一、进口鸭毛中沙门氏菌的分离与鉴定（论文文献综述）
权国梅[1]（2021）在《F4ac+产肠毒素大肠杆菌锌转运系统ZnuACB功能探究》文中研究指明锌是所有生命体中继铁之后最重要的微量元素,存在于微生物及哺乳动物蛋白质中,可作为结构组成或催化因子参与催化反应、DNA合成、基因表达、免疫反应等多种生理活动。宿主和致病菌在他们的互作界面建立了一种竞争性关系:宿主通过自身锌转运及多种策略限制致病菌的锌利用,影响致病菌的生长和毒力,达到抵御致病菌感染的目的;同时多种肠道共生微生物参与锌争夺,使得肠道内致病菌锌营养受到限制。细菌在面临宿主肠道内复杂的锌限制环境时,为了满足自身营养需求并建立稳固定植,进化出了多种锌转运系统来摄取锌。因此,寻找细菌主要的锌转运摄取系统并全面了解其发挥的主要功能,可为研究新型抗菌策略或抗菌靶点提供一定的理论基础。本研究以产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）参考株F4ac+ ETEC C83902为主要研究菌株,探究了其在低锌环境中主要的锌转运系统,并对锌转运系统在ETEC C83902致病过程中的功能进行了探究。具体研究内容如下:1利用RNA-seq技术筛选锌缺陷条件下F4ac+ETEC C83902主要锌转运蛋白为了揭示F4ac+ETEC C83902在低锌环境下的应对策略,本研究利用RNA-seq技术对锌充足和锌限制条件下F4ac+ETEC C83902的差异表达基因（different expression genes,DEGs）进行了筛选。结果显示,与锌充足条件相比,锌缺陷条件下有505个DEGs显着上调,523个DEGs显着下调。对DEGs进行了 GO和KEGG pathway富集分析,发现这些DEGs参与细菌多种生物学过程。其中与锌转运相关且表达显着上调的基因有znuA和znuCB;与锌转运相关且表达显着下调的基因有zntA、cusA、cusB、cusC和zraP。这些数据表明,ETEC C83902在缺锌的情况下,上调锌摄取转运系统基因的表达,下调锌转出系统基因的表达,以调节自身锌动态平衡。2 ETEC C83902 ZnuACB系统缺失株的构建及该系统对细菌在低锌环境下生长的影响前期RNA-seq结果显示,ETEC C83902在锌缺陷锌条件下上调ZnuACB（Zinc uptake）锌转运系统表达。为探究该系统在ETEC C83902菌中的功能,本研究对ETEC C83902锌转运系统znuACB基因进行了测序,并利用λ-Red同源重组系统构建了 ETEC C83902AznuA、ETEC C83902ΔznuB、ETEC C83902ΔznuC单个亚单位基因缺失株和ETEC C83902ΔznuACB全长基因缺失株,并检测了上述缺失株在TPEN处理的锌缺陷条件下的生长情况。研究结果显示:在锌缺陷培养条件下,ZnuACB功能的缺失导致细菌生长受到抑制,而添加锌可以抵消缺失株的生长抑制,这表明ETEC C83902ZnuACB锌转运系统通过摄取锌维持细菌在低锌环境下的生长。3 ZnuACB系统缺失对F4ac+ETEC生物被膜形成和黏附细胞能力的影响生物被膜是细菌为了适应外界环境,由自身产生的一种菌落聚集体,以保护细菌,使其能在严峻环境中生存繁殖。为探究ZnuACB转运系统对ETEC C83902生物被膜形成能力的影响,本研究进行了生物被膜定性、定量试验。结果发现,无论是在常规生物被膜诱导培养基条件,还是在TEPN处理的锌缺陷培养条件下,ZnuACB系统功能的丧失都会导致生物被膜形成能力的下降（p<0.05）。此外,本研究探究了 ZnuACB系统对ETEC C83902黏附IPEC-J2细胞能力的影响。结果显示:在常规LB培养条件下,ZnuACB系统的缺失导致ETEC C83902黏附能力下降,但差异不显着。在锌缺陷培养基中,ZnuACB系统全长基因的缺失导致ETEC C83902黏附能力下降81%（p<0.001）,且这种降低作用在添加锌离子后得以恢复。利用qPCR检测了不同培养条件下,ZnuACB系统的缺失对ETEC C83902黏附因子亚单位基因（faeG、fimA、cpA）;肠毒素eltB;生物被膜形成相关基因（luxS、pfs）转录水平的影响。结果显示,在LB培养条件下,与WT组相比,ETEC C83902ΔznuACB组的faeG、ecpA、luxS基因转录分别下降约25%、27%、33%（p<0.05）;fimA、eltB、pfs基因转录分别下降 16%、23%、21%（p>0.05）。在TPEN处理的锌缺陷培养条件下,与WT组相比,ETEC C83902ΔznuACB组的faeG、ecpA、eltB、luxS、pfs基因转录分别下降 46%、48%、72%、46%、41%（p<0.01）,fimA基因转录上调21%（p>0.05）。综上,本研究证实ZnuACB转运系统在维持低锌条件下细菌生物被膜形成、黏附力、毒力因子表达方面发挥重要作用。4 ZnuACB系统缺失对ETEC C83902鞭毛形成及对肠上皮细胞促炎反应的影响鞭毛是细菌主要的运动器官,但也作为重要的毒力因子参与细菌的致病过程。本研究探究了 ZnuACB锌转运系统缺失对鞭毛的影响。结果显示,ZnuACB锌转运系统的缺失导致细菌运动性降低,且在锌缺陷培养条件野生株（WT）运动性也丧失,提示锌的缺乏会降低细菌运动能力。回补0.5mM Zn2+后,WT及ZnuACB转运系统缺失株运动能力均得以恢复,且WT运动性恢复更为显着;而添加1mMZn2+后,WT及ZnuACB转运系统缺失株无运动,提示过量的锌会使细菌丧失运动能力。检测与细菌鞭毛合成相关基因的表达情况,结果显示:与WT相比,在LB培养条件下,ETEC C83902ΔznuA CB菌鞭毛合成相关基因flhC、fliA、fliC表达量分别下降了 67%、90%、92%（p<0.01）;在TPEN处理的锌缺陷条件下,ETEC C83902ΔznuACB flhC、fliA、fliC表达量分别下降了 75%、75%、63%（p<0.01）。此外,炎性因子表达情况检测表明:细菌感染IPEC-J2细胞1小时后,与WT感染组相比,ETECC83902ΔznuACB感染组IL-6、IL-8、TNF-α表达水平分别下降30%、46%（p<0.05）,24%（p>0.05）;锌缺陷条件下,细菌感染IPEC-J2细胞1小时后,与WT感染组相比,ETEC C83902ΔznuACB感染组IL-6、IL-8、TNF-α表达水平分别下降31%、45%、22%（p<0.05）。细菌感染IPEC-J2细胞4小时后,与WT感染组相比,ETEC C83902ΔznuACB感染组IL-6上调12%（p>0.05）,IL-8上调15%（p>0.05）,TNF-α无明显变化;锌缺陷条件下,细菌感染IPEC-J2细胞4 小时后,与 WT 组相比,ETEC C83902ΔznuACB感染组 IL-6 下调 26%（p<0.01）,IL-8下调46%（p<0.01）,TNF-α保持不变。综上,锌匮乏或锌转运系统的缺失可以导致细菌鞭毛合成相关基因在转录水平的表达下调,造成细菌鞭毛合成障碍,使细菌运动能力降低,同时,ZnuACB系统的缺失也降低细菌感染细胞后的炎性因子表达。5体内探索ZnuACB系统缺失对F4ac+ETEC C83902致病力的影响前期体外试验研究表明,ZnuACB锌转运系统对维持ETEC C83902生长、生物被膜形成、IPEC-J2细胞黏附、运动性等致病力方面具有重要作用,尤其是在低锌环境下,影响更为突出。为探究ZnuACB锌转运系统对ETEC C83902在仔猪体内致病力的影响。本研究进行了仔猪攻毒试验,结果发现,ZnuACB锌转运系统的缺失导致ETEC C83902引起的仔猪腹泻症状减轻、粪便载菌量减少;感染仔猪小肠绒毛的损伤程度降低;诱发宿主炎性反应程度降低,进一步证实ZnuACB锌转运系统在ETEC C83902致病力方面发挥重要作用。
吴秋玲[2]（2019）在《河南省生猪中主要食源性致病菌污染调查及沙门氏菌耐药分析》文中认为我国的猪肉生产量和消费量均居于世界首位,猪肉产业规模大,养殖企业数量增加,因此猪肉以及猪肉制品的安全问题就和国民健康息息相关。然而,近年来,国内外由食源性病原菌引发疾病的事件频频发生,严重危害人们的健康。食源性病原菌是引起食源性疾病的主要原因之一,是全球关注的食品安全核心问题,已成为威胁人们健康的重要公共卫生问题。因此,我国应加强对食源性疾病的研究,做好防控工作。本文将简要介绍食源性致病菌的在养殖场和屠宰场待宰生猪中流行情况,对引起生猪感染致病菌的因素进行调查,对分离出的致病菌的耐药情况进行分析,做好致病菌流行情况和耐药情况的分析,可以做好有效的防控以减少致病菌对生猪及其猪肉制品的污染,也可以在疾病发生时进行有效的治疗。引起细菌性食物中毒的食源性致病菌主要包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希菌和大肠杆菌O157:H7等,我们于2018.1-2019.9期间先后从河南省3个地区7个生猪养殖场共获得1001份样品,其中鼻腔拭子样品400份,肛门拭子样品556份,水样品15份,空气样品15份,饲料样品15份;从河南省3个市9个屠宰场共采集1522份样品,其中肛门拭子897份,鼻腔拭子320份,体表拭子包括劈半、脱毛和冷库共275份,烫毛水样15份,空气样15份。将采集到的样品按照国家标准（GB）规定的常规微生物学检验方法同时结合分子生物学方法进行主要食源性病原菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、致病性大肠埃希菌的分离、鉴定,然后利用微量肉汤稀释法检测沙门氏菌分离株对氨苄西林（ampicillin）（含量85.5%）、磷霉素（fosfomycin）（钠70%）、氟苯尼考（florfenicol）（含量98%）、喹乙醇（olaquindox）（含量80%）、头孢噻肟（cefquinome）等17种抗菌药的敏感性。结果显示,养殖场所采样品中,沙门氏菌的分离率为32.19%（179/556）,金黄色葡萄球菌的分离率为30.25%（121/400）,单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7与小肠结肠炎耶尔森菌均未分离到阳性菌株。从屠宰场宰前生猪肛门拭子样品中分离出沙门氏菌221株,分离率为25.20%（221/877）;从鼻腔拭子中分离出金黄色葡萄球菌18株,其分离率为18%（18/100）。在屠宰加工过程不同环节的样品中也分离到了沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,其中,麻电环节沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的分离率分别为30%（30/100）和24%（24/100）;劈半环节分离率分别为12.09%（11/91）和0;脱毛环节分离率分别为15.56%（14/90）和4.44%（4/90）;在卸头环节中,金黄色葡萄球菌的分离率为31.67%（38/120）;烫毛池水样中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的分离率分别为40%（6/15）和6.67%（1/15）。在冷库环节,上述两种细菌在体表拭子中的分离率分别为4.26%（4/94）和1.06%（1/94）。在屠宰场所有样品中均未分离出其他3种致病菌。本试验对养殖场和屠宰场分离出的沙门氏菌进行耐药分析,结果显示沙门氏菌对氨苄西林、多西环素高度耐药,耐药率分别为92.9%、100%。同时,粘菌素作为抗革兰氏阴性杆菌抗生素,受试菌中对粘菌素耐药的菌株也较多,耐药率达到78.6%。从屠宰场分离到的沙门氏菌,不同来源、不同环节的沙门氏菌对抗生素的耐药率存在差异,在新郑某屠宰场命名为A,漯河某屠宰场命名为B所采的3批样品中分离出的沙门氏菌对多西环素、四环素的耐药率都接近100%,然而,B1的沙门氏菌对氨苄西林、黏菌素、氟苯尼考、新霉素、头孢他啶也表现出了高度的耐药,B2的沙门氏菌对卡那霉素、氟苯尼考也表现出来高度耐药,屠宰链的不同环节沙门氏菌对同一种抗生素的耐药表现出差异,例如B2宰前肛、麻电肛、劈半体表、脱毛体表、冷库体表样品中分离出沙门氏菌对恩诺沙星的耐药率分别为91%、47%、62.5%、40%、100%,存在较大的差异。整体结果显示,沙门氏菌和金黄色葡萄球菌对生猪以及屠宰加工环节的污染情况较严重,其中沙门氏菌在养殖场和屠宰场宰前生猪中分离率差异不大,但金黄色葡萄球菌在养殖场中污染情况较屠宰场宰前环节严重。在不同屠宰场所采样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的污染情况又存在较大的差异,在屠宰链不同环节中,烫毛池水样致病菌分离率最高,其次为麻电环节。值得我们关注的是在冷库体表中也分离到了致病菌,这就可能在猪肉及猪肉制品流入市场后引发食源性疾病。通过对河南部分地区生猪养殖场和屠宰场进行致病菌污染调查,对分离得到的沙门氏菌进行耐药分析,了解到沙门氏菌在养殖场和屠宰场的污染情况严重,且沙门氏菌出现多重耐药,因此必须严格控制抗菌药物在畜牧业中的滥用和不合理使用,从而为食品安全和人类健康提供保障。
