一、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达（论文文献综述）
李豫皖[1]（2020）在《Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究》文中认为研究背景/目的:目前在构建骨组织工程中血管形成的作用越来越受到广泛关注,但在构建骨组织工程中,血管形成和成骨分化之间的分子机制目前尚未阐明。人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC）是一种来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞具有向成骨细胞,成软骨细胞和成脂细胞等多系分化的能力,hAMSCs也具有良好的血管生成能力;Schnurri-3（Shn3）也称为人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白-3（human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 3,HIVEP3）属于BMP/TGF-?的同源物家族。由于Shn3在成骨细胞中的缺失导致Runx2蛋白水平升高进而增强骨形成;骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9）具有显着上调间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）中的各种成骨分化过程中成骨相关因子的表达也能够刺激血管生成相关因子表达。然而,目前Shn3是否能够调节以及如何调节BMP9诱导的hAMSCs在体内外成骨分化和血管形成尚不清楚。基于此,在本课题研究中探讨Shn3是否参与调节BMP9在体内和体外诱导的hAMSCs向成骨分化和血管形成作用的影响及其信号通路和分子机制。方法:（1）胰酶/胶原酶联合消化方法分离并培养hAMSCs,倒置相差显微镜观察其形态改变;使用第3代hAMSCs,通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞表面分子标志物的表达;免疫荧光染色鉴定hAMSCs中波形蛋白和CK-19的表达,检测对第3代hAMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化潜能。（2）通过构建重组腺病毒（adenovirus,Ad）外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）（Ad-RFP）转染第3代hAMSCs后,观察转染效率,并使用qRT-PCR检测Shn3基因在细胞中的表达情况;使用碱性磷酸酶染色和生化定量检测第3、5和7天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的早期成骨分化效应;使用茜素红S染色和骨矿化定量观察第14和21天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的晚期骨矿化的作用,并使用qRT-PCR检测第7天时过表达Shn3对BMP9诱导的成骨相关基因Runx2（Runt related transcription factor 2）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）、I型胶原（Collagen type I,COL-I）、和成骨相关转录因子OSX（Osterix）的mRNA表达水平。（3）通过使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染技术,设BMP9组,Sim-Shn3组,BMP9+Sim-Shn3组和BMP9+Shn3组,分别转染第3代hAMSCs在24h后,将细胞打入裸鼠皮下形成裸鼠体内异位骨化的模型,在4周左右时收取异位骨块样本,并通过Micro-CT（μ-CT）对骨块扫描并行分析,对骨块行固定、包埋和切片染色,使用Masson’s Trichrome三色染色、H&E染色（hematoxylin and eosinstaining）对切片行骨小梁数量和分布进行分析,番红O固绿染色（Safranin O-fast green staining）染色观察异位成骨内软骨形成情况。使用免疫组织化学染色对各实验组异位骨块切片行染色观察,主要观察异位骨块内成骨相关指标包括OCN和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）以及血管形成相关分子如血管生成素-1（Angiopoietin 1,ANGPT1）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在异位骨块中的数量和分布情况。（4）使用细胞免疫组化技术观察过表达或沉默Shn3腺病毒转染细胞后,对BMP9诱导的第3代hAMSCs血管分化指标VEGF的表达及分布。使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,与人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs）在Transwell小室内共培养,其中腺病毒转染的hAMSCs在上层,HUVECs细胞在下层,使用基质胶（Matrigel）铺于板底,观察HUVECs细胞的小管形成能力,简介检测过表达或沉默Shn3对BMP9诱导的hAMSCs血管形成能力。（5）使用电纺聚乳酸-羟基乙酸(poly（lactic-co-glycolic acid,PLGA）共聚物支架材料,将过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）对支架材料的机构和搭载细胞后的细胞长入情况进行观察和分析。通过使用上述支架材料搭载转染腺病毒后的各实验组细胞,在培养48h后,将PLGA-细胞复合物移植入小鼠背部皮下组织内,在5周后,收集小鼠背部皮下移植物样本,并对样本行大体观察移植物在体内的血管长入情况,之后对移植物样本行免疫组织荧光染色,观察其血管性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF）在移植物内的表达和分布。（6）使用蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,其成骨分化相关指标OCN、OPN和Runx2的蛋白表达水平;通过使用Western blot技术,检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对BMP/Smads经典的信号（Smad-1/5/8）进行蛋白印迹检测其表达;通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对成骨相关转录因子Runx2和VEGF的直接作用关系。结果:（1）使用胰酶和II型胶原酶联合消化方法可以一次性获得大量形态均一的hAMSCs;通过细胞传代之后到第3代hAMSCs时,hAMSCs可稳定表达波形蛋白,而低表达CK-19;流式细胞检测第3代hAMSCs细胞表面分子标志物符合MSCs鉴定的表型。第3代hAMSCs具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。（2）重组腺病毒外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Ad-RFP）成功转染第3代hAMSCs后,且qRT-PCR结果显示Shn3在72h左右达到峰值。