一、应用ELISA检测鸭瘟抗体的研究（论文文献综述）
李海琴,方绍培,谭美芳,曾艳兵,黄江南,季华员,张帆帆,谭佳,陈小连,康昭风,杨群,韦启鹏[1]（2021）在《江西部分地区种鸭坦布苏病毒病及鸭瘟免疫状况调查与分析》文中研究说明【目的】调查江西省部分地区规模化种鸭场鸭坦布苏病毒病和鸭瘟免疫状况。【方法】2020—2021年从江西省的11个规模化种鸭场采集血清样品1 233份,应用酶联免疫吸附试验测定鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的抗体水平。【结果】鸭坦布苏病毒病抗体的总阳性率为61.1%,阳性率最高的为E场（80.4%）,11个种鸭场中有8个场的阳性率未达到国家合格率标准。鸭瘟抗体的总阳性率为80.5%,抗体阳性率较高的为I场（90.8%）和H场（88.8%）,11个种鸭场中有2个场的鸭瘟抗体阳性率未达到国家合格率标准。不同季度调查结果显示第四季度鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的抗体阳性率最高,第一季度的鸭坦布苏病毒病和鸭瘟抗体阳性率均未达到国家合格率标准。【结论】江西省部分地区规模化种鸭场的鸭坦布苏病毒病和鸭瘟免疫水平不容乐观。尤其是鸭坦布苏病毒病免疫水平较低,建议当地种鸭场加强鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的免疫,定期监测抗体水平,优化免疫程序,以提高整个鸭群的保护力。
孙凤萍,高骏,李红,刘成倩,易建中,姚慧娟[2]（2018）在《鸭瘟病毒间接ELISA方法的建立》文中提出通过SPF鸡胚进行鸭瘟病毒培养和增殖,采用反复冻融后离心-0.22μm滤膜过滤-差速离心-蔗糖密度梯度离心法（sucrose-density-gradient-centrifugation,SDGC）,纯化后病毒粒子作为ELISA包被抗原,从而建立了鸭瘟病毒间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。经对不同血清样品的检测,表明此方法具有操作简便、敏感性高、特异性好的优点,特别适用于大批鸭群的抗体检测和流行病学调查,为合理免疫和疫病预防提供有效的技术手段。
刘情,邓伯雄,刘亚刚[3]（2015）在《鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立》文中指出本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶（thymidine kinase,TK）重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1∶200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1∶400和1∶200,抗原抗体作用时间为60min,最佳封闭液为5%BSA,最佳封闭时间为60min,最佳显色时间为10min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。
庄金秋,梅建国,王艳,姚春阳,沈志强[4]（2015）在《鸭瘟病毒实验室检测方法研究进展》文中指出鸭瘟是危害养鸭业的一种重要传染病。本文概述了鸭瘟病毒（DPV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、ELISA法、血清中和试验等病毒特异性抗原及其抗体的检测等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR技术、实时荧光定量RT-PCR技术、LAMP技术和核酸杂交技术等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。
范薇[5]（2013）在《鸭瘟病毒gD基因发现及重组蛋白应用研究》文中研究表明鸭瘟（Duck Plague, DP）,又称鸭病毒性肠炎（Duck Enteritis）,是由鸭瘟病毒引起的鸭、鹅和其他雁形目禽类动物发生的一种以血管损伤,组织出血,消化道黏膜糜烂,淋巴器官受损和全身实质性器官退行性病变为特征的急性、接触性、败血性传染病。鸭瘟病毒（Duck Plague Virus, DPV）,又称鸭肠炎病毒（Duck Enteritis Virus, DEV）,或鸭疱疹病毒1型（Anatid herpesvirus1, AnHV-1）,属疱疹病毒科未定种的疱疹病毒。本研究在实验室前期构建的DPV CHv毒株基因文库的基础上,首次发现并鉴定了DPVCHv株gD基因（GenBank登录号：EU195085）,并对gD基因开展系列研究,获得以下结果：1.鸭瘟病毒gD基因发现、克隆及生物信息学分析根据本实验室构建的DPV基因组文库,随机挑取文库中的重组质粒测序,并对测定的序列进行手工和计算机拼接,寻找病毒基因组的开放阅读框架（open reading frames, ORF）。拼接出的其中一个ORF1269采用多种网上生物信息学数据库及软件进行生物信息学分析。结果表明该ORF属疱疹病毒gD基因家族,为DPV的gD基因（GenBank登录号EU195085）。 gD基因完整编码区（ORF）全长1269bp,C+G共557bp,含量为44%。编码的gD蛋白含有422个氨基酸,分子量为47.5kD,理论等电点（PI）为6.66。进化树分析gD基因与与猫疱疹病毒-1型（FeHV-1）海豹疱疹病毒1型（PhoHV-1）以及犬疱疹病毒亲缘性较高；而gD蛋白与鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV、GaHV-1）的gD亲缘性最高。gD具有一个特征性的信号肽位于氨基酸序列1-22位；在7-29,360-382氨基酸之间有一跨膜区；gD蛋白主要定位于内质网中（44.4%）,其次在胞质、分泌小囊泡、生物膜外（包括细胞膜）、线粒体和细胞核中呈相同分布（11.1%）。gD有4个N-糖基化位点和9个O-糖基化位点。gD富含无规卷曲（Coil）,含量高达59.72%；其次为p-折叠（Strand）,含量为24.64%；而α-螺旋（Helix）含量较低占15.64%。2.鸭瘟病毒gD基因胞外区原核表达、产物纯化及其抗体制备根据发现的DPVgD基因序列,设计一对引物扩增DPV gD基因胞外区并将其克隆至pGEM-T载体中,经酶切和DNA测序鉴定正确后,将gD胞外区基因插入到pET32a载体的MscⅠ和HindⅢ之间,成功构建重组表达质粒pET32a-gD。将pET32a-gD转化感受态宿主菌E.coli BL21（DE3）, IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳检测出大小约为30kD的重组蛋白,重组蛋白以可溶和不可溶包涵体两种形式表达。Western blot检测发现该蛋白能与DPV阳性血清发生特异性反应。大量表达gD蛋白,使用Ni-NTA亲和层析进行纯化,将纯化后的gD胞外区蛋白与弗氏佐剂混合后免疫家兔三次,使用ELISA方法测定血清中抗gD抗体滴度。抗gD抗体滴度可达1：256000；采集免疫家兔血清,使用Protein A亲和层析纯化收获抗gD蛋白抗体IgG,为后续研究奠定基础。3.鸭瘟病毒gD基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的瞬时表达根据DPVgD基因序列,设计一对特异引物,用PCR方法从DPV基因组中扩增目标基因全序列,将其正向插入真核表达载体pEGFP-N1和pcDNA3.1（+）多克隆位点NheⅠ和HindⅢ酶切位点之间,成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-N1-gD和pcDNA3.1（+）-gD,脂质体介导转染至COS-7细胞中,采用激光共聚焦显微镜直接观察、Western-blotting及间接免疫荧光方法检测gD蛋白的表达。激光共聚焦显微镜下可见转染了pEGFP-N1-gD质粒的COS-7细胞质内及细胞膜上出现荧光蛋白的点状聚集现象,显示gD主要定位于细胞膜上。Western-blotting显示gD在COS-7细胞中表达产物的分子量为55KD左右,比gD预测分子量要大,为gD糖基化修饰后成熟糖蛋白；间接免疫荧光检测发现在COS-7细胞中的胞浆、核内及细胞膜上均出现荧光蛋白的点状聚集现象,显示gD主要定位于细胞膜上4.鸭瘟病毒gD基因的转录及表达分析及gD蛋白在宿主细胞中的亚细胞定位研究常规方法制备鸭胚成纤维细胞,细胞长成单层后,接种病毒DPV CHv株,分别于接毒后Oh（未接毒细胞,空白对照组）、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、60h采集样品,进行（1）细胞总RNA提取；（2）细胞总蛋白提取,（3）细胞固定。分别进行（1）荧光定量PCR检测gD基因转录时相；（2） Western-blotting检测gD蛋白表达时相；（3）间接免疫荧光检测gD亚细胞定位。结果表明：DPVgD基因在病毒感染鸭胚成纤维细胞后2h开始转录,8h开始表达,12h后转录量和表达量迅速增加后稍下降但仍维持较高水平至60h；该基因在DEF细胞中的表达产物呈现高丰度现象,主要为分子量55Kd的成熟糖蛋白.而gD蛋白在DEF细胞中的定位是一个动态变化过程,最早在接种后8h观察到定位于胞浆,12h见除胞浆外还定位于细胞核膜上,24h主要定位于细胞膜,48h在细胞核核膜、细胞膜及胞浆中均有定位。持续至60h后由于细胞融合崩解至定位不规则。该定位特征与疱疹病毒糖蛋白相同。检测到的时相定位与疱疹病毒糖蛋白的合成过程及定位基本相似,证实了DPVgD功能与其他疱疹病毒gD功能的相似性。5. DPV gD胞外区蛋白作为包被抗原检测鸭瘟抗体间接ELISA建立和应用本试验以pET32a为载体原核表达的重组DPVgD蛋白作包被抗原,进行间接ELISA检测DPV抗体的研究；并对该方法进行了优化和应用。采用方阵滴定实验确定重组表达蛋白与血清的最佳稀释度,最适包被重组抗原蛋白浓度为100ng/孔（1μg/mL,100μL/孔）包被后37℃1h,然后于4℃条件下过夜,最佳血清稀释度为1：80，0.5%的明胶PBST作封闭液,阴阳性的临界值（cut off值）为阴性样本OD值的平均值（x）+3SD。用建立的间接ELISA检测方法对收集到的DPV阳性血清、DHBV阳性血清、DHV阳性血清以及GpV阳性血清作1：80稀释,ELISA测定发现其只与DPV阳性血清发生反应。与本室自制的DPV全病毒ELISA试剂盒平行检测临床样本血清90份,吻合率为94%,检出率差异不显着。结果表明建立的gD-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性,可以用于DPV感染的诊断和疫苗免疫后的抗体监测。6.基于DPV gD基因的PCR检测方法建立和应用依据DPV gD基因无信号肽片段序列设计引物,建立了检测DPVgD基因PCR方法并进行了应用。特异性试验中,从正常DEF细胞、鸭胚尿囊液及DHV. DHBV. GpVDNA中均未扩增出阳性条带,同时对同为疱疹病毒的HSV-1, HSV-2和BV来说,可从病毒DNA中能扩增出条带,说明了gD蛋白在同科病毒中的同源性,而扩增出的片段大小并不与gD基因预计扩增片段大小相同,说明了gD基因PCR引物及方法的特异性；敏感性试验结果显示能检测出lpg左右的DPV DNA;应用该PCR方法对DPV感染病料肝脏、脾脏、胸腺、淋巴结和法氏囊等免疫相关器官组织进行检测,均能扩增出与预期大小一致以及序列吻合的特异性条带,正常组织中未检出阳性条带。证实该方法可应用于临床DPV的检测。
常华[6]（2011）在《鸭瘟病毒gE基因功能初步研究》文中研究表明1.鸭瘟病毒gE基因的序列特征及密码子偏爱性的生物信息学分析本实验室注册的鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV） gE基因全长为1473bp （GenBank登录号为EU071044）。用生物信息学软件分析gE基因及该基因编码的蛋白,结果表明该基因编码490个氨基酸的多肽,含有信号肽切割位点,在整个多肽链中存在21个抗原决定簇、4个潜在的酰基化位点、29个磷酸化位点和6个N-糖基化位点；gE糖蛋白是典型的Ⅰ型膜蛋白,N端由396个氨基酸组成胞外区,中间为23个氨基酸组成跨膜区,C端为71个氨基酸组成胞内区；亚细胞定位分析表明gE糖蛋白主要位于细胞质；系统进化树分析显示DPV gE与α-疱疹病毒亚科中的马立克病毒属（Mardivirus）亲缘关系较近；同时分析了DPV gE基因密码子偏爱性,结果表明DPV gE基因在同义密码子中较偏爱第三位为A和T的密码子,如选择原核表达系统表达该蛋白则要选择宿主表达菌,才能利于DPV gE基因的体外表达。2.鸭瘟病毒gE基因的克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备用Primer Premier5.0软件设计一对鸭瘟病毒（DPV）gE基因序列的特异性引物,采用PCR方法从鸭瘟病毒基因组DNA中扩增gE基因,将gE基因片段克隆至pMD18-T载体中,用双酶切（EcoR I和Xho I）方法和DNA测序鉴定正确后,命名为pMD18-T-gE。并采用酶切的方法将gE基因正向插入原核表达载体pET32a（+） （EcoR I和XhoI位点间）,成功构建了重组表达质粒pET32a-gE。将该重组表达质粒转化到表达宿主菌BL21（DE3）、BL21（pLysS）和Rosseta中,用IPTG诱导,经过对表达宿主菌、诱导温度、诱导时间的优化,确定了该重组表达质粒的最佳诱导条件为在表达宿主菌Rosseta中用0.2mmol/L IPTG,30℃条件下诱导4.5h,表达出了大小约为74KD的重组蛋白pET32a/DPV-gE,且主要以包涵体形式存在。将表达产物用包涵体洗涤方法纯化后,高纯度的表达蛋白与等量弗氏佐剂混合作为免疫原,经过四次免疫家兔,获得了兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE的多克隆抗体。血清用饱和硫酸铵法粗提IgG,并经High Q阴离子交换柱层析纯化后,得到了特异性强的兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE的抗体IgG。3.