用更强。结论:前期构建的TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP在骨缺损治疗中,发挥了较好基因缓释载体的功能,增强了新骨生成的效果。经局部注射后,以12周为观察节点时,局部转染含80ug质粒的TACS@EG-HBC/p BMP4-EGFP复合粒子,可使骨缺损局部完成对合生长。
叶慧[3](2017)在《两亲性N-烷基化-O-季铵盐化壳聚糖制备及其作为药物/基因载体的研究》文中研究指明以鱿鱼软骨甲壳素(β-甲壳素)为起始原料,与3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CTA)反应,制取中间体O-季铵盐化甲壳素;O-季铵盐化甲壳素经经浓碱脱乙酰制备脱乙酰度(DD)为100%的O-季铵盐化壳聚糖;O-季铵盐化壳聚糖与癸醛发生希夫碱反应后用硼氢化钠还原得到N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖。通过莫尔滴定法、元素分析、FTIR、1H NMR等表征中间体O-季铵盐化甲壳素、O-季铵盐化壳聚糖及终产物N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的结构,TGA表征N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的热性能。探究O-季铵盐化甲壳素、O-季铵盐化壳聚糖、N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的制备条件。初步开展N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖作为药物载体和基因载体的应用研究。采用β-甲壳素与CTA反应制备O-季铵盐化甲壳素,通过研究反应温度、物料比(β-甲壳素与CTA的摩尔比)和碱种类(Li OH、Na OH、KOH)对产物季铵盐取代度(DSQ)的影响,发现采用质量百分比浓度为40%的KOH溶液碱化,在反应温度为60℃、物料比为1:7时,O-季铵盐化甲壳素DSQ最高,为104%。通过3次浓碱脱乙酰反应,制备了DD为100%的O-季铵盐化壳聚糖,每次反应温度为50℃、Na OH质量百分比浓度为34%、反应时间为1 h。采用癸醛对O-季铵盐化壳聚糖进行癸烷反应制备N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖。通过正交实验发现,癸醛的用量对产物烷基化程度(DSA)的影响最大,反应温度次之,反应时间影响最小。N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的DSA随癸醛的用量增加先急剧增加后趋于平缓;随反应温度的升高,产物DSA先增大最后达到平衡;随反应时间增加,产物DSA先增加再趋于平缓;与传统加热方式相比,微波加热反应时间短、操作简便。70℃下,癸醛与O-季铵盐化壳聚糖的物料比为6:1,微波加热反应30 min,产物DSA可达到85%。N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的热分解温度高于121℃,适用于高温湿热灭菌。开展N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖包封与释放扑热息痛(PCTM)和维生素B12的试验研究。结果表明:药物包封率随药物投放量先增加而增大;当药物与N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的投料比率为3:5,达到了载药微球的载药极限。随N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖DSA的增加,PCTM和维生素B12载药量与包封率均增加;DSA为67%的N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖,其对PCTM的载药量达到51%,包封率为83%,其对维生素B12的载药量达到47%,包封率为80%。空白N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖微粒的粒径为200350 nm,而包封维生素B12后大部分载药微粒的粒径增加至300700 nm,表明虽然有少量疏水药物分子聚集在载体外部,但是大多数药物分子基本被疏水作用包封在载体内部。PCTM和维生素B12在磷酸盐缓冲溶液中的释放共分三阶段,2 h内为突释阶段,药物迅速释放,这可能源自载药微粒外部的疏水药物分子聚集体,DSA为21%的载体所制备载药微粒药物释放量分别为53%和67%,DSA为63%的载体所制备载药微粒药物释放量为35%和43%;26 h为缓释阶段,药物均速释放;69 h为平释阶段,10 h时药物释放完全。DSA为62%载体所制备的载PCTM微粒药物释放动力学符合Logistic和Weibull模型,为S型释放。开展N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的细胞毒性测试和作为p EGFP基因载体转染人胚肾细胞HEK 293的试验研究。结果表明:DSQ为12%和DSQ为55%的胞存活率分别为63%和51%,而PEI在200μg/m L时细胞全部死亡,表明N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的细胞毒性低于PEI。壳聚糖的季铵盐化可以提高壳聚糖的正电性,增加与DNA和细胞膜的相互作用,但当N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的DSQ大于36%时,强正电性会限制DNA的解吸附,降低转染效果。DSQ为36%的N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖与DNA在N:P为8:1时,转染效率最好;N:P为20:1时转染效率较低。在N:P为8:1时,非病毒载体的标准对照PEI(25KDa)转染HEK 293细胞的荧光强度为1.0×107 RLU/mg protein,Lipofectamine 2000为1.0×1011 RLU/mg protein,而DSQ为36%的N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖为1.8×108 RLU/mg protein,优于PEI,但是低于Lipofectamine 2000。N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖有望成为新型的非病毒基因载体。
钱嫦云[4](2012)在《壳聚糖季磷盐的合成及其用作非病毒基因载体的评价》文中提出作为一种全新的疾病治疗手段,基因治疗为恶性肿瘤、自身免疫系统疾病、感染性疾病等临床难题提供了新的解决途径。然而,缺乏安全高效的基因输送载体极大地制约了基因治疗的应用。壳聚糖生物相容性好但水溶性差,基因转染效率低,在基因载体的应用上受到限制。本论文中,通过对壳聚糖进行化学改性制备了新型的壳聚糖衍生物基因载体,即季磷盐修饰的壳聚糖(NPCS),探讨其与DNA之间的相互作用以及其基因转染性能。首先用化学合成的方法将小分子磷盐接枝到壳聚糖分子链上,并考察了壳聚糖季磷盐的溶解性能。红外光谱(FT-IR)与核磁共振氢谱(1H-NMR)结果表明,磷盐成功地接枝到壳聚糖上,并得到两种不同取代度的NPCS。与壳聚糖相比,NPCS的溶解性提高,稀溶液的pH稳定性增加。利用静电吸附,制备了NPCS载基因复合物并对其进行了表征。研究发现,NPCS/DNA复合物粒径大小在120-200nm之间,表面带有正电荷。MTT实验考察了NPCS材料的细胞毒性,结果表明NPCS细胞毒性比壳聚糖大,但比PEI低。以编码绿色荧光蛋白的质粒DNA为报告基因考察了NPCS对于HEK293和HeLa细胞的基因转染效率。与壳聚糖相比,NPCS的基因转染效率显着提高。取代度为21.5%的NPCS在pH6.5的条件下,对HeLa细胞的转染效率与PEI相当。为提高复合物在体内的稳定性,使用单甲氧基聚乙二醇(MPEG)对NPCS进行了修饰,合成了PEG-NPCS。FT-IR与1H-NMR结果证实MPEG成功地接枝到了NPCS分子链上。MTT实验结果表明,PEG-NPCS对于HeLa细胞的细胞毒性比NPCS低。粒径与Zeta电位测量结果显示,PEG-NPCS与DNA形成的复合物大小在145nm左右,表面带有正电荷,并且在72h内维持稳定。