ALP染色和碱性磷酸酶活性结果显示,在第3、5和7天时,外源性过表达Shn3减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应,而沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应;茜素红S染色和骨矿化定量结果提示在第14和21天时,外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的hAMSCs晚期骨矿化和钙结节的形成;qRT-PCR结果显示在第7天时,外源性过表达Shn3下调了BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关因子包括Runx2、BSP、COL-I和OSX的mRNA表达。（3）在上述Shn3抑制BMP9诱导的hAMSCs体外成骨分化的基础上,进一步研究了Shn3对BMP9诱导的裸鼠皮下异位骨形成的成骨分化的影响。使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染BMP9诱导的第3代hAMSCs细胞后制造的裸鼠异位成骨模型中,大体观察结果和micro-CT结果显示,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组异位成骨的骨体积减小。与其他组相比,BMP9+Sim-Shn3组具有较强的异位成骨能力。Micro-CT的分析结果显示外源性Shn3表达增加了BMP9在hAMSCs中诱导异位骨块的平均骨密度,相反,外源性过表达Shn3降低了BMP9诱导的hAMSCs异位骨形成的平均骨密度。骨组织形态学定量分析显示骨体积/总体积（Bone volume/total volume,BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular number,Tb.N）,骨小梁厚度（Trabecular thickness,Tb.Th）和骨密度（Bone mineral density,BMD）与BMP9组相比,在BMP9+Sim-Shn3组有显着增加,相反,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组的上述参数有不同程度的下降,但骨小梁分离度在各组中无明显差异。组织化学染色结果显示与BMP9组相比,Sim-Shn3可增加了BMP9诱导的异位成骨中小梁骨数量和骨基质的形成。而外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的骨基质形成,同时免疫组化染色结果显示沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的异位骨化中成骨相关因子OCN和OPN以及血管形成相关因子ANGPT1和VEGF的表达,但外源性过表达Shn3基因抑制了此种效应。（4）细胞免疫组化染色结果显示,在第7天是,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs血管分化相关指标VEGF的表达;免疫荧光染色结果显示HUVECs细胞表达内皮粘蛋白（Endomucin,EMCN）、CD31、VEGF和vWF分子的表达;在与HUVECs细胞使用Transwell共培养诱导小管形成实验结果同样显示,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs间接小管形成的能力。（5）在使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜结果显示,细胞在PLGA电纺支架中生长情况良好,多数细胞能够贴壁;PLGA-细胞复合物移植入小鼠皮下的血管形成实验样本大体观察结果显示,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的皮下血管长入,且样本的免疫荧光染色结果提示,较其他各组中,沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的血管形成相关分子vWF的表达。（6）Western blot结果显示,在第7天是,较其他各组,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关指标包括OCN、OPN和Runx2的蛋白水平表达;外源性过表达BMP9增强了Smad1/5/8的磷酸化水平,同时Sim-Shn3显着增强了BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化表达。ChIP分析结果表明,转录因子Runx2能够在BMP9诱导的hAMSC中与VEGF启动子区域相结合。且免疫沉淀和免疫印迹结果表明外源性沉默Shn3的表达能够增强BMP9诱导的细胞中转录因子Runx2对其下游分子VEGF启动子的活性,证明了转录因子Runx2与VEGF分子之间的直接作用关系。结论:（1）人羊膜间充质干细胞具有MSCs的基本表型,具有向多系分化的能力包括成骨、成软骨及成脂细胞的潜能。（2）外源性沉默Shn3基因表达能够增强BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化,而外源性过表达Shn3基因表达则减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化。在外源性沉默Shn3表达后,能够加强BMP9诱导的hAMSCs在体外的血管形成。（3）通过沉默Shn3基因表达可以在体内外促进BMP9诱导的早期和晚期成骨分化以及血管形成的这一过程中,这可能是通过增强BMP/Smads信号来介导,并且Shn3在参与调节BMP9诱导的hAMSCs成骨分化和血管形成的双向效应中,Shn3通过调节关键成骨转录因子Runx2,激活其下游分子VEGF以促进BMP9诱导的hAMSCs的成骨和血管生成方面,Shn3发挥了重要的作用。
朱云森[2]（2020）在《骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究》文中认为背景和目的:正常的骨基质矿化是骨形成和骨修复重建的关键步骤;成骨细胞分泌的I型胶原组成基质的主要成分并提供矿化的基础框架结构,而非胶原蛋白参与并调控羟基磷灰石的有序沉积。骨粘连蛋白（osteonectin,ON）是一种重要的非胶原蛋白,又称为SPARC或BM-40,它对1型胶原和羟基磷灰石有高度的亲和力,参与了细胞外基质矿化的始末过程;同时作为重要的细胞外基质功能调节蛋白,骨粘连蛋白调节细胞外基质和胶原的合成,影响成骨细胞数量和功能,对矿化起重要的调控作用。P38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶,是细胞外信号向细胞内传导的重要通路,也是骨形成的重要信号枢纽,在不同的成骨信号的作用下,p38MAPK可以调节成骨细胞碱性磷酸酶的活性和矿化能力。既往骨粘连蛋白在矿化中的研究多集中于基因敲除的动物实验,本课题的目点是为骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化提供直接的实验依据,同时对p38 MAPK是否是其重要的信号传导途径进行实验研究,为有效干预骨基质矿化提供更多的作用位点。研究方法:第一部分:成骨细胞分离、培养与鉴定取新生SD乳鼠（出生48h内）的颅盖骨,采用酶交替消化法进行成骨细胞分离,利用差异贴壁法进行纯化,获得的成骨细胞使用碱性磷酸酶染色进行阳性率测定,茜素红染色检测矿化结节形成。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞矿化期OCN、OPN、BSP及p38 MAPK基因表达的影响研究分离培养获得的传代成骨细胞进行随机分组,分别加入不同浓度的大鼠重组骨粘连蛋白（SPARC/BM-40）:A组,空白对照组,不添加骨粘连蛋白;B组,0.01μg/ml骨粘连蛋白;C组,0.1μg/ml骨粘连蛋白;D组,1μg/ml骨粘连蛋白;E组,10μg/ml骨粘连蛋白;在第2、5及8d分别取材并提取各组RNA,通过RT-qPCR检测骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、骨涎蛋白（BSP）及p38 MAPK的基因表达,明确骨粘连蛋白在成骨细胞矿化中的调控作用,并根据实验结果确定实验的最佳适宜浓度（骨粘连蛋白OPTIMA）及取材观察时间。