鸭瘟病毒gE蛋白在病毒感染宿主细胞中的定位本研究将纯化的兔抗重组蛋白pET32a/DPV gE IgG作为一抗,用间接免疫荧光技术检测DPV gE蛋白在病毒感染鸭胚成纤维细胞内的定位,结果显示早在感染DPV 5.5 h后,细胞质中检测到特异性荧光点,在感染后9-24h荧光强度增强,在感染36h时绿色荧光广泛分布在细胞浆中,之后随着细胞病变在48 h时胞浆中的绿色荧光开始减弱,且一些绿色荧光聚集且靠近核区域,60h细胞病变脱落形成空斑,此时绿色荧光减少且减弱。4.鸭瘟病毒gE基因在感染宿主细胞中的转录和表达特征本研究应用实时荧光定量PCR方法和Western blotting检测DPV感染鸭胚成纤维细胞后DPV gE基因的转录和表达情况。结果表明gE基因在DPV感染后4h时开始转录,8h检测到表达,在感染36h后转录和表达量最高,随后逐渐降低。且DPV gE基因在鸭胚成纤维细胞中表达产物的分子量约为54KD。5.利用间接免疫酶组化法（IPA）检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律本研究将30日龄鸭人工感染DPV强毒,在感染病毒后于不同的时间点采集不同的器官或组织,并制备切片,用兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG作为一抗,用间接免疫酶组化法（IPA）检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律。在感染后6h DPV gE蛋白在免疫器官（胸腺、法氏囊、脾）中被检测到,在感染后8h-12h检测到DPV gE蛋白分布在哈德氏腺、食道、腺胃、肝和肠道,且随感染时间增加阳性信号也增强,在感染后24h-48h在肾、肺、心、脑也检测到DPV gE蛋白。6.用间接免疫荧光方法（IFA）检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布将30日龄鸭人工感染DPV强毒,在感染病毒后于不同的时间点采集不同的器官或组织,用兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG作为一抗,经建立优化的间接免疫荧光（IFA）方法检测DPV gE蛋白在鸭体组织中的分布。结果显示感染鸭瘟病毒后DPV gE蛋白分布在免疫器官（脾脏、法氏囊、胸腺、哈德氏腺）、消化器官（肝脏、肠道、食管、腺胃）及实质器官（肾、心、脑及肺）。在感染后4h, DPV gE蛋白首先在脾脏和法氏囊中检测到,随后在感染后8h在哈氏腺、胸腺、肝脏和肠道也检测gE蛋白,在感染后12h在肾、心、肺和脑中也开始检测到弱阳性信号,且随感染时间从12h到216h阳性信号逐渐增多。7.基于重组蛋白pET32a/DPV-gE的间接ELISA法检测鸭瘟病毒抗体的建立及应用本研究基于纯化的重组蛋白pET32a/DPV-gE建立了间接ELISA方法检测DPV血清抗体。重组蛋白pET32a/DPV-gE最佳包被稀释度为1:100（2ug/100ul）,最佳酶标二抗的稀释度为1：1000,最佳血清稀释度为1：160。用建立的DPV-gE-ELISA方法检测鸭沙门氏菌（Salmonella anatum, S.anatum）、鸭大肠杆菌（E.coli）、鸭疫里默氏菌（RA）阳性血清和鸭病毒性肝炎病毒（DHV）,结果均显示阴性；批内或批间重复试验的变异系数均小于10%；可以检测出经1：1280倍稀释的DPV阳性血清。用DPV-gE-ELISA与本实验室已建立的包被DPV全病毒ELISA法（DPV-ELISA）对55份地方鸭血清进行检测,结果显示,与DPV-ELISA的符合率为87.27%。
沈婵娟[7]（2010）在《鸭瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白应用的研究》文中认为1鸭瘟病毒U151基因的序列特征分析及密码子偏爱性分析根据本实验室构建的鸭瘟病毒（DPV） DNA文库,并结合NCBI中的开放阅读框（ORF） Finder和BLAST工具进行分析,一个完整的ORF被鉴定出来。该ORF是DPV UL51基因（GenBank No.DQ072725）,大小为759bp,编码一种皮层蛋白,并且含有一个在α-疱疹病毒亚科中保守的区域。进化关系分析揭示DPV UL51基因与马立克属疱疹病毒UL51基因的进化关系最近。之后,对该基因编码蛋白序列进行了一系列生物信息学分析,结果显示,该蛋白含有4个潜在的磷酸化位点、,1个潜在的酰基化位点和4个潜在的线性B细胞表位,表明它可能是一种磷酸化和酰基化的蛋白,并且能够诱导较强的免疫反应；同时,该蛋白不含任何的N-糖基化位点、跨膜区域、信号肽和核定位信号,却含有高尔基体定位信号,表明它可能定位于胞浆的高尔基体中。对DPV UL51基因密码子偏爱性分析的结果揭示,该基因对同义密码子中第三位为A和T的密码子有强烈的偏爱性,并且原核表达系统可能更适合该基因的表达。这些结果为进一步研究DPV UL51基因的特性和功能提供了理论支持。2 DPV UL51基因的克隆、原核表达、产物纯化及其多克隆抗体的制备根据本实验室提供的DPV UL51基因序列,采用primer5.0软件设计一对特异性引物,运用PCR方法从DPV基因组DNA中扩增UL51基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切、PCR和DNA测序鉴定正确后,将该基因正向插入原核表达载体pET28a（+）的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建了重组表达质粒pET28a-UL51。将该表达质粒转化到表达宿主菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导,表达出了大小约为34KD的重组UL51蛋白,并且主要以包涵体形式存在；经过对诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间的优化,确定了该重组表达质粒的最佳诱导条件为0.8mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4h。将表达产物用镍柱梯度亲和层析纯化后,高纯度的表达蛋白与等量弗氏佐剂混合作为免疫原,四次免疫家兔,获得了抗重组UL51蛋白高免血清。将该血清经辛酸-硫酸铵粗提和High Q阴离子交换柱层析纯化后,得到了特异性强的兔抗重组UL51蛋白抗体IgG,为进一步研究DPV UL51基因的特性和功能奠定了基础。3 DPV UL51基因在感染宿主细胞中的转录和表达特征本试验应用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting法检测DPV UL51基因在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的转录和表达情况。结果表明：该基因在DPV感染后2h时已经开始转录,8h开始表达,48h转录和表达量都达到最高峰,之后逐渐降低；该基因在DEF细胞中的表达产物分子量为34KD；并且该基因表达产物是病毒粒子的一种组成成分。该研究为阐明DPVUL51基因的功能提供了有用的数据。4 DPV UL51蛋白在病毒感染细胞中的定位通过间接免疫荧光技术检测DPV UL51蛋白在病毒感染细胞内的定位特性,结果显示,最早可在感染后8h的胞浆中检测到特异性荧光点,24-36 h有大量绿色荧光团块聚集于近核区域,之后随着细胞病变的增强,胞核和胞浆中的绿色荧光均开始减弱。用胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白在DPV感染细胞中的亚细胞定位,结果显示,DPV UL51蛋白主要位于胞浆空泡中的病毒粒子和一些膜结构上；此外,在感染早期,DPV UL51蛋白大量累积于高尔基复合体膜上,其后通过某种未知机理被运送到细胞膜附近。该研究也为阐明DPVUL51蛋白的功能奠定了基础。5 DPV UL51基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时转录和表达特性根据DPV UL51基因序列设计一对特异性引物,用PCR扩增并克隆至pMD18-T载体上,经双酶切和测序鉴定后,再将该目的片段亚克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体上,得到重组质粒pcDNA3.1-UL51,通过脂质体介导将其转入COS-7细胞；应用实时荧光定量RT-PCR、Western blotting和间接免疫荧光法检测该基因在COS-7细胞中的转录、表达和定位情况。结果表明：该基因在转染后6h时已经开始转录,12 h开始表达,24 h转录和表达量都达到最高峰,之后逐渐降低；并且该基因在COS-7细胞中得表达产物的分子量为33 KD。间接免疫荧光法显示该基因的表达产物早期聚集于近核区域,晚期定位于胞浆和胞核中。该研究也为阐明DPV UL51基因的特性和功能提供了有用的数据。6用免疫组化方法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态分布采用DPV强毒CHv株人工感染30日龄鸭,于攻毒后于不同时间采集法氏囊、胸腺、脾、哈德氏腺、肝、胰、食管、腺胃、小肠（包括十二指肠、空肠和回肠）、大肠（包括盲肠和直肠）、脑、肾、肺、心、肌肉组织或器官,用建立的基于重组UL51蛋白抗体的间接免疫荧光和免疫酶组化法,分别检测DPV UL51蛋白在鸭体组织中的定位和动态分布。结果表明,DPV UL51蛋白主要分布在法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、食道、和肠道中,并且主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞和上皮细胞的胞浆中。本研究不仅有助于理解在急性DPV感染时,DPV的致病机理,同时也为α-疱疹病毒UL51蛋白同源物的定位和分布的研究奠定了基础。7基于重组UL51蛋白的间接EL ISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测鸭瘟病毒抗体的研究和应用DPV感染给世界上养鸭国家和地区造成了重大的经济损失。DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗效果和制定合理的免疫程序的关键。因此,本研究中,基于纯化的重组UL51蛋白,我们分别建立了一种间接ELISA法（UL51-ELISA）和一种免疫层析试纸条法（UL51-ICS）来检测DPV血清抗体。首先对UL51-ELISA法的反应条件进行优化,结果表明,最适重组UL51蛋白包被量为2.5μg/100μL,最佳的血清稀释倍数为1：200,最佳的酶标二抗稀释倍数为1：2000；用建立的UL51-ELISA法对鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、鸭疫里默氏菌（RA）、鸭大肠杆菌（E.coli）的阳性血清进行检测,结果均为阴性,特异性好；对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1：3200倍稀释的DPV阳性血清。UL51-ICS是基于膜层析原理,并以胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG混合物共同作为示踪剂的一种方法。该ICS法将纯化的重组UL51蛋白抗原包被于检测线（T）,兔IgG包被于质控线（C）。经优化和筛选,确定了UL51-ICS法中的重组UL51蛋白、兔IgG、胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG的最佳工作浓度分别为2mg/mL、lmg/mL、2mg/mL和2mg/mL。用建立的UL51-ICS法分别对非DPV的鸭源病原体阳性血清进行检测,结果均为阴性,特异性好；并能检出经1：128倍稀释的DPV阳性血清。同时,该法也具有良好的批内及批间重复性和较好的稳定性,制备好的试纸条至少可在4℃或25℃保存1年；为了评价UL51-ELISA和UL51-ICS法的效果,我们同时用UL51-ELISA、UL51-ICS、包被全病毒的ELISA法（DPV-ELISA）和中和试验（NT）四种方法对110份地方鸭血清进行检测,结果显示,与DPV-ELISA和NT相比,本研究建立的UL51-ELISA法与UL51-ICS法都有较高的特异性、敏感性和很高的的符合率,并且成本低,适于在现场或实验室进行DPV感染的血清学监测。8基于抗重组UL51蛋白抗体的抗原捕获ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测DPV的研究和应用本研究中,我们使用纯化的大鼠抗重组UL51蛋白多克隆抗体和兔抗重组UL51蛋白多克隆抗体,分别建立了一种抗原捕获ELISA法（AC-ELISA）和一种胶体金免疫层析试纸条（ICS）法来检测DPV。使用建立的抗原捕获AC-ELISA方法,可以检测到1：640倍稀释的阳性DPV细胞培养液中的DPV；检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E. coli菌体培养液等结果均为阴性。使用建立的ICS法,可以检测到1：80倍稀释的阳性DPV细胞培养液中的DPV；检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E. coli菌体培养液,结果均为阴性。为了评价AC-ELISA和ICS方法的效果,我们同时用AC-ELISA、ICS和常规PCR三种方法对10份人工感染DPV强毒后的病鸭泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示,与PCR方法相比,本研究建立的AC-ELISA法和ICS具有较高的特异性、敏感性和符合率,适于在现场或实验室进行DPV感染的检测。
黄河龙[8]（2010）在《鸭瘟检测方法的研究进展》文中研究表明鸭瘟是由鸭瘟病毒引起鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性烈性传染病,具有流行广泛、传播迅速、发病率高和死亡率大等特点。介绍了鸭瘟病毒和鸭瘟诊断方法及鸭瘟（病毒）检测方法的研究进展。