王冰清[5](2011)在《用于提高体内外基因转染功效的亚油酸和聚苹果酸双接枝壳聚糖新型纳米载体》文中研究表明外源基因实现治疗潜能需合适的递送载体。壳聚糖生物相容、生物可降解,在基因递送中显示巨大的潜力,但壳聚糖/pDNA纳米复合物转染效率低,需功能化修饰,以克服基因递送屏障。亚油酸和聚苹果酸双接枝壳聚糖(LMC)聚合物是疏水性亚油酸和亲水性聚苹果酸修饰壳聚糖而成的两亲性壳聚糖衍生物,水中可自组装形成LMC纳米粒。结合亲水修饰和疏水修饰的特性,可用作基因的高效递送载体。合成不同亚油酸和聚苹果酸接枝比的LMC纳米粒,包载表达绿色荧光蛋白的模式质粒pEGFP,制备LMC/pEGFP纳米复合物,考察LMC亲水修饰和疏水修饰与LMC/pEGFP纳米复合物的构效关系,研究纳米复合物体内外转染效率。1LMC纳米粒合成与表征选择合适投料比合成不同亚油酸和聚苹果酸接枝比的LMC(LMC1、LMC2、LMC3和LMC4)纳米粒,分别测定接枝比、细胞毒性、接触角、粒径和Zeta电势。LMC1、LMC2、LMC3和LMC4纳米粒的亚油酸接枝比分别为23.3%、46.6%、70.0%和73.3%,聚苹果酸接枝比分别为3%、3%、3%和7%;LMC纳米粒粒径为150-300 nm; pH 5.5时Zeta电势为32.9-50.9 mV,有利于结合荷负电pEGFP;浓度低于1 mg/mL时,LMC纳米粒无细胞毒性,安全性良好。2 LMC/pEGFP纳米复合物制备和表征pH 5.5时LMC纳米粒经静电作用缩合pEGFP,形成LMC/pEGFP纳米复合物,包封率大于85%,pEGFP结合能力与壳聚糖基本相当。LMC/pEGFP纳米复合物为球形,粒径随质量比增加而增大,均略小于空白LMC纳米粒。LMC/pEGFP纳米复合物抗非特异性蛋白吸附能力与pEGFP释放速率随亚油酸和聚苹果酸接枝比增加而提高,均显着高于壳聚糖/pEGFP纳米复合物。LMC/pEGFP纳米复合物抗酶解能力随亚油酸接枝比增加而提高,但随聚苹果酸接枝比增加而降低,除LMC4/pEGFP纳米复合物外,LMC/pEGFP纳米复合物抗酶解能力均显着高于壳聚糖/pEGFP纳米复合物。3 LMC/pEGFP纳米复合物的细胞黏附、细胞摄取、摄取机制和核质分布研究了LMC/pEGFP纳米复合物的细胞黏附、细胞摄取、摄取机制和核质分布百分率,结果表明LMC/pEGFP纳米复合物的细胞黏附率和细胞摄取率较壳聚糖/pEGFP纳米复合物分别高0.8-3.8和1.7-3.2倍,且随亚油酸接枝比增加而增加及随聚苹果酸接枝比增加而降低。LMC3/pEGFP纳米复合物主要经能量依赖的、网格蛋白介导的内吞途径入胞,与细胞骨架重构和小窝蛋白介导的途径无关。LMC/pEGFP纳米复合物的细胞核质粒分布百分率随亚油酸接枝比增加而增加,但LMC3/pEGFP与LMC4/pEGFP纳米复合物的细胞核质粒分布百分率无显着差异。4 LMC/pEGFP纳米复合物的体内外转染效率考察LMC/pEGFP纳米复合物转染HEK293细胞的效率,并研究质量比、血清和转染时间对转染效率的影响。结果表明LMC3/pEGFP纳米复合物转染效率最高,质量比为12:1时达34.5%,较壳聚糖/pEGFP纳米复合物高8.0倍;LMC3/pEGFP纳米复合物血清相容性良好,在含血清培养基中转染效率显着增加;转染效率随转染时间延长而增加,72 h时为40.8%,分别为24 h和48 h的2.1和1.4倍。小鼠胫前肌注射LMC3/pEGFP纳米复合物测定其体内转染效率,结果表明LMC3/pEGFP纳米复合物绿色荧光蛋白表达量最高(36.6±10.7 I/mg),分别为聚乙烯亚胺(PEI)/pEGFP纳米复合物和壳聚糖/pEGFP纳米复合物的2.2倍和4.2倍。
刘决照,辛梅华,李明春[6](2010)在《壳聚糖基非病毒基因载体研究新进展》文中研究指明壳聚糖是自然界中广泛存在的天然阳离子多糖,生物相容性和生物降解性能好、安全无毒,作为非病毒基因载体具有潜在的应用价值,但壳聚糖溶解性差、靶向性弱和转染率低等缺点限制了其应用。针对这些缺点,研究者对壳聚糖进行修饰改性,制备了一系列壳聚糖衍生物作为基因载体。本文就近年来改性壳聚糖衍生物用作非病毒基因载体的研究结果作简要综述,重点介绍其细胞毒性和转染能力。
殷黎晨[7](2010)在《用于改善生物大分子药物功效的超多孔水凝胶、纳米粒新型给药载体》文中指出随着科学技术的迅猛发展,以往单一学科及其技术难以解决的关键科学问题经多学科交叉及技术的使用获得突破。本文运用生物科学、材料科学、纳米科学及药剂学等学科的理论和方法,研究可显着改善蛋白质多肽类药物及DNA、siRNA功效的新型给药载体及其作用机理。蛋白质多肽、核酸等生物大分子药物药理活性强、特异性高,在肿瘤、糖尿病、感染性疾病等重大疾病的治疗中显示出巨大潜力,但其临床应用主要为注射剂型,多数药物半衰期短,长期用药患者顺应性差。而非注射给药特别是口服给药时,此类亲水性生物大分子药物不易被亲脂性的生物膜摄取,易被体内各种酶降解导致活性降低或失活,生物利用度低。利用给药系统(Drug Delivery System, DDS)可提高生物大分子药物的体内外稳定性、促进药物吸收、改善药物体内作用功效。其中水凝胶给药载体还可控制药物释放,具有生物黏附、生物相容和生物可降解等特性;纳米给药载体还可增溶难溶性药物,缓控释药物和靶向给药。同时具有抑制蛋白酶活性、促进药物渗透及黏膜黏附等性质的多功能聚合物给药载体可显着提高蛋白质多肽类药物的口服吸收,能有效突破胞外屏障(吞噬系统、核酸酶)和胞内屏障(细胞膜、内涵体、溶酶体、核膜)的多功能非病毒基因载体有望持续、高效地将基因导入靶细胞和靶组织。据此,设计并研究新型互穿网络聚合物超多孔水凝胶(SPH-IPN),以胰岛素为模型药物,研究SPH-IPN促进蛋白质多肽类药物的口服吸收及作用机理;依据壳聚糖季胺盐(TMC)与巯基化聚合物黏膜黏附及促渗特点,设计一种新型壳聚糖多功能衍生物—巯基化壳聚糖季胺盐(TMC-Cys),以胰岛素和pEGFP分别作为模型蛋白质药物和模型基因,研究其自组装纳米载体促进蛋白质药物口服吸收、基因转染及其作用机理:对TMC-Cys纳米载体进行甘露糖配体修饰,以TNF-αsiRNA为靶基因,研究甘露糖修饰的TMC-Cys (MTC)纳米载体对小肠M细胞、巨噬细胞的主动靶向作用及增加siRNA口服给药功效与作用机理。以丙烯酸(AA)和丙烯酰胺(AM)为单体,过硫酸铵(APS)/N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)为引发体系,NaHCO3为起泡剂,N,N’-亚甲基-双丙烯酰胺(Bis)为交联剂,溶液聚合制得聚(丙烯酸-丙烯酰胺)(P(AA-co-AM))超多孔水凝胶;采用分步互穿网络聚合物技术,聚合时加入O-羧甲基壳聚糖(O-CMC),胶凝后以戊二醛(GA)交联O-CMC,制得SPH-IPN。傅立叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振(13C NMR)、差示扫描量热分析(DSC)等研究表明SPH-IPN中含有P(AA-co-AM)和交联的O-CMC;扫描电镜(SEM)、光镜、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察表明SPH-IPN含有大量相互连接、直径100-300μm的孔隙,O-CMC围绕孔隙边缘分布。SPH-IPN孔隙率大于80%,水中可快速溶胀,平衡溶胀比30-80,SPH-IPN的溶胀比随O-CMC含量增加、交联度增加、交联时间延长而降低。引入互穿网络聚合物(IPN)结构可显着提高SPH-IPN的压缩模量和拉伸模量;压缩模量和拉伸模量均随O-CMC含量增加而显着提高;压缩模量随O-CMC交联度增加、交联时间延长而显着提高。考察pH、离子强度和温度对SPH-IPN溶胀行为的影响;以胰岛素为模型药物,研究SPH-IPN的载药量、载胰岛素SPH-IPN在不同介质中的体外释放行为、载药前后胰岛素的稳定性及聚合物-药物相互作用;研究SPH-IPN中水的状态及保水性。研究表明,SPH-IPN的溶胀具有离子强度、pH和温度敏感性。离子强度≥0.01mol·L-1时,SPH-IPN的溶胀比随离子强度增大而减小;离子强度<0.001mol·L-1时,溶胀不受影响。pH≤3.0时SPH-IPN几乎不溶胀;3.0≤pH≤6.2时随pH升高溶胀速率加快,溶胀比增大;pH≥6.2时溶胀充分,溶胀行为无显着改变;SPH-IPN对脉冲式pH改变可快速响应,呈现可逆的溶胀-去溶胀行为。温度升高可促进SPH-IPN的溶胀。SPH-IPN对胰岛素吸附载药的载药量为4%-7%,显着高于传统超多孔水凝胶(CSPH);载药量随O-CMC含量增加而略有降低。胰岛素体外释放对离子强度、pH和温度敏感。圆二色谱分析和生物活性检测结果表明载药前后胰岛素的构象和生物活性无显着变化。SPH-IPN对胰岛素的实际载药率显着高于理论载药率,pH 7.4 PBS介质中药物可快速、完全释放,空白SPH-IPN和释药后SPH-IPN的FTIR图谱相似,表明SPH-IPN与胰岛素间存在较强的物理相互作用,不存在化学共价连接。溶胀的SPH-IPN中可冻结水占主要部分;SPH-IPN与水分子形成氢键的作用随O-CMC含量和胰岛素载药量增加而减弱。外加压力与37℃孵育时,SPH-IPN保水性较好,保水性随O-CMC含量增加而提高。考察载胰岛素SPH-IPN正常大鼠口服给药和回肠给药的生物利用度,以及糖尿病模型大鼠口服给药降血糖效果;从黏膜黏附、蛋白酶抑制、渗透促进、小肠滞留等方面探讨SPH-IPN促胰岛素肠道吸收机理;考察聚合物结构完整性对SPH-IPN抑酶、促渗、小肠滞留及胰岛素口服吸收的影响。