第三部分:骨粘连蛋白对成骨细胞其它矿化指标的影响及SB203580（p38MAPK特异性阻断剂）的阻断效应研究根据第二部分实验结果,我们对骨粘连蛋白在成骨细胞中的正向调控作用进行进一步证实,同时对p38的具体作用进行研究,实验进行重新分组:空白对照组,不添加骨粘连蛋白;骨粘连蛋白OPTIMA组,添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h,再添加骨粘连蛋白OPTIMA;实验增加了小整合素结合配体N-连接糖蛋白家族:细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）、牙本质基质蛋白1（DMP1）和牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因表达的RT-qPCR检测;同时利用流式细胞仪对成骨细胞内钙离子浓度进行了测定;茜素红染色检测矿化结节及电镜下观察成骨细胞的超微结构;Western-blot测定各组p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK（P-p38）的蛋白表达。第四部分:P38 MAPK重组腺病毒载体及p38 MAPK-shRNA慢病毒载体的构建P38MAPK重组腺病毒载体（AD-p38）的构建:根据基因库序列,设计p38MAPK引物,加入酶切位点,以大鼠心脏cDNA为模板进行PCR扩增,经过测序鉴定后,将目的基因片段连入pShuttle-CMV的相应酶切位点,构建重组腺病毒穿梭质粒,酶切线性化处理后将其与AdEasyTM DNA共转化BJ5183感受态菌,抽提重组AdEasyTM质粒制备Ad-p38MAPK DNA转染细胞。P38MAPK-shRNA慢病毒载体的构建:根据p38MAPK基因序列,由公司合成提供3条干扰靶点序列shRNA1、shRNA2、shRNA3及非特异性靶序列,经酶切线性化处理后,通过连结慢病毒穿梭质粒及辅助包装共转染细胞,进行病毒滴度测定,通过效应蛋白表达检测选择干扰程度最大的用于后续试验。第五部分:P38信号通路在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的作用的进一步研究为了进一步探讨p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的信号通路作用,我们通过构建的p38 MAPK重组腺病毒载体转染成骨细胞过表达p38及p38-shRNA慢病毒载体转染成骨细胞来抑制表达p38,并进行实验分组:对照组,仅添加骨粘连蛋白OPTIMA;AD-p38 MAPK组:成骨细胞被AD-p38 MAPK转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h再添加骨粘连蛋白OpTIMA;p38 MAPK-shRNA组:成骨细胞被p38 MAPK-shRNA转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;使用RT-qPCR和Western-blot法测定各组OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE及p38MAPK基因和蛋白的表达。结果:第一部分:分离培养的成骨细胞通过碱性磷酸酶染色细胞阳性率接近100%,矿化诱导2周后茜素红染色及四环素培养标记的矿化结节观察,结果满意。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及p38的基因表达均有不同程度的影响;根据实验结果确定1μg/ml骨粘连蛋白为本组实验最佳效应浓度（骨粘连蛋白OpTIMA）,第5天为实验观察取材时间;1μg/ml的骨粘连蛋白组在第5天能显着提高成骨细胞OCN、OPN、BSP及p38的基因表达,与空白对照组比较差异均有统计学差异（OCN,p<0.01;OPN,p<0.05;BSP,p<0.05;p38,p<0.001）;同时我们得出初步结论,骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用,并对p38 MAPK通路有激活作用。第三部分:实验进一步证实了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化中的正向调控作用,p38 MAPK是其重要的信号传导通路。P38 MAPK蛋白测定结果显示骨粘连蛋白OPTIMA组p38及P-p38的蛋白表达均明显增加,与空白对照组比较差异均有统计学意义（p<0.001）;骨粘连蛋白OPTIMA组Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达与空白对照组比较均有明显提高,差异均有统计学意义（DMP1,p<0.01;DSPP,p<0.01;MEPE,p<0.001）;流式细胞仪进行细胞内钙离子浓度测定显示骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较明显提高,差异有统计学意义（p<0.01）;根据茜素红染色及photoshop成像分析,骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较矿化结节面积明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）;电镜下超微结构观察与空白对照组比较,骨粘连蛋白OPTIMA组细胞成骨活性增加,成骨细胞内含有更多的细胞器及富含矿化物的囊泡结构。添加p38阻断剂（SB203580）后与骨粘连蛋白OPTIMA组比较,P-p38的蛋白测定有显着下降（P<0.001）,非胶原蛋白（OCN、OPN、BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达也均有明显下降,差异均有统计学意义,电镜下观察成骨细胞活性较骨粘连蛋白OPTIMA组明显受到抑制。第四部分:P38MAPK重组腺病毒载体构建中的基因片段电泳验证及序列测定结果均与基因库一致;p38MAPK-shRNA慢病毒载体通过干扰预实验选择p38MAPK-shRNA3转染成骨细胞（干预性能与对照组比较:shRNA1、shRNA2,P<0.01;shRNA3,P<0.001）,病毒滴度的测定阳性转染组为1.7×108IU/ml（对照组:2 × 108IU/ml）,符合实验标准。第五部分:实验进一步证实了 p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的重要作用;结果显示AD-p38组明显上调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因和蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均显着升高,两组差异均有统计学意义;而p38-shRNA组及p38阻断剂组明显下调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,两组的OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因、蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均明显下降,差异均有统计学意义。结论:骨粘连蛋白通过p38 MAPK通路调控成骨细胞矿化:①骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因和蛋白表达,显着提高细胞内钙离子浓度,促进成骨细胞矿化结节的形成和成骨活性。②骨粘连蛋白可以激活p38 MAPK信号通路:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞p38 MAPK的基因和蛋白表达。③P38MAPK是骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化的重要信号通路:p38阻断剂的使用及p38-shRNA病毒载体转染的成骨细胞（p38抑制表达）明显下调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用;AD-p38转染的成骨细胞（p38过表达）上调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用。