王立业[3]（2016）在《艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的处置与残留消除研究》文中研究说明艾地普林为新型二氢叶酸还原酶抑制剂类抗菌药,药效学与甲氧苄啶（TMP）相似,但在多种动物的药动学性质显着优于TMP,预示着该药具有广阔的开发应用前景。药物在动物体内代谢和处置不仅关系到药理活性或毒性的变化,同时也影响其残留部位与消除速率。为了全面揭示艾地普林在多种动物体内的变化过程与规律,科学评价其有效性与安全性,本研究首先合成了氚标记艾地普林,采用放射性示踪与LC-v.ARC/MS-IT-TOF联用对艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的代谢、排泄、分布和消除进行研究;制备艾地普林及主要代谢物的标准物质;研制艾地普林注射剂并对其在猪体内的排泄规律进行研究;建立了艾地普林及其代谢物在猪、鸡和鱼主要组织中的多残留高效液相色谱检测方法,对艾地普林在猪、鸡和鱼体内的残留消除进行研究,进一步确定残留靶组织和残留标示物;最后按照JFFCA等国际组织推荐的食品安全性评估的指导原则,艾地普林开展食品安全性评价。本研究为艾地普林的临床使用和残留监控提供必要的科学依据。1氚标记艾地普林的合成及其质量标准研究以3,5-二甲氧基-4-二甲氨基苯甲醛为原料,经醛基还原、溴取代、斯文氧化、Knoevenagel反应及成环反应合成2-溴-艾地普林。2-溴-艾地普林在氢氧化钠的甲醇溶液和DMF的混合溶液中与250mmHg氚气在60℃下被10%Pd/C催化发生T-Br交换生成粗产物2-氚-艾地普林。对粗产物进行制备液相分离纯化得到2-氚-艾地普林。对2-氚-艾地普林质量研究结果表明:化学纯度≥99%,放化纯度≥99.2%,比活度为17.2Ci/g,-20℃存储6个月其化学纯度和放化纯度均保持在98%以上,稳定性良好。2艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的物料平衡与代谢研究猪4头和鸡、鱼、大鼠各6只/尾按5mg/kg BW单次灌胃3H-ADP后不同时间点收集排泄物。样品一部分经消化后LSC测定总放射性,分析艾地普林在动物体内的排泄规律;另取一部分样品经提取净化后LC-v.ARC/MS-IT-TOF对放射性化合物进行定性定量分析。结果表明,艾地普林在四个物种中排泄集于0-1d,之后缓慢排泄。停药后0-1d,猪、鱼和大鼠的累积排泄回收率达到72%以上,鸡的达到85%以上;停药后0-7d,四种动物的回收率均达到90%以上。在14d的回收期内,猪、鸡、鱼和大鼠的累积排泄回收率分别为95.6±1.2%、94.2±3.1%、94.2±2.7%和94.8±7.9%。在猪和大鼠,约78%剂量通过尿液排泄,剩余通过粪便排泄。在猪、鸡、鱼和大鼠体内分别发现包括原型在内的12、11、3和6种放射性化合物,代途径包括N-脱甲基化、甲氧基脱甲基化、α-羟基化、N-氧化和NH2-葡萄糖醛酸结合。N-脱甲基化是主要的代谢方式,形成两个主要代谢物N-脱一甲基艾地普林和N-脱二甲基艾地普林。艾地普林是所有样品中最主要的成分能被检测到最后时间点,其它代谢物消除较快。停药后6h,艾地普林、N-脱一甲基-ADP和N-脱二甲基-ADP在猪尿液和粪便中分别占样品放射性的42.3、11.4、11.8%和89.1、9.7、1.1%,在鸡排泄物占样品放射性的63.2、12.8、6.5%,在鱼排泄物占样品放射性的87.5、9.9、2.5%,在大鼠粪便和尿液中占样品放射性的71.2、14.7、2.6%和79.6、20.5、0.0%。3艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的分布与消除研究猪24头、鸡36只、鱼42尾和大鼠36只分别随机分为6组（鱼7组）按5mg/kg BW连续7天灌胃3H-ADP,末次给药后不同时间点宰杀一组动物并收集所有组织。样品一部消化后LSC测定其总放射性,得到组织中总残留量的分布特征;另取一部分主要组织样品经提取净化后HPLC-v.ARC/MS-IT-TOF对药物及其代谢物进行定性定量分析。艾地普林及其代谢物在四个物种中分布广泛,停药后6h,浓度最高的组织为胆汁,其次是肾脏、肝脏、脾脏、肺、肾上腺以及免疫和消化系统,在心脏、肌肉、脂肪、血液、鱼鳔、皮肤和被毛中的浓度相对较低。停药后1d药物浓度下降较快,约为6h浓度的1/2。停药后第7d（鱼第14d）所有组织均能检测到放射性。停药后第14d（鱼21d）,肝脏中的药物浓度最高,在猪、鸡、鱼和大鼠中分别达到372±25、160±23、103±21和185±25μg/kg,其次为肾脏;其他组织只能检测到少量放射性。总残留在肝脏的消除半衰期最长,分别达到4.38、3.40、6.63和4.17d,肝脏被推荐作为艾地普林残留监控的靶组织。在猪、鸡、鱼和大鼠的主要组织中,12（A0-A11）、8（A0、A1、A2、A3、A9、A10、A11、A12）、3（A0、A1、A2）和6（A0、A1、A2、A6、A9、A10）放射性化合物被检测到,大部分的放射性化合物在肝脏和肾脏中被发现,肌肉和脂肪中只检测到A0、A1和A2。A0、A1和A2作为主要的组分能被检测到停药后第3d,其他次要代谢物仅能被检测到6h或1d。停药后7d或14d,只能检测到少量A0。在所有四个物种主要组织中,A0的含量最高,占样品放射性的比例均大于42%。A1作为主要代谢物,分别在猪、鸡、鱼和大鼠样品中占样品放射性的18.2～34.1%、21.3～26.8%、12.4～16.8%、19.2～38.5%和 4.0～14.1%、1.6～7.9%、1.6～2.9%、3.1～5.3%。在肝脏中,A0的消除半衰期最长且其消除趋势与总残留趋于一致,建议作为艾地普林在猪、鸡和鱼体内的残留标示物。4艾地普林及其主要代谢物标准物质的制备及质量研究通过优化的艾地普林合成路线合成艾地普林。以3,5-二甲氧基-4-甲氨基苯腈为原料,经过腈基还原、Knoevenagel反应和环合反应合成N-脱一甲基艾地普林。以对氨基苯腈为起始原料,经过苯环溴取代、甲氧基化、腈基还原、Knoevenagel反应及环合反应合成N-脱二甲基艾地普林。以艾地普林为原料、无水三氯化铝为脱甲基试剂,对艾地普林脱甲基反应得到3-羟基艾地普林。将合成的各化合物经分离纯化、干燥后得标准品候选物。对标准品候选物的结构进行紫外、红外、核磁共振、质谱和元素分析的确证并通过对其质量标准研究,得出艾地普林、N-脱一甲基-艾地普林、N-脱二甲基-艾地普林、3-羟基-艾地普林的含量定值分别为98.76%、98.48%、98.41%和98.32%,相关质量标准符合含量测定标准物质的要求。5艾地普林注射制剂的研制及其在猪体内的排泄研究以ADP为原料药,注射用水为溶媒,乳酸作为助溶剂筛选得到最佳处方组成为:200mg艾地普林加入20.0μL乳酸助溶后定容至2mL注射用水中,溶液经过过滤、封装、灭菌得到艾地普林注射剂。对研制注射液按照《中华人民共和国兽药典》（2010版）注射制剂质量标准要求进行质量和稳定性研究。结果表明,所研制ADP注射液符合药典规定的质量标准要求,其在6个月的加速试验和12个月的长期试验研究中,含量下降均<5%,外观色泽等指标无明显变化,艾地普林注射剂的稳定性良好。建立了艾地普林（AO）、N-脱一甲基艾地普林（A1）、N-脱二甲基艾地普林（A2）和3-羟基艾地普林（A3）在猪粪便和尿液中的多残留检测高效液相色谱方法。猪4头按5 mg/kg BW单次肌注艾地普林注射剂,给药后不同时间点分别收集粪便和尿液,样品经提取净化后分别HPLC-UV和LC/MS-IT-TOF测定。结果表明,排泄的高峰期主要集中在0-6h和6h-1d,分别占给药量的25.5±2.9%和26.4±4.7%,之后只有很少的药物被回收。14d内累积回收到66.7士3.5%的给药剂量,其余给药剂量可能为随尿液排泄的未被定量的次要代谢物。尿液中药物的回收量显着大于粪便,分别占给药量的61.4±4.7%和5.3±1.7%。质谱检测结果表明,所检测的化合物种类与放射性研究中口服给药的基本的一致,并未有新的化合物被发现。6艾地普林在猪、鸡和鱼体内的残留消除研究建立了 A0、A1、A2和A3在猪和鸡的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪、心、肺、胃、大肠和小肠9种组织和鲤鱼的肝脏、肾脏、肌肉、皮肤、胃肠和鳔6种组织中的多残留检测方法。猪30头、鸡36只和鲤鱼60尾分别平均随机分成6组,猪按5mg/kg BW连续7d肌肉注射、鸡和鲤鱼分别5mg/kg b.w连续7d灌胃艾地普林后不同时间点宰杀一组动物,收集组织。按建立的方法对样品处理并测定。结果表明,肝脏、肾脏和肺脏中艾地普林及其代谢物残留量最高,A0是三个物种中不同时间点各组织中最主要的组成成分,其次是A1,A2的含量最低,未检测出A3。在猪、鸡和鱼体内,肝脏是药物滞留时间最长的组织,其中艾地普林原型在肝脏中的半衰期最长,分别为3.04、2.54和4.53d,推荐艾地普林在猪、鸡和鲤鱼体内的残留靶器官为肝脏,残留标示物为艾地普林原型。7艾地普林在猪、鸡和鱼可食组织中休药期和最高残留限量标准的制定按照JECFA等国际组织推荐的兽药残留风险评估的程序和方法,对艾地普林在猪、鸡和鲤鱼可食组织进行风险评价,制定艾地普林的最高残留限量（MRLs）和休药期（WDT）标准。结合我国国情,建议采用相对保守的EMEA评价程序所制定的休药期和残留限量标准:艾地普林在猪和鸡肝、肾、肌肉和脂肪及鱼的肌肉中的MRLs为50μg/kg;在猪、鸡和鲤鱼的WDT分别为20d、17d和12d。本研究改进了艾地普林的合成路线并合成得到质量合格的氚标记艾地普林,科学阐释了其在猪、鸡、鱼和大鼠体内代谢和处置特点,制备得到艾地普林及主要代谢物的标准物质,成功研制艾地普林单方注射制剂并揭示了其在猪体内的排泄规律,确定了艾地普林在猪、鸡和鲤鱼体内的残留靶组织和残留标示物,结合毒理学数据最终制定了艾地普林三种动物体内最大残留限量和休药期等食品安全性标准。这些成果进一步完善了艾地普林安全性评估的内容,为艾地普林的科学合理使用和成功上市提供了必要科学依据。
谢京国,鞠波,王庆锡,闫静[4]（2015）在《进口原羊毛检疫监管中的数字管理》文中认为以进口原羊毛检疫监管过程为研究对象,分析提炼检疫监管过程中主要环节的关键数字。通过数字分析,可以在整个进口原羊毛检疫监管链条过程中准确把握产品质量安全的关键问题,提升进口原羊毛检疫监管有效性。
胡霏[5]（2013）在《鼠伤寒沙门氏菌免疫磁分离结合荧光免疫层析快速检测方法的研究》文中研究表明沙门氏菌是最常见的人畜共患病原菌之一，鼠伤寒沙门氏菌又是在沙门氏菌感染中常居首位，主要侵袭回肠、结肠，甚至整个胃肠道，常引起小肠结肠炎，在小儿的沙门氏菌感染中最为常见。该病潜伏期一般为8～48h，起病急，多以腹泻、发热起病；由于体质差异，该病轻重缓急不尽相同。因此，建立一个针对鼠伤寒沙门氏菌感染的快速、高灵敏度的半定量检测方法对沙门氏菌病的临床诊断具有重要意义。本论文以破碎的鼠伤寒沙门氏菌抗原免疫雄性新西兰大白兔，制备抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体。经过4次免疫以及1次加强免疫，获得抗血清，采用辛酸硫酸铵沉淀法纯化，并通过间接ELISA测得抗体效价为106。通过SDS-PAGE电泳实验对抗体进行评价，有部分杂带，但重链与轻链明显，重链约50kD，轻链约25kD。用间接ELISA方法对13种菌进行特异性实验，该多抗仅与属内菌株及大肠杆菌O157:H7出现交叉。在荧光免疫层析平台，利用双抗体夹心的免疫学原理将抗体进行配对，最终选择多抗的自配对，并对试纸条进行条件优化。在最优条件下制备的试纸条，检测限为3.162×106cfu/mL，定量限为4.082×106cfu/mL；三批试纸条对鼠伤寒沙门氏菌菌液浓度对数lgc的回收率均在96%101%之间，其中对高浓度菌液的浓度回收率在80%120%之间，对低浓度菌液的浓度回收率也达到60%以上；T值、C值、T/C值的板内及板间变异系数均在5%以内。在免疫磁分离平台，选用微米级羧基端磁珠XMag-COOH，经EDC和NHSS活化，并偶联多抗得抗鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠。确定最佳偶联条件为，向每0.5mg磁珠中添加100μg抗体，于37℃pH6.010mM MES缓冲液体系中偶联2h，并用1%BSA的PBST对免疫磁珠进行封闭。富集实验时，向1mL菌液中加入0.5mg免疫磁珠，在37℃条件下混合45min。最佳洗脱条件为用pH2.60.2M磷酸-柠檬酸缓冲液洗脱5min，并用Tris-HCl调体系pH至7.0左右后进行荧光层析实验，测得洗脱回收率为45%左右。本论文针对鼠伤寒沙门氏菌建立了免疫磁分离技术结合荧光免疫层析技术的快速检测方法。荧光免疫层析检测模拟样本的回收率在60%170%之间，联合检测模拟样本时回收率在38%55%之间，即实际富集倍数可达55倍，灵敏度至少可达105cfu/mL。