正常大鼠口服载胰岛素完整的SPH-IPN (I-SPH-IPN)后药物吸收和降血糖效果显着,血糖最低降至初始值的65%,相对皮下注射的口服生物利用度为5.0%,药理生物利用度为6.3%;口服载胰岛素粉碎的SPH-IPN (P-SPH-IPN)后药物吸收和降血糖效果均不明显;回肠给予载胰岛素I-SPH-IPN和P-SPH-IPN时,药物吸收和降血糖效果显着,血糖最低降至初始值的30%,二者效果相当,均优于口服给药;糖尿病模型大鼠口服载胰岛素I-SPH-IPN后降血糖效果显着。SPH-IPN可通过非特异性作用和机械作用黏附至小肠黏膜,黏附力随O-CMC含量增加而增大。SPH-IPN可通过捕获蛋白酶溶液和络合Ca2+抑制肠腔蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶)活性,且SPH-IPN络合二价金属离子的能力随O-CMC含量增加而增强,抑酶作用相应增强。I-SPH-IPN和P-SPH-IPN的体外抑酶作用相当,I-SPH-IPN可减少药物在肠腔中的释放,增加黏液层和黏膜中的释放,从而降低肠腔蛋白酶对药物的降解,I-SPH-IPN对胰岛素的保护作用强于P-SPH-IPN。SPH-IPN通过机械作用可逆打开小肠上皮细胞间紧密连接,促进胰岛素的胞间转运;加入I-SPH-IPN和P-SPH-IPN, Caco-2细胞单层的跨膜电阻最低分别降至初始值的25%和50%,FITC-胰岛素在Caco-2细胞单层中的转运量分别提高至未加聚合物的4.9和1.9倍,离体小肠中的Papp分别提高至4.2和1.8倍,表明I-SPH-IPN打开上皮细胞间紧密连接和促胰岛素渗透的能力强于P-SPH-IPN。I-SPH-IPN通过机械作用固定于大鼠小肠壁,小肠滞留时间超过8h;P-SPH-IPN在小肠中易分散,无法通过机械作用固定于肠壁,滞留时间短于4h。考察SPH-IPN的细胞毒性、基因(遗传)毒性、小肠组织相容性、口服急性、亚急性毒性和血液相容性,从整体动物、组织、细胞和分子水平评价SPH-IPN的安全性;HPLC测定SPH-IPN中单体和交联剂的残留量,为生物相容性评价提供依据。FDA/PI双染色、LDH、中性红、蛋白质含量测定试验结果表明RBL-2H3和Caco-2细胞与SPH-IPN及其浸提液(10、1、0.1 mg·mL-1)短时程(24h)接触后,胞外LDH释放量、胞内中性红摄入量、蛋白质含量均无显着变化,细胞活力无显着影响;MTT试验结果表明二种细胞与SPH-IPN及其浸提液长时程(7d)接触后,细胞增殖率无显着影响,SPH-IPN细胞毒性低。DNA Ladder、流式细胞仪检测、单细胞凝胶电泳和小鼠骨髓微核试验结果表明SPH-IPN不会引起RBL-2H3和Caco-2细胞凋亡、DNA断裂和小鼠骨髓微核发生,基因毒性低。SPH-IPN不会引起大鼠小肠黏膜组织损伤,组织相容性良好。SPH-IPN浸提液小鼠灌胃给药最大耐受剂量为1000 mg·kg-1;亚急性毒性试验中连续28天每天一次灌胃给予SPH-IPN浸提液(500、200、100mg·kg-1),小鼠体重增长正常,血液学和血清生化指标正常,肝、肾、脾重量正常,组织切片中未见炎症、坏死、水肿等病理现象,肝、肾、脾中ACP、ALKP、GPT、GOT和LPO含量正常,表明SPH-IPN口服安全性好。SPH-IPN的溶血率低于5%,动态凝血率低于硅化玻璃,血小板黏附率低,具有一定的抗凝血效果,血液相容性良好。SPH-IPN中AA、AM和GA的残留量分别为1.4±0.6、2.0±0.2、<0.2 ppm,符合其限量规定。壳聚糖经季胺化和巯基化修饰制备TMC-Cys,表征理化性质:聚电解质(PEC)法制备TMC-Cys/胰岛素自组装纳米粒(TMC-Cys NP)并表征理化性质;考察TMC-Cys NP正常大鼠口服给药和回肠给药的降血糖效果,研究TMC-Cys NP促胰岛素口服吸收机理。壳聚糖(Mw 30、200、500 kDa)与碘甲烷反应合成季胺化度分别为15%和30%的TMC,TMC与Cys经EDAC/NHS催化的缩合反应合成TMC-Cys。400-500μmol·g-1 Cys共价连接至TMC,其中约35%为游离巯基,其余为二硫键;游离巯基在中性条件下可氧化形成二硫键。FTIR和13C NMR表明TMC与Cys以酰胺键连接,DSC和TGA结果表明季胺化和巯基化修饰可改变壳聚糖的结晶度,降低其热稳定性。TMC-Cys的抑菌作用与TMC相近,清除自由基作用强于TMC,季胺化度较高时抑菌作用较强,清除自由基能力减弱。荷正电的TMC-Cys与荷负电的胰岛素经静电作用自组装形成TMC-Cys NP,纳米粒呈球形,分散度良好,粒径为100-170 nm,Zeta电势为+12-+18 mV,胰岛素包封率达90%。纳米粒粒径、Zeta电势和包封率受胰岛素溶液pH、TMC-Cys/胰岛素质量比和离子强度影响;胰岛素体外释放受壳聚糖分子量、季胺化度、释放介质离子强度和离子类型影响。TMC-Cys NP的小肠黏膜黏附力和黏蛋白黏附率较TMC NP分别提高2.1-4.7倍和1.5-2.2倍,黏蛋白黏附率随壳聚糖分子量或季胺化度升高而增加。DSC分析表明TMC-Cys通过与黏蛋白间形成二硫键提高黏附力。与TMC NP相比,TMC-Cys NP胰岛素的离体小肠Papp提高1.7-26倍,Caco-2细胞摄取量提高1.7-3.0倍,Peyer’s结摄取量提高1.7-5.0倍,其中TMC-Cys(200,30) NP的促渗作用最强。大鼠口服和回肠给药时,TMC-Cys NP的降血糖效果优于TMC NP,血糖最低分别降至初始值的65%和30%。Caco-2细胞MTT试验和大鼠回肠LDH试验结果表明TMC-Cys NP细胞毒性低,安全性良好。以增强型绿荧光蛋白表达质粒(pEGFP)为模式质粒,PEC法制备TMC-Cys/pEGFP自组装纳米复合物(TMC-Cys NC)并表征理化性质;考察TMC-Cys NC在HEK293细胞和小鼠胫前肌中的体内外转染效率,研究其转染机制。TMC-Cys NC呈球形,分散度良好,粒径为150-400 nm,Zeta电势为+14-+20mV;凝胶阻滞试验结果表明TMC-Cys可通过静电作用缩合pDNA; TMC-Cys NC可有效保护pDNA免受核酶降解。TMC-Cys NC的细胞黏附率较TMC NC显着提高;TMC-Cys NC的HEK293细胞摄取率分别提高至TMC NC和Lipofectamine2000的1.4-3.0倍和1.6-4.4倍;4℃时TMC-Cys NC的摄取量为37℃时的25%,叠氮钠和氯丙嗪处理分别使摄取量减少40%和70%,表明TMC-Cys NC主要经能量依赖的网格蛋白介导的细胞内吞途径进胞;松胞素D和染料木素对TMC-Cys NC的摄取无显着影响,表明进胞机理与细胞骨架的重构和窖蛋白介导的通路无关。TMC-Cys NC的释放行为呈现谷胱甘肽(GSH)浓度依赖性,胞外GSH浓度下缓慢释放pEGFP,胞内GSH浓度下快速释放pEGFP并转运进核,细胞核中pEGFP的含量为TMC NC组的3.7倍。TMC-Cys NC在HEK293细胞中的转染效率提高至TMC NC的1.4-3.2倍,其中TMC-Cys(100,30) NC的转染效率最高(约35%),为Lipofectamine2000的1.5倍。TMC-Cys(100,30) NC的体内转染效率分别提高至TMC NC和Lipofectamine2000的2.3倍和4.1倍。制备MTC及其纳米粒,研究纳米粒的理化性质;以TNF-a siRNA为靶基因,研究MTC纳米粒对小肠M细胞、巨噬细胞的主动靶向作用和提高siRNA口服给药功效及其作用机理。TMC (200、500 kDa)经甘露糖修饰和巯基化修饰制得甘露糖修饰度约20%的MTC;捕获法、吸附法和自组装法分别制备载siRNA MTC纳米粒(en-MTC-TPP NP、ad-MTC-TPP NP和MTC-SANP),纳米粒为球形或亚球形,分散良好,粒径为130-230 nm,Zeta电势为正值,siRNA包封率为70-80%,纳米粒可显着提高siRNA的血清稳定性;纳米粒粒径随壳聚糖分子量增大而增大:ad-MTC-TPP NP和MTC-SANP受离子强度影响较大,siRNA包封率随离子强度升高而显着降低,但en-MTC-TPP NP受离子强度影响较小。与载NC siRNA的巯基化壳聚糖季胺盐纳米粒(en-TC-TPP NP)相比,en-MTC-TPP NP的Caco-2细胞和Raw 264.7细胞黏附力显着提高,siRNA在Raw 264.7细胞中的摄取量提高2.0-24倍,Peyer’s结摄取量提高19-24倍,体外M细胞模型和Caco-2细胞单层转运量提高1.2-2.1倍,离体小肠转运量提高6.9-11.0倍,且M细胞模型中的转运量显着高于Caco-2细胞单层中的转运量,含Peyer’s结离体小肠的转运量高于不含Peyer’s结离体小肠的转运量,表明甘露糖配体修饰载体可通过特异性配体-受体结合作用显着提高纳米粒对M细胞和巨噬细胞的主动靶向作用,从而促进siRNA的小肠摄取和转运。以TNF-αsiRNA为靶基因,en-MTC-TPP NP在Raw 264.7细胞中的干扰效率显着强于en-TC-TPP NP和Lipofectamine2000;相同干扰效率(70%)时,en-MTC-TPP NP的siRNA剂量较Lipofectamine2000降低200倍。en-MTC-TPP NP在Raw 264.7细胞和Caco-2细胞中基本无毒性,表明纳米粒在发挥基因沉默作用时不会造成细胞毒性。小鼠口服en-MTC-TPP NP可显着降低血清TNF-α含量。