王克雄[9]（2009）在《鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中认为鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目动物的一种急性、热性及败血性传染病。其特征是流行广泛、传播迅速、发病和死亡率高。近年来在我国养鸭业较发达的地区发生流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。由于鸭瘟病毒的分子生物学研究比较滞后,目前还没有建立针对鸭瘟的敏感而有效的分子生物学诊断方法。而通过单克隆抗体技术对DEV主要的皮层蛋白VP22抗原表位进行研究,不仅有助于了解VP22抗原结构与功能的关系,而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等提供一定的参考依据。本试验在进行克隆并鉴定鸭肠炎病毒VP22（UL49）基因基础上,将已经构建好的重组表达质粒pET-30a-UL49转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果显示,表达的融合蛋白分子量约为36Ku,与预期的大小一致。重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。将重组蛋白纯化、复性后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定,最终获得4株能够稳定分泌抗DEV VP22蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B10、2G1、3F10和3G2。其单抗亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM。Western blot实验表明这4株MAbs不仅能与重组的DEV VP22蛋白发生反应,而且还能与DEV发生特异性反应,说明4株MAbs都能够识别天然构象的VP22蛋白。因此,这4株单克隆抗体可作为DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位研究的工具。为了进一步研究DEV VP22表位结构,首先设计了20个部分重叠且覆盖VP22全长的短肽融合蛋白,并在大肠杆菌BL21中进行了表达;然后利用肽扫描技术（Pepscan技术）对4株抗DEV VP22蛋白单克隆抗体中的一株2B10的抗原表位进行了精确定位,该表位位于VP22蛋白的200～206aa之间,其氨基酸序列为“ELSGQTP”。然后进一步通过间接ELISA鉴定,其结果与Western blot鉴定结果一致。本研究对进一步分析DEV VP22蛋白的结构与功能以及建立以表位为基础的疫苗和诊断方法具有重要的意义。
信洪一[10]（2009）在《鸭瘟病毒US3基因的发现、原核表达及应用研究》文中研究说明1鸭瘟病毒US3基因发现、克隆及分子特性分析鸭瘟病毒给养鸭业带来极大的危害,然而对于该病毒的分子生物学信息了解甚少。本文通过实验室构建的DEV基因组文库发现了一个编码DEV US3蛋白的开放阅读框,并通过PCR检测和克隆、测序进一步鉴定其存在于DEV。通过对该序列的进化树分析发现,DEV在进化关系上更接近与马立克氏病毒属。其它生物信息学分析包括基本理化性质分析、翻译后修饰分析、亚细胞定位分析、疏水性分析、抗原性分析已及蛋白高级结构预测,其为进一步研究DEV US3蛋白提供了理论支持。2鸭瘟病毒US3基因原核载体构建、表达、产物纯化及其抗体制备根据我们获得的鸭瘟病毒US3基因序列,设计一对特异扩增DEV US3基因完整开放阅读框的PCR引物,并将扩增序列克隆到pMD18-T载体,构建重组载体pMD18T-US3,通过对该重组质粒做PCR、酶切及测序鉴定后,将目的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a（+）,成功构建了重组表达载体pET-32a-US3。进一步将该重组质粒转化入表达宿主菌BL21（DE3）,诱导表达出一条分子量约63kD的融合蛋白,与预期大小一致。重组蛋白表达可溶性研究显示该蛋白主要以包涵体形式存在于宿主菌。对表达条件优化结果显示,该重组质粒的原核表达最佳IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L、最佳诱导表达温度为30℃、最佳诱导时间为4 h。根据优化表达条件,诱导表达的重组蛋白经过包涵体洗涤粗提后溶于8 mol/L的尿素中,溶解的表达产物再经镍离子亲和层析纯化,获得了高纯度的表达蛋白。用此纯化表达产物制备弗氏佐剂疫苗接种家兔制备抗DEVUS3蛋白高免血清,并经过进一步的纯化过程成功获得了抗DEV US3蛋白的抗体IgG,为相关DEV US3蛋白的研究提供了必要的条件。3鸭瘟病毒US3基因在宿主细胞内的转录时相、表达时相和US3蛋白亚细胞定位试验利用荧光定量方法对DEV感染不同时间US3基因的转录时相进行分析,结果显示DEV US3基因在感染后1 h开始启动转录,在感染后8 h达到最高峰,而在感染后12 h以后转录水平明显下降并维持在一定水平。试验同时也以间接免疫荧光技术对DEV感染细胞后US3蛋白表达时相进行了分析,结果显示在病毒感染后2 h可以在感染细胞中检测到DEV US3蛋白表达,此后随着感染时间延长表达量持续增多,虽然在感染后8 h病毒转录量明显减少,但病毒持续表达蛋白的积累效应使DEV US3蛋白在细胞浆中大量存在。亚细胞定位分析显示,DEV US3蛋白在感染后2 h主要定位于核周,随着US3蛋白的不断表达而进入胞浆,到感染后12 h时及以后US3基因表达蛋白大量存在与胞浆,此时细胞出现变形。4抗鸭瘟病毒US3基因原核表达蛋白抗体介导的酶免疫组化检测DEV的研究和应用建立并优化了以抗DEV US3蛋白IgG介导的酶免疫组化检测方法,并利用该方法检测人工感染鸭DEV CHv株（DEV-CHv）后,在雏鸭心、肝脏、脾脏、肺脏、肠道、肾脏、胰腺、哈氏腺、法氏囊、脑等不同组织或器官中US3蛋白的表达时相和分布规律,结果显示鸭瘟病毒人工肌肉注射雏鸭,在感染6 h后可以在心、肝、脾、肺、肾、胸腺、法氏囊中检测到DEV-US3蛋白抗原;在感染后8 h可以在脑、腺胃、胰腺、哈氏腺、十二指肠、空肠中检测到DEV-US3蛋白抗原;而在感染后12 h在食道、直肠检测到DEV-US3蛋白抗原。5抗鸭瘟病毒US3基因原核表达蛋白抗体介导的免疫荧光检测DEV的研究和应用建立并优化了以抗DEV US3蛋白IgG介导的免疫荧光检测方法,并利用该方法检测20株临床鸭瘟阳性样本,结果检出率为100%。进一步利用该方法研究人工感染鸭DEV CHv株（DEV-CHv）后,在雏鸭心、肝脏、脾脏、肺脏、肠道、肾脏、胰腺、哈氏腺、法氏囊、脑等不同组织或器官中US3蛋白的表达时相和分布规律,结果显示鸭瘟病毒人工肌肉注射雏鸭,在感染4 h后可以在胸腺、法氏囊中检测到DEV-US3蛋白抗原;在感染6 h后可以在心、肝、脾、肺、脑、胰腺、肾中检测到DEV US3蛋白抗原;在感染后8 h可以在腺胃、哈氏腺、十二指肠、空肠、食道、直肠中检测到DEV US3蛋白抗原。6鸭瘟病毒US3基因原核表达蛋白作为包备抗原ELISA检测DEV抗体的研究和应用试验利用纯化的原核表达蛋白DEV US3作为包被抗原,建立了间接ELISA检测DEV抗体的方法。通过对包被抗原和待检阳性血清的方阵加样,测定了以不同浓度抗原包被和不同稀释度一抗条件下的检测效果,结果显示最适包被蛋白浓度为2.2μg/mL,最适一抗稀释度为1:320。进一步试验利用该优化的抗原包被浓度和一抗稀释度测定了不同稀释度酶标二抗条件下的检测效果,结果显示1:2000倍稀释的酶标二抗检测具有最大的P/N比,因此确定1:2000倍稀释为最适酶标二抗稀释度。利用该优化条件,试验验证了间接ELISA检测DEV抗体的特异性、敏感性和重复性。结果显示该优化条件下的间接ELISA检测方法具有良好的特异性,且敏感性可达1:6400,重复性变异系数均小于5%,也说明该方法具良好的重复性。此外,试验利用建立的该ELISA方法检测了120个鸭瘟临床样品,结果检测率为85%,与实验室建立的全病毒包被抗原间接ELISA检测试剂盒具有相同的检出率,说明试验建立的间接ELISA方法具有很好的检测效果,可以应用于临床上检测抗DEV抗体水平。7基于鸭瘟病毒US3基因PCR方法的建立和应用根据试验中发现的DEV US3基因序列设计一对特异扩增DEV US3基因序列的引物,并以该引物做PCR扩增检测DEV核酸,以建立PCR检测DEV的方法。结果显示该引物可扩增产生一条148 bp的特异产物,与预期大小一致。进一步对该引物PCR扩增特异性检测发现,只有在以DEV DNA为模板时才能扩增产生该特异条带,而以鸭乙型肝炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、小鹅瘟病毒、鸭疫里默氏菌、鸭源沙门氏菌和鸭源大肠杆菌等病原体DNA为模板时,都未扩增产生任何条带,说明试验建立的PCR检测方法具有很好的特异性。灵敏度检测结果显示该PCR检测方法最低可以检测出3 fg DEV DNA。对15份DEV强毒感染鸭病料检测均为阳性,而3份未感染DEV鸭提取核酸为模板检测均为阴性。由此可见试验建立的PCR检测DEV的方法具有特异性好、敏感度高的特点,可以运用于临床检测DEV。
二、应用ELISA检测鸭瘟抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用ELISA检测鸭瘟抗体的研究（论文提纲范文）
（1）江西部分地区种鸭坦布苏病毒病及鸭瘟免疫状况调查与分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 鸭血清 |
| 1.1.2 试验试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 ELISA检测 |
| 1.2.2 ELISA检测结果判定标准 |
| 1.2.3 群体免疫合格率 |
| 2 结果 |
| 2.1 流行病学调查 |
| 2.2 不同场区鸭坦布苏病毒病抗体水平调查 |
| 2.3 不同场区鸭瘟抗体水平调查 |
| 2.4 不同季度鸭坦布苏病毒病和鸭瘟抗体水平调查 |
| 3 结论与讨论 |
（2）鸭瘟病毒间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株: |
| 1.1.2 SPF鸡胚: |
| 1.1.3 实验动物: |
| 1.1.4 ELISA相关试剂: |
| 1.1.5 对照血清: |
| 1.1.6 主要仪器: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒增殖: |
| 1.2.2 病毒提纯: |
| 1.2.3 电镜观察: |
| 1.2.4鸭抗DPV阳性血清的制备: |
| 1.2.5 鸡胚中和试验: |
| 1.2.6 酶标板均一性的检测: |
| 1.2.7 ELISA操作步骤: |
| 1.2.8 ELISA结果的判定: |
| 1.2.9 间接ELISA方法的特异性和敏感性的检验: |
| 1.3 ELISA方法的应用 |
| 1.3.1 雏鸭母源抗体水平的监测: |
| 1.3.2 雏鸭免疫抗体水平的监测: |
| 2 结果 |
| 2.1 DPV接种10日龄SPF鸡胚后的病变情况 |
| 2.2 电镜观察结果 |
| 2.3 酶标板均一性检测 |
| 2.4 ELISA试验最佳条件的确定 |
| 2.5 交叉实验 |
| 2.6 阻断试验 |
| 2.7 与中和试验检测方法的比较 |
| 2.8 重复性试验 |
| 2.9 ELISA方法的应用结果 |
| 2.9.1 免疫种鸭雏鸭DPV母源抗体水平的监测: |
| 2.9.2 雏鸭DPV免疫后抗体水平的监测: |
| 3 讨论 |
（3）鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 DPV TK基因的克隆及表达载体的构建 |
| 1.4 TK重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 1.5 间接ELISA方法的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TK基因表达载体的构建 |
| 2.2 TK重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.3 纯化重组蛋白的Western blotting分析 |
| 2.4 间接ELISA方法的建立 |
| 3 讨论 |
（5）鸭瘟病毒gD基因发现及重组蛋白应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒gD基因研究进展 |
| 1 疱疹病毒概述 |
| 1.1 疱疹病毒分类 |
| 1.2 疱疹病毒形态结构 |
| 1.3 疱疹病毒基因组结构 |
| 1.4 疱疹病毒基因转录和蛋白表达调节 |
| 1.5 疱疹病毒主要结构蛋白 |
| 2 疱疹病毒gD基因研究进展 |
| 2.1 疱疹病毒gD基因在基因组中定位及复制类型 |
| 2.2 疱疹病毒gD蛋白结构 |
| 2.3 疱疹病毒gD蛋白功能 |
| 2.4 疱疹病毒gD蛋白应用展望 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 鸭瘟病毒gD基因克隆及生物信息学 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株和菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 gD基因的发现 |
| 2.2 gD基因的克隆和鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 gD基因的发现 |
| 3.2 gD基因的克隆和鉴定结果 |
| 3.3 gD基因的同源比对结果 |
| 3.4 gD生物信息学分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV gD基因的发现 |
| 4.2 DPV gD的结构预测 |
| 4.3 gD的功能及研究意义 |
| 第三章 鸭瘟病毒gD基因胞外区原核表达、产物纯化及其抗体制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株/毒株/载体 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 DPV-gD基因的扩增 |