肖西志[6]（2013）在《食品和饲料中沙门氏菌及动物皮毛中炭疽杆菌快速鉴定方法的研究》文中研究说明传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及血清学特性等方面加以鉴定。但在实践中，细菌的分离过程往往出现假阳性的结果，直到最后的鉴定（生化和血清学鉴定），而且对于目前已经开发成熟的鉴定系统，如VITEK、BIOLOG,、脂肪酸分析系统等仍然存在无法对相似菌进行鉴定的情况。在沙门氏菌的日常检测过程中，经常在选择性培养基中分离到类似于沙门氏菌的细菌。这些细菌的分离给后续确定带来很大的干扰，不仅造成人力和物力的浪费，还大大推迟了得到确诊结果的时间。对于分离到的可疑沙门氏菌，通常会进行系统的生化鉴定以及血清学鉴定。生化鉴定可以通过商品化的微生物鉴定系统，如VITEK2、BIOLOG和PHOENIX-100，血清学鉴定则需要昂贵的分型血清逐一进行。细菌的生化鉴定成本高、检测周期长、特异性低。同时血清型分析在临床检测中存在假阳性的缺点，而且也是个耗时、费力的工作。因此，迫切需要改良并开发新的方法来弥补传统鉴定方法的不足。在炭疽杆菌的检测过程中，假阳性的反应经常出现，一些常见的芽胞杆菌是引起假阳性的真正原因。这些细菌包括苏云金芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、环状芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌等。因此，需要研究更准确、快速的炭疽杆菌鉴定方法。本研究的目的，一是在沙门氏菌检测过程中经常分离到的铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌为研究对象，分别制备了这两种菌的多克隆抗体，通过体外抑菌试验和临床应用，拟建立一种抑制并消除这两种干扰菌所带来干扰的沙门氏菌快速鉴定方法；二是以动物皮毛中的细菌16S rDNA为研究对象，用PCR方法对分离到的可疑培养物进行16S rDNA的扩增，然后用17种内切酶分别对PCR产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳后出现特异性的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，从而达到对炭疽杆菌准确、快速鉴定的目的。本研究获得了以下研究结果：（1）用铜绿假单胞菌免疫新西兰大白兔后，血清经纯化后所得到的IgG抗体在体外能够抑制并杀灭铜绿假单胞菌，同时对其他来源的这两种菌也具有抑制和杀灭活性，该作用通过扫描电镜和细菌培养试验得到证实，即在加入铜绿假单孢菌多克隆抗体后的10min，菌体开始膨胀、裂解，并于80min后全部裂解。阴沟肠杆菌作为对照，没有受到所制备的抗体的影响。同时，所制备的多克隆抗体对添加于RVS肉汤和MkTTn肉汤中的沙门氏菌也没有任何抑制作用。（2）将铜绿假单胞菌多克隆抗体应用于沙门氏菌检测过程中，即添加于选择性增菌液中，可明显抑制增菌液中铜绿假单胞菌的生长，从而避免了在随后的选择性分离过程中铜绿假单胞菌所带来的干扰。在实际应用过程中，用未经改良的方法检测沙门氏菌阴性样品时，铜绿假单胞菌的检出率很高，最高达19.8%（45/227），而用改良的方法，则铜绿假单胞菌的检出率仅有2.2%（5/227），沙门氏菌分离的准确率提高了89.2%。因此，在沙门氏菌检测过程中，添加铜绿假单孢菌多克隆抗体可明显提高沙门氏菌分离鉴定的准确性，在降低了检测成本的同时，也缩短了检测周期。（3）用奇异变形杆菌免疫新西兰大白兔后，血清经抗体纯化柱纯化所得到的IgG抗体在体外能够抑制并杀灭奇异变形杆菌，同时对其他来源的奇异变形杆菌也具有抑制和杀灭活性，该作用通过扫描电镜和细菌培养试验得到证实，即奇异变形杆菌与制备的奇异变形杆菌抗体孵育2h后，在扫描电镜下形成网状结构。裂解物的培养显示，无细菌生长。而所制备的奇异变形杆菌多克隆抗体对沙门氏菌和其他肠杆菌科的细菌无抑制作用。（4）将奇异变形杆菌多克隆抗体应用于沙门氏菌检测过程中，即添加于沙门氏菌的选择性增菌液SC和MM中，可抑制增菌液中奇异变形杆菌的生长，从而避免了在随后的选择性分离过程中奇异变形杆菌所带来的干扰。在实际应用过程中，常规方法的检测结果显示，假阳性率最高达到57%（12/21），而应用改进的方法，假阳性率只有18%（2/11），准确率提高了68.4%。因此，作为一种特异性的抑制剂，奇异变形杆菌多克隆抗体的应用明显提高了沙门氏菌检测过程中的准确性，降低了检测成本，节约了检测时间。（5）针对细菌16S rDNA，建立了鸡尾酒式的内切酶分析方法，即应用17种内切酶分别对PCR扩增的细菌16S rDNA分别进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，所建立的方法能够在48h内对存在于动物皮毛中常见的细菌进行准确、快速的鉴定，同时将炭疽杆菌与其他细菌进行了准确的区分。因此，所建立的方法作为炭疽杆菌鉴定的补充方法，可应用于临床炭疽杆菌的快速鉴定中。综上所述，本研究首次将抗体作为抑制剂介入到沙门氏菌的分离培养过程中，成功地抑制并消除了相应的干扰菌所带来的干扰。在实际的应用过程中，不仅提高了沙门氏菌分离的准确性，而且也节省了大量的人力、物力，缩短了沙门氏菌鉴定的时间；成功建立了基于细菌16S rDNA的PCR-RFLP指纹图谱的炭疽杆菌鉴定方法，该方法在无须进行DNA序列测定的情况下，对从动物皮毛中分离到的可疑炭疽杆菌培养物进行准确的鉴定，为炭疽杆菌的快速鉴定提供了一种补充方法。
廖晓丹[7]（2012）在《减毒沙门氏菌递呈PEDV/TGEV双基因核酸疫苗研究》文中指出猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）主要引起猪的病毒性腹泻,这两种病原引起的腹泻对2周龄内新生仔猪危害尤为严重,可导致感染仔猪发生严重的腹泻、呕吐与脱水,死亡率高达100%,给养猪业造成严重的经济损失。如何增强猪的肠道特异性黏膜免疫对其防治具有重要意义。本研究在临床分离鉴定PEDV的基础上,基于PEDV和TGEV相似的致病机理和免疫特点,创新性研究增强黏膜免疫诱导效力的新型口服基因疫苗的免疫机理,以PEDV S基因及TGEV S双基因为靶基因,pVAXD双启动子真核表达质粒为载体,进行减毒沙门氏菌携带的PEDV和TGEV二联DNA疫苗的构建与免疫原性研究,主要研究内容如下：1.猪流行性腹泻病毒的分离鉴定本文用Vero细胞成功地从仔猪腹泻粪样中分离了PEDV四川分离株（SC-L株）,并对其生物学特性进行了初步研究。PEDV SC-L在Vero细胞上连续传代,增殖稳定,典型病变在接毒后48小时开始出现,表现为细胞变圆、细胞肿胀、最终细胞皱缩、破碎并脱落。通过透射电镜观察发现：病毒粒子在感染细胞胞浆内可见散在或呈晶格状排列的空心或实心的病毒粒子；病毒粒子成堆或成串排列在细胞膜上,与细胞膜融合,然后以胞外分泌的方式被释放到细胞膜外。病毒对5-溴脱氧尿核苷不敏感,是一种RNA病毒,对氯仿、乙醚敏感,60℃或以上处理30min便会失去感染力。通过对其S基因S1区进行序列测定,发现与韩国DR13株同源性最高,核苷酸同源性高达99.2%。遗传进化树分析显示所分离毒株与韩国DR13分离株亲缘关系最近。该毒株的成功分离为该病的诊断和防制积累了基础材料。2. PEDV S基因主要抗原区域基因片断的克隆及原核表达研究采用PCR方法从PEDV S基因TA克隆质粒中扩增出S基因的主要抗原区域基因片段Sa,扩增得到的Sa片段插入到pMD19-T simple中,构建的重组质粒命名为pMD19-T-Sa。对核苷酸序列进行测定和分析：扩增的基因长度为739bp,可编码247个氨基酸残基。本研究将Sa插入pET-32a（+）原核表达质粒,构建了原核表达质粒pET-32a（+）-PEDV-Sa,在大肠杆菌BL21中进行原核表达,SDS-PAGE电泳鉴定,原核表达质粒pET-32a（+）-PEDV-Sa表达的目的融合蛋白大小为45Kd,表达的蛋白经亲和层析法纯化后免疫家兔,制备PEDV Sa重组蛋白的多克隆抗血清。3. PEDV S基因与TGEV S基因双基因共表达真核质粒的构建采用RT-PCR扩增PEDV S基因S1区（包含病毒的主要中和表位和受体结合区域）和TGEV SC-H株S基因（包含A、B、C、D四个抗原位点）,分别将其插入pMD19-T simple载体,构建重组质粒pMD19-T-PSl与pMD19-T-TS。对pMD19-T-PS1与pMD19-T-TS的核苷酸序列进行测定：克隆的PEDV SC-L株S1基因长约2367bp,编码789个氨基酸残基,TGEV SC-H株S基因长约1896bp,编码632个氨基酸残基。序列比对分析显示：PEDV SC-L株S1基因编码的氨基酸序列与其它PEDV毒株的同源性在88.8%-98.6%,TGEV SC-H株与其它TGEV毒株S基因编码的氨基酸序列同源性在95.5%～99.7%之间。研究以pVAXD双启动子真核表达质粒为载体,构建了能够同时表达PEDV S1和TGEV S基因的真核表达质粒pVAXD-PS1-TS以及分别单独表达PEDV S1基因和TGEV S基因的真核表达质粒pVAXD-PS1和pVAXD-TS。将构建成功的三种真核表达质粒以脂质体法分别转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光检测发现：真核表达质粒转染的COS-7细胞在倒置荧光显微镜下呈现特异性荧光；表明上述构建的三种重组质粒可在体外表达。PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒pV AXD-PS1-TS、pV AXD-PS1与pVAXD-TS的成功构建为PEDV和TGEV DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。4.携带PEDV S和TGEV S双基因的减毒沙门氏菌口服疫苗免疫研究研究将三种真核表达质粒pV AXD-PS1-TS、pV AXD-PS1与pVAXD-TS分别电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建了同时携带PEDV S1和TGEV S基因的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAXD-PS1-TS）;以及携带PEDV S1基因的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAXD-PS1）和携带TGEV S基因的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAXD-TS）。小鼠灌胃接种重组减毒沙门氏菌后,提取小鼠肠道细胞总RNA,通过RT-PCR检测S1与S基因的转录。将重组菌SL7207（pVAXD-PS1）与SL7207（pVAXD-TS）混合以1×109CFU/只的剂量灌胃接种小鼠,SL7207（pVAXD-PS1-TS）以1×109CFU/只的剂量灌胃接种,间接ELISA方法检测免疫后小鼠的特异性PEDV和TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体水平。结果：重组减毒沙门氏菌可有效激发免疫小鼠特异性PEDV（?）TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体的产生,具有良好的免疫原性。通过比较单基因混合免疫组和双基因免疫组之间的抗体水平进一步表明：单基因混合免疫组的特异性血清IgG与肠道IgA抗体在三个免疫组中最高,且在免疫后第六周显着高于（P<0.05）其它免疫组。研究为PEDV和TGEV口服DNA疫苗的研究和应用奠定了基础。
刘斌[8]（2012）在《沙门氏菌血清分型分子靶点的发掘及鉴定体系的建立》文中认为沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一,它引起的食物中毒病例在世界范围内常常排在首位。该菌有2500多个血清型,近50个血清组。但是,能够感染人类的致病菌株主要集中于4个血清组（即血清组A、B、C和D）中,其中伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡沙门氏菌等8种血清型是最常见的感染人体和禽畜类动物的菌型。传统的血清学分型方法存在着许多缺陷,不能及时、准确地鉴定菌株的血清型。PCR方法以快速、灵敏、准确等优点逐渐成为其重要的替代方法之一。本研究通过生物信息学技术建立了靶点发掘平台,采用比较基因组的方法,分别发掘了沙门氏菌血清组A-D和上述8种常见血清型沙门氏菌的特异PCR检测靶点,并以此分别建立了血清组和血清型多重PCR检测体系,可鉴定A-D血清组及8种血清型的菌株。沙门氏菌血清组A-D多重PCR检测体系的建立。分别从NCBI,Sanger研究院,美国伊利诺斯州大学和美国华盛顿大学基因组测序中心等基因组数据库下载到沙门氏菌已经测序菌株的全基因组序列,并按照沙门氏菌的血清组形式建立6个血清组的基因组库:A型,B型,C1型,C2型,D型和其他型。除其他型外,每个库中选择一株代表菌株,将其基因组序列依次切割成长度为986 bp的DNA片段,然后将这些片段与所有的沙门氏菌的基因组进行序列比对,选择出仅在代表菌株所属基因组库中存在的DNA片段,所得片段将作为PCR检测的候选靶点。血清组A、B、C1、C2和D分别发掘到2、6、7、10和7个特异序列。以这些特异序列为模板,分别设计引物,通过PCR方法分别选出每个血清组中特异性和灵敏度俱佳的引物对。将这5个血清组的引物对进行组合建立多重PCR体系。应用该体系对107株来自不同血清组的沙门氏菌分离株的进行检测,结果表明,本研究建立的PCR体系验证结果与Luk等建立的B、C2和D（A）血清组多重PCR体系以及血清学鉴定结果一致。检测食品样品时,只需增菌12 h,就可从初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳样品中检测出阳性结果。沙门氏菌8种常见血清型多重PCR检测体系的建立。按照类似的方式建立8个沙门氏菌血清型的基因组库:伤寒沙门氏菌/丙型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡沙门氏菌以及其他血清型库。将每个血清型库中的代表菌株的基因型序列也切割成986 bp的DNA片段,与所有的沙门氏菌的基因组进行序列比对,选出每个血清型的候选靶点,分别有1、11、18、1、22、4和3个。经PCR筛选出各个血清型中特异性和灵敏度皆优的引物对,构建多重PCR体系。该体系可从153株分离株鉴定出肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等8种血清型,与血清学验证的结果一致;只需增菌12 h,便可从初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳样品中检测出这8种血清型。沙门氏菌血清组与血清型靶点基因的功能分析。沙门氏菌血清组的32个特异靶点中,含有34个基因,主要是rfb基因、膜蛋白基因和纤毛基因。这些基因主要与糖的合成与代谢、糖基的转移或者运输有关,对沙门氏菌血清组的O抗原的形成和保持稳定起着至关重要的作用,说明血清组间的差异与菌株的LPS的糖基有着密切关系。经基因功能分析,沙门氏菌的血清型特异靶点对应的基因主要是噬菌体基因、致病因子基因、转座子基因、限制性内切酶基因等。这些基因与移动元件和毒力基因密切相关,可使菌株对其宿主和环境产生适应性,可能是这些菌株为了更好的适应不同的宿主和环境而产生了相应的血清型。沙门氏菌分离株的PCR分子检测与MLST分型。437株来自食品、养殖场和临床的沙门氏菌分离株,分别用建立的血清组和血清型鉴定体系进行分子血清分型。这些分离株被鉴定出A、B、C1、C2和D五个血清组,以及伤寒与副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、鸡沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和阿贡纳沙门氏菌等血清型,与血清学鉴定结果相比,两者的Kappa值都处于0.80以上,说明结果基本一致。其中,肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌占了4050%,这两种血清型的菌株用MLST方法进行了亚分型分析,肠炎沙门氏菌的ST型较为单一,以ST11为主,是世界范围内极为普遍的菌型;鼠伤寒沙门氏菌的ST型有5种分型,其中临床和养殖场的分离株以ST19型为主,食品菌株则以ST34为主,还发现了3种只出现在东亚和东南亚范围的ST新型。根据菌株的耐药检测结果发现,鼠伤寒沙门氏菌的ST型与其耐药性有一定的相关性,其中ST34型菌株的耐药种类最多,通常可以对68种抗生素产生抗性。经进化分析,发现食品分离株与临床分离株具有十分紧密的联系。