何武兵[3]（2020）在《重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用》文中认为背景:组织工程人工骨中骨髓间充质干细胞（BMSCs）、骨生长因子和合适的载体发挥重要作用。研究编码人骨形态发生蛋白2（hBMP2）和转化生长因子β 3（TGF-β3）的慢病毒（LV）对BMSCs的体内外成骨分化,促进骨形成,协同提高脊柱融合效果。方法:构建编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒并转染大鼠BMSCs。转染后BMSCs成骨分子的表达使用qRT-PCR和蛋白质印迹进行检测。构建大鼠腰椎后外侧横突间融合模型。术后通过放射学、手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估融合效果。结果:hBMP2和/或hTGF-β3基因通过聚合酶链反应扩增,DNA测序,以及BLAST分析来确认。编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒感染的BMSCs可有效地过表达hBMP2和hTGF-β3,以及上调培养上清液中hBMP2和hTGF-β3的水平。共转染hBMP2和hTGF-β3比单独转染hBMP2或hTGF-β3更有效地诱导BMSCs成骨分化。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3共转染组（分别编码hBMP2和hTGF-β 3的LV转染的BMSCs混合使用）和LV-hBMP2-hTGF-β3组（编码hBMP2和hTGF-β3融合基因的LV转染的BMSCs）中骨桥蛋白（OPN）,骨钙蛋白（OCN）和骨保护素（OPG）的表达水平显着高于LV-BMP2（LV携带hBMP2转染的BMSCs）组和 LV-hTGF-β3（LV 携带 hTGF-β3 转染的 BMSCs）组（P<0.05）。hBMP2和/或hTGF-β3过表达上调碱性磷酸酶（ALP）活性。大鼠腰椎后外侧植入术后2周、4周、6周、8周通过放射学评估骨生长情况。大鼠腰椎后外侧植入术后8周,通过手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3组1只（共5只）,和LV-hBMP2-hTGF-β3组4只（共8只）大鼠脊柱全部融合;LV-空载体组6只（共7只）,LV-hBMP2组1只（共8只）和LV-hTGF-β3组1只（共10只）大鼠脊柱全部植入处均未见明显骨痂生长;其余各组大鼠脊柱植入处可见部分骨痂,但是无法融合。结论:本研究表明慢病毒载体能够成功转导hBMP2和/或hTGF-β3基因,靶向基因可在BMSCs中成功过表达。我们的体外实验表明,联合使用hBMP2和hTGF-β3基因可以协同诱导骨分化。本实验条件下,慢病毒携带hBMP2和hTGF-β3基因感染的BMSCs,分别单独产生BMP2和hTGF-β3,在免疫活性大鼠模型中能诱导成骨,但是无法获得脊柱融合。hBMP2和hTGF-β3融合基因转染比hBMP2和hTGF-β3混合转染的BMSCs更能诱导成骨,脊柱融合率更高。免疫活性大鼠模型中,hBMP2和hTGF-β3基因可以联合使用、融合基因效果更佳,均能协同诱导成骨、促进脊柱融合,预计这两种细胞因子的组合将在未来作为一种治疗策略。
史怡凡[4]（2020）在《氟化钠对重组人骨形成蛋白-2应用于大鼠异位成骨协同作用的可行性研究》文中研究表明在口腔颌面外科中,先天性畸形、外伤、感染、肿瘤可以导致骨缺损,需要通过骨移植进行修复。尽管现在已经存在很多种的骨移植技术,但由于附加手术侵袭,自体骨源的限制,异体骨免疫排斥和感染等因素的影响,研发骨诱导材料代替骨移植显得越来越重要。在1965年Urist证明移植脱钙骨可以诱导骨骼肌形成软骨和骨。骨形成蛋白作为一种活性的骨诱导因子已经被证实存在于脱钙骨基质中,促进骨质形成。通过分子生物学技术的发展和应用,现阶段已经研发出十余种重组人骨形成蛋白,其中重组人骨形成蛋白-2和重组人骨形成蛋白-7应用最为广泛,已经在部分骨移植、骨再生领域应用于临床。由于重组人骨形成蛋白-2半衰期较短,为使其能在作用部位长期维持有效浓度,需要将其整合到合适的载体上,减少重组人骨形成蛋白-2的剂量及副作用。天然高分子（胶原、壳聚糖等）、人工合成高分子聚合物（聚乳酸、聚乙烯二醇等）、无机材料（羟基磷灰石、钛合金等）均可作为重组人骨形成蛋白的载体。氟化物对骨质形成过程作用复杂,且存在剂量和时间依赖性。较低浓度的氟化物可以促进骨质形成、骨质矿化,高浓度的氟化物对成骨过程存在抑制作用。本文综述了重组人骨形成蛋白-2的研究概况和目前应用现状,以及氟化物对骨形成过程的作用。拟通过动物试验探究氟化物与重组人骨形成蛋白-2在异位成骨中是否存在协同作用,氟化物能否作为促进重组人骨形成蛋白-2成骨的促进物。实验目的:探讨氟素对重组人骨形成蛋白-2在肌肉中成骨的影响。方法:rhBMP-2与I-型胶原混合体植入8周大的大鼠腹直肌内,大鼠分三组,分别给予蒸馏水、含1mg/L氟化钠,100mg/L氟化钠喂养。形成的新骨摘除后行病理学检查,测定碱性磷酸酶（ALP）活性及钙含量。结果:1.低浓度氟染组（1mg/L）和高浓度氟染组（100mg/L）碱性磷酸酶活性略高于对照组,但没有显着区别（P>0.05）。2.氟染3周后低浓度氟染组与高浓度氟染组碱性磷酸酶活性达同一水平。3.对照组与氟染组的钙含量随时间延长逐渐增加,第3周时低浓度氟染组与高浓度氟染组钙含量无明显差异,但显着高于对照组（P<0.05）。4.氟化物不能改变rhBMP-2异位成骨机制。结论:通过实验我们发现氟作为参与骨质形成的重要元素,在rhBMP-2诱导的异位成骨过程中对于骨化没有明显的影响。虽然本实验在rhBMP-2植入3周后可以发现氟染组新生骨中钙含量存在增高的趋势,但氟能否作为合适的添加物促进rhBMP-2诱导成骨还需要长期观察。