罗永峰[8](2010)在《靶向核酸纳米归巢气雾装置的构建》文中认为研究背景和目的:基因治疗,特别是最具前景的小分子RNA干扰作为基因药的治疗,选择合适的载体及导入方法是一个瓶颈,也是核酸为基础的药物能否在临床成功应用的关键。病毒载体因其具有高效转导基因的特点,是目前基因治疗临床研究的主流载体。但随着时间的推移,病毒载体介导免疫炎症以及激活原癌基因的潜在危险性等自身无法克服的缺陷已日益显现。因此,研发非病毒载体已成为基因治疗研究的热点。非病毒载体具有低毒、低免疫原性等特点,其中的壳聚糖及其衍生物因具备极高的生物相容性受到科学家们的青睐。我们在前期的研究工作中,已经研制出烷基化壳聚糖纳米核酸载体,并能成功的将靶目标核酸转入肺的上皮细胞,表达相应蛋白。但存在的缺点是转染效率低。精氨酸中的特征基团胍基能够促进细胞的内吞,具有细胞转导肽的作用,因此,对壳聚糖进行胍基化修饰有望改善原壳聚糖纳米载体转染效率低的缺点。同时,β2肾上腺能受体广泛分布于支气管平滑肌和肺组织内,依据配体-受体结合的原理,采纳临床用支气管舒张剂-β2受体兴奋剂作为归巢装置,把沙丁胺醇接枝于胍基化的壳聚糖上,有望通过靶向性修饰增加其核酸转运的效率与特异性。不仅如此,针对特定靶器官的局部给药方式具有吸收迅速、起效快、使用方便和副作用小等特点,是呼吸系统疾病治疗一种常用有效的给药途径。通过探讨超声雾化运送壳聚糖纳米核酸药的给药方式,最终构建一种新型RNA干扰壳聚糖纳米载体靶向归巢气雾治疗装置,将能极大解决RNA干扰等核酸类药物在呼吸系统疾病临床应用的问题。研究内容和方法:第一部分胍基化壳聚糖的物化性质和基因转染效率第一节胍基化壳聚糖物化性质的检测1.胍基化壳聚糖的合成2.透射电镜观察Gua-chitosan/DNA的粒径大小和分布;3.比较中性水溶液中chitosan和Gua-chitosan之间的溶解性,以及完全溶解状态下,两种载体溶液的PH值;4.凝胶阻滞实验观察两种载体的核酸结合能力;5.利用WES-8比较各种载体的细胞毒性。第二节胍基化壳聚糖转染效率的评价与机制探讨1.应用绿色荧光蛋白报告基因载体(Enhanced green fluorescent protein plasmid, pEGFP)转染293细胞,荧光显微镜观察不同壳聚糖纳米载体的转染效率,并结合流式细胞仪进行转染效率的定量分析;2.流式细胞仪检测在不同载体的包裹下单个细胞的荧光强度,了解它们对GFP表达影响;3.观察不同胍基取代度对壳聚糖转染效率的影响;4.跟踪不同时间点各种载体转染效率的变化。5.连接Pet质粒和yoyo1荧光染料,观察各种载体向细胞内转运核酸的能力。6.连接Pet质粒和yoyo1荧光染料,观察各种载体在体转运核酸的能力。第二部分载体的靶向性改造1.沙丁胺醇接枝于胍基化的壳聚糖及质谱分析。2.比较Sal-Gua-chitosan和Gua-chitosan在具有β2受体的293细胞及不表达β2受体的16HBE细胞的转染效率。第三部分超声雾化对壳聚糖核酸复合物转染效率的影响及其机理1.凝胶电泳观察超声雾化下,Gua-chitosan对于DNA的保护作用;2.分别比较载体/DNA复合物经超声雾化以后,pEGFP在293和16HBE细胞当中转染效率的变化;3.透射电镜观察超声雾化前后,载体和载体/DNA复合物粒径大小和分布的变化。结果第一部分胍基化壳聚糖的物化性质和基因转染效率第一节胍基化壳聚糖粒径在20-70nm之间;壳聚糖经胍基化修饰以后在中性水溶液当中的溶解性大大增加;胍基能降低壳聚糖自身的电荷密度,造成与DNA结合的临界复合比升高;与天然壳聚糖相仿,胍基化改造并没有增加载体的细胞毒性,两者对于细胞生长率均没有明显影响。第二节胍基化壳聚糖转染pEGFP的效率明显高于天然壳聚糖,这种转染效率的提高在一定范围内并不依赖于胍基化程度的高低。在单个细胞的水平上,胍基化壳聚糖所转染的绿色荧光蛋白的强度高于天然壳聚糖。在转染后24小时,脂质体所介导的基因表达达到峰值,而胍基化壳聚糖所介导的基因转染,蛋白表达的高峰出现在72小时。细胞体外实验和在体实验均显示,胍基化壳聚糖能更有效的地把质粒DNA运送到细胞体内。第二部分载体的靶向性改造与不表达β2受体的16HBE细胞比较,293细胞用Sal-胍基化壳聚糖纳米载体转染绿色荧光报告质粒的表达效率显着高于未引入配体的胍基化壳聚糖纳米载体。第三部分超声雾化对壳聚糖核酸复合物转染效率的影响及其机理壳聚糖能有效保护被包裹的DNA免受超声振荡的剪切作用。壳聚糖/DNA复合物经超声雾化以后转染效率显着提高。超声处理后复合物粒径分布范围较前变窄,粒径增大,颗粒均匀度较前明显改善。结论1.胍基化修饰的壳聚糖纳米载体能有效提高核酸的运送及转染效率,在生理PH值环境下能够溶于水,为临床局部应用的可行性奠定了基础。胍基化修饰的壳聚糖纳米提高转染效率的机制可能是通过提高细胞的内吞作用实现,。该特质性更有利于其在体转送核酸物质。2.β2受体兴奋剂-沙丁胺醇接枝的胍基化壳聚糖纳米载体通过引入靶向归巢装置,能够利用气道细胞存在大量β2受体的特点,依据配体-受体结合的基本原理,进一步提高细胞对核酸的摄取与转染效率,为在体经气道局部给予核酸类药奠定了重要基础。3.壳聚糖包裹能有效保护超声振荡下的DNA免受剪切破坏;同时超声雾化通过改变复合物的粒径和分布,可以有效提高核酸的转染效率。
白欣[9](2009)在《新型基因载体巯基烷基化壳聚糖的制备及体外性质的初步研究》文中研究表明目的:制备巯基烷基化壳聚糖(TACS)载基因纳米粒,并对其体外相关性质进行初步研究。方法:复凝聚法制备TACS/pDNA复合纳米粒子,并用透射电镜对其的形态和粒径进行观察和表征;凝胶阻滞分析观察其对基因的保护情况;以Lipofectamine 2000转染试剂作为阳性对照,检测其对人胚胎肾细胞(HEK293)的转染活性;四噻氮唑盐(MTT)比色法测定其对细胞活性的影响。结果:巯基烷基化壳聚糖/DNA复合纳米粒子形态不很均一,粒径在390nm左右;凝胶阻滞分析证明了载体能有效地包裹和保护基因不受DNaseⅠ酶的消化;体外基因转染实验证实了TACS纳米粒子能够有效地转染HEK293,其转染效率远高于壳聚糖纳米粒子,略低于脂质体;MTT测定其对细胞活力影响甚微,对细胞的毒性明显低于脂质体结论:TACS有望成为一种有价值的新型基因载体。
慕卿[10](2008)在《智能型壳聚糖衍生物的制备及改性壳聚糖在基因传输中的应用》文中研究说明壳聚糖是一种来源丰富的天然高分子,由于具有良好的生物相容性、生物降解性和无毒无害,它广泛应用在很多领域,比如生物医药和农业等。但其结晶性高,溶解性差,这就极大地限制了壳聚糖的进一步开发利用。通过化学改性是改善壳聚糖性能,扩大其应用范围的有效途径。由于壳聚糖主链中氨基的活性远高于3号位和6号位的羟基,因此大部分反应在氨基基团上,而氨基赋予了壳聚糖生物活性,基于生物材料应用的考虑,我们希望改性后的壳聚糖仍能保留壳聚糖的氨基和生物活性。另一方面,刺激响应型体系能根据周围环境变化,可逆地发生体积或形状的响应变化,这种优良的性能引起了科学家极大的兴趣。我们希望壳聚糖能改性成为刺激响应高分子并且在改性之后仍能保留原来氨基的活性。为了达到这个目的,我们首先合成了反应中间体O-马来酰化N-邻苯二甲酰基壳聚糖(MPCS),通过与此与双键单体的自由基聚合,我们制备了热敏性接枝共聚物(chitosan-g-PNIPAAm)和pH敏感接枝共聚物(chitosan-g-PAA)。另外,我们还采用了其他保护-脱保护方法,制备了氨基恢复,且侧链带苯硼酸的接枝共聚物(chitosan-g-phenyloboric acid)。侧链的苯硼酸在碱性条件下对糖有响应性。与合成阳离子相比,壳聚糖更适合于在黏膜中进行基因传输。但在细胞中转染效率低限制了它的应用范围。已有文献报道,壳聚糖经过改性之后再与基因复合会提高其转染效率。在本论文里,我们先合成了巯基烷基化壳聚糖(HWCS),然后采用复凝聚法制备了HWCS-DNA纳米粒子。动态光散射测量了它的粒径和电势,同时,我们还对于纳米粒子在HEK-293细胞中的转染效率也进行了研究。1.在氨基保护的壳聚糖链接枝上单体异丙基丙烯酰胺(NIPAAm),并脱保护得到保留氨基的热敏性接枝共聚物,与壳聚糖相比,它的溶解范围增大,可以溶解在pH=1-12的缓冲溶液中。2.以O-马来酸酐化N-邻苯二甲酰化壳聚糖(MPCS)为介质在均相体系中通过偶氮二异丁腈引发制备了壳聚糖甲基丙烯酸β-羟乙酯接枝共聚物。3.通过化学法制备保留氨基且pH敏感的接枝共聚物(chitosan-g-PAA),并研究了接枝条件对接枝率的影响。在对接枝产物水溶液进行酸化的过程中,溶液逐渐变浑浊,这是因为接枝产物中氨基和羧基由于电荷作用自组装形成了聚电解质复合物。4.以O-马来酰化N-邻苯二甲酰化壳聚糖(MPCS)为中间产物,通过γ射线引发,在均相溶液体系中制备含有改性壳聚糖-聚丙烯酸的双亲性凝胶。通过研究接枝产物在不同pH缓冲溶液中溶胀度的变化,我们发现接枝产物在酸性条件(pH<7)下溶胀较小,在碱性条件(pH>7)下溶胀较大。而且,我们还评估了接枝产物在DMF溶剂中的溶胀情况。5.以铜离子为阻聚剂,利用γ射线引发,在壳聚糖膜上接枝N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)单体,制备出新型的具有温敏性的壳聚糖接枝膜。通过纯水水通量实验,发现接枝后的壳聚糖膜水通量随着温度的升高而减小,而纯壳聚糖膜的水通量是不随温度变化的,从而证明了接枝膜具有温度敏感效应。6.巯基烷基化壳聚糖通过复凝聚法与DNA复合形成纳米粒子。结果表明巯基烷基化壳聚糖能有效的包裹和保护DNA不受脱氧核糖核酸酶的消化。而且其在HEK-293细胞中的转染效率也比纯壳聚糖基因纳米粒子要高,这是因为壳聚糖上引入的烷基和巯基有利于纳米粒子在细胞中的进入和基因的解离。7.壳聚糖苯硼酸接枝共聚物通过新的保护—脱保护得到,并以红外和核磁进行了表征。