董丽宁[9]（2011）在《大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制》文中研究说明土壤是人类赖以生存和发展的基础,承担着来自环境中大约90%的污染物,目前人们对土壤质量的要求主要集中于农药残留,重金属污染和有机污染,对于土壤中病原微生物的研究关注不多。土壤中的病原微生物可以通过多种暴露途径与人体接触,从而危害人体健康。大肠杆菌和沙门氏菌是土壤中两类重要的病原微生物,但目前国内检测病原微生物主要采用传统的平板培养方法,其操作耗时耗力,往往需要5-6天才能完成,而且灵敏度比较低,假阳性数量较多。近几年,随着免疫学和分子生物学的发展,基于新技术的病原微生物检测方法也被建立起来,尤其是国外,已有部分快速检测试剂盒产品问世,而国内相关研究相对滞后。为建立一种有效的病原微生物定量检测方法,本研究采用MPN-PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。该方法的关键思路在于利用了PCR方法快速准确的优势,取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤,从而减少了传统方法中的繁琐步骤,提高了检测效率。针对大肠杆菌和沙门氏菌的特异性基因分别设计了两对特异性引物,优化了PCR反应模板的制备,建立了一种定量检测病原微生物的方法,并对该方法的灵敏度进行了评估,最后,在该方法的基础上开发了定量检测试剂盒。最终结果如下：1、分别以大肠杆菌和沙门氏菌作为研究对象,对同一样品进行了MPN计数与平板菌落计数并对计数结果进行回归分析,建立了两者对数值之间的定量关系。大肠杆菌MPN计数与平板菌落计数回归方程为y=0.9566x, R2=0.994 1；沙门氏菌MPN计数与平板菌落计数回归方程为y=1.0144x,R2=0.9957。对两者回归系数进行方差分析显示极显着。使MPN计数法具有与平板菌落计数法一样的准确性,从而为病原微生物,甚至功能微生物的定量计数提供更为准确的结果。2、根据沙门氏菌的invA基因序列,采用沙门氏菌用的特异性引物invA-1和invA-2,引物扩增片段为284bp；根据大肠杆菌phoA基因序列,采用引物设计软件Primer 5.0进行设计引物,引物扩增片段为684bp。同时对三种PCR反应模板制备方法进行了比较,选用热裂解法作为PCR反应模板制备方法。利用灭菌土壤中添加纯菌实验评估了定量检测方法的灵敏度：大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤,沙门氏菌定量检测方法的灵敏度为250个/g土壤。3、在建立定量检测方法的基础上,成功研制MPN-PCR定量检测试剂盒,并对其进行了灵敏度和保存期的评估：大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤,沙门氏菌定量检测方法的灵敏度为250个/g土壤。有效期均为3个月。4、利用所开发的定量检测试剂盒,对张家港和北京的共13个土壤样品进行了大肠杆菌和沙门氏菌的定量检测,结果发现土壤中不存在沙门氏菌,有6个样品检测到大肠杆菌,数量分别为：350、500、950、700、800、1700个/g土壤。
张亚[10]（2010）在《稻田养鸭抑制水稻纹枯病机制及拮抗细菌A168筛选鉴定研究》文中指出稻田养鸭不仅能除草、防虫、免耕、减少甲烷排放,提高水稻产量和品质,而且能减轻水稻纹枯病的发生和危害。本研究从两方面就稻田养鸭抑制水稻纹枯病进行探讨。一方面从鸭在稻田中的活动来研究其对水稻及水稻纹枯病菌的影响；另一方面从鸭嘴、鸭毛和鸭粪分泌物中提取粗提物和筛选微生物来研究其对水稻及水稻纹枯病菌的影响。本研究旨在通过系统研究稻田养鸭抑制水稻纹枯病的主要因素及作用机理,探索生物防治水稻纹枯病新途径。主要研究结果如下：1影响因素及作用机理研究1.1稻田养鸭对水稻纹枯病菌菌核的影响在初始菌核相同的情况下,调查放鸭区和未放鸭区纹枯病菌菌核数量。在水稻生长的分蘖末期和齐穗期,放鸭区菌核量为35.7万粒／hm2、41.9万粒／hm2,比未放鸭区菌核72.9万粒／hm2、96.4万粒／hm2,低48.97%、43.46%,表明鸭通过啄食菌核,从而减少纹枯病菌源,减轻病害发生。1.2封泥对水稻纹枯病的影响将泥砌封于水稻基部叶鞘研究其对水稻纹枯病的影响。先砌封泥于水稻叶鞘再人工接种纹枯病菌,其发病率为3.08～10.61%、病情指数为5.42～11.82,明显低于井冈霉素处理和对照的发病率3.88～55.36%和3.97～86.22%、病情指数5.66～18.40和19.94～60.72,其控病效果为72.80～81.21%,优于井冈霉素处理和对照。对先砌封泥再接病菌的处理,不同时期测定水稻的过氧化物酶活性均比对照高,但低于井冈霉素处理；同时砌封泥处理使水稻的可溶性糖含量降低。1.3鸭毛、鸭嘴和鸭粪粗提物对水稻几丁质酶活性的影响一般认为,水稻抗病性与水稻几丁质酶活性呈正相关的。本研究采用乙酸乙酯和乙醇提取鸭毛、鸭嘴及鸭粪分泌物,并将粗提物施用于水稻,测定水稻几丁质酶活性。其中,鸭粪乙酸乙酯粗提物处理水稻后第8d水稻几丁质酶活性达最大值,为124.7 U·g（-1）·FW（-1）·min（-1）,显着高于对照（77.11 U·g（-1）·FW（-1）·min（-1））,且差异显着（P<0.05,P<0.01）；鸭粪乙醇粗提物处理水稻后第8d几丁质酶活性达最大值62.9 U·g（-1）·FW（-1）·min（-1）,与对照62.9U·g（-1）·FW（-1）·min（-1）比较无显着差异（P>0.05,P>0.01）；表明鸭粪乙酸乙酯粗提物能提高水稻几丁质酶活性,鸭粪乙醇提取物不能提高水稻几丁质酶活性。而鸭毛和鸭嘴乙酸乙酯、乙醇粗提物处理水稻后,水稻几丁质酶活性与对照比较也无显着变化。1.4鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻几丁质酶活性的影响采用稀释分离法分别从鸭毛、鸭嘴和鸭粪中共分离出细菌323株,真菌126株。经初步归类,从鸭毛中分离获得1株细菌B106和1株真菌F123,鸭嘴中分离获得1株细菌B75和1株真菌F66,鸭粪中分离获得1株细菌B117和1株真菌F16,并用各菌株悬浮液处理水稻。细菌B117悬浮液处理水稻后,第3d、7d水稻几丁质酶活性达最大值,分别为42.24U·g（-1）·FW（-1）·min（-1）、42.23U·g（-1）·FW（-1）·min（-1）,明显高于对照41.74U·g（-1）·FW（-1）·min（-1）、41.69 U·g（-1）·FW（-1）·min（-1）,且差异显着（P<0.05,P<0.02）,说明鸭粪中存在能提高水稻几丁质酶活性的细菌；其它菌株F16、B106、F123、B75、F66等菌悬液处理水稻后,水稻几丁质酶活性均无显着变化。1.5鸭毛、鸭嘴和鸭粪粗提物对水稻纹枯病菌的影响采用平板拮抗法测定鸭毛、鸭嘴和鸭粪乙醇、乙酸乙酯粗提物对水稻纹枯病菌的抑制作用。鸭毛、鸭嘴和鸭粪的乙醇、乙酸乙酯粗提物抑菌效果分别为13%、8%、6%,7%、88.64%、84.11%；鸭粪乙醇粗提物在24h内对水稻纹枯病病菌ECso值为26.11mg／ml；鸭粪乙醇粗提物经萃取分离得到石油醚和乙酸乙酯两种组分,其中石油醚组分抑制效果较弱,乙酸乙酯组分抑制能力较强,对水稻纹枯病抑制率为89.70%,EC（50）值为15.52mg／ml；对乙酸乙酯组分进行硅胶柱层析分离得到5种流份,其中第2流份（L2）有显着抑菌活性,其在24h、48h内对水稻纹枯病抑制率分别为89.58%、80.36%,通过GC-MS分析鉴定,为酚酸类和硫醇类物质。本研究表明：稻田养鸭生态系统中鸭分泌物中存在抑制水稻纹枯病菌的物质。1.6鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻纹枯病菌的影响采用平板对峙法将菌株B106、B75、B117,F123、F66,F16进行拮抗试验。菌株B106、B75,F123、F66,F16均无拮抗作用,而来自鸭粪中的菌株B117对水稻纹枯病菌具有较强的拮抗作用,进一步分离纯化得菌株A168。稻田养鸭生态系统中鸭分泌物中存在抑制水稻纹枯病菌的拮抗菌。2鸭粪中拮抗细菌A168筛选、鉴定、生物学特性及拮抗作用研究2.1鸭粪中拮抗细菌A168筛选、鉴定及生物学特性采用平板拮抗法,将细菌B117纯化100次,获得拮抗菌株A168,对其进行了鉴定和生物学特性研究。A168菌体杆状,革兰氏染色阳性、芽孢中生、周生鞭毛。A168菌株能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸,葡萄糖产气试验阴性,淀粉水解阴性,硝酸还原试验阳性,厌氧生长阴性,酪素分解试验阳性,酪氨酸分解试验阴性,接触酶试验阳性,VP反应阳性,苯丙氨酸脱氨酶试验阴性。16S rDNA分析与其亲缘关系较近菌株Bacillus cereus （AJ577288.1）的同源性达99%,初步鉴定A168菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）,其16SrDNA序列已在GenBank中注册,登录号为GQ118339。A168菌株最优培养时间60h,最适温度28℃、最适pH 7.0。A168菌株能利用的碳源有蔗糖、葡萄糖、甘露醇、α-乳糖、D-木糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-果糖；能利用的氮源有胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏和酵母浸膏、干酪素,氯化铵等,但不能利用硝酸钾。2.2 A168菌株活性物质的提取条件及抑菌机理研究采用乙酸乙酯以物料比4：1,在28℃条件下连续超声萃取36h提取A168菌株活性物质效果最好。A168菌株活性物质对水稻纹枯病菌（R.solani）的ECso和EC90值分别为2.15mg／mL和237.86mg／mL；经处理的水稻纹枯病菌菌丝扭曲；当浓度为35mg／mL时,可溶性蛋白质的合成抑制率最大为24.45%,菌核萌发率最低为80.36%；水稻纹枯病菌致病力随活性物质浓度的提高而降低,当浓度为45mg／mL时,纹枯病菌被抑制率为80.29%；A168菌株活性物质对病原菌菌丝体电导率无影响。A168菌株活性物质可通过抑制菌丝生长、蛋白质合成、菌核萌发、降低病菌致病力等途径达到控制纹枯病发生。2.3 A168菌株最优培养基及发酵条件研究通过正交试验确定菌株A168的最优发酵培养基配方及发酵条件：豆饼粉2%,葡萄糖7%,CaCO3 0.4%,NaCL 0.35%,蛋白胨6%。摇瓶最优发酵条件：培养时间48h,温度28℃,菌龄24h,接种量6%,转速为200r／min,装液量为210ml（摇瓶500mL）,pH值7.0。10L发酵罐最优发酵条件：通气量为180L／h,转速为200r／min,温度为28℃,初始pH为6.5,最优发酵时间为72h。2.4 A168菌株在水稻上定殖规律及对水稻纹枯病田间防治效果研究采用回收标记菌株法探索了A168菌株定殖规律及田间防效。以摩擦方式定殖A168菌量最多；在分蘖期菌量最大,水稻齐穗期次之,成熟期最少；水稻基部叶鞘定殖的菌量高于根部和茎部；在接种后32d仍能够回收到活菌；田间防效达78.47%,明显高于井冈霉素。表明A168菌株在水稻上定殖能力强防病效果较好。2.5 A168菌株促生、抗病及增产效果研究经A168菌悬液处理水稻幼苗比对照根长、株高、叶长和鲜重分别增长12.35～30.95%、26.52～30.77%、16.37～20.02%和10.26～29.52%；且对"Lemont"“陆两优996”品种的促生效果比“创丰1号”好；经A168菌悬液处理的水稻"Lemont"内吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR4）、赤霉素（GA3）的含量比对照高,脱落酸（ABA）的含量比对照低；苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化物酶（POD）活性比对照高,但过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性与对照比较无显着变化；经A168菌悬液处理后的水稻产量比对照高,其中“陆两优996"品种增产最大为13.13%,其次为"Lemont"品种,“创丰1号”品种增产最低。本研究结果表明：A168菌株具有促进水稻生长,提高水稻抗病性及增加水稻产量的作用。2.6 A168菌株活性物质的分离、纯化及鉴定采用生化反应、硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFF、FPLC Phenyl FF疏水色谱柱、HPLC C18液相色谱纯化等方法研究A168菌株活性物质成分并进行了分离、纯化及鉴定。初步鉴定A168过滤液中含有蛋白质和肽,进一步分离、纯化获得拮抗纹枯病菌L-518样品。通过SDS-PAGE电泳可知,L-518样品约有15KD,再经质谱分析其质荷比为15006.899。L-518样品不耐高温,对蛋白酶K稳定,对胰蛋白酶和胃蛋白酶不稳定,这些性质与多肽基本相似,初步鉴定为多肽类物质。