戴瑛[5]（2013）在《CGRP上调TGF-β/BMP-2表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究》文中研究指明研究目的：牙周炎发生的初始原因是细菌、毒素因子和机体间的防御功能的平衡被打破所致。越来越多的研究表明与遗传有关的宿主易感性是牙周炎发病过程中的主要决定因素之一。近年来，牙周病易感因素与基因多态性方面的研究越来越受到关注。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）阳性神经纤维广泛分布于牙周炎的起始部位。有研究表明，受到外界刺激后的牙周组织中CGRP含量增高，并通过特定的机制，调节牙周组织中的成骨细胞、骨细胞、成纤维细胞的生理活性。另有研究表明CGRP是骨细胞的活性调节因子，可以促进成骨分化及骨组织的形成。并且一定浓度的CGRP可促进体外培养的牙周膜成纤维细胞的增殖，并对细胞表面黏附分子起促进作用。研究证实，CGRP对人牙周膜成纤维细胞影响主要在于CGRP可促进人牙周膜成纤维细胞的增殖、胶原合成、成骨分化等。但是对于CGRP在人牙周膜成纤维细胞的纤维钙化方面的信号转导通路的研究国内外鲜见报道。本研究试图初步探讨CGRP对人牙周膜细胞细胞增殖、胶原合成、纤维钙化等作用可能涉及的信号通路。研究方法：第一部分：临床采集健康牙齿，采用酶消化+组织贴附法，进行人牙周膜成纤维细胞原代培养。运用sABC法，进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色，对人牙周膜成纤维细胞进行形态学观察和免疫组织化学鉴定。以CGRP-A和CGRP-C基因为目的基因，以腺病毒为载体，采用腺病毒构建技术，构建CGRP基因重组腺病毒（Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C），感染人牙周膜成纤维细胞，并加以鉴定，作为细胞实验的基础。第二部分：通过Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纤维细胞后培养72h，运用细胞流式检测、定量PCR测定和Western-blot测定的方法，检测人牙周膜成纤维细胞增殖、凋亡水平变化、胶原合成分泌水平变化，以及MMP-2、MMP-9、OPN、CAP-3、ALP等效应蛋白的表达水平变化。探讨CGRP-A、CGRP-C基因对感染的人牙周膜成纤维细胞纤维钙化作用的影响。第三部分：在单因素Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纤维细胞后培养72小时，运用定量PCR测定和Western-blot测定的方法，进一步检测BMP-2、BMP-4、BMP-7、TGF-β等细胞因子的变化。在分子水平上探讨CGRP多态性基因作用于人牙周膜成纤维细胞后，对人牙周膜成纤维细胞的细胞增殖、胶原合成纤维化，成骨钙化等作用可能涉及的信号通路。结果：1、原代细胞培养成功，免疫荧光染色鉴定：波形丝蛋白染色呈阳性，角蛋白染色呈阴性，并选取四个细胞株作为后两部分实验的材料。2、成功构建降钙素基因相关肽的重组腺病毒Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C，并感染人牙周膜成纤维细胞表达降钙素基因相关肽。3、细胞流式检测显示：Ad.CGRP-A处理组处于S/G2/M期的细胞比例显着高于Ad.CGRP-C处理组和空病毒对照组。Ad.CGRP-C处理组处于S/G2/M期的细胞比例显着低于空病毒对照组。4、定量PCR检测和Western-blot测定部分细胞外基质胶原蛋白（COL）、金属蛋白酶（MMP）、成骨分化标志物（ALP）及凋亡蛋白酶-3（CAP-3）基因结果显示：（1） Ad.CGRP-A处理组COLI、III、IV型胶原蛋白表达水平显着高于Ad.CGRP-C处理组和空病毒对照组；Ad.CGRP-C处理组COLI、III、IV型胶原蛋白表达水平显着低于空病毒对照组。（2） Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组MMP-2的相对表达水平显着高于空病毒对照组；且Ad.CGRP-C处理组的相对表达水平显着高于Ad.CGRP-A处理组；MMP-9表达含量较低，没有检测到结果。（3） Ad.CGRP-A处理组蛋白ALP的相对表达水平明显高于空病毒对照组；而Ad.CGRP-C处理组与空病毒对照组无明显差异。（4） Ad.CGRP-A处理组蛋白OPN的相对表达水平明显高于空病毒对照组；而Ad.CGRP-C处理组相对表达水平显着低于Ad.CGRP-A处理组与空病毒对照组。（5） Ad.CGRP-A处理组和Ad.CGRP-C处理组的CAP-3相对表达水平与空病毒对照组CAP-3的相对表达水平无明显差异。5、定量PCR检测和Western-blot测定，TGF及BMP家族基因表达结果显示：（1）在观察促成骨钙化的研究试验中，通过对BMP-2、MBP-4、BMP-7几个细胞因子的定量PCR实验结果显示： Ad.CGRP-A处理组BMP-2表达显着高于空病毒对照组和Ad.CGRP-C处理组；但是Ad.CGRP-C处理组BMP-2表达水平与空病毒对照组无显着差异；BMP-4组中，Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组与空病毒对照组之间的相对表达水平无显着差异；BMP-7表达含量较低，没有检测到结果。（2）在观察促纤维化的研究试验中，Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组TGF-β的相对表达水平均高于空病毒对照组；而Ad.CGRP-A处理组相对表达水平低于Ad.CGRP-C处理组。结论：1、 CGRP-A显着促人牙周膜成纤维细胞高表达BMP-2、OPN及ALP，提示CGRP通过激活BMP-2途径促人牙周膜成纤维细胞成骨分化。CGRP-C可显着抑制人牙周膜成纤维细胞中OPN表达，对BMP-2和ALP表达无显着影响，提示CGRP基因+5247位点的单核甘酸多态性显着影响CGRP促人牙周膜成纤维细胞成骨分化。2、 CGRP-A显着促人牙周膜成纤维细胞高表达TGF-β、COLI型、COLIII型、COLIV型，此外CGRP-A显着提高人牙周膜成纤维细胞中S/G2/M期细胞比例，提示CGRP通过激活TGF-β途径促人牙周膜成纤维细胞增殖及纤维化。值得注意的是，尽管CGRP-C也可显着促人牙周膜成纤维细胞高表达TGF-β，但同时CGRP-C显着上调人牙周膜成纤维细胞中MMP-2表达（表达水平较CGRP-A和对照组分别升高4倍和5倍），提示CGRP-C可能通过上调金属蛋白酶表达的途径抑制人牙周膜成纤维细胞的纤维化及增殖能力，但其相关的具体调控机制方面需要深入探索。
贾春蓉,冯兴华,刘宏潇,李敏,吴志奎[6]（2012）在《淫羊藿苷对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达及其分子机制的影响》文中进行了进一步梳理目的:探讨淫羊藿苷对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达及其分子机制的影响。方法:以体外培养的AS髋关节囊组织的成纤维细胞为实验对象,在细胞因子BMP与TGF-β的诱导刺激下,观察BMP-2与TGF-β1作用下,AS成纤维细胞成骨型表达状况,以及淫羊藿苷对细胞因子诱导后的成纤维细胞成骨型表达及其分子机制的影响。结果:细胞因子作用后,AS成纤维细胞的ALP活性、胶原含量、骨钙素含量较正常对照组与AS对照组明显提高（P<0.01）。药物作用后,淫羊藿苷含药血清对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞ALP、胶原含量、骨钙素含量活性有明显的抑制作用（P<0.01）;而兔空白血清组SASP含药血清组则作用不明显（P>0.05）。结论:淫羊藿苷可以通过抑制细胞因子对成纤维细胞成骨型标志物的影响而达到抑制成纤维细胞进一步向成骨型的分化。
贾春蓉,冯兴华,刘宏潇,李敏,吴志奎[7]（2011）在《补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达的影响》文中研究指明[目的]探讨补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎（AS）成纤维细胞成骨型表达的影响。[方法]以体外培养的AS髋关节囊组织的成纤维细胞为实验对象,观察在细胞因子BMP-2与TGF-β的诱导刺激下,AS成纤维细胞成骨型表达标志物ALP活性、胶原含量、骨钙素含量的变化。[结果]细胞因子作用后,AS成纤维细胞的ALP活性、胶原含量、骨钙素含量较正常对照组与AS对照组有明显提高（P<0.01）。药物作用后,补肾强脊颗粒含药血清对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞ALP、胶原含量、骨钙素含量活性有明显的抑制作用（P<0.01）;而兔空白血清组SASP含药血清组则作用不明显（P>0.05）。[结论]补肾强脊颗粒可以通过抑制细胞因子对成纤维细胞成骨型标志物的影响而达到抑制成纤维细胞进一步向成骨型的分化。