二、壳聚糖及烷基化壳聚糖/DNA复合物介导的基因转染研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、壳聚糖及烷基化壳聚糖/DNA复合物介导的基因转染研究(论文提纲范文)
(1)基于硒活性的壳聚糖复合物的制备研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩写符号说明 |
第一章 绪论 |
1.1 壳聚糖的改性及其衍生物应用的研究进展 |
1.1.1 壳聚糖的结构和性质 |
1.1.2 壳聚糖的化学改性 |
1.1.3 壳聚糖基无机纳米复合材料 |
1.2 多糖硒复合物的研究进展 |
1.2.1 硒的存在形式及生理功能 |
1.2.2 多糖修饰的纳米硒 |
1.2.3 有机硒多糖 |
1.2.4 多糖硒复合物的生物活性 |
1.3 论文研究的目的和意义 |
1.4 论文研究的主要内容 |
第二章 壳聚糖和羧甲基壳聚糖功能化纳米硒的制备及抗氧化活性研究 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料与仪器 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 壳聚糖和羧甲基壳聚糖功能化纳米硒的制备 |
2.3.2 壳聚糖和羧甲基壳聚糖功能化纳米硒的表征 |
2.3.3 抗氧化活性的测定 |
2.4 结果与讨论 |
2.4.1 壳聚糖和羧甲基壳聚糖功能化纳米硒的合成 |
2.4.2 壳聚糖和羧甲基壳聚糖功能化纳米硒的表征 |
2.4.3 抗氧化活性分析 |
2.5 本章小结 |
第三章 不同相对分子质量壳聚糖功能化纳米硒的制备及抗氧化活性研究 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料与仪器 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验仪器 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 不同相对分子质量壳聚糖功能化纳米硒的制备 |
3.3.2 不同相对分子质量壳聚糖功能化纳米硒的表征 |
3.3.3 抗氧化活性的测定 |
3.4 结果与讨论 |
3.4.1 不同相对分子质量壳聚糖功能化纳米硒的合成 |
3.4.2 不同相对分子质量壳聚糖功能化纳米硒的表征 |
3.4.3 抗氧化活性分析 |
3.5 本章小结 |
第四章 壳聚糖还原稳定纳米硒的制备及抗氧化活性研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验材料与仪器 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验仪器 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 壳聚糖还原稳定纳米硒的制备 |
4.3.2 壳聚糖还原稳定纳米硒的表征 |
4.3.3 抗氧化活性的测定 |
4.4 结果与讨论 |
4.4.1 壳聚糖还原稳定纳米硒的合成 |
4.4.2 壳聚糖还原稳定纳米硒的表征 |
4.4.3 抗氧化活性分析 |
4.5 本章小结 |
第五章 N,O-硒化-N-(2-羧乙基)壳聚糖的制备及抗氧化活性研究 |
5.1 引言 |
5.2 实验材料与仪器 |
5.2.1 实验材料 |
5.2.2 实验仪器 |
5.3 实验方法 |
5.3.1 N,O-硒化-N-(2-羧乙基)壳聚糖的制备 |
5.3.2 N,O-硒化-N-(2-羧乙基)壳聚糖的表征 |
5.3.3 抗氧化活性的测定 |
5.4 结果与讨论 |
5.4.1 N,O-硒化-N-(2-羧乙基)壳聚糖的合成 |
5.4.2 N,O-硒化-N-(2-羧乙基)壳聚糖的表征 |
5.4.3 抗氧化活性分析 |
5.5 本章小结 |
第六章 O-硒代二乙酯壳聚糖和N-硒代二乙酸壳聚糖的制备及抗氧化活性研究 |
6.1 引言 |
6.2 实验材料与仪器 |
6.2.1 实验材料 |
6.2.2 实验仪器 |
6.3 实验方法 |
6.3.1 O-硒代二乙酯壳聚糖和N-硒代二乙酸壳聚糖的制备 |
6.3.2 O-硒代二乙酯壳聚糖和N-硒代二乙酸壳聚糖的表征 |
6.3.3 抗氧化活性的测定 |
6.4 结果与讨论 |
6.4.1 O-硒代二乙酯壳聚糖和N-硒代二乙酸壳聚糖的合成 |
6.4.2 O-硒代二乙酯壳聚糖和N-硒代二乙酸壳聚糖的表征 |
6.4.3 抗氧化活性分析 |
6.5 本章小结 |
第七章 壳聚糖纳米硒和壳聚糖有机硒抗癌活性的比较 |
7.1 引言 |
7.2 实验材料与仪器 |
7.2.1 实验材料 |
7.2.2 实验仪器 |
7.3 实验方法 |
7.3.1 细胞系和细胞培养 |
7.3.2 细胞存活率的测定 |
7.3.3 细胞吸收效率的测定 |
7.3.4 细胞周期分布的测定 |
7.3.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
7.3.6 Hoechst33342 染色分析细胞形态 |
7.3.7 线粒体膜电位变化的测定 |
7.3.8 Caspase-3 活性的检测 |
7.3.9 统计分析 |
7.4 结果与讨论 |
7.4.1 体外抗肿瘤活性分析 |
7.4.2 细胞摄取分析 |
7.4.3 细胞周期分析 |
7.4.4 细胞凋亡分析 |
7.4.5 Hoechst33342 分析细胞凋亡的形态 |
7.4.6 线粒体膜电位变化 |
7.4.7 Caspase-3 活化 |
7.5 本章小结 |
主要结论与展望 |
主要结论 |
展望 |
主要创新点 |
致谢 |
参考文献 |
附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
(2)可注射壳聚糖缓释基因载体的构建及在骨缺损修复中的实验研究(论文提纲范文)
中英文缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
实验一 可注射改性壳聚糖缓释基因载体的构建、表征及温敏效果的鉴定 |
1 引言 |
2 实验材料 |
2.1 细胞 |
2.2 试剂及来源 |
2.3 主要溶剂的配制 |
2.4 主要仪器和设备 |
3 实验方法 |
3.1 改性壳聚糖的制备 |
3.2 红外光谱分析 |
3.3 EG-HBC的温敏凝胶特性检测 |
3.4 pBMP4-EGFP的扩增与提取 |
3.5 负载pBMP4-EGFP质粒的改性壳聚糖复合粒子的制备 |
3.6 负载pBMP4-EGFP的改性壳聚糖复合粒子的表征检测 |
3.7 核酸保护试验 |
3.8 改性核壳结构对负载基因的体外缓释效果 |
4 结果 |
4.1 改性壳聚糖红外光谱分析 |
4.2 EG-HBC的 PH温敏凝胶特性检测 |
4.3 负载pBMP4-EGFP的改性壳聚糖纳米复合粒子的表征检测 |
4.4 核酸保护试验 |
4.5 改性核壳结构对负载基因的体外缓释效果 |
5 讨论 |
5.1 骨缺损治疗现状 |
5.2 基因治疗的载体选择 |
5.3 壳聚糖作为基因载体的改性研究 |
6 结论 |
7 参考文献 |
实验二 可注射壳聚糖缓释载体介导BMP4-EGPF基因转染兔BMSC基因缓释,成骨性能影响及体内缓释的实验研究 |
1 引言 |
2 实验材料 |
2.1 实验动物 |
2.2 细胞 |
2.3 试剂及来源 |
2.4 主要溶剂的配制 |
2.5 主要仪器和设备 |
3 实验方法 |
3.1 TACS/pBMP4-EGFP和 TACS@EG-HBC/pBMP4-EGFP制备 |
3.2 兔BMSC的体外分离,培养与鉴定 |