二、进口鸭毛中沙门氏菌的分离与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、进口鸭毛中沙门氏菌的分离与鉴定（论文提纲范文）
（1）F4ac+产肠毒素大肠杆菌锌转运系统ZnuACB功能探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 产肠毒素大肠杆菌研究概述 |
| 1 大肠杆菌简述及分类 |
| 2 产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC) |
| 2.1 猪源产肠毒素大肠杆菌的传播及感染 |
| 2.2 产肠毒素大肠杆菌的主要毒力因子 |
| 3 猪源产肠毒素大肠杆菌的预防与控制 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 细菌与宿主互作界面的锌稳态 |
| 1 细菌感染宿主时面临的压力 |
| 1.1 营养物质的限制 |
| 1.2 酸性pH |
| 1.3 氧化应激与硝化应激 |
| 1.4 其他压力 |
| 2 细菌和宿主互作界面锌稳态的维持 |
| 2.1 锌的作用 |
| 2.2 宿主体内锌稳态的维持 |
| 2.3 细菌体内锌稳态的维持 |
| 2.4 细菌锌转运系统ZnuACB研究现状 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 试验研究 |
| 研究一 利用RNA-seq技术筛选锌缺陷条件下F4ac~+ETEC主要锌转运蛋白 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 RNA-seq测序样品的制备 |
| 2.2 RNA-seq测序 |
| 2.3 RNA-seq测序数据生物信息分析 |
| 2.4 qPCR验证DEGs表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 测序数据质量评估 |
| 3.2 基因表达情况统计 |
| 3.3 差异表达基因分析结果 |
| 3.4 GO富集分析结果 |
| 3.5 KEGG pathway富集分析结果 |
| 3.6 锌转运相关差异基因筛选及qPCR验证 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 F4ac~+ETEC ZnuACB系统缺失株构建及该系统对细菌在低锌环境下生长的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 znuACB基因扩增及ZnuA氨基酸序列ClustalOmega比对分析 |
| 2.2 λ-Red同源重组方法构建znuA,znuB,znuC,znuACB基因缺失株 |
| 2.3 不同锌离子条件下的生长试验 |
| 2.4 数据统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 znuACB测序及ZnuA蛋白多序列比对结果 |
| 3.2 融合PCR产物的制备 |
| 3.3 一次同源重组菌的PCR鉴定 |
| 3.4 二次同源重组菌的PCR鉴定 |
| 3.5 各缺失株的序列测序鉴定 |
| 3.6 不同锌离子条件下野生菌株及各缺失株的生长曲线 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 ZnuACB系统缺失对F4ac~+ETEC生物被膜形成和黏附细胞能力的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 生物被膜定性试验 |
| 2.2 生物被膜定量试验 |
| 2.3 生物被膜电镜观察 |
| 2.4 不用条件下细菌对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞的黏附试验 |
| 2.5 qPCR检测主要黏附因子及生物被膜形成基因的表达 |
| 2.6 数据统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细菌生物被膜定性结果 |
| 3.2 细菌生物被膜定量结果 |
| 3.3 生物被膜电镜观察结果 |
| 3.4 IPEC-J2细胞黏附试验结果 |
| 3.5 qPCR检测毒力相关因子变化情况 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 ZnuACB系统缺失对F4ac~+ETEC鞭毛形成及对肠上皮细胞促炎反应的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌运动性试验 |
| 2.2 qPCR检测不同锌条件下鞭毛合成相关基因的表达情况 |
| 2.3 qPCR检测细菌感染IPEC-J2细胞后炎性因子的表达情况 |
| 2.4 数据统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细菌运动性试验结果 |
| 3.2 鞭毛形成相关基因转录水平变化 |
| 3.3 炎性因子转录水平变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究五 体内探索ZnuACB系统缺失对F4ac~+ETEC致病力的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 筛选易感型阳性仔猪 |
| 2.2 实验动物分组及处理 |
| 2.3 体温、体重测定及临床症状监测 |
| 2.4 样品采集及保存 |
| 2.5 石蜡切片制备及染色 |
| 2.6 ELISA检测血清中的IL-8炎性因子 |
| 3 结果 |
| 3.1 易感阳性仔猪筛选结果 |
| 3.2 体温、体重变化、临床症状及粪便载菌量 |
| 3.3 石蜡切片HE染色结果分析 |
| 3.4 血清中IL-8炎性因子检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）河南省生猪中主要食源性致病菌污染调查及沙门氏菌耐药分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 试验一 河南省部分地区生猪养殖场主要食源性致病菌污染调查 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 讨论 |
| 试验二 河南省部分地区屠宰链主要食源性致病菌的污染调查 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 试验三 河南省猪源沙门氏菌耐药分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（3）艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的处置与残留消除研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 药效学研究 |
| 1.2.2 毒理学研究 |
| 1.2.3 代谢研究 |
| 1.2.4 药动学研究 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 2 氚标记艾地普林的制备及其质量标准研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 药物与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 氚标记艾地普林的合成工艺 |
| 2.1.4 氚标记艾地普林的质量标准研究 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 氚标记艾地普林及其中间产物结构鉴定 |
| 2.2.2 氚标记艾地普林的质量标准 |
| 2.3 讨论 |
| 3 艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内物料平衡与代谢研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 药物与试剂 |
| 3.1.2 溶液的配制 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.1.5 给药与采样 |
| 3.1.6 样品处理 |
| 3.1.7 样品的测定 |
| 3.1.8 方法学考核 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 方法学考核 |
| 3.2.2 样品提取方法的确定 |
| 3.2.3 艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的物料平衡 |
| 3.2.4 艾地普林代谢物的鉴定 |
| 3.2.5 艾地普林在四种动物体内代谢谱和代谢路径 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 方法的科学性和先进性 |
| 3.3.2 艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的物料平衡规律 |
| 3.3.3 艾地普林在各个动物体内代谢特点 |
| 4 艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的分布和消除研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 药物与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器和设备 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 动物给药与采样 |
| 4.1.5 样品处理 |
| 4.1.6 样品测定 |
| 4.1.7 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 提取方法的确定 |
| 4.2.2 艾地普林及其代谢物在猪、鸡、鱼和大鼠体内的分布 |
| 4.2.3 艾地普林及其代谢物在猪、鸡、鱼和大鼠组织中的消除 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 艾地普林及其代谢物在动物体内的分布特征 |
| 4.3.2 艾地普林及其代谢物在动物体内的消除规律 |
| 5 艾地普林及其主要代谢物标准品的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 仪器和设备 |
| 5.1.2 原料和试剂 |
| 5.1.3 艾地普林的合成与纯化 |
| 5.1.4 N-脱一甲基艾地普林的合成与纯化 |
| 5.1.5 N-脱二甲基艾地普林的合成与纯化 |
| 5.1.6 3-羟基艾地普林的合成与纯化 |
| 5.1.7 质量标准研究 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 结构表征 |
| 5.2.2 纯度测定 |
| 5.2.3 理化性质及一般杂质检查 |
| 5.2.4 含量定值 |
| 5.2.5 均匀性检验 |
| 5.2.6 稳定性检验 |
| 5.3 讨论 |
| 6 艾地普林注射制剂的研制 |
| 6.1 药品与试剂 |
| 6.2 仪器与设备 |
| 6.3 处方研究 |
| 6.3.1 辅料的选择 |
| 6.3.2 处方筛选 |
| 6.3.3 制备工艺 |
| 6.3.4 工艺流程 |
| 6.4 质量标准研究 |
| 6.4.1 外观性状 |
| 6.4.2 鉴别 |
| 6.4.3 检查 |
| 6.4.4 稳定性研究 |
| 6.5 结果与分析 |
| 6.5.1 处方筛选 |
| 6.5.2 质量标准 |
| 6.6 讨论 |
| 7 艾地普林注射制剂在猪体内的排泄研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 药物与试剂 |
| 7.1.2 溶液的配制 |
| 7.1.3 主要仪器与设备 |
| 7.1.4 艾地普林及其代谢物在猪尿液和粪便中多残留检测方法 |