王惠娟,董进[8]（2011）在《转化生长因子β对成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfal基因表达的影响》文中提出目的:通过转化生长因子β（TGF-β）对体外成骨细胞增殖、骨形态蛋白-2（BMP-2）及核心结合因子1（Cbfal）基因表达的影响,探讨TGF-β对骨代谢影响的可能机制。方法:不同浓度的TGF（0、0.01、100ng/ml）刺激体外培养的大鼠成骨细胞,采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力,用半定量RT-PCR法检测成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达。结果:TGF-β可明显促进成骨细胞增殖（P<0.05）,并促进成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达（P<0.01）,具有浓度依赖性。结论:TGF-β可促进成骨细胞的增殖、分化及成熟,可能是通过增强BMP-2、Cbfal基因的表达来实现的。
曾昭勋[9]（2011）在《hTGF-β1、hBMP-2基因修饰骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究》文中提出目的:（1）在明确人转化生长因子β（hTGF-β）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向骨组织细胞分化作用的基础上,基于转基因技术实现BMSCs的hTGF-β1基因修饰;（2）研究hTGF-β1联合hBMP-2协同诱导BMSCs成骨作用的影响,阐明其成为理想骨组织工程种子细胞价值。方法:1.利用基因同源重组原理,通过AdMax腺病毒系统构建hTGF-β1重组腺病毒,以及对照组病毒pAdMax-EGFP-3FLAG.2.目的基因修饰的骨髓间充质干细胞的建立:（1）采用差速贴壁传代筛选法和流式细胞鉴定相结合,分离培养大鼠骨髓间充质干细胞;（2）通过腺病毒载体介导hTGF-β1基因转染BMSCs,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况,确定最佳感染复数;（3）RT-PCR检测转染后BMSCs中hTGF-β1的表达情况;ELISA检测转染细胞培养上清中目的蛋白的表达。3.双基因修饰的BMSCs细胞生物学特性分析:将外源基因修饰的BMSCs分为5组:A.正常MSCs组;B.空病毒修饰组;C.hBMP-2修饰组;D.hTGF-β1修饰组;E.hTGF-β1+ hBMP-2修饰组。（1）采用MTT法测定各组细胞增殖能力;（2）酶促反应检测细胞碱性磷酸酶活性。结果:（1）成功将hTGF-β1基因导入表达载体pAV-MCMV-EGFP-3FLAG中,构建了重组腺病毒Ad-hTGF-β1,DNA测序证明,所克隆目的基因序列与Genebank收录一致。（2）通过结合贴壁培养法和流式细胞鉴定高效、快速的分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并通过GFP荧光表达提示目的基因存在于所转染的细胞中;RT-PCR显示转染细胞中有大量目的基因mRNA转录;ELISA结果显示转染细胞胞浆中有目的蛋白的表达。（3）不同基因修饰后的MSCs增殖能力均得到不同程度的增强,其中hTGF-β1和hBMP-2共同修饰对促进MSCs的增殖能力最明显;ELISA检测显示双转组中MSCs的ALP活性明显高于各单转组。结论:（1）利用新的AdMax腺病毒载体转染方法可使骨髓间充质干细胞高效稳定地表达hTGF-β1及hBMP-2基因;（2）利用两种基因间的协同作用,联合应用hTGF-β1和hBMP-2可明显促进组织工程骨种子细胞的成骨化,效果优于单用一种生长因子。
杨济洲[10]（2010）在《国新牌骨痛膏促进家兔骨愈合的实验研究》文中提出研究背景骨折是骨科临床的常见病和多发病,随着社会经济的发展,交通运输高度发达,而且中国逐渐迈入老龄化社会,骨折成高发态势。据统计约有5%-10%的骨折可因各种原因发生骨折迟缓性愈合及不愈合。目前,国外对于药物促进骨折愈合的研究较少,国内的研究也多侧重于中药内服,相对中药内服促进骨愈合而言,外用中药促进骨愈合的研究水平不高。中医药治疗骨折已有漫长的历史,经验丰富。1931年出土的《居延汉简》中就记录了汉代军医以膏药为主治疗各种创伤的方药和方法,可见早在秦汉时代应用敷贴治疗骨伤就已经很普遍了。因此利用现代分子生物学及细胞生物学深入研究并揭示外用中药治疗骨折的疗效及机制有重要的现实意义和社会意义。国新牌骨痛膏源自吉林省民间验方,为促进骨愈合的一种外用膏剂,在临床应用多年,疗效确切,治愈大量骨折、骨不连、骨坏死病人,但是作用机制仍不清楚,本研究拟通过检测血生化指标、X线评分、组织切片观察、胶原分型、骨形态发生蛋白（BMP-2）免疫组化、骨形态发生蛋白（BMP-2）原位杂交等方法验证其促进促进骨愈合的效果,从现代医学的角度探讨其促进骨愈合的的作用机制,进而从现代医学角度为外用中药促进骨愈合提供更为科学的依据。研究目的探讨国新牌骨痛膏促骨愈合效果,揭示其促进骨愈合的可能机理。研究方法将30只日本大耳白兔均以手术造成双桡骨中段宽约3mm、深达髓腔的骨缺损模型,术后观察日本大白兔的一般情况。再将造模成功的30只日本大耳白兔随机分成国新牌骨痛膏外用药组和空白对照组,再将每组15只随机分成三个亚组,即第1周取标本组（A组）、第2周取标本组（B组）、第4周取标本组（C组）,空白对照组以石膏固定,给药组外敷国新牌骨痛膏后以石膏固定,给药组每2天换一次药,1周处死A组,2周处死B组,4周处死C组。每组处死前均予耳缘静脉取血,检测血中ALP、钙、磷、镁浓度,两组行t检验；处死后拍摄双侧桡骨侧位X光片肉眼观察评分,A、B、C各组行t检验比较；病理学HE、Masson染色观察；Ⅰ、Ⅲ型胶原苦味天狼星染色后偏正光显微镜观察分析；免疫组化法检测桡骨缺损处骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP-2）的表达,测MOD值后A、B、C各组行t检验；原位杂交法检测桡骨缺损处骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP-2）的表达,测MOD值后A、B、C各组行t检验。研究结果术后各组实验兔的一般情况良好；术后1、2、4周时,生化指标检查：给药组与对照组血中ALP、钙、磷、镁及钙磷乘积值均无统计学差异；放射学检查：术后第1周给药组即有骨痂形成,对照组未见骨痂生长。术后第2周两组均可见骨痂形成,给药组骨折缺损区有较完全的骨痂填满并见大量外骨痂形成,对照组骨折缺损区可见软性骨痂填充,大部分无外骨痂。术后第4周给药组缺损区骨皮质重建,骨干外形恢复,髓腔再通,对照组缺损区骨痂基本填满,仍有连接性骨痂阴影,髓腔未通。各组X线片肉眼观察评分结果给药组的得分均高于空白对照组,统计学差异显着；病理学HE、Masson染色观察发现给药组第1周即出现骨痂,第2周外骨痂明显,第4周缺损部位骨痂中胶原明显减少,骨缺损修复质量好。对照组第1周时未见骨痂形成,第2周大部分无外骨痂,第4周缺损部位骨痂仍含有大量胶原,修复质量较给药组差；Ⅱ、Ⅲ型胶原苦味天狼星染色结果,给药组的Ⅰ型胶原出现较对照组早,且Ⅰ型胶原含量高；BMP-2免疫组化及原位杂交结果给药组BMP-2mRNA的表达出现时间早于对照组,表达程度明显优于对照组,统计学差异显着。结论（1）国新牌骨痛膏对血ALP、钙、磷、镁及钙磷乘积没有影响。（2）国新牌骨痛膏可以促进Ⅰ型胶原的表达。（3）国新牌骨痛膏可以调节BMP-2的合成、分泌并促进BMP-2的表达（4）国新牌骨痛膏可以使骨痂提前出现,提高骨愈合质量,缩短愈合时间,促进骨愈合