| 2.3 DPV gD胞外区基因的克隆 |
| 2.4 原核表达重组质粒pET32a-gD的构建 |
| 2.5 重组表达质粒的诱导表达 |
| 2.6 gD胞外区蛋白的大量表达 |
| 2.7 gD胞外区表达蛋白的纯化和复性-Ni-NTA亲和层析 |
| 2.8 gD-His的Western Blot检测 |
| 2.9 兔抗gD-His融合蛋白抗体的制备及IgG的提取和纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 DPV基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 pGEM-T/gD克隆鉴定结果 |
| 3.3 pGEM-T/gD的序列测定结果 |
| 3.4 表达重组质粒pET32a-gD的鉴定结果 |
| 3.5 pET32a-gD的诱导表达结果 |
| 3.6 pET32a-gD表达蛋白在宿主菌中的分布结果 |
| 3.7 pET32a-gD表达蛋白纯化结果 |
| 3.8 pET32a-gD表达产物的结合活性检测结果 |
| 3.9 兔抗DPV gD融合蛋白阳性血清的制备结果 |
| 3.9.1 兔抗gD重组蛋白的ELISA抗体效价 |
| 3.9.2 兔抗gD重组蛋白IgG的纯化结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV gD的表达载体的选择 |
| 4.2 重组蛋白的表达形式 |
| 4.3 DPVgD蛋白的原核表达 |
| 4.4 兔抗gD重组蛋白IgG的制备和纯化 |
| 第四章 鸭瘟病毒gD基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株、细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 DPV病毒CHv株的增殖及基因组DNA的提取 |
| 2.2 gD基因扩增 |
| 2.3 真核表达载体的构建 |
| 2.4 真核表达载体转染 |
| 2.5 真核表达载体在细胞内表达和检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 DPVgD全基因的获得 |
| 3.2 含gD基因的真核表达载体的构建 |
| 3.3 gD蛋白在COS-7细胞内的瞬时表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达载体的选择 |
| 4.2 gD功能及定位 |
| 4.3 gD的检测 |
| 第五章 鸭瘟病毒gD基因的转录及表达分析及gD蛋白在宿主细胞中的亚细胞定位研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2 鸭瘟病毒gD基因的转录时相分析 |
| 2.3 鸭瘟病毒gD基因的表达时相分析 |
| 2.4 间接免疫荧光检测DPVgD亚细胞定位 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸭瘟病毒gD基因的转录时相 |
| 3.2 DPV gD基因产物在宿主细胞中的表达时相 |
| 3.3 间接免疫荧光检测DPV gD亚细胞定位动态监测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒gD基因转录时相分析 |
| 4.2 DPVgD表达时相分析 |
| 4.3 gD蛋白宿主细胞中的定位研究 |
| 第六章 鸭瘟病毒gD胞外区表达蛋白作为包备抗原ELISA检测DPV抗体的研究和应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 ELISA试剂的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 DPV gD基因胞外区蛋白的获得与纯化 |
| 2.2 DPV gD基因胞外区蛋白作为包被抗原间接ELISA方法的建立 |
| 2.3 间接ELISA方法检测DPV抗体的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 DPV gD表达蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.2 对临床样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ELISA方法在鸭瘟病毒检测中的应用 |
| 4.2 建立在重组gD蛋白基础上的间接ELISA方法 |
| 4.3 DPVgD-ELISA方法的优化 |
| 第七章 检测DPV gD基因PCR方法的建立与应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 毒株DNA模板的提取 |
| 2.2 PCR检测 |
| 2.3 PCR灵敏性检验 |
| 2.4 PCR特异性检验 |
| 2.5 组织样品的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 对DPV强毒CHv株及疫苗株DNA的检测结果 |
| 3.2 PCR灵敏性试验 |
| 3.3 PCR特异性试验 |
| 3.4 组织病料的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCR在DPV检测上的应用 |
| 4.2 gDPCR的建立 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的论着目录 |
（6）鸭瘟病毒gE基因功能初步研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒gE基因及其编码蛋白的研究进展 |
| 1. 疱疹病毒gE基因的特点 |
| 1.1 疱疹病毒gE基因序列特点 |
| 1.2 疱疹病毒gE基因的类型 |
| 2. 疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构及功能 |
| 2.1 疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构特点 |
| 2.2 疱疹病毒gE基因编码蛋白的功能 |
| 2.2.1 糖蛋白gE胞外区的功能 |
| 2.2.2 糖蛋白gE细胞质区的功能 |
| 3 疱疹病毒gE蛋白与其他蛋白的相互作用 |
| 3.1 gE蛋白与gI蛋白的相互作用 |
| 3.2 gE蛋白与VP22、gM、gD蛋白的相互作用 |
| 3.3 gE蛋白与US9蛋白 |
| 4 选题目的和意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章 DPV gE基因序列特征及其密码子偏爱性的生物信息学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 基因文库 |
| 1.1.2 主要生物信息学分析软件 |
| 1.1.3 试验数据 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DPV gE基因生物信息学分析的方法 |
| 1.2.2 DPV gE基因的密码子偏爱性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 DPV gE基因的序列特征 |
| 2.2 DPV gE基因编码蛋白的序列特征 |
| 2.3 DPV gE基因编码蛋白的功能预测 |
| 2.3.1 跨膜区的预测结果 |
| 2.3.2 信号肽预测结果 |
| 2.3.3 亚细胞定位分析结果 |
| 2.3.4 DPV gE蛋白翻译后修饰的预测结果 |
| 2.3.5 DPV gE蛋白疏水性分析及抗原性分析 |
| 2.3.6 DPV gE蛋白的二级结构与三级结构的预测 |
| 2.4 DPV gE蛋白的系统进化树分析 |
| 2.5 DPV gE基因的密码子偏爱性分析 |
| 2.5.1 DPV gE基因与17种疱疹病毒gE基因间的密码子偏爱性分析 |
| 2.5.2 DPV gE基因的密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析 |
| 2.5.3 DPV gE基因稀有密码子的分析 |
| 2.5.4 DPV gE基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DPV gE蛋白序列的分子特性分析 |
| 3.2 DPV gE蛋白的抗原性和高级结构特点 |
| 3.3 DPV gE蛋白与其它α-疱疹病毒gE蛋白的系统进化关系 |
| 3.4 DPVgE基因的密码子偏爱性分析及其对表达的影响 |
| 4 小结 |
| Abstract |
| 第三章 gE基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 毒株与菌株 |
| 1.2 工具酶及主要试剂盒 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.3.1 核酸电泳试剂 |
| 1.3.2 SDS-PAGE凝胶电泳试剂 |
| 1.3.3 表达产物纯化试剂配制 |
| 1.3.4 Western blotting试剂 |
| 1.4 其他试剂配制 |
| 1.5 主要实验设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 构建DPV gE基因的克隆载体pMD18-T-gE |
| 2.1.1 鸭瘟病毒(DPV)基因组DNA的提取 |
| 2.1.2 PCR扩增鸭瘟病毒(DPV)gE基因 |
| 2.1.3 DPV gE基因的T-载体克隆与鉴定 |
| 2.2 构建DPV gE基因的原核表达载体 |
| 2.2.1 表达质粒pET-32a(+)与重组质粒pMD18-T-gE的提取、酶切及回收 |
| 2.2.2 重组表达菌株的构建 |
| 2.3 重组蛋白的诱导表达及条件优化 |
| 2.3.1 制备感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS |
| 2.3.2 重组表达质粒转化至感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS |
| 2.3.3 重组表达菌株的培养及表达 |
| 2.3.4 重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.4 纯化重组蛋白 |
| 2.4.1 重组表达蛋白的可溶性分析 |
| 2.4.2 重组表达蛋白的大量制备 |
| 2.4.3 Western Blotting检测 |
| 2.5 兔抗重组表达蛋白高免血清的制备与纯化 |
| 2.5.1 兔抗重组蛋白高免血清的制备 |
| 2.5.2 兔抗重组蛋白高免血清IgG的纯化及鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 DPV gE基因的扩增、T-克隆与鉴定 |
| 3.2 原核表达载体pET32a-gE的构建与鉴定 |
| 3.3 重组蛋白pET32a/DPV-gE的诱导表达 |
| 3.3.1 诱导表达重组蛋白pET32a/DPV-gE |
| 3.3.2 诱导重组蛋白pET32a/DPV-gE表达的条件优化 |
| 3.4 重组蛋白pET32a/DPV-gE的纯化 |
| 3.4.1 重组蛋白的可溶性分析 |
| 3.4.2 重组蛋白的大量纯化 |
| 3.5 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清的制备 |
| 3.5.1 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清效价测定 |
| 3.5.2 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清IgG的纯化 |
| 3.6 Western Blotting检测 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 DPV gE基因的引物设计和克隆测序 |
| 4.2 DPV gE表达载体的选择 |
| 4.3 诱导表达条件的优化 |
| 4.4 包涵体的形成 |
| 4.5 疱疹病毒gE基因的表达 |
| 4.6 兔抗重组蛋白pET32a/DPV gE抗体的制备和纯化 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第四章 鸭瘟病毒gE蛋白在病毒感染宿主细胞中定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 检测DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的定位 |
| 2.2 间接免疫荧光方法的条件优化 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 结果判定标准 |
| 2.5 DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的动态监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫荧光检测DPV gE蛋白的细胞内定位方法的建立及优化 |
| 3.2 特异性试验 |
| 3.3 间接免疫荧光法检测DPVgE蛋白在DPV感染细胞中定位的动态 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于特定蛋白在细胞定位的研究方法 |
| 4.2 间接免疫荧光方法检测细胞定位的条件优化 |
| 4.3 DPV gE基因表达产物在宿主细胞定位的分析 |
| 4.4 疱疹病毒gE蛋白的亚细胞定位与其功能的关系 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 DPV gE基因在宿主细胞的转录和表达特征 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、菌株、细胞及抗体 |