| 7.1.5 动物给药、样品的收集与测定 |
| 7.1.6 数据处理 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 艾地普林及其主要代谢物在猪尿液和粪便中的定量方法学 |
| 7.2.2 艾地普林及其代谢物在猪尿液和粪便中的排泄规律 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 艾地普林及其主要代谢物在粪便和尿液中的定量方法学 |
| 7.3.2 艾地普林在粪便和尿液中的排泄规律 |
| 8 艾地普林在猪、鸡和鱼可食性组织中的残留消除研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 药物与试剂 |
| 8.1.2 溶液的配制 |
| 8.1.3 主要仪器与设备 |
| 8.1.4 艾地普林及其主要代谢物在动物可食性组织中的多残留检测方法 |
| 8.1.5 动物给药、样品的收集与测定 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 艾地普林及其主要代谢物在动物可食性组织中的定量方法学 |
| 8.2.2 艾地普林及其代谢物在动物可食性组织中的残留消除规律 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 艾地普林及其主要代谢物的定量方法学 |
| 8.3.2 艾地普林在三种食品动物体内的残留消除规律 |
| 9 艾地普林在食品动物的安全性评价 |
| 9.1 JECFA |
| 9.1.1 每日允许摄入量(ADI) |
| 9.1.2 残留靶组织和残留标示物 |
| 9.1.3 推荐最高残留限量(MRL) |
| 9.1.4 休药期 |
| 9.1.5 膳食暴露评估 |
| 9.2 FDA |
| 9.2.1 日许量(ADI) |
| 9.2.2 安全浓度(Safety Concentration,SC) |
| 9.2.3 残留靶组织与残留标示物 |
| 9.2.4 最高残留限量(MRLs) |
| 9.2.5 休药期 |
| 9.3 EMEA |
| 9.3.1 日许量 |
| 9.3.2 安全浓度 |
| 9.3.3 残留靶组织与残留标示物 |
| 9.3.4 最高残留限量(MRLs) |
| 9.3.5 计算TMDI |
| 9.3.6 休药期 |
| 9.4 推荐我国的残留限量标准草案 |
| 10 全文创新性总结 |
| 11 文献综述:抗菌增效剂的应用、现状及发展趋势 |
| 11.1 作用机制 |
| 11.2 构效关系 |
| 11.3 耐药机制 |
| 11.4 应用于临床的抗菌增效剂 |
| 11.4.1 甲氧苄啶 |
| 11.4.2 巴喹普林 |
| 11.4.3 奥美普林 |
| 11.4.4 溴莫普林 |
| 11.5 新型抗菌增效剂的研发 |
| 11.5.1 依匹普林 |
| 11.5.2 克拉普林 |
| 11.5.3 AR-709 |
| 11.5.4 RAB1 |
| 11.5.5 K-130 |
| 11.6 发展趋势 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ—作者简介 |
| 附录Ⅱ—氚标记艾地普林制备的标准操作规程 |
| 附录Ⅲ—动物可食性组织中艾地普林及主要代谢物定量检测的标准操作规程 |
| 附录Ⅳ—答辩主要问题的回答与论文修改 |
（4）进口原羊毛检疫监管中的数字管理（论文提纲范文）
| 1 企业应首先建立兽医卫生防疫体系 |
| 2 进口原羊毛加工企业的基础数字 |
| 3 检疫监管中的基础数字 |
| 4 人员生物安全防护 |
| 5 结论 |
（5）鼠伤寒沙门氏菌免疫磁分离结合荧光免疫层析快速检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 沙门氏菌研究进展 |
| 1.1.1 沙门氏菌生物学特性 |
| 1.1.2 沙门氏菌致病机理 |
| 1.1.3 食品中沙门氏菌污染现状 |
| 1.2 沙门氏菌检测方法研究进展 |
| 1.2.1 传统检测方法 |
| 1.2.2 免疫学方法 |
| 1.2.3 分子生物学方法 |
| 1.2.4 其他检测方法 |
| 1.3 技术原理 |
| 1.3.1 双抗体夹心荧光免疫层析技术 |
| 1.3.2 免疫磁分离技术 |
| 1.4 本论文研究目的和主要内容 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 主要内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体的制备及纯化鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物与菌种 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 溶液及培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 抗原与抗血清的准备 |
| 2.3.2 抗血清的纯化 |
| 2.3.3 抗血清及多克隆抗体效价的测定 |
| 2.3.4 SDS-PAGE 电泳 |
| 2.3.5 多克隆抗体特异性的鉴定 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 效价 |
| 2.4.2 SDS-PAGE 电泳图 |
| 2.4.3 特异性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 荧光免疫层析平台的建立及条件优化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验抗体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 荧光胶乳标记 |
| 3.3.2 喷膜 |
| 3.3.3 荧光免疫层析平台抗体对的选择 |
| 3.3.4 荧光免疫层析试纸条的条件优化 |
| 3.3.5 荧光免疫层析试纸条的评价 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 抗体的确定 |
| 3.4.2 荧光免疫层析试纸条的条件确定 |
| 3.4.3 荧光免疫层析试纸条的性能 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 免疫磁珠的制备与条件优化及联合检测方法的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验磁珠与抗体 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 免疫磁珠的制备 |
| 4.3.2 磁珠偶联抗体条件的优化 |
| 4.3.3 免疫磁珠富集 ST.条件的优化 |
| 4.3.4 洗脱条件的选择 |
| 4.3.5 联合检测方法对模拟样本的检测 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 偶联条件的确定 |
| 4.4.2 富集条件 |
| 4.4.3 洗脱条件 |
| 4.4.4 模拟样本检测结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）食品和饲料中沙门氏菌及动物皮毛中炭疽杆菌快速鉴定方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 食品和饲料中沙门氏菌检测方法的研究进展 |
| 1.1 病原分离鉴定 |
| 1.1.1 预增菌 |
| 1.1.2 选择性增菌 |
| 1.1.3 选择性平板培养基 |
| 1.1.4 可疑菌落的鉴定 |
| 1.2 免疫学检测 |
| 1.2.1 全血试验 |
| 1.2.2 快速玻片凝集试验 |
| 1.2.3 血清凝集试验 |
| 1.2.4 自动酶标免疫检测仪 |
| 1.3 血清学检测 |
| 1.3.1 酶联免疫吸附试验 |
| 1.3.2 斑点酶联免疫吸附试验 |
| 1.3.3 斑点免疫金渗滤法 |
| 1.4 分子生物学方法 |
| 1.4.1 PCR 方法 |
| 1.4.2 LAMP |
| 1.4.3 其他方法 |
| 1.5 特异性抗体介入到沙门氏菌分离过程的可行性 |
| 1.5.1 抗体结构及新功能的发现 |
| 1.5.2 抗体的体外特异性抗微生物作用 |
| 1.5.3 抗体体外应用前景 |
| 1.6 讨论 |
| 第二章 16S rDNAPCR-RFLP 用于细菌鉴定的研究进展 |
| 2.1 16S rDNA 研究现状 |
| 2.1.1 细菌核糖体 DNA/RNA 的结构 |
| 2.1.2 16S rRNA/DNA 基因在细菌系统分类中的应用 |
| 2.2 针对细菌的 16S rDNA 开展的 PCR-RFLP 鉴定研究 |
| 2.2.1 PCR-RFLP 的原理 |
| 2.2.2 细菌鉴定中 16S rDNA PCR-RFLP 的应用 |
| 2.3 基于细菌 16S rDNA 的 PCR-RFLP 应用前景及需要克服的问题 |
| 试验研究 |
| 第三章 用铜绿假单胞菌多克隆抗体提高沙门氏菌分离鉴定准确性的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 材料 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 接种物的制备与确定 |
| 3.2.2 抗体滴度检测和抗体纯度鉴定 |
| 3.2.3 抑菌试验用抗体用量的确定 |
| 3.2.4 铜绿假单胞菌抗体的体外特异性抑菌试验 |
| 3.2.5 沙门氏菌分离 |
| 3.2.6 实际应用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 用奇异变形杆菌多克隆抗体提高沙门氏菌分离鉴定准确性的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 抗体的滴度与纯度 |
| 4.2.2 抑菌试验用抗体滴度的确定 |
| 4.2.3 奇异变形杆菌多克隆抗体的体外特异性抑菌作用 |
| 4.2.4 沙门氏菌模拟试验 |
| 4.2.5 初步应用结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 动物皮毛中炭疽杆菌快速鉴定方法的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 细菌分离 |
| 5.2.2 VITEK 鉴定 |
| 5.2.3 16S rDNA 扩增 |
| 5.2.4 炭疽杆菌与所分离细菌的内切酶图谱比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）减毒沙门氏菌递呈PEDV/TGEV双基因核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎研究进展 |
| 1.1 PEDV概述 |
| 1.1.1 PEDV病原学特性 |
| 1.1.2 病毒基因组结构与复制 |
| 1.1.3 PEDV主要编码的结构蛋白及功能 |
| 1.1.4 PEDV流行病学与致病机理 |
| 1.1.5 常规疫苗研究进展 |
| 1.1.6 基因工程疫苗研究进展 |
| 1.2 TGEV概述 |
| 1.2.1 TGEV病原学特征 |
| 1.2.2 TGEV的流行特点与致病机理 |
| 1.2.3 TGEV基因组结构复制与表达 |
| 1.2.4 TGEV结构蛋白与功能 |
| 1.2.5 TGEV常规疫苗研究现状 |
| 1.2.6 基因工程疫苗 |
| 2 减毒沙门氏菌研究进展 |
| 2.1 沙门氏菌的减毒原理 |
| 2.2 减毒沙门氏菌入侵途径 |
| 2.3 减毒沙门氏菌传递疫苗的免疫应答机制 |
| 2.4 减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的优点 |
| 2.5 减毒沙门氏菌在疫苗研究中的应用 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 细胞、载体及菌株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 腹泻病料的采集与处理 |
| 2.2 病毒的分离 |
| 2.3 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.4 病毒电镜观察 |
| 2.5 病毒核酸类型鉴定 |
| 2.6 病毒的理化特性试验 |
| 2.6.1 氯仿敏感试验 |
| 2.6.2 耐热试验 |
| 2.6.3 耐酸试验 |
| 2.7 RT-PCR扩增 |
| 2.7.1 引物的设计 |
| 2.7.2 病毒增殖 |
| 2.7.3 病毒RNA的提取与cDNA的合成 |
| 2.7.4 S基因PCR扩增 |
| 2.8 扩增产物的克隆与序列测定 |
| 2.8.1 PCR产物胶回收 |
| 2.8.2 目的基因与T载体连接 |
| 2.8.3 DH5α感受态细胞制备 |
| 2.8.4 连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.8.5 重组质粒质粒的PCR鉴定 |
| 2.8.6 目的基因核苷酸序列测序与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒分离与传代 |