3.3 兔BMSC多项分化潜能鉴定 |
3.4 改性壳聚糖缓释基因载体复合粒子对骨髓间充质干细胞增殖的影响 |
3.5 改性壳聚糖缓释基因载体对BMSC的转染效率的检测 |
3.6 由不同改性壳聚糖缓释基因载体复合粒子转染后对BMSC成骨分化的影响 |
3.7 小鼠体内转染缓释实验 |
3.8 统计分析 |
4.结果 |
4.1 兔BMSC的培养及传代 |
4.2 兔BMSC表面标志物鉴定 |
4.3 兔BMSC成脂诱导培养及油红O染色 |
4.4 兔BMSC成骨诱导培养及Von kossa染色 |
4.5 改性壳聚糖基因载体复合粒子对兔BMSC增殖的影响 |
4.6 改性壳聚糖基因载体复合粒子对BMSC转染效率评价 |
4.7 不同改性壳聚糖复合粒子转染后对成骨分化的影响 |
4.8 小鼠肌肉组织内转染实验 |
5.讨论 |
6 结论 |
7 参考文献 |
实验三 携载BMP4-EGFP的可注射型壳聚糖缓释基因复合粒子对骨缺损修复的实验研究 |
1 引言 |
2 实验材料 |
2.1 动物 |
2.2 细胞 |
2.3 试剂及来源 |
2.4 设备及来源 |
3 实验方法 |
3.1 携载BMP4-EGFP基因质粒的改性壳聚糖复合粒子的构建 |
3.2 动物模型建立 |
3.3 术后主要观察指标 |
3.4 统计学分析 |
4 结果 |
4.1 实验动物总体情况观察 |
4.2 骨缺损大体标本观察 |
4.3 X线结果 |
4.4 Lane-SandhuX线评分 |
4.5 新生骨组织中BMP4 免疫组化结果 |
4.6 HE染色 |
4.7 生物力学的测定 |
5.讨论 |
5.1 大段骨缺损模型的建立 |
5.2 细胞因子的选择 |
5.3 可注射水凝胶材料的在缓释作用及的骨缺损中的应用 |
6 结论 |
7 参考文献 |
文章的创新点 |
文章的问题和不足之处 |
展望与未来研究的方向 |
附录 |
致谢 |
综述 |
参考文献 |
(3)两亲性N-烷基化-O-季铵盐化壳聚糖制备及其作为药物/基因载体的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 前言 |
1.1 甲壳素 |
1.2 壳聚糖及其衍生物 |
1.2.1 壳聚糖 |
1.2.2 壳聚糖C-2 改性衍生物 |
1.2.3 壳聚糖C-6 改性衍生物 |
1.3 基因/药物载体概述 |
1.3.1 基因载体 |
1.3.2 药物载体 |
1.4 甲壳素/壳聚糖及其衍生物作为药物载体的应用 |
1.4.1 缓释和控释系统 |
1.4.2 靶向药物递送系统 |
1.4.3 改善难溶药物的吸收 |
1.5 甲壳素/壳聚糖及其衍生物作为基因载体的应用 |
1.5.1 壳聚糖基因载体 |
1.5.2 疏水壳聚糖衍生物作为基因载体 |
1.5.3 亲水性壳聚糖衍生物作为基因载体 |
1.5.4 两亲性壳聚糖衍生物作为基因载体 |
1.6 课题的目的和意义 |
1.7 研究内容及方法 |
1.7.1 研究内容 |
1.7.2 研究方法 |
1.8 本课题的创新 |
第2章 实验部分 |
2.1 实验试剂与仪器 |
2.2 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的制备 |
2.2.1 O-季铵盐化甲壳素的制备 |
2.2.2 O-季铵盐化壳聚糖的制备 |
2.2.3 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的制备 |
2.3 各级产物结构表征 |
2.3.1 FTIR |
2.3.2 1H NMR |
2.3.3 TGA表征 |
2.3.4 O-季铵盐化甲壳素/壳聚糖DD和DSQ的测定 |
2.3.5 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖DSA的测定 |
2.4 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖作为药物载体的研究 |
2.4.1 PCTM工作曲线的确定 |
2.4.2 PCTM+N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖微球的制备及载药量和包封率的测定 |
2.4.3 维生素B_(12)工作曲线的测定 |
2.4.4 维生素B_(12)+N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖微球的制备及载药量和包封率的测定 |
2.4.5 维生素B_(12)载药微球粒径的测定 |
2.4.6 维生素B_(12)载药微球的表面形态观测 |
2.4.7 PTCM载药微球在磷酸盐缓冲溶液中的体外释放实验 |
2.4.8 维生素B_(12)载药微球在磷酸盐缓冲溶液中的体外释放实验 |
2.5 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖作为基因载体的研究 |
2.5.1 基因载体/DNA复合物的制备 |
2.5.2 细胞毒性实验 |
2.5.3 体外转染实验 |
第3章 结果与讨论 |
3.1 制备条件对O-季铵盐化甲壳素结构的影响 |
3.1.1 温度 |
3.1.2 CTA浓度 |
3.1.3 碱种类 |
3.2 O-季铵盐化壳聚糖的制备参数探索 |
3.3 制备条件对N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖结构的影响 |
3.3.1 正交试验结果 |
3.3.2 反应温度对N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖DSA的影响 |
3.3.3 癸醛用量对N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖DSA的影响 |
3.3.4 反应次数对N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖DSA的影响 |
3.3.5 反应时间对N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖DSA的影响 |
3.3.6(微波)加热方式对N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖DSA的影响 |
3.4 各级产物的结构表征结果 |
3.4.1 FTIR |
3.4.2 ~1H NMR |
3.4.3 TGA |
3.5 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖载药及释放性能 |
3.5.1 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖对PCTM的载药量和包封率 |
3.5.2 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖对维生素B12的载药量和包封率 |
3.5.3 维生素B12载药微球粒径 |
3.5.4 维生素B12载药微球的表面形态 |
3.5.5 载药微球在磷酸盐缓冲溶液中的体外释放性能 |
3.6 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖基因载体的细胞毒性与转染率 |
3.6.1 细胞毒性 |
3.6.2 N/P对基因转染效果的影响 |
3.6.3 N-癸烷-O-季铵盐化壳聚糖的DSQ对基因转染效果的影响 |
第4章 结论与建议 |
4.1 结论 |
4.2 建议 |
参考文献 |
致谢 |
(4)壳聚糖季磷盐的合成及其用作非病毒基因载体的评价(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
目录 |
第一章 研究背景 |
1.1 高分子载体基因传递系统 |
1.1.1 基因治疗的概述 |
1.1.2 常用的高分子基因载体 |
1.1.3 高分子载体介导的基因传递 |
1.2 壳聚糖及其化学改性 |
1.2.1 壳聚糖的结构及理化性质 |
1.2.2 壳聚糖的生物学特性 |
1.2.3 壳聚糖的化学改性研究 |
1.3 壳聚糖非病毒基因载体 |
1.3.1 壳聚糖用作基因载体的研究 |
1.3.2 壳聚糖衍生物用作基因载体 |
1.4 课题的提出 |
第二章 壳聚糖季磷盐的合成与表征 |
2.1 材料、试剂与仪器 |
2.1.1 材料与试剂 |
2.1.2 仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 壳聚糖季磷盐 (NPCS) 的合成 |
2.2.2 NPCS 的结构表征 |
2.2.3 NPCS 溶解度的测定 |
2.2.4 NPCS 溶液 pH 稳定性考察 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 NPCS 的合成及表征 |
2.3.2 NPCS 的溶解性能 |