| 1.2 主要试剂及其配制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相 |
| 2.1.1 荧光定量PCR引物设计与合成 |
| 2.1.2 荧光定量PCR标准曲线的制作 |
| 2.2 Western blotting检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达时相 |
| 2.2.1 DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达 |
| 2.2.2 DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达特征 |
| 3. 结果 |
| 3.1 DPV gE基因在宿主细胞中的转录特征 |
| 3.1.1 RNA完整性及纯度分析 |
| 3.1.2 引物特异性分析 |
| 3.1.3 β-actin内参基因的T-克隆与鉴定 |
| 3.1.4 标准曲线的制作 |
| 3.1.5 DPV gE基因在宿主细胞中的转录分析 |
| 3.2 DPV gE基因在宿主细胞中的表达特征 |
| 3.2.1 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG特异性分析 |
| 3.2.2 DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 运用实时荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相 |
| 4.2 分析DPV gE基因转录特征 |
| 4.3 Western blotting方法检测DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第六章 利用间接免疫酶组化法(IPA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及抗体 |
| 1.2 试验动物及其他组织材料 |
| 1.3 试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 组织样品的制备 |
| 2.1.1 试验动物分组及采集样品 |
| 2.1.2 固定、包埋样品和制备切片 |
| 2.2 建立并优化间接免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的分布 |
| 2.2.1 间接免疫酶组化法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布 |
| 2.2.2 检测DPV gE蛋白组织定位的间接免疫酶组化法的条件优化 |
| 2.2.3 特异性试验 |
| 2.2.4 结果判定标准 |
| 2.2.5 DPV gE蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫酶组化检测DPV gE蛋白组织定位方法的最佳优化条件 |
| 3.2 特异性试验 |
| 3.3 DPV gE蛋白在感染鸭组织中的定位和动态分布 |
| 3.3.1 淋巴器官 |
| 3.3.2 消化器官 |
| 3.3.3 其它器官 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 免疫酶组化检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.2 间接免疫酶组化法检测DPVgE蛋白在感染鸭组织中的定位与分布 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第七章 用间接免疫荧光方法(IFA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布 |
| 1 材料 |
| 1.1 抗体、毒株及试验动物 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 玻片处理及样品制备 |
| 2.2 切片 |
| 2.3 建立与优化基于pET32a/DPV-gE IgG介导的间接免疫荧光方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的定位 |
| 2.4 利用IFA检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫荧光检测DPV gE蛋白组织定位方法的优化结果 |
| 3.2 特异性试验结果 |
| 3.3 应用间接免疫荧光检测DPV gE在感染鸭组织中的定位及动态分布 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 间接免疫荧光法检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.2 间接免疫荧光法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布 |
| 4.3 间接免疫荧光方法与免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在人工感染鸭体内的定位及分布规律比较 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第八章 基于重组蛋白pET32a/DPV-gE的间接ELISA法检测鸭瘟病毒抗体的建立及应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株及血清 |
| 1.2 主要试剂及配制 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组蛋白pET32a/DPV-gE的大量制备和纯化 |
| 2.2 pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体方法的建立 |
| 2.2.1 pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的检测程序 |
| 2.2.2 优化最佳的酶标二抗稀释度 |
| 2.2.3 优化最佳的包被抗原浓度及血清稀释度 |
| 2.2.4 pET 32a/DPV-gE-ELISA方法临界值的确定 |
| 2.2.5 特异性试验 |
| 2.2.6 敏感性试验 |
| 2.2.7 重复性试验 |
| 2.3 pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白pET 32a/DPV-gE纯化的检测结果 |
| 3.2 pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的建立 |
| 3.2.1 最佳酶标二抗稀释度的检测结果 |
| 3.2.2 最佳的包被抗原浓度及待检血清稀释度 |
| 3.2.3 ELISA阴阳性临界值的判定标准 |
| 3.2.4 特异性试验的检测结果 |
| 3.2.5 敏感性试验的检测结果 |
| 3.2.6 重复性试验的检测结果 |
| 3.3 地方血清样品检测结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 包被抗原的选择 |
| 4.2 基于重组蛋白pET 32a/DPV-gE建立间接ELISA方法检测DPV抗体的优化 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）鸭瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白应用的研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒UL51基因及其编码蛋白的研究进展 |
| 1. 疱疹病毒UL51基因的特点 |
| 1.1 疱疹病毒UL51基因在基因组中定位 |
| 1.2 疱疹病毒UL51基因的类型 |
| 2. 疱疹病毒UL51基因编码蛋白的特点 |
| 2.1 UL51基因编码蛋白的表达和基本特性 |
| 2.2 UL51基因编码蛋白的定位特性 |
| 2.2.1 UL51蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.2 UL51蛋白在病毒自身内的定位 |
| 3. 疱疹病毒UL51蛋白的功能 |
| 3.1 疱疹病毒的装配概述 |
| 3.2 疱疹病毒皮层蛋白的功能概述 |
| 3.3 疱疹病毒UL51蛋白功能的研究进展 |
| 4. 疱疹病毒UL51蛋白与其它蛋白的相互作用 |
| 5. 展望 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章 DPV UL51基因的序列特征及密码子偏爱性分析 |
| 摘要 |
| 1. 试验数据 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 DPV UL51基因的生物信息学分析方法 |
| 2.2 DPV UL51基因的密码子偏爱性分析方法 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51蛋白质序列生物信息学分析 |
| 3.1.1 DPV UL51基因编码蛋白的保守结构区 |
| 3.1.2 DPV UL51基因的系统进化分析 |
| 3.1.3 DPV UL51基因编码蛋白的基本理化性质 |
| 3.1.4 DPV UL51基因编码蛋白的亚细胞定位分析结果 |
| 3.1.5 DPV UL51蛋白翻译后修饰预测 |
| 3.1.6 DPV UL51蛋白的疏水性分析 |
| 3.1.7 DPV UL51蛋白的抗原性分析 |
| 3.1.8 DPV UL51蛋白的二级结构分析 |
| 3.1.9 DPV UL51蛋白的三级结构分析 |
| 3.2 DPV UL51基因密码子偏爱性分析 |
| 3.2.1 DPV与17种疱疹病毒间UL51基因密码子使用偏爱分析 |
| 3.2.2 DPV UL51基因密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析 |
| 3.2.3 DPV UL51基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 DPV UL51蛋白与其它α-疱疹病毒UL51蛋白的系统进化关系 |
| 4.2 DPV UL51蛋白一般理化特征 |
| 4.3 DPV UL51蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.4 DPV UL51蛋白翻译后修饰 |
| 4.5 DPV UL51蛋白的抗原性和高级结构特点 |
| 4.6 DPV UL51基因密码子偏爱性分析及其对表达的影响 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第三章 鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达、产物纯化及其多克隆抗体制备 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 菌株、质粒和毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及其配制 |
| 1.3.1 基因克隆表达相关试剂 |
| 1.3.2 SDS-PAGE电泳相关试剂 |
| 1.3.3 琼脂糖电泳相关试剂 |
| 1.3.4 弗氏佐剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 DPV UL51基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 DPV基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 PCR扩增DPV UL51基因 |
| 2.1.4 UL51基因PCR产物的回收 |
| 2.1.5 纯化的UL51基因与pMD18-T的连接 |
| 2.1.6 DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.1.7 转化感受态细胞 |
| 2.1.8 质粒的抽提 |
| 2.1.9 重组质粒的PCR和酶切鉴定 |
| 2.1.10 UL51基因序列测定 |
| 2.2 原核表达质粒pET28a-UL51的构建、诱导表达与条件优化 |
| 2.2.1 原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定 |
| 2.2.2 重组表达质粒pET28a-UL51的诱导表达 |
| 2.2.3 重组质粒pET28a-UL5 1诱导条件的优化 |
| 2.3 重组UL51蛋白的大量制备、纯化与复性 |
| 2.3.1 重组UL51蛋白的大量制备(包涵体处理) |
| 2.3.2 重组UL51蛋白的纯化 |
| 2.3.3 重组UL51蛋白的复性 |
| 2.4 兔抗重组UL51蛋白抗体的制备、效价测定与纯化 |
| 2.4.1 兔抗重组UL51蛋白高免血清的制备 |
| 2.4.2 兔抗重组UL51蛋白高免血清效价测定 |
| 2.4.3 兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的纯化 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51基因的扩增、T-克隆与鉴定结果 |
| 3.1.1 UL51基因的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 UL51基因T克隆鉴定结果 |
| 3.2 原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果 |
| 3.2.1 重组表达质粒pET28a-UL51的构建与酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒pET28a-UL51的诱导表达 |