| 3.2 病毒TCID_(50)测定结果 |
| 3.3 电镜观察病毒形态 |
| 3.4 病毒核酸类型鉴定结果 |
| 3.5 病毒理化特性试验结果 |
| 3.5.1 氯仿敏感性试验 |
| 3.5.2 耐酸性试验 |
| 3.5.3 耐热性试验 |
| 3.6 RT-PCR扩增结果 |
| 3.7 PEDV S基因序列测定 |
| 3.7.1 PEDV S基因核苷酸序列 |
| 3.7.2 PEDV S基因推导氨基酸序列 |
| 3.8 核苷酸序列及氨基酸序列同源性与进化树分析结果 |
| 3.9 PEDV S蛋白N端的亲水性、表面性与抗原性预测分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒的分离鉴定 |
| 4.2 病毒S基因部分序列分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 PEDV S基因主要抗原区域基因片段的原核表达及生物活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要生物试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪流行性病毒S1基因主要抗原区片段的原核表达载体构建 |
| 2.1.1 PEDV Sa基因的PCR扩增 |
| 2.1.2 PEDV Sa基因片段的克隆 |
| 2.1.3 Sa基因T-A克隆质粒PCR鉴定 |
| 2.1.4 Sa基因T-A克隆质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.5 Sa蛋白原核表达质粒的构建 |
| 2.1.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.2 PEDV Sa蛋白基因重组表达质粒的诱导表达 |
| 2.2.1 重组质粒pET32a-Sa转化BL21感受态细胞 |
| 2.2.2 SDS-PAGE电泳方法 |
| 2.2.3 PEDV Sa重组成熟蛋白的培养和诱导 |
| 2.2.4 IPTG诱导表达时间的优化 |
| 2.2.5 IPTG诱导表达浓度的优化 |
| 2.3 PEDV Sa重组成熟蛋白的大量表达及纯化 |
| 2.3.1 重组蛋白的大量表达 |
| 2.3.2 重组蛋白的初步洗涤纯化 |
| 2.3.3 重组蛋白的亲和层析纯化 |
| 2.4 重组蛋白高免血清的制备及Western-blot鉴定 |
| 2.4.1 制备融合蛋白高免血清 |
| 2.4.2 重组蛋白的Western-blot鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PEDV Sa基因的扩增 |
| 3.2 PEDV Sa原核表达质粒的构建 |
| 3.3 PEDV Sa重组蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 3.4 PEDV Sa重组蛋白原核表达条件优化 |
| 3.4.1 PEDV Sa重组蛋白诱导表达IPTG浓度的优化 |
| 3.4.2 对PEDV Sa重组蛋白诱导表达时间优化 |
| 3.5 PEDV Sa重组融合蛋白的Western-blot鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 关于PEDV Sa基因原核表达 |
| 4.2 PEDV Sa重组蛋白表达条件优化 |
| 4.3 PEDV Sa蛋白纯化 |
| 5 小结 |
| 第四章 PEDV和TGEV双基因共表达真核质粒的构建 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、菌株、质粒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 PEDV与TGEV的增殖与收获 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 PEDV S1基因与TGEV S基因的RT-PCR扩增 |
| 2.4.1 PEDV S1基因与TGEV S基因cDNA的合成 |
| 2.4.2 PCR扩增PEDV S1基因与TGEV S基因 |
| 2.5 PEDV S1基因与TGEV S基因的T-A克隆 |
| 2.5.1 PEDV S1基因与TGEV S基因PCR产物胶回收 |
| 2.5.2 PEDV S1基因与TGEV S基因与T载体的连接 |
| 2.5.3 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.6 PEDV S1基因与TGEV S基因T-A克隆质粒的鉴定 |
| 2.6.1 PEDV S1基因与TGEV S基因重组质粒小量提取 |
| 2.6.2 PEDV S1基因与TGEV S基因重组质粒酶切鉴定 |
| 2.7 PEDV S1和TGEV S基因真核表达载体的构建 |
| 2.7.1 PEDV S1基因与TGEV S基因的获取与表达载体的酶切 |
| 2.7.2 PEDV S1基因与TGEV S基因与真核表达载体的连接 |
| 2.7.3 PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒的鉴定 |
| 2.8 PEDV S1和TGEV S双基因共表达质粒pVAXD-PS1-TS的构建 |
| 2.8.1 TGEV S基因的获取与pVAXD-PS1重组质粒的酶切 |
| 2.8.2 TGEV S基因与酶切后的pVAXD-PS1重组质粒连接 |
| 2.8.3 pVAXD-PS1-TS双基因共表达真核质粒的鉴定 |
| 2.9 PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒的体外表达 |
| 2.9.1 制备转染用质粒 |
| 2.9.2 转染COS-7细胞 |
| 2.9.3 间接免疫荧光检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV S1基因与TGEV S基因的RT-PCR扩增 |
| 3.2 PEDV S1基因与TGEV S基因T-A克隆质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒鉴定结果 |
| 3.4 真核表达质粒表达检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 真核表达载体的选择 |
| 5 小结 |
| 第五章 减毒沙门氏菌携带PEDV S1和TGEV S双基因DNA疫苗口服免疫的研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株、质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 携带PEDV和TGEV双基因DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建 |
| 2.1.1 SL7207感受态细胞的制备 |
| 2.1.2 电转化沙门氏菌SL7207 |
| 2.1.3 重组减毒沙门氏菌的鉴定 |
| 2.2 重组减毒沙门氏菌体外稳定性试验 |
| 2.3 重组沙门氏菌对小鼠的安全性试验 |
| 2.4 重组减毒沙门氏菌的生长曲线 |
| 2.5 RT-PCR检测基因的转录 |
| 2.6 重组沙门氏菌对小鼠的免疫原性试验 |
| 2.6.1 试验小鼠的免疫程序 |
| 2.6.2 小鼠血清及肠道样品的制备 |
| 2.6.3 免疫小鼠特异性PEDV和TGEV血清IgG和肠道IgA抗体检测 |
| 2.6.4 减毒沙门氏菌特异性血清IgG和肠道IgA检测 |
| 2.7 免疫小鼠的脾细胞制备及γ-干扰素检测 |
| 2.7.1 免疫小鼠脾细胞的制备 |
| 2.7.2 免疫小鼠γ-干扰素的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 携带真核表达质粒的重组减毒沙门氏菌鉴定结果 |
| 3.2 RT-PCR检测PEDV和TGEV S基因在体内的转录 |
| 3.3 重组减毒沙门氏菌的生长曲线 |
| 3.4 重组减毒沙门氏菌的稳定性试验结果 |
| 3.5 重组减毒沙门氏菌感染小鼠的安全性试验 |
| 3.6 PEDV血清IgG抗体的间接ELISA检测结果 |
| 3.7 PEDV肠道黏膜IgA抗体的间接ELISA检测结果 |
| 3.8 TGEV血清IgG抗体的间接ELISA检测结果 |
| 3.9 TGEV肠道黏膜IgA抗体的间接ELISA检测结果 |
| 3.10 减毒沙门氏菌特异性肠道IgA检测 |
| 3.11 减毒沙门氏菌特异性肠道IgG检测 |
| 3.12 免疫小鼠γ-干扰素的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件材料 |
| 个人简介 |
| 攻读博士期间发表学术论文 |
（8）沙门氏菌血清分型分子靶点的发掘及鉴定体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 沙门氏菌生物学特性 |
| 1.2 沙门氏菌与食品安全 |
| 1.3 沙门氏菌流行病学特征 |
| 1.4 沙门氏菌的分型 |
| 1.4.1 沙门氏菌的血清分型 |
| 1.4.2 沙门氏菌的噬菌体分型 |
| 1.4.3 沙门氏菌的分子分型 |
| 1.5 沙门氏菌的血清鉴定研究进展 |
| 1.6 沙门氏菌的基因组测序 |
| 1.7 几种常见血清型的介绍 |
| 1.8 研究的意义、目的及思路 |
| 1.8.1 研究目的和意义 |
| 1.8.2 研究思路 |
| 第二章 血清组A-D 分子靶点的发掘及多重PCR 体系的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 运行软件 |
| 2.1.2 BLAST 软件的下载及安装 |
| 2.1.3 菌株 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 主要试剂及配制 |
| 2.1.6 仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 全基因组数据的下载和本地数据库的建立 |
| 2.2.2 血清组A、B、C 和D 代表菌株的选择 |
| 2.2.3 全基因组序列切割方式的选择 |
| 2.2.4 血清组特异候选靶点的发掘 |
| 2.2.5 候选靶点特异性的在线验证 |
| 2.2.6 沙门氏菌菌株的血清组鉴定 |
| 2.2.7 DNA 提取及纯度分析 |
| 2.2.8 引物设计 |
| 2.2.9 PCR 反应体系及循环参数 |
| 2.2.10 引物评价 |
| 2.2.11 血清组多重PCR 体系的建立 |
| 2.2.12 血清组多重PCR 体系的特异性评价 |
| 2.2.13 血清组多重PCR 体系的灵敏度评价 |
| 2.2.14 人工污染食品样品检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 全基因组数据的下载和本地数据库的建立 |
| 2.3.2 血清组A、B、C1、C2 和D 代表菌株的选择结果 |
| 2.3.3 全基因组序列的切割结果 |
| 2.3.4 血清组特异候选靶点的发掘 |
| 2.3.5 候选靶点特异性的在线验证 |
| 2.3.6 沙门氏菌菌株的血清型鉴定 |
| 2.3.7 引物设计及其评价 |
| 2.3.8 血清组多重PCR 体系的建立 |
| 2.3.9 血清组多重PCR 体系的特异性和灵敏度评价 |
| 2.3.10 人工污染食品样品检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 沙门氏菌血清组靶点发掘中筛选方式的选取及优缺点评析 |
| 2.4.2 沙门氏菌血清组靶点发掘中DNA 片段切割程序的不足与改进 |
| 2.4.3 沙门氏菌血清组多重PCR 靶点与引物的选取及检测体系的评价与分析 |
| 第三章 8 种常见血清型分子靶点的发掘及PCR 体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 运行软件及安装 |
| 3.1.2 培养基、试剂及仪器设备 |
| 3.1.3 血清型沙门氏菌的本地数据库的建立 |
| 3.1.4 常见沙门氏菌血清型及其代表菌株的选择 |
| 3.1.5 全基因组序列的切割 |
| 3.1.6 特异候选靶点的发掘 |
| 3.1.7 候选靶点特异性的在线验证 |
| 3.1.8 菌株 |
| 3.1.9 沙门氏菌菌株的培养 |
| 3.1.10 沙门氏菌分离菌株的血清型鉴定 |
| 3.1.11 DNA 提取及纯度分析 |
| 3.1.12 沙门氏菌菌株DNA 模板的PCR 检测 |
| 3.1.13 引物设计 |
| 3.1.14 引物评价 |
| 3.1.15 血清型多重PCR 体系的建立 |
| 3.1.16 血清型多重PCR 体系的特异性评价 |
| 3.1.17 人工污染食品样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 本地数据库的建立 |
| 3.2.2 血清型代表菌株的选择结果 |
| 3.2.3 全基因组序列的切割与靶点发掘结果 |
| 3.2.4 候选靶点特异性的在线验证 |
| 3.2.5 沙门氏菌菌株的血清型鉴定 |
| 3.2.6 引物设计及特异性、灵敏度评价 |