2.4 本章小结 |
第三章 壳聚糖季磷盐用作基因载体的研究 |
3.1 材料、试剂与仪器 |
3.1.1 材料与试剂 |
3.1.2 仪器 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 质粒 DNA 的提取和纯化 |
3.2.2 NPCS/DNA 复合物的制备 |
3.2.3 粒径及表面电荷测定 |
3.2.4 凝胶电泳阻滞实验 |
3.2.5 表面形态观察 |
3.2.6 NPCS 的细胞毒性实验 |
3.2.7 NPCS 转染 EGFP 质粒的实验 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 NPCS/DNA 复合物的制备与表征 |
3.3.2 NPCS 的细胞毒性 |
3.3.3 体外基因转染 |
3.4 本章小结 |
第四章 聚乙二醇-壳聚糖季磷盐的合成、表征 |
4.1 材料、试剂与仪器 |
4.1.1 材料与试剂 |
4.1.2 仪器 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 聚乙二醇-壳聚糖季磷盐 (PEG-NPCS) 的合成 |
4.2.2 PEG-NPCS 聚合物的结构表征 |
4.2.3 PEG-NPCS 的细胞毒性实验 |
4.2.4 PEG-NPCS/DNA 复合物的制备与表征 |
4.2.5 PEG-NPCS/DNA 复合物的稳定性实验 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 PEG-NPCS 的合成与表征 |
4.3.2 PEG-NPCS 的细胞毒性 |
4.3.3 PEG-NPCS/DNA 复合物的表征 |
4.4 本章小结 |
第五章 总结与展望 |
5.1 总结 |
5.2 展望 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士期间发表的论文 |
(5)用于提高体内外基因转染功效的亚油酸和聚苹果酸双接枝壳聚糖新型纳米载体(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
1 材料和仪器 |
2 实验方法 |
2.1 LMC聚合物的制备 |
2.2 LMC纳米粒的制备和表征 |
2.3 pEGFP质粒的制备 |
2.4 LMC/pEGFP纳米复合物的制备 |
2.5 LMC/pEGFP纳米复合物的粒径和Zeta电势 |
2.6 透射电镜 |
2.7 凝胶阻滞 |
2.8 包封率测定 |
2.9 核酶抑制 |
2.10 非特异性蛋白吸附 |
2.11 血红细胞黏附 |
2.12 细胞摄取 |
2.13 细胞摄取机制 |
2.14 EB排阻 |
2.15 pEGFP释放 |
2.16 亚细胞分布 |
2.17 体外细胞转染 |
2.18 体内转染 |
3 结果与讨论 |
3.1 LMC纳米粒 |
3.2 LMC/pEGFP纳米复合物的制备和表征 |
3.3 透射电镜 |
3.4 凝胶阻滞 |
3.5 包封率 |
3.6 核酶抑制 |
3.7 非特异性蛋白吸附 |
3.8 细胞黏附 |
3.9 细胞摄取 |
3.10 细胞摄取机制 |
3.11 EB排阻 |
3.12 pEGFP释放 |
3.13 核质分布 |
3.14 体外转染 |
3.15 体内转染 |
总结与展望 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
综述 壳聚糖类基因非病毒载体 |
参考文献 |
(6)壳聚糖基非病毒基因载体研究新进展(论文提纲范文)
1 壳聚糖概述 |
2 壳聚糖衍生物在基因载体中的应用 |
2.1 季铵化壳聚糖作为基因载体 |
2.2 羧甲基化壳聚糖作为基因载体 |
2.3 聚乙二醇化壳聚糖作为基因载体 |
2.4 壳聚糖-g-聚乙烯亚胺作为基因载体 |
2.5 十二烷基化壳聚糖作为基因载体 |
2.6 有机酸改性壳聚糖作为基因载体 (见图2) |
2.7 季铵化-N-芳香基壳聚糖作为基因载体 |
2.8 配体改性壳聚糖作为基因载体 (见图3) |
2.9 其它改性壳聚糖衍生物作为基因载体 |
3 结语 |
(7)用于改善生物大分子药物功效的超多孔水凝胶、纳米粒新型给药载体(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
1 蛋白质多肽类药物口服给药系统 |
2 基因递释系统 |
3 超多孔水凝胶 |
4 纳米给药系统 |
5 功能化壳聚糖衍生物 |
参考文献 |
第一部分 用于改善蛋白质多肽类药物功效的超多孔水凝胶新型给药载体 |
第一章 SPH-IPN的制备和表征 |
1 材料与仪器 |
2 实验方法 |
2.1 SPH-IPN的制备 |
2.2 IPN结构表征 |
2.3 SPH-IPN形态学 |
2.4 SPH-IPN孔隙率测定 |
2.5 SPH-IPN的溶胀性能 |
2.6 SPH-IPN的机械性能 |
3 结果和讨论 |
3.1 SPH-IPN的制备 |
3.2 IPN结构表征 |
3.3 SPH-IPN形态学 |
3.4 孔隙率 |
3.5 SPH-IPN的溶胀 |
3.6 SPH-IPN的机械性能 |
4 小结 |
参考文献 |
第二章 SPH-IPN的刺激敏感性溶胀及载药和释药特性 |
1 材料与仪器 |
2 实验方法 |
2.1 SPH-IPN刺激敏感性溶胀 |
2.2 胰岛素含量测定 |
2.3 载药与释药 |
2.4 胰岛素稳定性 |
2.5 SPH-IPN与胰岛素的相互作用 |
2.6 SPH-IPN中水的状态 |
2.7 SPH-IPN的保水性 |
3 结果与讨论 |
3.1 刺激敏感性溶胀 |
3.2 载药量 |
3.3 体外释药 |
3.4 胰岛素稳定性 |
3.5 SPH-IPN与胰岛素相互作用 |
3.6 SPH-IPN中水的状态 |
3.7 SPH-IPN的保水性 |
4 小结 |
参考文献 |
第三章 SPH-IPN增加胰岛素口服吸收及促吸收机理 |
1 材料与仪器 |
2 实验方法 |
2.1 生物利用度 |
2.2 黏膜黏附力 |
2.3 溶胀与保水 |
2.4 胰岛素释放 |
2.5 蛋白酶抑制 |
2.6 Caco-2细胞单层转运 |
2.7 胰岛素小肠转运 |
2.8 小肠滞留 |
3 结果和讨论 |
3.1 载胰岛素SPH-IPN口服生物利用度 |
3.2 黏膜黏附力 |
3.3 溶胀与保水 |
3.4 胰岛素释放 |
3.5 蛋白酶抑制 |
3.6 Caco-2细胞单层转运 |
3.7 胰岛素小肠转运 |
3.8 小肠滞留 |
4 小结 |
参考文献 |
第四章 SPH-IPN的生物相容性 |
1 材料与仪器 |
2 实验方法 |
2.1 细胞毒性 |
2.2 基因(遗传)毒性 |
2.3 组织相容性 |
2.4 急性毒性 |
2.5 亚急性毒性 |
2.6 血液相容性 |
2.7 单体、交联剂残留量测定 |
3 结果与讨论 |
3.1 细胞毒性 |
3.2 基因(遗传)毒性 |
3.3 组织相容性 |
3.4 急性毒性 |
3.5 亚急性毒性 |
3.6 血液相容性 |
3.7 残留量 |
4 小结 |
参考文献 |
第二部分 用于提高蛋白质药物、DNA、siRNA功效的巯基化壳聚糖季胺盐新型纳米载体 |
第五章 巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒增加胰岛素口服吸收及其作用机理 |
1 材料与仪器 |
2 实验方法 |
2.1 TMC的合成与纯化 |
2.2 TMC-Cys的合成与纯化 |
2.3 TMC-Cys的表征 |
2.4 TMC-Cys的抑菌作用 |
2.5 TMC-Cys的抗氧化作用 |
2 .6 TMC-Cys NP的制备 |
2.7 纳米粒粒径和Zeta电势 |
2.8 纳米粒形态 |
2.9 包封率测定 |
2.10 体外释放 |
2.11 黏膜黏附力 |
2.12 TMC-Cys NP促胰岛素小肠吸收 |
2.13 降血糖效果 |
2.14 生物相容性 |
3 结果和讨论 |
3.1 TMC的合成与纯化 |
3.2 TMC-Cys的合成与表征 |
3.3 TMC-Cys的抑菌作用 |
3.4 TMC-Cys的抗氧化作用 |
3.5 TMC-Cys NP的制备和表征 |
3.6 纳米粒形态 |
3.7 体外释放 |
3.8 黏膜黏附力 |
3.9 促渗作用 |
3.10 降血糖作用 |
3.11 生物相容性 |
4 小结 |
参考文献 |
第六章 巯基化壳聚糖季胺盐纳米载体增加基因转染效率及其作用机理 |
1 材料与仪器 |
2 实验方法 |
2.1 TMC-Cys NC的制备 |
2.2 TMC-Cys NC的粒径和Zeta电势 |
2.3 凝胶阻滞 |
2.4 TMC-Cys NC的形态 |
2.5 核酶抑制 |
2.6 细胞黏附 |
2.7 HEK293细胞摄取 |
2.8 体外释放 |
2.9 亚细胞分布 |
2.10 体外细胞转染 |
2.11 体内转染 |
3 结果和讨论 |
3.1 TMC-Cys NC的制备和表征 |