| 3.2.3 重组质粒pET28a-UL51诱导表达条件的优化 |
| 3.3 重组UL51蛋白的纯化结果 |
| 3.4 兔抗重组UL51蛋白抗体的效价测定与纯化结果 |
| 3.4.1 兔抗重组UL51蛋白高免血清效价测定 |
| 3.4.2 兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的纯化 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 基因的引物设计和克隆测序 |
| 4.2 表达系统的选择 |
| 4.3 疱疹病毒UL51基因的原核表达 |
| 4.4 兔抗重组UL51蛋白抗体的制备和纯化 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第四章 鸭瘟病毒UL51基因在感染宿主细胞中的转录和表达特征 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒和抗体 |
| 1.2试验动物 |
| 1.3 主要试剂及其配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 Western blotting相关试剂 |
| 1.4 主要仪器和用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 荧光定量RT-PCR方法检测DPV UL51基因在感染宿主细胞中的转录时相 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2 细胞培养及采样 |
| 2.1.3 总RNA提取 |
| 2.1.4 去除RNA中的DNA |
| 2.1.5 RNA完整性及纯度测定 |
| 2.1.6 逆转录 |
| 2.1.7 目的片段的PCR扩增及回收 |
| 2.1.8 荧光定量PCR |
| 2.1.9 荧光定量PCR扩增标准曲线的建立 |
| 2.1.10 数据分析和处理 |
| 2.2 Western blotting检测DPV UL51基因在感染宿主细胞中的表达时相 |
| 2.2.1 细胞培养及采样时间 |
| 2.2.2 细胞样品处理和SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.3 Western blotting检测 |
| 2.3 Westem blotting检测DPV UL51基因表达产物是否为DPV粒子的组成成分 |
| 2.3.1 细胞培养及病毒纯化 |
| 2.3.2 Westem blotting检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51基因在宿主细胞中的转录时相分析结果 |
| 3.1.1 RNA完整性及纯度分析 |
| 3.1.2 RT-PCR检测 |
| 3.1.3 荧光定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 3.1.4 DPV UL51基因在宿主细胞中的转录量分析 |
| 3.2 DPV UL51基因在宿主细胞中的表达时相分析结果 |
| 3.2.1 细胞蛋白的提取及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.2 DPV UL51基因产物在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 3.3 DPV UL51基因表达产物是DPV粒子的一种组成成分 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL51基因在宿主细胞中的转录时相分析 |
| 4.1.1 实时荧光定量RT-PCR方法检测DPV UL51基因在宿主细胞中的转录时相方法的建立与优化 |
| 4.1.2 疱疹病毒UL51基因转录时相的比较 |
| 4.2 DPV UL51基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 4.2.1 Western blotting方法检测DPV UL51基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 4.2.2 疱疹病毒UL51蛋白表达时相的比较 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 鸭瘟病毒UL51蛋白在病毒感染细胞中的定位 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、抗体和细胞 |
| 1.2 主要试剂及其配制 |
| 1.2.1 细胞固定液 |
| 1.2.2 封片剂 |
| 1.3 主要仪器和用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白细胞内的定位 |
| 2.1.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白细胞内的定位方法的建立 |
| 2.1.2 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的细胞内定位方法的条件优化 |
| 2.1.3 特异性检测 |
| 2.1.4 免疫荧光检测结果判定 |
| 2.1.5 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的细胞内定位的动态监测 |
| 2.2 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.1 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位方法的建立 |
| 2.2.2 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白亚细胞定位方法的条件优化 |
| 2.2.3 特异性试验 |
| 2.2.4 胶体金免疫电镜法检测结果判定 |
| 2.2.5 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白在病毒感染细胞中的亚细胞定位的动态监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白细胞内的定位 |
| 3.1.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的细胞内定位方法的建立及优化 |
| 3.1.2 特异性试验 |
| 3.1.3 间接免疫荧光法检测UL51蛋白在DPV感染细胞中的定位动态 |
| 3.2 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.1 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位方法的建立及优化 |
| 3.2.2 特异性试验 |
| 3.2.3 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白在DPV病毒感染的细胞中的亚细胞定位动态 |
| 4 讨论 |
| 4.1 特定蛋白在细胞定位的方法简介 |
| 4.2 DPV UL51基因表达产物在宿主细胞定位与病毒增殖的关系分析 |
| 4.3 疱疹病毒UL51蛋白的亚细胞定位与其功能的关系 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第六章 用免疫组化方法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态分布 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 毒株和抗体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及其配制 |
| 1.3.1 组织固定、脱水和包埋 |
| 1.3.2 所需主要溶液的配置 |
| 1.3.3 免疫酶组化SP法所需试剂 |
| 1.3.4 免疫荧光所需试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 人工感染动物试验 |
| 2.1.1 试验分组 |
| 2.1.2 人工感染及样品的采集、固定、包埋和切片 |
| 2.2 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立及优化 |
| 2.2.1 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立 |
| 2.2.2 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白组织定位条件的优化 |
| 2.2.3 特异性试验 |
| 2.2.4 免疫酶组织化学法的检测结果判定 |
| 2.2.5 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布 |
| 2.3 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立与优化 |
| 2.3.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立 |
| 2.3.2 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位条件的优化 |
| 2.3.3 特异性试验 |
| 2.3.4 免疫荧光检测结果判定 |
| 2.3.5 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 人工感染DP强毒后鸭的临床症状及大体解剖病理变化 |
| 3.2 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白在鸭组织中的定位与分布 |
| 3.2.1 免疫酶组化检测DPV UL51蛋白组织定位方法的优化结果 |
| 3.2.2 异性试验 |
| 3.2.3 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布结果 |
| 3.3 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白在鸭组织中的定位与分布 |
| 3.3.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位方法的优化结果 |
| 3.3.2 异性试验 |
| 3.3.3 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 免疫酶组化和间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.1.1 免疫酶组化法检测DPV UL51蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.1.2 间接免疫荧光法检测DPV UL51蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.2 免疫酶组化和间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位与分布结果及二者的比较 |
| 4.2.1 免疫酶组化法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位与分布结果 |
| 4.2.2 间接免疫荧光法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位与分布结果 |
| 4.2.3 不同方法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭体内的定位及分布规律比较 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第七章 基于重组UL51蛋白的间接ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测鸭瘟病毒抗体的研究和应用 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株、毒株和血清 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.2.1 ELISA相关溶液 |
| 1.3 主要仪器及用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组UL51蛋白的大量制备和纯化 |
| 2.1.1 菌体发酵培养 |
| 2.1.2 重组ULL51蛋白的包涵体洗涤法大量纯化 |
| 2.1.3 重组UL51蛋白的复性和检测 |
| 2.2 UL51-ELISA法检测DPV抗体方法的建立 |
| 2.2.1 最佳抗原包被浓度的确定 |
| 2.2.2 待检血清和酶标二抗最佳稀释度的确定 |
| 2.2.3 UL51-ELISA方法的检测程序 |
| 2.2.4 UL51-ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 2.2.5 敏感性试验 |
| 2.2.6 特异性试验 |
| 2.2.7 重复性试验 |
| 2.3 UL51-ICS法检测DPV抗体方法的建立 |
| 2.3.1 ICS的组装 |
| 2.3.2 UL51-ICS法的原理和结果判定 |
| 2.3.3 UL51-ICS法的最佳试验条件的优化 |
| 2.3.4 敏感性试验 |
| 2.3.5 特异性试验 |
| 2.3.6 重复性试验 |
| 2.3.7 稳定性试验 |
| 2.4 UL51-ELISA法和UL51-ICS法检测DPV抗体的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 纯化的重组UL51蛋白的检测结果 |
| 3.2 UL51-ELISA法的建立 |
| 3.2.1 最佳抗原包被浓度确定的结果 |
| 3.2.2 待检血清和酶标抗体最适度的确定 |