| 3.2.7 血清型多重PCR 体系的建立 |
| 3.2.8 血清型多重PCR 体系的特异性评价 |
| 3.2.9 人工污染食品样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 沙门氏菌血清型靶点发掘评析 |
| 3.3.2 与文献报道的沙门氏菌血清型靶点发掘方法的对比分析 |
| 3.3.3 沙门氏菌血清型多重PCR 引物的选取与分析 |
| 第四章 血清组与血清型分子靶点的功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 蛋白分析软件 |
| 4.1.2 靶点的蛋白序列分析 |
| 4.1.3 蛋白结构预测与功能分析 |
| 4.1.4 基因与表型相关性分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 血清组靶点基因功能分析结果 |
| 4.2.2 血清型靶点基因功能分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 血清组靶点基因与各个血清组间的表型差异的相关性分析 |
| 4.3.2 血清组C1 的靶点基因SCH_0368 和SCH_0595 的进化分析 |
| 4.3.3 血清型靶点基因与各个血清型间的表型差异的相关性分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 沙门氏菌分离株的分子检测与分型 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 多重PCR 检测分离株 |
| 5.2.2 血清学鉴定分离株 |
| 5.2.3 耐药性测试验 |
| 5.2.4 MLST 分型 |
| 5.2.5.数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 分离株鉴定结果 |
| 5.3.2 MLST 结果 |
| 5.3.3 流行病学分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新性 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已录用或正整理的论文 |
（9）大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 前言 |
| 综述 |
| 一、土壤中病原微生物的来源 |
| 1、禽畜粪便 |
| 2、污水灌溉 |
| 二、本研究所涉及的病原菌简介 |
| 1、大肠杆菌 |
| 2、沙门氏菌 |
| 三、病原微生物检测方法研究进展 |
| 1、传统的检测方法 |
| 2、免疫学上的方法 |
| 3、分子生物学上的方法 |
| 4、联合检测方法 |
| 参考文献 |
| 第一章 病原微生物定量检测方法的建立 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 MPN计数法与平板菌落计数法计数结果相关性研究 |
| 1.3 大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立 |
| 1.4 该方法的评价 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 大肠杆菌稀释涂布平板计数法和MPN计数法相关性实验结果 |
| 2.2 沙门氏菌稀释涂布平板计数法和MPN计数法相关性实验结果 |
| 2.3 PCR反应模板的制备 |
| 2.4 引物特异性检测 |
| 2.5 灵敏度和检测限检测 |
| 3、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 、病原微生物定量检测试剂盒的研制 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 试剂盒的组成 |
| 1.2 定量检测试剂盒使用说明 |
| 1.3 试剂盒灵敏度和保存期检验 |
| 2、结果与分析 |
| 2.1 试剂盒灵敏度和保存期检验 |
| 3、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 病原微生物定量检测试剂盒的应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 样品的采集及相关信息 |
| 1.2 土壤理化性质的测定及微生物计数 |
| 1.3 PCR方法定性检测土壤中大肠杆菌 |
| 1.4 试剂盒法定量检测土壤中病原微生物 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 理化性质的测定 |
| 2.2 细菌真菌放线菌的计数 |
| 2.3 土壤总DNA的提取与纯化究 |
| 2.4 大肠杆菌和沙门氏菌特异性引物扩增 |
| 2.5 PCR产物的纯化回收 |
| 2.6 扩增产物的TA克隆 |
| 2.7 克隆转化子的测序 |
| 2.8 实际土壤样品的MPN-PCR定量检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新之处 |
| 附录:文中所用的培养基和试剂配方 |
| 致谢 |
（10）稻田养鸭抑制水稻纹枯病机制及拮抗细菌A168筛选鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 国内外研究概况 |
| 1.1 稻田养鸭研究概况 |
| 1.2 水稻纹枯病防治国内外研究概况 |
| 2 研究目的及意义 |
| 第二章 稻田养鸭抑制水稻纹枯病发生因素及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 稻鸭共育对水稻纹枯病菌核的影响 |
| 2.2 鸭活动搅动田泥对水稻纹枯病发生的影响 |
| 2.3 鸭毛、鸭嘴和鸭粪中粗提物对水稻几丁质酶的影响 |
| 2.4 鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻几丁质酶活性的影响 |
| 2.5 鸭毛、鸭嘴和鸭粪粗提物对水稻纹枯病菌的影响 |
| 2.6 鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻纹枯病菌的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 鸭啄食菌核对减少菌源的影响 |
| 3.2 封泥对水稻纹枯病发生的影响 |
| 3.3 鸭毛、鸭嘴和鸭粪粗提物对水稻几丁质酶活性的影响 |
| 3.4 鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻几丁质酶的影响 |
| 3.5 鸭毛、鸭嘴和鸭粪中粗提物对水稻纹枯病菌的影响 |
| 3.6 鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻纹枯病菌的影响 |
| 3.7 鸭粪粗提物研究 |
| 第三章 鸭粪中水稻纹枯病菌拮抗细菌A168的筛选、鉴定及生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸭粪中拮抗水稻纹枯病细菌的筛选及抑菌谱测定 |
| 2.2 菌株A168菌落培养特征 |
| 2.3 形态特征 |
| 2.4 生理生化特征 |
| 2.5 16S rDNA序列分析 |
| 2.6 系统发育分析和系统发育树构建 |
| 2.7 A168菌株生物学特性 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 A168菌株活性物质的提取及对水稻纹枯病菌抑制机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同溶剂对提取A168菌株活性物质的影响 |
| 2.2 不同物料比对提取A168菌株活性物质的影响 |
| 2.3 不同培养温度对提取A168菌株活性物质的影响 |
| 2.4 不同萃取时间对提取A168菌株活性物质的影响 |
| 2.5 不同提取方式对提取A168菌株活性物质的影响 |
| 2.6 A168菌株活性物质对水稻纹枯病菌的室内毒力测定 |
| 2.7 A168菌株活性物质对菌丝生长的影响 |
| 2.8 A168菌株活性物质对水稻纹枯病菌丝体蛋白质含量的影响 |
| 2.9 A168菌株活性物质对菌核萌发的影响 |
| 2.10 A168菌株活性物质对水稻纹枯病抑制作用 |
| 2.11 A168菌株活性物质对水稻纹枯病菌丝体细胞膜透性的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 第五章 拮抗细菌A168发酵条件研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 摇瓶发酵 |
| 2.2 10L发酵罐试验 |
| 3 结论与讨论 |
| 第六章 A168菌株在水稻中定殖规律及对水稻纹枯病田间防效 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 A168(240)菌株在水稻Lemont叶鞘上的定殖 |
| 2.2 A168(240)菌株在水稻Lemont植株定殖途径 |
| 2.3 A168菌株在不同水稻品种植株中的定殖 |
| 2.4 A168(240)菌株用浸种法接种在水稻Lemont植株中的生长动态 |
| 2.5 A168(240)菌株在水稻叶鞘上的定殖情况 |
| 2.6 田间防治效果 |
| 2.7 A168防治水稻纹枯病的作用方式 |
| 3 结论与讨论 |
| 第七章 A168菌株对水稻幼苗的促生、抗病及增产作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 A168菌悬液对不同水稻品种的促生效果 |
| 2.2 A168菌悬液浸种Lemont后水稻内源激素含量变化 |
| 2.3 A168菌液浸种Lemont后水稻内抗病酶活性的影响 |
| 2.4 A168菌悬液浸种水稻苗对增产的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 第八章 A168菌活性物质的分离、纯化及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 拮抗物质功能成分测定 |
| 2.2 拮抗物质的分离纯化 |
| 2.3 纯化抗菌蛋白L-518对水稻纹枯病菌拮抗活性的检测 |
| 2.4 SDS-PAGE电泳与分子量测定 |
| 2.5 MALDI-TOF-MS结果 |
| 2.6 氨基酸组成分析 |
| 2.7 L-518样品理化性质 |
| 3 结论与讨论 |
| 第九章 结论、创新点与展望 |
| 1 主要研究成果 |
| 1.1 探明了稻田养鸭抑制水稻纹枯病发生的主要因素及抑制机理 |
| 1.2 从鸭粪中分离获得1株水稻纹枯病菌拮抗细菌A168 |
| 1.3 明确了A168菌株活性物质提取方法及抑菌机制 |
| 1.4 确定了A168菌株发酵罐发酵条件 |
| 1.5 研究了A168菌株在水稻上定殖规律及对水稻纹枯病田间防效 |
| 1.6 研究了A168菌株对水稻幼苗促生、抗病及增产作用 |
| 1.7 初步鉴定了A168菌株活性物质 |
| 2 创新点 |
| 2.1 首次系统研究了稻田养鸭抑制水稻纹枯病发生的因子与作用机制 |
| 2.2 首次报道鸭粪中存在有对水稻纹枯病菌具有拮抗作用的细菌,并对其进行了筛选、鉴定及抗菌谱研究 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 A168 16S rDNA序列 |
| 附录三 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 附录四 培养基 |
| 附录五 大肠杆菌CaCl_2法感受态细胞制备及转化 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文情况 |
四、进口鸭毛中沙门氏菌的分离与鉴定（论文参考文献）
- [1]F4ac+产肠毒素大肠杆菌锌转运系统ZnuACB功能探究[D]. 权国梅. 扬州大学, 2021
- [2]河南省生猪中主要食源性致病菌污染调查及沙门氏菌耐药分析[D]. 吴秋玲. 河南农业大学, 2019(06)
- [3]艾地普林在猪、鸡、鱼和大鼠体内的处置与残留消除研究[D]. 王立业. 华中农业大学, 2016(05)
- [4]进口原羊毛检疫监管中的数字管理[J]. 谢京国,鞠波,王庆锡,闫静. 安徽农业科学, 2015(06)
- [5]鼠伤寒沙门氏菌免疫磁分离结合荧光免疫层析快速检测方法的研究[D]. 胡霏. 华南理工大学, 2013(05)
- [6]食品和饲料中沙门氏菌及动物皮毛中炭疽杆菌快速鉴定方法的研究[D]. 肖西志. 西北农林科技大学, 2013(01)
- [7]减毒沙门氏菌递呈PEDV/TGEV双基因核酸疫苗研究[D]. 廖晓丹. 四川农业大学, 2012(07)
- [8]沙门氏菌血清分型分子靶点的发掘及鉴定体系的建立[D]. 刘斌. 上海交通大学, 2012(07)
- [9]大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制[D]. 董丽宁. 南京农业大学, 2011(06)
- [10]稻田养鸭抑制水稻纹枯病机制及拮抗细菌A168筛选鉴定研究[D]. 张亚. 湖南农业大学, 2010(08)