二、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达（论文提纲范文）
（1）Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 羊膜间充质干细胞分离、提取与鉴定及其多向分化潜能的实验研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Shn3对BMP9 诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成的作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成中的信号机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:成骨分化和血管形成中分子的偶联机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的主要学术成果 |
（2）骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 成骨细胞的分离、培养与鉴定 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 骨粘连蛋白影响成骨细胞矿化期非胶原蛋白基因的表达 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 骨粘连蛋白对其它矿化指标的影响及SB203580的阻断效应 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四部分 AD-p38及p38-rhRNA病毒载体构建 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第五部分: P38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中信号通路作用的进一步研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 生物矿化及仿生的机制研究及应用 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表文章一览表 |
| 致谢 |
（3）重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 构建hBMP2、hTGF-β3以及hBMP2-hTGF-β 3真核表达质粒、病毒的包装和转染BMSCs细胞 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SD大鼠的BMSCs的提取、体外培养和鉴定 |
| 1.2.2 构建PCDH-CMV-EGFP-hBMP2、PCDH-CMV-EGFP-hTGF-β3以及PCDH-CMV-EGFP-hBMP2-hTGF-β3真核表达质粒,并筛选、鉴定、扩增和抽提 |
| 1.2.3 包装病毒的过程 |
| 1.2.4 慢病毒携带重组质粒单个和联合转染BMSCs细胞 |
| 1.2.5 检测经过转染的BMSCs细胞中的目的基因表达 |
| 1.2.6 转染后BMSCs细胞形态变化 |
| 1.2.7 转染后的BMSCs细胞成骨分子的表达 |
| 1.2.8 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 大鼠BMSCs的形态学观察 |
| 1.3.2 大鼠BMSCs的表型鉴定 |
| 1.3.3 目的基因PCR扩增产物电泳分析 |
| 1.3.4 酶切验证重组质粒 |
| 1.3.5 重组质粒经公司测序后结果 |
| 1.3.6 慢病毒包装结果 |
| 1.3.7 慢病毒介导的重组目的质粒感染BMSCs细胞 |
| 1.3.8 免疫印记分析检测目的基因的表达 |
| 1.3.9 实时荧光定量PCR检测BMSCs中目的基因的表达 |
| 1.3.10 感染后的细胞形态变化 |
| 1.3.11 利用细胞爬片和免疫组化染色检测各组细胞转染后的细胞形态和目的蛋白表达 |
| 1.3.12 转染后各组BMSCs的成骨分子的表达 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 慢病毒介导的BMP2和TGF-β3重组质粒感染BMSCs后对大鼠脊柱融合的协同成骨作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定 |
| 2.2.3 各组LV转染大鼠BMSCs移植材料的准备 |
| 2.2.4 手术方法 |
| 2.2.5 标本收集 |
| 2.2.6 观察指标 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 X线片观察 |
| 2.3.2 手动测量评估 |
| 2.3.3 微计算机断层扫描(Micro-CT)分析 |
| 2.3.4 组织学观察标本 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）氟化钠对重组人骨形成蛋白-2应用于大鼠异位成骨协同作用的可行性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 骨缺损的修复简介 |
| 1.2 RhBMP-2 概述 |
| 1.3 rhBMP-2 载体概述 |
| 1.4 双释放系统的研究 |
| 1.5 rhBMP-2 的应用 |
| 1.5.1 rhBMP-2 在骨科的应用 |
| 1.5.1.1 rhBMP-2应用于长骨骨折及骨缺损治疗的相关研究 |
| 1.5.1.2 rhBMP-2 应用于股骨头坏死治疗的研究 |
| 1.5.2 rhBMP-2 在脊柱融合术中的应用 |
| 1.5.3 rhBMP-2 在脑外科的应用 |
| 1.5.4 rhBMP-2 在软骨修复中的应用 |
| 1.5.5 rhBMP-2 在口腔领域的应用 |
| 1.5.5.1 rhBMP-2应用于颌面部骨缺损修复的相关研究 |
| 1.5.5.2 rhBMP-2应用于颌面部牵张成骨的相关研究 |
| 1.5.5.3 rhBMP-2应用于口腔种植的相关研究 |
| 1.6 氟化物在成骨过程的作用 |
| 1.6.1 氟对成骨细胞的影响 |
| 1.6.2 氟对破骨细胞的影响 |
| 1.6.3 氟对骨形成相关激素的影响 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植入材料 |
| 2.3.2 外科手术 |
| 2.3.3 一般状态观察 |
| 2.3.4 生化检测 |
| 2.3.5 组织学分析 |
| 2.3.6 数据处理和统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 一般状态 |
| 3.2 氟化物对rhBMP-2 诱导的异位成骨的钙含量改变 |
| 3.3 氟化物对rhBMP-2 诱导的异位成骨的碱性磷酸酶活性改变 |
| 3.4 氟化物对rhBMP-2 诱导的异位成骨组织学改变 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 后记和致谢 |
（5）CGRP上调TGF-β/BMP-2表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究意义 |