| 3.2.3 ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 特异性试验结果 |
| 3.2.6 重复性试验结果 |
| 3.3 UL51-ICS方法的建立 |
| 3.3.1 UL51-ICS法检测DPV抗体法的条件优化 |
| 3.3.2 敏感性试验结果 |
| 3.3.3 特异性试验结果 |
| 3.3.4 重复性试验结果 |
| 3.3.5 稳定性试验结果 |
| 3.4 地方血清样品检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组蛋白的优点及应用 |
| 4.2 UL51-ELISA法的建立与优化 |
| 4.3 UL51-ICS方法的建立与优化 |
| 4.4 UL51-ELISA法、UL51-ICS法、DPV-ELISA法和NT法的比较 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第八章 基于抗重组UL51蛋白抗体的抗原捕获ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测DPV的研究和应用 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 蛋白、毒株和泄殖腔棉拭纸 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器及用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 抗重组UL51蛋白多克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.1.1 兔抗重组UL51蛋白多克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.1.2 鼠抗重组UL51蛋白多克隆抗体的制备、纯化和胶体金标记 |
| 2.2 样品的处理 |
| 2.2.1 细胞培养液、鸭胚尿囊液或菌体培养液的处理 |
| 2.2.2 泄殖腔棉拭子样品的处理 |
| 2.3 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法检测DPV方法的建立 |
| 2.3.1 最佳鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG工作浓度的确定 |
| 2.3.2 酶标抗体最适浓度的确定 |
| 2.3.3 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3.4 敏感性试验 |
| 2.3.5 灵敏度试验 |
| 2.3.6 重复性试验 |
| 2.4 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS法的建立 |
| 2.4.1 胶体金标记的兔抗重组UL51蛋白抗体的制备 |
| 2.4.2 ICS的组装 |
| 2.4.3 ICS法的原理和结果判定 |
| 2.4.4 试纸条最佳试验条件的优化 |
| 2.4.5 敏感性试验 |
| 2.4.6 特异性试验 |
| 2.4.7 重复性试验 |
| 2.4.8 稳定性试验 |
| 2.5 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法和ICS法检测DPV的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 纯化的重组UL51蛋白抗体的检测结果 |
| 3.2 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA方法的建立 |
| 3.2.1 鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG最佳工作浓度确定的结果 |
| 3.2.2 酶标抗体最适浓度的确定结果 |
| 3.2.3 阴阳性临界值的确定结果 |
| 3.2.4 特异性试验 |
| 3.2.5 敏感性检测结果 |
| 3.2.6 重复性试验结果 |
| 3.3 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS法的建立 |
| 3.3.1 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS法的条件优化 |
| 3.3.2 敏感性试验结果 |
| 3.3.3 特异性试验 |
| 3.3.4 重复性试验结果 |
| 3.3.5 稳定性试验结果 |
| 3.4 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法和ICS法检测DPV的应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 样品处理方法的选择 |
| 4.2 基于抗重组UL51蛋白抗体的抗原捕获ELISA法的建立与优化 |
| 4.3 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS方法的建立与优化 |
| 4.4 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法、ICS法和常规PCR法的比较 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第九章 鸭瘟病毒UL51基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时转录和表达特性 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、菌株、载体、细胞和抗体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV UL51基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 DPV基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 PCR扩增DPV UL51基因 |
| 2.1.4 UL51基因PCR产物的回收 |
| 2.1.5 纯化的UL51基因与pMD18-T的连接 |
| 2.1.6 DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.1.7 转化感受态细胞 |
| 2.1.8 质粒的抽提 |
| 2.1.9 重组质粒的PCR和酶切鉴定 |
| 2.1.10 UL51基因序列测定 |
| 2.2 真核表达质粒pcDNA3.1-UL51的构建与鉴定 |
| 2.2.1 目的片段的酶切与连接 |
| 2.2.2 重组质粒的转化 |
| 2.2.3 重组质粒的酶切和PCR鉴定 |
| 2.3 UL51基因在COS-7细胞中的瞬时转录和表达特性分析 |
| 2.3.1 重组真核表达载体pcDNA3.1-UL51转染COS-7细胞 |
| 2.3.2 荧光定量RT-PCR方法检测UL51基因在COS-7细胞中的瞬时转录 |
| 2.3.3 Western blotting检测UL51基因在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 2.3.4 间接免疫荧光法检测UL51基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51基因的扩增、T-克隆与鉴定结果 |
| 3.1.1 UL51基因的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 UL51基因T克隆鉴定结果 |
| 3.2 真核表达载体pcDNA3.1-UL51的构建与酶切鉴定 |
| 3.3 UL51基因在COS-7细胞中的转录情况 |
| 3.3.1 RNA完整性及纯度分析 |
| 3.3.2 UL51基因在COS-7细胞中的相对转录量分析 |
| 3.4 UL51基因在COS-7细胞中的表达情况 |
| 3.4.1 细胞蛋白的提取及SDS-PAGE检测 |
| 3.4.2 UL51基因表达产物在在COS-7细胞中的表达时相分析 |
| 3.5 UL51基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 真核表达载体、转染试剂、宿主细胞的选择 |
| 4.2 UL51基因转录和表达产物的检测 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）鸭瘟检测方法的研究进展（论文提纲范文）
| 1 鸭瘟病毒和鸭瘟诊断方法 |
| 1.1 鸭瘟病毒 |
| 1.2 鸭瘟诊断方法 |
| 2 鸭瘟检测方法 |
| 2.1 早期检测鸭瘟方法 |
| 2.2 ELISA检测鸭瘟 |
| 2.3 PCR方法检测鸭瘟 |
| 2.4 原位杂交检测鸭瘟 |
| 3 展望 |
（9）鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.2 鸭肠炎病毒简介 |
| 1.3 鸭肠炎病毒的装配方式 |
| 1.4 鸭肠炎病毒分子生物学研究 |
| 1.5 鸭病毒性肠炎的诊断 |
| 1.5.1 综合分析流行病学、临床症状和病理变化 |
| 1.5.2 病毒的分离和鉴定 |
| 1.5.3 血清学方法 |
| 1.5.4 分子生物学方法 |
| 1.6 鸭病毒性肠炎的防治 |
| 1.6.1 预防 |
| 1.6.2 治疗 |
| 1.7 鸭病毒性肠炎存在的问题与展望 |
| 1.7.1 鸭病毒性肠炎流行病学的问题与变化 |
| 1.7.2 病理变化的非典型化 |
| 1.7.3 疫苗保护效果的变化 |
| 1.7.4 “新型鸭病毒性肠炎”的提出 |
| 1.8 疱疹病毒概述 |
| 1.8.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.8.2 疱疹病毒形态结构 |
| 1.8.3 疱疹病毒基因组结构 |
| 1.8.4 疱疹病毒主要结构蛋白 |
| 1.8.5 疱疹病毒VP22 蛋白研究进展 |
| 1.9 B 细胞抗原表位的筛选 |
| 1.9.1 抗原表位概述 |
| 1.9.2 B 细胞抗原表位的研究方法 |
| 第二章 鸭肠炎病毒VP22 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白VP22 的表达及纯化 |
| 2.2 重组蛋白的Western blot 分析 |
| 2.3 ELISA 筛选方法的建立 |
| 2.4 细胞融合率 |
| 2.5 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.6 腹水效价的测定 |
| 2.7 杂交瘤细胞染色体分析 |
| 2.8 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.9 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 鸭肠炎病毒VP22 蛋白B 细胞线性表位的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 VP22 表位预测 |
| 2.2 UL49 基因的分段克隆、表达与鉴定 |
| 2.3 单克隆抗体2B10 抗原表位的初步分析与鉴定 |
| 2.4 单克隆抗体2B10 抗原表位分析与定位 |
| 2.5 ELISA 鉴定抗原表位 |
| 2.6 抗原表位与DEV 阳性血清的反应性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）鸭瘟病毒US3基因的发现、原核表达及应用研究（论文提纲范文）
| 本论文创新性工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用英文缩写词汇含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒US3基因研究进展 |
| 1 疱疹病毒US3基因在基因组中定位 |
| 2 疱疹病毒US3蛋白与病毒成熟、释放 |
| 3 疱疹病毒US3蛋白与免疫逃逸、潜伏感染 |
| 4 疱疹病毒US3蛋白与病毒的传播、致病性 |
| 5 疱疹病毒US3蛋白与细胞凋亡 |
| 5.1 细胞凋亡概念和生物学意义 |
| 5.2 细胞凋亡的机理 |
| 5.2.1 死亡受体通路 |
| 5.2.2 线粒体通路 |
| 5.2.3 内质网通路 |
| 5.2.4 细胞凋亡相关的部分调控基因及表达产物 |
| 5.3 疱疹病毒US3蛋白与细胞凋亡 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 DEV US3基因发现、克隆及分子特性分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 DEV US3基因的发现 |
| 2.2 DEV US3基因鉴定 |
| 2.2.1 DEV病毒的增殖 |
| 2.2.2 DEV DNA的提取 |
| 2.2.3 US3基因的T克隆和鉴定 |
| 2.3 DEV US3基因生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 DEV US3基因的发现 |
| 3.2 DEV US3基因的克隆和鉴定结果 |
| 3.2.1 DEV US3基因的PCR扩增结果 |
| 3.2.2 DEV US3基因T克隆及鉴定结果 |
| 3.3 DEV US3基因生物信息学分析结果 |
| 3.3.1 DEV US3基因系统进化树构建 |
| 3.3.2 DEV US3核酸序列及其推导氨基酸序列一般特性分析 |
| 3.3.3 DEV US3蛋白亚细胞定位分析结果 |
| 3.3.4 DEV US3蛋白翻译后修饰预测 |
| 3.3.5 DEV US3蛋白序列疏水性分析 |
| 3.3.6 DEV US3蛋白抗原性分析 |
| 3.3.7 DEV US3蛋白质高级结构预测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DEV US3基因的发现 |