3.2 凝胶阻滞 |
3.3 TMC-Cys NC的形态 |
3.4 核酶抑制 |
3.5 细胞黏附 |
3.6 HEK293细胞摄取 |
3.7 GSH浓度敏感性释放 |
3.8 亚细胞分布 |
3.9 体外细胞转染 |
3.10 体内转染 |
4 小结 |
参考文献 |
第七章 靶向M细胞、巨噬细胞的MTC纳米载体增加siRNA口服给药功效及其作用机理 |
1 材料和仪器 |
1.1 材料与试剂 |
1.2 仪器 |
1.3 细胞株与动物 |
2 实验方法 |
2.1 MTC的合成与表征 |
2.2 MTC纳米粒的制备 |
2.3 纳米粒粒径和Zeta电势 |
2.4 凝胶阻滞 |
2.5 纳米粒形态 |
2.6 血清稳定性 |
2.7 包封率 |
2.8 体外释放 |
2.9 细胞黏附 |
2.10 体外M细胞模型转运与摄取 |
2.11 小肠M细胞转运与摄取 |
2.12 巨噬细胞摄取 |
2.13 巨噬细胞基因沉默 |
2.14 细胞毒性(MTT试验) |
2.15 siRNA口服给药 |
3 结果与讨论 |
3.1 MTC的合成与表征 |
3.2 MTC纳米粒粒径和Zeta电势 |
3.3 凝胶阻滞 |
3.4 纳米粒形态 |
3.5 血清稳定性 |
3.6 包封率 |
3.7 体外释放 |
3.8 细胞黏附 |
3.9 体外M细胞模型转运与摄取 |
3.10 小肠M细胞转运与摄取 |
3.11 细胞摄取 |
3.12 Raw 264.7细胞基因沉默 |
3.13 细胞毒性(MTT试验) |
3.14 siRNA口服给药 |
4 小结 |
参考文献 |
总结和展望 |
致谢 |
个人简历 |
文献综述 基于壳聚糖类载体的生物大分子药物给药系统 |
(8)靶向核酸纳米归巢气雾装置的构建(论文提纲范文)
英文缩略语表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 胍基化壳聚糖的物化性质和基因转染效率 |
第一节 胍基化壳聚糖物化性质的检测 |
1.材料与仪器 |
2.方法 |
3. 结果 |
4.讨论 |
第二节 胍基化壳聚糖核酸转染效率的评价与机制探讨 |
1.材料与仪器 |
2.方法 |
3.结果 |
4.讨论 |
第二部分 载体的靶向性改造 |
1.材料与仪器 |
2.方法 |
3.结果 |
4.讨论 |
第三部分 超声雾化对载体核酸复合物转染效率的影响及其机理 |
1.材料与仪器 |
2.方法 |
3.结果 |
4.讨论 |
附图 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
(9)新型基因载体巯基烷基化壳聚糖的制备及体外性质的初步研究(论文提纲范文)
英文缩写一览表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
1. 前言 |
2. 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.2 方法 |
3. 结果 |
3.1 质粒 pcDNA3.1(+)-EGFP 的酶切鉴定 |
3.2 TACS 的结构分析 |
3.3 壳聚糖基因纳米粒子的理化性质 |
3.4 壳聚糖对基因的结合和保护 |
3.5 纳米粒的细胞毒性 |
3.6 体外基因转染结果 |
4. 讨论 |
1 壳聚糖作为基因载体的研究 |
2 改性壳聚糖作为基因载体的研究 |
3 TACS性质的初步探讨 |
5. 结论 |
参考文献 |
附录 |
研究成果 |
致谢 |
综述 |
参考文献 |
(10)智能型壳聚糖衍生物的制备及改性壳聚糖在基因传输中的应用(论文提纲范文)
目录 |
摘要 |
Abstract |
第一章 文献综述 |
1.1 甲壳素和壳聚糖 |
1.1.1 概述 |
1.1.2 甲壳素/壳聚糖的性能 |
1.1.3 甲壳素/壳聚糖的应用 |
1.2 壳聚糖的化学改性研究 |
1.3 壳聚糖接枝改性的研究 |
1.4 智能高分子 |
1.4.1 温度响应性高分子 |
1.4.2 pH敏感高分子 |
1.4.3 葡萄糖响应的高分子 |
1.4.4 光响应高分子 |
1.4.5 场响应性高分子 |
1.5 壳聚糖作为基因治疗载体的研究进展 |
1.5.1 概述 |
1.5.2 壳聚糖基因载体 |
1.5.3 壳聚糖基因纳米粒的制备方法 |
1.5.4 目前的问题与难点 |
1.6 本论文的思路和意义 |
参考文献 |
第二章 马来酰化邻苯二甲酰基壳聚糖接枝异丙基丙烯酰胺 |
2.1 引言 |
2.2 实验部分 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 MPCS和接枝产物的结构分析 |
2.3.2 接枝产物的结晶性 |
2.3.3 热稳定性 |
2.3.4 接枝产物的温度敏感性 |
2.3.5 接枝产物的溶解性测试 |
2.3.6 接枝体系各因素对接枝率的影响 |
2.4 本章小节 |
参考文献 |
第三章 马来酰化邻苯二甲酰基壳聚糖接枝甲基丙烯酸羟乙酯 |
3.1 引言 |
3.2 实验部分 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 红外光谱分析 |
3.3.2 核磁分析 |
3.3.3 接枝共聚物的热性能分析 |
3.3.4 接枝共聚物的结晶性 |
3.3.5 接枝体系各因素对接枝率的影响 |
3.4 本章小结 |
参考文献 |
第四章 γ射线引发制备聚丙烯酸-壳聚糖的双亲性凝胶 |
4.1 引言 |
4.2 实验部分 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 接枝产物的红外光谱表征 |
4.3.2 接枝共聚物的热性能分析 |
4.3.3 辐射剂量和单体浓度对接枝反应的影响 |
4.3.4 溶胀度实验 |
4.4 本章小节 |
参考文献 |
第五章 化学法制备带聚丙烯酸侧链的壳聚糖聚两性电解质 |
5.1 引言 |
5.2 实验部分 |
5.2.1 接枝产物的制备 |
5.2.2 聚两性电解质复合粒子自组装 |
5.2.3 表征与测试 |
5.3 结果与讨论 |
5.3.1 结构表征 |
5.3.2 结晶性研究 |
5.3.3 接枝体系各因素对接枝率的影响 |
5.3.4 聚电解质复合物(PEC)的自组装过程 |
5.4 本章小节 |
参考文献 |
第六章 壳聚糖辐射接枝异丙基丙烯酰胺温敏性膜的制备 |
6.1 引言 |
6.2 实验部分 |
6.2.1 壳聚糖膜的制备 |
6.2.2 接枝过程 |
6.2.3 表征与测试 |
6.3 结果与讨论 |
6.4 本章小节 |
参考文献 |
第七章 巯基烷基化壳聚糖基因纳米粒子的制备和研究 |
7.1 引言 |
7.2 实验部分 |
7.2.1 烷基化壳聚糖的制备 |
7.2.2 巯基化烷基化壳聚糖 |
7.2.3 壳聚糖及其衍生物和pDNA复合纳米粒子的制备 |
7.2.4 表征与测试 |
7.3 结果与讨论 |
7.3.1 巯基烷基化壳聚糖的结构分析 |
7.3.2 壳聚糖基因纳米粒子的理化性质 |
7.3.3 壳聚糖对基因的结合和保护 |
7.3.4 MTT法检测结果 |
7.3.5 体外基因转染结果 |
7.4 本章小节 |
参考文献 |
第八章 壳聚糖与苯硼酸接枝共聚的研究 |
8.1 引言 |
8.2 实验部分 |
8.2.1 实验试剂材料 |
8.2.2 邻苯二甲酰化壳聚糖(PHCS)的制备 |
8.2.3 壳聚糖接枝苯硼酸反应 |
8.2.4 表征与测试 |
8.3 结果与讨论 |
8.4 本章小节 |
参考文献 |
结论 |
附录:主要缩略语 |
攻读学位期间发表的论文 |
致谢 |
四、壳聚糖及烷基化壳聚糖/DNA复合物介导的基因转染研究(论文参考文献)
- [1]基于硒活性的壳聚糖复合物的制备研究[D]. 陈琬雯. 江南大学, 2020(01)
- [2]可注射壳聚糖缓释基因载体的构建及在骨缺损修复中的实验研究[D]. 谢娟. 安徽医科大学, 2019(08)
- [3]两亲性N-烷基化-O-季铵盐化壳聚糖制备及其作为药物/基因载体的研究[D]. 叶慧. 深圳大学, 2017(07)
- [4]壳聚糖季磷盐的合成及其用作非病毒基因载体的评价[D]. 钱嫦云. 上海交通大学, 2012(07)
- [5]用于提高体内外基因转染功效的亚油酸和聚苹果酸双接枝壳聚糖新型纳米载体[D]. 王冰清. 复旦大学, 2011(01)
- [6]壳聚糖基非病毒基因载体研究新进展[J]. 刘决照,辛梅华,李明春. 化工进展, 2010(08)
- [7]用于改善生物大分子药物功效的超多孔水凝胶、纳米粒新型给药载体[D]. 殷黎晨. 复旦大学, 2010(11)
- [8]靶向核酸纳米归巢气雾装置的构建[D]. 罗永峰. 广州医学院, 2010(08)
- [9]新型基因载体巯基烷基化壳聚糖的制备及体外性质的初步研究[D]. 白欣. 安徽医科大学, 2009(06)
- [10]智能型壳聚糖衍生物的制备及改性壳聚糖在基因传输中的应用[D]. 慕卿. 中国科学技术大学, 2008(06)