| 第一部分：人牙周膜成纤维细胞的原代培养及表达降钙素基因相关肽(CGRP)的重组腺病毒感染 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分：检测 CGRP-A, CGRP-C 基因对感染的人牙周膜成纤维细胞纤维钙化作用的影响 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分：探讨 CGRP-A, CGRP-C 基因上调 TGF-β/BMP-2 表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）淫羊藿苷对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达及其分子机制的影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 组织取材及成纤维细胞的体外培养 |
| 1.3 无菌淫羊藿苷溶液的配制 |
| 1.4 实验分组与给药 |
| 1.5 方法 |
| 1.5.1 碱性磷酸酶 (ALP) 活性检测 |
| 1.5.2 细胞上清液胶原含量测定 |
| 1.5.3 细胞上清液骨钙素 (OC) 含量测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 淫羊藿苷对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞ALP活性的影响 |
| 2.2 淫羊藿苷对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞上清液胶原含量的影响 |
| 2.3 淫羊藿苷对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞上清液骨钙素的影响 |
| 3 讨论 |
（7）补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 组织取材 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 成纤维细胞的体外培养 |
| 1.3.2 补肾强脊颗粒含药血清制备 |
| 1.3.2. 1 药物与动物 |
| 1.3.2. 2 分组给药及血清制备 |
| 1.3.3 分组与给药 |
| 1.3.4 碱性磷酸酶 (ALP) 活性检测 |
| 1.3.5 细胞上清液胶原含量测定 |
| 1.3.6 细胞上清液骨钙素 (OC) 含量测定 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞ALP活性的影响 |
| 2.2 补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞上清液胶原含量的影响 |
| 2.3 补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞上清液OC含量的影响 |
| 3 讨论 |
（9）hTGF-β1、hBMP-2基因修饰骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 携带人转化生长因子β1 基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分不同目的基因修饰的骨髓间充质干细胞生物学特性分析 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）国新牌骨痛膏促进家兔骨愈合的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照及缩略语检索 |
| 文献综述一 中医促进骨愈合的研究进展 |
| 1.中医药促进骨愈合的机理 |
| 1.1 改善血液循环 |
| 1.2 促进钙盐的沉积 |
| 1.3 促进胶原基因的表达和胶原蛋白的合成 |
| 1.4 提高成骨细胞活性 |
| 1.5 提高微量元素的含量 |
| 1.6 调节内分泌 |
| 1.7 刺激骨生长因子的分泌与合成 |
| 2.中医促进骨愈合的治疗进展 |
| 2.1 单味中药研究进展 |
| 2.2 中药方剂内治法促进骨愈合 |
| 2.3 中药外治法促进骨愈合 |
| 2.4 针灸促进骨愈合 |
| 2.5 小针刀促进骨愈合 |
| 2.6 中药电热夹板促进骨愈合 |
| 3.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 骨生长因子研究进展 |
| 1.骨生长因子概述 |
| 1.1 BMP |
| 1.2 TGF-β |
| 1.3 FGF |
| 1.4 IGF |
| 1.5 VEGF |
| 2.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 国新牌骨痛膏促进家兔骨愈合的实验研究 |
| 前言 |
| 料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物与试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 动物模型制作方法 |
| 2.3 给药方法 |
| 2.4 标本取材 |
| 2.5 观察指标 |
| 2.6 图像采集分析 |
| 2.7 统计方法 |
| 结果 |
| 1.一般情况 |
| 2.生化指标测定结果 |
| 3.放射学检查结果 |
| 4.组织学观察结果 |
| 5.Ⅰ、Ⅲ型胶原苦味天狼星染色结果 |
| 6.BMP-2免疫组化染色结果及分析 |
| 7.BMP-2原位杂交染色结果及分析 |
| 讨论 |
| 1.方药立法依据 |
| 2.对ALP、钙、磷、镁及钙磷乘积的影响 |
| 3.促进骨形成修复 |
| 4.对Ⅰ、Ⅲ型胶的影响 |
| 5.对骨形态发生蛋白(BMP-2)的影响 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达（论文参考文献）
- [1]Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究[D]. 李豫皖. 重庆医科大学, 2020(01)
- [2]骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究[D]. 朱云森. 苏州大学, 2020(06)
- [3]重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用[D]. 何武兵. 南方医科大学, 2020
- [4]氟化钠对重组人骨形成蛋白-2应用于大鼠异位成骨协同作用的可行性研究[D]. 史怡凡. 吉林大学, 2020(08)
- [5]CGRP上调TGF-β/BMP-2表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究[D]. 戴瑛. 第二军医大学, 2013(04)
- [6]淫羊藿苷对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达及其分子机制的影响[J]. 贾春蓉,冯兴华,刘宏潇,李敏,吴志奎. 辽宁中医杂志, 2012(04)
- [7]补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达的影响[J]. 贾春蓉,冯兴华,刘宏潇,李敏,吴志奎. 浙江中医药大学学报, 2011(06)
- [8]转化生长因子β对成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfal基因表达的影响[J]. 王惠娟,董进. 中国当代医药, 2011(22)
- [9]hTGF-β1、hBMP-2基因修饰骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究[D]. 曾昭勋. 福建医科大学, 2011(10)
- [10]国新牌骨痛膏促进家兔骨愈合的实验研究[D]. 杨济洲. 北京中医药大学, 2010(10)