| 4.2 DEV US3蛋白与其它α疱疹病毒US3蛋白的系统进化关系 |
| 4.3 DEV US3蛋白一般理化特征 |
| 4.4 DEV US3蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.5 DEV US3蛋白翻译后修饰 |
| 4.6 DEV US3蛋白高级结构特点 |
| 5 小结 |
| 第三章 DEV US3基因原核载体构建、表达、产物纯化及其抗体制备 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 pET32-US3重组原核表达质粒的构建和鉴定 |
| 2.1.1 重组载体pMD18T-US3的酶切和US3基因片段的纯化回收 |
| 2.1.2 原核表达载体pET32a(+)双酶切线性化及纯化回收 |
| 2.1.3 线性pET32a(+)质粒与酶切回收US3序列的连接 |
| 2.1.4 DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.1.5 重组pET32a-US3质粒的转化与DH5 |
| 2.1.6 重组pET32a-US3质粒的提取 |
| 2.1.7 重组pET32a-US3质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 重组质粒pET32a-US3的诱导表达 |
| 2.2.1 感受态表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的制备 |
| 2.2.2 重组质粒pET32a-US3转化表达宿主菌Ecoli BL21(DE3) |
| 2.2.3 重组质粒pET32-US3阳性E.coli BL21(DE3)菌株的表达鉴定 |
| 2.2.4 重组质粒pET32a-US3诱导原核表达条件优化 |
| 2.2.5 重组质粒pET32a-US3原核表达产物的可溶性分析 |
| 2.3 重组质粒pET32a-US3原核表达蛋白的纯化 |
| 2.3.1 重组质粒pET32a-US3大量诱导表达 |
| 2.3.2 重组质粒pET32a-US3原核表达蛋白的镍离子亲和层析纯化 |
| 2.3.3 纯化蛋白的复性 |
| 2.4 兔抗DEV-US3融合表达蛋白多克隆抗体IgG的制备 |
| 2.4.1 兔抗DEV-US3血清的制备 |
| 2.4.2 兔抗DEV-US3血清效价测定 |
| 2.5 兔抗DEV-US3融合表达蛋白多克隆抗体IgG的纯化 |
| 2.5.1 IgG的辛酸-硫酸铵(CA-AS)粗提 |
| 2.5.2 阴离子交换层析纯化IgG |
| 2.5.3 纯化抗体IgG特异性检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 原核重组表达载体pET32a-US3的构建 |
| 3.2 重组载体pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌的诱导表达 |
| 3.2.1 重组质粒pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌的表达鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌诱导表达条件的优化 |
| 3.2.3 重组质粒pET32a-US3阳性BL21(DE3)菌诱导表达产物可溶性分析 |
| 3.3 融合表达蛋白pET32a-US3的纯化 |
| 3.4 兔抗DEV-US3血清制备 |
| 3.4.1 抗体效价的ELISA检测 |
| 3.4.2 抗DEV-US3血清的IgG的纯化 |
| 3.4.3 蛋白免疫印迹性检验纯化IgG的特异性 |
| 4 讨论与分析 |
| 4.1 DEV-US3基因表达体系的选择 |
| 4.2 DEV-US3在原核表达系统中的表达 |
| 4.3 融合表达蛋白的纯化 |
| 4.4 抗DEV-US3血清IgG的制备 |
| 5 小结 |
| 第四章 鸭病毒性肠炎病毒US3基因在宿主细胞内的转录时相、表达时相和US3蛋白亚细胞定位 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 鸭成纤维细胞的培养 |
| 2.3 DEV US3基因转录时相 |
| 2.3.1 DEV病毒的增殖 |
| 2.3.2 细胞总RNA提取 |
| 2.3.3 基因组DNA的去除 |
| 2.3.4 反转录 |
| 2.3.5 普通聚合酶链式反应 |
| 2.3.6 PCR产物回收 |
| 2.3.7 实时荧光定量PCR |
| 2.3.8 Real-time PCR扩增标准曲线的建立 |
| 2.3.9 DEV US3转录时相结果和数据处理 |
| 2.4 DEV US3基因表达时相和亚细胞定位 |
| 2.4.1 DEV病毒的增殖 |
| 2.4.2 间接免疫荧光检测条件优化 |
| 2.4.3 间接免疫荧光检测的特异性 |
| 2.4.4 间接免疫荧光检测DEV US3蛋白的表达和定位 |
| 3 结果 |
| 3.1 DEV US3基因转录时相 |
| 3.1.1 细胞总RNA提取 |
| 3.1.2 RT-PCR检测 |
| 3.1.3 实时荧光定量检测标准曲线的建立 |
| 3.1.4 DEV US3基因的转录量分析 |
| 3.2 DEV US3基因表达时相和亚细胞定位 |
| 3.2.1 间接免疫荧光检测条件优化 |
| 3.2.2 间接免疫荧光检测的特异性 |
| 3.2.3 间接免疫荧光检测DEV US3蛋白的表达和定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DEV US3基因转录时相和表达时相 |
| 4.2 DEV US3蛋白亚细胞定位 |
| 5 小结 |
| 第五章 抗鸭病毒性肠炎病毒US3基因原核表达蛋白抗体介导的酶免疫组化检测DEV的研究和应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 鸭人工感染DEV试验 |
| 2.2 组织包埋及切片 |
| 2.2.1 载(盖)玻片准备 |
| 2.2.2 组织包埋及切片 |
| 2.3 间接免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的建立 |
| 2.3.1 兔抗DEV-US3蛋白IgG制备 |
| 2.3.2 免疫组化反应条件的优化 |
| 2.3.3 间接免疫组化检测DEV-US3蛋白特异性 |
| 2.3.4 结果判定 |
| 2.4 间接免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的应用 |
| 2.4.1 鸭病毒性肠炎临床样本进行检验 |
| 2.4.2 人工感染DEV鸭组织中DEV-US3基因的表达时相及其蛋白分布 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 间接酶免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的建立 |
| 3.1.1 酶免疫组化方法检测DEV-US3蛋白条件优化 |
| 3.1.2 间接免疫组化检测DEV-US3蛋白特异性 |
| 3.2 间接酶免疫组化检测DEV US3蛋白方法的应用 |
| 3.2.1 鸭病毒性肠炎临床样本的检验 |
| 3.2.2 人工感染DEV鸭组织中DEV US3基因的表达时相及其蛋白分布 |
| 4 讨论与分析 |
| 4.1 间接免疫组化检测DEV US3蛋白方法的建立 |
| 4.2 间接免疫组化检测DEV-US3蛋白方法的应用 |
| 5 小结 |
| 第六章 抗鸭病毒性肠炎病毒US3基因原核表达蛋白抗体介导的免疫荧光检测DEV的研究和应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 人工感染DEV雏鸭组织样品采集、包埋及切片 |
| 2.2 间接免疫荧光检测DEV-US3蛋白方法的建立 |
| 2.2.1 兔抗DEV-US3蛋白IgG制备 |
| 2.2.2 免疫荧光检测方法的条件优化 |
| 2.2.3 间接免疫荧光检测DEV-US3蛋白特异性 |
| 2.2.4 结果判定 |
| 2.3 间接免疫荧光检测DEV-US3蛋白方法的应用 |
| 2.3.1 鸭病毒性肠炎临床样本进行检验 |
| 2.3.2 人工感染DEV鸭组织中DEV-US3基因的表达时相及其蛋白分布 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 免疫荧光检测人工感染鸭病毒性肠炎病毒后鸭组织DEV-US3基因编码蛋白方法的建立与优化 |
| 3.1.1 免疫荧光方法检测DEV US3蛋白的建立 |
| 3.1.2 免疫荧光方法检测DEV US3蛋白特异性 |
| 3.2 间接免疫荧光检测DEV US3蛋白方法的应用 |
| 3.2.1 鸭病毒性肠炎临床样本的检验 |
| 3.2.2 人工感染DEV鸭组织中DEV-US3基因的表达时相及其蛋白分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间接免疫荧光检测DEV US3蛋白方法的建立 |
| 4.2 间接免疫荧光检测人工感染DEV鸭组织中DEV US3基因的表达时相及其蛋白分布 |
| 5 小结 |
| 第七章 鸭病毒性肠炎病毒US3基因原核表达蛋白作为包备抗原ELISA检测DEV抗体的研究和应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DEV US3基因原核表达蛋白表达与纯化 |
| 2.2 DEV-US3蛋白作为包被抗原间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 2.2.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定 |
| 2.2.3 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.4 ELISA检测临界值的确定 |
| 2.2.5 ELISA检测特异性检验 |
| 2.2.6 ELISA检测敏感性 |
| 2.2.7 ELISA检测重复性 |
| 2.3 间接ELISA方法检测DEV抗体的应用 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DEV-US3表达蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.1.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释浓度的确定 |
| 3.1.2 酶标二抗最适工作浓度的确定 |
| 3.1.3 ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 3.1.4 间接ELISA检测的特异性 |
| 3.1.5 间接ELISA检测的敏感性 |
| 3.1.6 间接ELISA检测的重复性 |
| 3.2 间接ELISA对临床血清样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第八章 基于鸭病毒性肠炎病毒US3基因PCR方法的建立和应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 核酸DNA的提取 |
| 2.1.1 细胞病毒的DNA提取 |
| 2.1.2 细菌菌株DNA的提取 |
| 2.1.3 组织中DNA的提取 |
| 2.2 DEV-US3基因PCR检测DEV方法的建立 |
| 2.2.1 引物的设计 |
| 2.2.2 DEV-US3基因PCR反应体系的建立 |
| 2.2.3 PCR检测灵敏性 |
| 2.2.4 PCR检测特异性 |
| 2.3 PCR方法对病料组织的检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 PCR扩增DEV强毒株DNA结果 |
| 3.2 PCR检测DEV方法的灵敏性 |
| 3.3 PCR检测DEV方法的特异性 |
| 3.4 PCR检测DEV方法的临床应用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 致谢 |
| 作者简介 |
| 附表:常见试剂的配制 |
| 附图1——免疫组化染色 |
| 附图2——免疫荧光染色 |
四、应用ELISA检测鸭瘟抗体的研究（论文参考文献）
- [1]江西部分地区种鸭坦布苏病毒病及鸭瘟免疫状况调查与分析[J]. 李海琴,方绍培,谭美芳,曾艳兵,黄江南,季华员,张帆帆,谭佳,陈小连,康昭风,杨群,韦启鹏. 江西农业大学学报, 2021(05)
- [2]鸭瘟病毒间接ELISA方法的建立[J]. 孙凤萍,高骏,李红,刘成倩,易建中,姚慧娟. 上海畜牧兽医通讯, 2018(02)
- [3]鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 刘情,邓伯雄,刘亚刚. 中国畜牧兽医, 2015(12)
- [4]鸭瘟病毒实验室检测方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,王艳,姚春阳,沈志强. 水禽世界, 2015(02)
- [5]鸭瘟病毒gD基因发现及重组蛋白应用研究[D]. 范薇. 四川农业大学, 2013(03)
- [6]鸭瘟病毒gE基因功能初步研究[D]. 常华. 四川农业大学, 2011(02)
- [7]鸭瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白应用的研究[D]. 沈婵娟. 四川农业大学, 2010(12)
- [8]鸭瘟检测方法的研究进展[J]. 黄河龙. 安徽农业科学, 2010(04)
- [9]鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 王克雄. 甘肃农业大学, 2009(06)
- [10]鸭瘟病毒US3基因的发现、原核表达及应用研究[D]. 信洪一. 四川农业大学, 2009(07)